JPS5820189A - 耐熱性ヘスペリジナ−ゼａｈ−２の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、耐酸性、耐熱性にすぐれたヘスにリジナーゼ
ＡＨ−２の製造法ＫＩＤするものである。

を培地に培養し、得られた培養物からヘスはリジナーゼ
ＡＨ−２を分離採取することを特徴とする耐熱性へスに
リジナーゼムＨ−２の製造法に関するものである。

従来、温州みかん句誌等、柑橘類句誌は保存中に白濁を
生じ、その商品価値を低下させる欠点があった◎ しかし、このシラツブの白濁現象はみかん果肉中に存在
するヘスはリジンが原因であることが分り、その防止法
としてヘスはリジンを比較的可溶性のへスイレチン−７
−グルコシドに分解するヘスイリジナーゼを使用する方
法（ｌ＃公紹３０−３９０号、特公昭５９−２２５０９
号、特公昭４７−２４７３９号）が開発されるに至って
いる。

しかしながら、一般のＮ橘類缶詰製造工程では８０〜８
２℃（缶中心ｆｆ１度７４〜７５℃、ｐＨ３付近）で約
１０分間の殺菌工程が存在すること、又へスベリジナー
ゼをシラツブ（２５’ｊｌシユークロース、ｐＨ２８，
７０℃）Ｋ溶解して使用するため、ヘスはリジナーゼは
扁い耐熱性と耐酸性を要求さ・れるのであるが、従来知
られ次へスはリジナーゼには＾い耐熱性と同時に烏い耐
酸性を有するものはみられなかったのである。

本発明者らは、耐熱性と耐敵性を有するヘスベリジナー
ゼの工業的製造を確立する目的で多数の菌株の検索を行
なった。即ち、＊５Ｌ水５５ｍを１００１容三角フラス
コに取り１２０υで５０分間殺菌した後、土壌から分離
した菌株を接種して６０℃で３日間培養し、得られた培
養物に５０ｄの水を加えて５℃で一夜抽出を行なった後
Ｆ遇して＃素液とし、これをｐＨ５，０で７０℃、３０
分間加熱処理を行ない、直ちに冷却し残存ヘスはリジナ
ーゼ活性を測定することにより、検索した〇本＠明者ら
は、多数の菌株のなかから、−菌株が耐熱性と同時に耐
酸性を有するヘスはリジナーされ、黴工研にＦＥＲＭ　
Ｐ−＜５００１として寄託されはニシリウム５ｐ７２ｔ
のツアペック培地と麦芽エキス場鳩での形−１生育状態
、生理的性質は、次の通シである。

囚　形態 ■　分生子柄 基底−系または気生−系より生じる。２７〜五２ｘ２０
〜２５０μ、滑面〜わずか粗面、先端はわずかに膨らみ
、五〇〜５．５μ。

■　スニシリ 主に単輪生体で、ときに分枝を生じる。

■　フイアリツド とつくり形、１８〜２．５　Ｘ　８．０〜１２．０μ、
５〜１２本が輪生。

■　分生子 フイアロ型分生子、球形〜血球形、粗面、２．０〜２゜
８μ、分生子鎖はゆるいカラム状。９（Ｂ）　　生育状
態 ■　ツアはツク寒天培地 生育はやや抑制的である。ビロード状〜綿毛状、栄養菌
糸は無色〜白色、分生子形成部位は灰貢縁色〜淡青緑色
、無色〜淡黄色の分泌物を形成。集落裏面は白色〜淡黄
色である。

■　麦芽エキス寒天培地 生育はかなり速やかである。平たん、ビロード状〜綿毛
状、栄養菌糸ＩＩｉ無色〜白色、分生子形成部位は灰黄
緑色。巣落彊面は淡黄色である。

（Ｃ）　　生理的性質 ■　最適生育条件 ｐＨは４．０〜６０がよく、温度Ｆｉ２５〜３２℃がよ
い。

■　生育の範四 ｐＨ２，５〜１００で生育する。８℃で生育し、３７℃
でははとんど生育しない。

以上の性質を主にＢａｒｒ＠ｎのＴｈｅ　Ｇ＠ｎ＠ｒａ
　ｏｆＨｙｐｈｏｍｙｅ＠ｔ＠ｓ　　ｆｒＯｍ　　８ａ
１１　　（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　　＆　　Ｗｉｌｋｉｎｓ
。

Ｂａｌｔｌｍｏｒｅ　（１９６８）　）に従って検索す
ると、■フイアロ型分生子を形成する、■分生子堆・分
生子座を形成しない、■分生子柄は、よく発達し、先端
にフイアリツドを形成する、■フイアリツドはとつくり
形で、ベニシリとなる、■分生子は球形〜血球形で、長
い連鎖状になる等により気的に培養してヘスペリシナ−
ゼムＨ−２が生産される培地としては、固体培地、液体
培地のいずれでもよく、培地成分は炭素源、窒素源等一
般培地に使用逼れるものであればいずれでもよいが、皺
培地で十分である。

培養は、好気的に２０〜４０−０．好ましくは２５〜３
５℃で２〜５日間行なわれる。

固′体培地における場合は、培養物に水を加えてヘスイ
リジナーセＡＨ−２を抽出し、液体培地における場仕は
、培養物を濾過し、ヘスはリジナーゼＡＨ−２を含む培
養ｐ液を得ることができる。

ヘスベリジナーゼＡＨ−２含肩°液にはエタノールを多
ｊｌｔ添加１２、沈澱？ｌ　ｋ　ＩｔＪ収し、エタノー
ルを揮散させることによって、ヘスはリジナーゼムＨ−
２粗酵素粉本を得ることができ名。

史に１粗酵素粉末を精製するには、これを水に浩解Ｌ、
ｏｇｈｙ−セルロースカラムを通すことによって、セル
ラーセ、ペクチナーゼ等の狭麹＃木、雑蛋白質等が分離
除去嘔れる。

次に、本％明で得られるヘスイリジナーゼＡＨ−２の理
化学的性質を示す。

ｔ　作　　用：へスベリジンに作用してヘスイリジンを
ヘスベレテン−７−グルコ シドに分解する。

２　基質！Ｘ注性：スはリジンに作用し、ルナン、ナリ
ンジンにも作用する。

五　至適ｐＨ：至適ｐｎＦｉ五３〜五７である。

（第１図に示す通り。） ４、全適温ｍ：至適温度は約６０℃である。

（第２図に示す通り。） ５、　　鋺ｐＨ組引ｐＨ２，５〜７．９　テ４０　”０
．２時間加熱しても安定であり、ｐＨ 五〇〜４．０で６０℃、１時間加 熱しても安定である。各ｐＨにお いて４０℃で１時間処理した場 合の安定曲線を第３図に示す。

６　温度安尾性：　ｐＨ４，０，５分間処理において、
６５℃で失活なし、７０℃で５ 一失活し、７５℃で２５１失活 する。（第４図に示す通９゜） また、ｐＨ５２，１時間処理にお いて、５０℃で失活なし、６０ ℃で１５１失活する。

Ｚ　阻　　害：釧、水銀、鉛で阻害され、その他ではラ
ウリル硫識ナトリウム Ｎ−ブロムコハク酸イミドで阻 害される。

ａ　等電点二４．７〜４．８（焦点電気泳動法による。

） ９　分子量：約１５万〜１７万（セファデックスＧ−２
００に↓る醐定。） 次に、公知の糸状菌生産へスベリジナーゼとへスはリジ
ナーゼＡＨ−２ｔ−比較対照したものを表−１に示す。

上記表−１から明らかなように、本発明で得られるヘス
ハリジナーゼＡＨ−２は耐熱性及び耐酸性において、他
のへスはリジナーゼに比較して特にすぐれていることが
わかる。即ち、アスペルギルスオリーゼ、Ｒニシリウム
・プロゲヌムの生産するヘスイリジナーゼは温度安定性
が低く、実際の句誌製造に使用することは不可能である
。またアスペルギルス・ニガーのヘスはリジナーゼも充
分な耐熱性、耐酸性を有しているとはい臭ず、失活防止
のため、殺菌工程では注意深く条件制御を行なうことが
必賛であり、工業的な実施には操作が面倒な蝋点がある
。これに対して本発明のはニシリウムＳＰ￥２７の生産
するヘス勺ジナーゼＡＨ−２は、他の糸状菌の生産する
ヘス’リジナーゼと較べ特に温度安定性の点で優れてい
る。災にｐＨ２，８０２５＊シｚ−クロース中で７０℃
、４時間の熱処理後、約４０９６の酵素活性が残存する
こと、又ｐＨ！ｈ、５．５−以上のグルコース或いはシ
ェークロース存在下にａｏｏ、１ｏ分間加熱処理しても
、本発明のへスペリジナーゼＡＨ−２は最大酵素活性の
約５５〜６０嘔を残存し孟しい耐熱性を示した。

即ち、この耐熱性ヘス４９ジナーゼＡＨ−２は通常のみ
かん缶詰の殺嬶処！（街中／Ｕ温ｆ７４〜７５υにて約
１０分間）後もかな９の＃素話性が残存する性質を有す
るものである◎ 本発明の耐熱性へスベリジナーゼＡＨ−２は、酵素作用
を缶内で行なう方法に使用するものであるから、＃１票
剤中にはクチナーゼ、セルラーゼ等果肉の組ｍを分解乃
至軟化する酵素やシラツブを分解するインベルターゼ等
の＃素が夾雑することは望ましくない。しかしこ八らの
夾雑酵素は熱処理、イオン交換クロマト等の一般的酵素
１／１Ｉ１１手段によって除去できる。

従って、ヘス１９ジナーゼＡＨ−２は柑橘類缶詰製造に
用いるのに最適であるということができる。

以下本発明の実施例を示す。なお本発明に用いたヘス１
リジナーゼ活性測定は以下に述べる通りである。

〔ヘスペリジナーゼ活性１１ｉｊ定＆）（１）　　基質
原液の１ｉｌｉｌ製法 ヘス堅リジン１００ダを精秤し水２ｏ―に懸濁させ１規
定苛性ン一ダＩＣ１ｗｊを加えて解解した稜、ｐＨ五８
のα１モルマッキイルベイン毅１ｇ＄２０ｗｊ’を加え
、更に１規定塩酸１０ｍを加える。この溶液のｐＨをチ
ェックし、ＰＨ＆８に榴止する。

（２）測定法及び力価の基準 上記基質原液１０ｍに検液５０μｌを加える。

４０℃で６０分間反応させ、生成する還元糖をソモギー
ネルソン法により比色定量する。本欄定条件下にてグル
コースとして１■の還元糖を生成する酵素力を１単位と
する。

実施例１ 皺８ＩＩＫ−水１０（ｌａＪｌｃ騰濁して塩緻でｐＨ４
，８にＦＥＢＭ　Ｐ−６００１を豊漁して３０℃で１日
間振盪培養を行なう。＄ｓｌ、水３５１ｉｊを１０ロー
容三角７ラスコに入れ１２０υ、５０分間滅１１ｗｋ、
上記種培養液１５−を接極し、６０υで６日間培養を行
なう。培養終了後５０−の水を加え、５υで一夜抽出し
た後培養物をｐ別し、このろ液を酵素液としてヘス１５
リジナーゼ活性７に１１１１定した。本酵素液はα５　
ｕ　／　ｄのへスはリジナーゼ活性を有し、砿１１Ｉ！
！！４りのへスはリジナーゼ活性は５　ｕｎｉｔｓであ
った。

得られた酵素液１００本分を合わせて＃ｊｌした後、３
倍量のエタノールを加えて酵素を沈澱させ沈澱を回収し
、デシケータ中で減圧下てエタノールを揮散させヘスは
リジナーゼＡＨ−２粉末１９２９が得られる。ヘス１９
ジナーゼ活性Ｆｉ５７．１　ｕ／１１であった。

実施例２ 種して５００で１日間振盪培養を行なう。皺ｔ４峙、水
ＩＪｔ−室プタに取９１２０℃で７０分間減ｍ後上記種
培養液を１１１種し、５０℃で６日間培養する。室ブタ
３枚分の培養物を１５４ｉの水で抽出し、実施例１と同
様な処理によりヘスにリジナーゼＡＨ−２粉末１５８１
１が得られる。ヘスにリジナーゼ活性社６１８　ｕ　／
　９であった。

実施例＆ 実施例１．２で得られたヘスイリジナーゼＡＨ−２粉末
を精製水に溶解し、あらかじめ０．０２モルリン酸緩衝
液（ｐＨ４５）で平衡化したｎｇ＊ｇ−セルロースカ、
ラムに供する。ヘスはリジナーゼ活性は吸着されずにカ
ラムを素通りするが、セルラーゼ、はクチナーゼはカラ
ムに吸着される。カラ五奢同緩衝液で洗浄して未吸着画
分を集める。得られた＃素液を脱塩製動した後、ｐＨ４
，５で５５℃、１時間の加熱処理を行なう。この熱処理
によってインベルターゼは失活するが、ヘス１９ジナー
ゼは失活しない。熱処理液を濾過して沈ＩＭ＠を除去　
。

し、得られた清泄液に５倍量の冷エタノールを加えて酵
素を沈澱させ、回収しｆｃ後、減圧下でエタノールを揮
発させてヘス１９ジナーゼＡＨ−２の白色粉末を得た。

この酵素粉末＃１２５０　ｕ　／　ＩＩのヘスはリジナ
ーゼ活性を有していた。

４、図面の簡単なＷ５？、明 第１図線本発明のへスベリジナーゼＡＨ−２のｐＨ活性
曲線を、總２図はその温度−活性曲線を示しく最適ｐＨ
，最適温度はそれぞれ、ｐＨ３，５，６０・付近に存在
する）、ａｌｌ！３図は本酵素を４０℃で１時間処理し
た場合のｐＨ安定ａｗを示しくｐＨ２，５〜７．９の範
囲で本酵素は安定である。〕、第４回はＰＨ４，０で５
分間各温度で処理した時の温度安定−線を示す。

代理人　弁理士　戸　１）親　男 第　　１　　図 第２図 温度（℃） 第　　３　　図

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. ベニシリクムｊｌｌＫ属するヘスベリジナーゼＡＨ−２
   生産■を培養し、培養物からヘス４９シナ−ゼムＨ−２
   を採取することを特徴とする耐熱性へススリジナーゼム
   Ｈ−２の製造法。