CN107847576A

CN107847576A - 针对艰难梭状芽孢杆菌的免疫方法

Info

Publication number: CN107847576A
Application number: CN201680041646.1A
Authority: CN
Inventors: L.奎伊梅内尔; P.J.皮伊特罗邦; P.伦多诺-哈耶斯; S.哈塞
Original assignee: Sanofi Pasteur Inc
Current assignee: Sanofi Pasteur Inc
Priority date: 2015-05-15
Filing date: 2016-05-14
Publication date: 2018-03-27
Also published as: BR112017024443A2; AU2016263203A1; WO2016187073A1; MX2017014666A; CA2986025A1; JP2018521967A; EP3294330A1; US20180110849A1; KR20180011784A; IL255592A

Abstract

本公开内容一般涉及对抗艰难梭状芽孢杆菌(C. difficile)的治疗性和/或保护性疫苗接种领域。更特别地，它涉及针对表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株和不表达CDT的菌株免疫宿主的方法。这些方法包括给予宿主包含灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和纯化的毒素B的免疫原性组合物。纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素可源自不表达CDT的艰难梭状芽孢杆菌菌株。

Description

针对艰难梭状芽孢杆菌的免疫方法

相关申请

本申请要求2015年5月15日提交的美国申请号62/162,357的优先权。

本公开内容的领域

本公开一般涉及针对艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile (C. difficile))的治疗性和/或保护性疫苗接种的领域。

本公开内容的背景

艰难梭状芽孢杆菌是一种广泛分布的具有多个菌株毒素型/ PCR-核糖核酸型(RT)的病原体。在几个国家进行的许多分子流行病学研究在过去5年中一直被公开。结果证实，编码几种毒素变体的循环菌株作为人类有症状的艰难梭状芽孢杆菌感染(CDI)的原因是流行的。5种最流行的菌株包括毒素型0、III、IV、V和VIII。本领域存在对包含艰难梭状芽孢杆菌抗原的组合物的需求，所述组合物用作对抗多个艰难梭状芽孢杆菌菌株/毒素型，特别是对抗表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(“CDT”；例如，来自CDTa和/或CDTb亚单位)的那些和不表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素的那些的治疗性和/或保护性免疫原性组合物(例如，疫苗)，特别是其中疫苗从不表达CDT的菌株制备，而需要免疫的菌株表达CDT。本领域已认识到，例如，重组毒素A和毒素B可能不提供对抗表达CDT的菌株的保护作用，除非二元毒素被包括在疫苗中(WO 2013/112867)。‘867申请的实施例11解释了“重组TcdA + TcdB疫苗不能够显著地增加用来自高毒力NAP1/027/BI17株(其表达CDT)…的孢子…攻击的仓鼠的存活率”，但“加入二元毒素(CDTa和CDTb)至疫苗中…始终增加该疫苗的保护功效”。事实上，只有包含“两种二元毒素蛋白(CDTa和CDTb)与TcdA和TcdB完全恢复…保护作用”。与这些教导相反，并且令人吃惊地是，考虑到所述教导，这样的问题使用在本公开内容中描述的试剂和方法得到克服。

附图简述

图1是细胞毒性测定结果的示意图。使用IMR90细胞的细胞毒性测定使用来自根据描述的方法各自经历灭活的一批毒素A和毒素B的样品进行(实施例2)。样品在第0天采集，随后加入甲醛以灭活毒素并在之后许多天评价材料的细胞毒性。y-轴确定在毒性材料的存在下，50%的细胞成为圆形(与它们的正常有条纹的形态学相反)的最小浓度(MC50)。用于测定的检测值的低限(LOD)使用虚线确定。

图2是灭活艰难梭状芽孢杆菌毒素A和毒素B的示例性方法的示意图。

图3是得自免疫研究的结果的示意图。在仓鼠攻击模型(使用5组，9只仓鼠/组)中执行的研究(在实施例2中描述的)中，类毒素A和类毒素B根据描述的方法制备，合并和配制为冻干组合物。在疫苗接种前，组合物被重新构成并加入佐剂。一组仓鼠被给予安慰剂。制备组合物(100 pg/剂量)的人剂量(HD)的4个不同的稀释液，与4个其它仓鼠组一一对应。给予的组合物(即，安慰剂或HD稀释液)在X-轴上确定。给予致死攻击剂量的艰难梭状芽孢杆菌后，测定各组的%存活率(Y-轴)，如以图表显示的。

图4A-B图示说明对于如在实施例3中描述的许多代表性毒素型临床分离株的细胞毒性测定结果(使用IMR-90细胞)。在小图A中，计算的IC50结果对存在于细菌上清液中的毒素A的浓度(µg/ml)作图。在小图B中，计算的IC50结果对存在于细菌上清液中的毒素B的浓度(µg/ml)作图。

图5提供如在实施例3中描述的交叉-中和测定结果。测定了疫苗特异性抗体中和得自各种毒素型代表性临床分离株的细菌上清液的各自细胞毒活性的相对功效(RE)。描述了每个分离株针对它们各自的细胞毒性指数的RE。基于用超免疫无关仓鼠血清和异源菌株获得的结果，计算的交叉-血清中和有效阈值RE是5.4。

图6A-B图示说明如在实施例4中描述的，使用艰难梭状芽孢杆菌疫苗菌株作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组(◦)比较，疫苗组(▪)随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是，与安慰剂对照组(◦)比较，疫苗组(▪)随时间推移的百分比存活率。

图7A-B提供如在实施例4中描述的，使用毒素型0 PCR-核糖核酸型012株作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组(◦)比较，疫苗组(▪)随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的百分比存活率。

图8A-B提供如在实施例4中描述的，使用毒素型III PCR-核糖核酸型027株IPP40348作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组(使用包含160µg AlOOH的疫苗)随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是，与安慰剂对照组比较，160µg AlOOH疫苗组随时间推移的百分比存活率。

图9A-B提供如在实施例4中描述的，使用毒素型III PCR-核糖核酸型027株CDC13695#7作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的百分比存活率。

图9C-D提供如在实施例4中描述的，使用毒素型III PCR-核糖核酸型SP041株作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的百分比存活率。

图10A-B提供如在实施例4中描述的，使用毒素型IV PCR-核糖核酸型023株作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的百分比存活率。

图11A-B提供如在实施例4中描述的，使用毒素型V PCR-核糖核酸型078株作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的百分比存活率。

图12A-C提供如在实施例4中描述的，使用毒素型VIII PCR-核糖核酸型017株作为攻击菌株的仓鼠攻击研究的结果。在小图A中显示的是，与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的粪便/评分(腹泻疾病)。在小图B中显示的是与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的百分比存活率。在小图C中显示的是与安慰剂对照组比较，疫苗组随时间推移的百分比体重变化。

本公开内容的概述

本公开内容提供包含艰难梭状芽孢杆菌抗原的组合物，其用作对抗多个艰难梭状芽孢杆菌菌株/毒素型，特别是对抗表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(“CDT”；例如，来自其亚单位CDTa和/或CDTb)的那些和不表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素的那些的治疗性和/或保护性免疫原性组合物(例如，疫苗)。在优选的实施方案中，组合物不包含CDT或其亚单位(或其任何免疫原)。对本领域普通技术人员将是显而易见的，其它实施方案在本公开内容中提供。

详细描述

本公开内容提供针对多个艰难梭状芽孢杆菌菌株和/或“毒素型” (即，表达毒素A (例如，从TcdA基因表达)、毒素B (例如，从TcdB基因表达)和/或表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(“CDT”/“二元毒素”，从CDTa和/或CDTb基因表达)，或不表达那些蛋白的任何一种或多种)免疫宿主的方法。表达毒素A的菌株和/或毒素型在此被确定为“A⁺”；不表达毒素A的菌株在此被确定为“A^-”。表达毒素B的菌株和/或毒素型在此被确定为“B⁺”；不表达毒素B的菌株在此被确定为“B^-”。表达CDT的菌株和/或毒素型在此被确定为“CDT⁺”；不表达CDT的菌株在此被确定为“CDT^-”。菌株和/或毒素型可通过其表达这些标记以任何组合(例如，A⁺B⁺CDT⁺、A⁺B⁺CDT^-、A⁺B^-CDT⁺、A⁺B^-CDT^-、A^-B⁺CDT^-、A^-B^-CDT⁺等)的任何一种或多种来表征。例如，毒素型O是A⁺B⁺CDT^-，毒素型III是A⁺B⁺CDT⁺，毒素型IV是A⁺B⁺CDT⁺，毒素型V是A⁺B⁺CDT⁺，和毒素型VIII是A^-B⁺CDT^-。

艰难梭状芽孢杆菌毒素型的各种类型可使用，例如，用于毒素型测定的方法例如基于以下的那些方法鉴定：使用聚合酶链反应(PCR)的PaLoc区(毒素表达基因座)的限制性片段长度多态性(RFLP)，以鉴定毒素基因tcdA的A3片段和毒素基因tcdB的B1片段。例如，一些菌株在TcdA和/或TcdB基因中可显示出与参考菌株VPI10463 (疫苗菌株ATCC43255)比较的较小变化。PCR核糖核酸型也可通过利用16S和23S核糖体DNA (rDNA)之间的基因间间隔区(ISR)的变异性测定。变异性，与存在于基因组中的rDNA的多个拷贝组合，导致在不同菌株中PCR扩增后各种扩增子的扩增。到目前为止，PCR核糖核酸分型能够鉴定超过400种不同的PCR核糖核酸型。基于多-基因座-序列的分型方法也可使用，其中大致范围在300和500bp之间并表现出7个管家基因(MLST 7HG)的DNA片段被测序。这种方法允许鉴定克隆的复合物；至少5个谱系已通过该方法鉴定。在此描述的组合物可被用来治疗性或预防性地接种，对抗通过任何一种或多种这些技术，或本领域普通技术人员可利用的任何其它技术鉴定的任何一种或多种菌株和/或毒素型。

也提供制备梭菌属类毒素的方法，通过这些方法制备的梭菌属类毒素和包含这些类毒素的组合物。本文具有特别意义的是艰难梭状芽孢杆菌毒素A和/或B和/或其衍生物(例如遗传解毒版本、截短形式等)。为了本公开内容的目的，毒素A和/或毒素B可包括可使用本领域的标准技术鉴定为毒素A和/或毒素B的任何艰难梭状芽孢杆菌毒素。示例性技术可包括，例如，免疫分析例如ELISA、斑点印迹(dot blot)或体内测定。可用于进行这样的鉴定的试剂可包括，例如，抗-毒素A兔多克隆抗血清(例如，Abcam^®产品号ab35021或Abcam^®产品号ab93318)或抗-毒素A小鼠单克隆抗体(例如，Abcam^®产品号ab19953 (mAb PCG4)或ab82285 (mAb B618M)的任何一种)、抗-毒素B兔多克隆抗血清(例如，Abcam^®产品号ab83066)或抗-毒素B小鼠单克隆抗体(例如，Abcam^®产品号ab77583 (mAb B428M)、ab130855 (mAb B423M)或ab130858 (mAb B424M)的任何一种) (全部从Abcam^®(Cambridge, MA)获得)。本文提供通过一个或多个以下步骤，生产在高温(例如，37℃)下稳定的且含有少量甲醛的艰难梭状芽孢杆菌类毒素组合物的方法：1) 提供包含毒素A和毒素B的艰难梭状芽孢杆菌培养物；2) 纯化来自培养物的毒素A和毒素B，以提供每种类毒素的独立的组分；3) 通过在适宜的温度(例如，约17-32℃的任何温度(例如，约25℃))下，与约0.15%-约0.5%的甲醛(w/v)的任一个(例如，对于类毒素A，约0.2%-0.8%的任一个，例如约0.2% (例如，约0.21%)和/或对于类毒素B，约0.4% (例如，约0.42%))一起孵育适宜的时间量(例如，约2-约21天)来灭活纯化的毒素A和纯化的毒素B (例如，以致各毒素被灭活为相应的类毒素)，以分别生成类毒素A和类毒素B组分；和，4) 合并类毒素以生产类毒素免疫学组合物和/或疫苗，其仅含有“残留量”的甲醛(例如，约0.0001%-0.025%的任一个，例如约0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.01%、0.016%、0.02%或0.025% (w/v)的任一个(优选约0.004%或0.008%的任一个))。虽然组合物中包含的甲醛量通常根据组合物的百分比(重量/体积(“w/v”))提及，基于某些因素例如蛋白浓度调整化学计算可能是重要的。例如，如本文预期的甲醛的合适浓度是将提供各个毒素A和/或毒素B多肽内的分子间交联，而不显著地使多肽彼此交联(例如，不产生分子间交联)的浓度。如在实施例中所示，包含0.5 mg/ml毒素A的组合物可仅需要0.21% (w/v)甲醛。然而，包含较高浓度的毒素A的组合物可需要更高或更低浓度的甲醛，以产生需要的分子内交联(例如，类毒素化(toxoiding))，而不产生大量的分子间交联。相同原理可应用于毒素B的类毒素化。用于特定组合物的合适的条件可由本领域普通技术人员使用在此描述的技术或本领域可利用的技术确定。例如，甲醛的特定量是否对组合物中特定毒素的类毒素化有效，可使用在实施例部分描述的细胞毒性测定、阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱、胺含量分析、抗原性和免疫原性测定的任何一种或多种测定。

还应该理解在此使用甲醛时，其它类似的试剂因而可如由本领域普通技术人员确定的那样进行替代。例如，在一些实施方案中，甲醛可被戊二醛替代。虽然可需要不同的浓度进行这样的替代，用于这样替代的合适的条件可使用在此描述的技术(例如，在实施例部分描述的细胞毒性测定、阴离子交换色谱、尺寸排阻色谱、胺含量分析、抗原性和免疫原性测定的任何一种或多种)确定。

在某些实施方案中，毒素A可与适宜量的甲醛(例如，约0.2%的甲醛)混合适宜的时间量(例如，约1-60分钟的任何时间，例如10分钟)，以产生类毒素A，然后在适宜的温度(例如，约25℃)孵育适宜的时间量(例如约2-21天，例如约6-12天的任何时间(例如，约6天))。在一些优选的实施方案中，如在本文的实施例中所示，毒素A可在包含约0.21% (w/v)甲醛的制剂中，通过于约25℃孵育毒素A约6至约12天转化为类毒素A。在某些实施方案中，毒素B可与适宜量(例如，约0.42%)的甲醛混合适宜的时间量(例如，约1-60分钟的任何时间，例如10分钟)，然后在适宜的温度(例如，约25℃)孵育适宜的时间量(例如，约2-30天，例如约13-21天的任何时间(例如，约21天))以产生类毒素B。在一些优选的实施方案中，如在本文的实施例中所示，毒素B可通过在包含约0.42% (w/v)甲醛的制剂中，于约25℃孵育混合毒素B约13至约20天转化为类毒素B。甲醛可以所需量从37%甲醛的储备溶液引入(例如，无菌地)包含毒素A或毒素B的溶液，接着孵育一段时间(例如，5-10分钟)并于适宜的温度贮存适宜的时间(例如，2-8℃持续多天)。在某些实施方案中，纯化的毒素A和纯化的毒素B可以合并，然后与适宜量(例如，约0.42%)的甲醛混合适宜的时间量(例如，约1-60分钟的任何时间，例如10分钟)，然后在适宜的温度(例如，约25℃)孵育适宜的时间量(例如，约2-30天，例如约13-21天的任何时间(例如，约21天)，以产生类毒素A和B。类毒素可被包含在合适的缓冲液(例如，约20-150 mM的任何磷酸盐(例如，100 mM)，pH 7.0)中。然后类毒素A和类毒素B组分可在合适的缓冲液中合并(例如，通过渗滤进入适宜的缓冲液例如20 mM柠檬酸盐，pH 7.5，5%-8%蔗糖(例如，8%))，以生产类毒素A/B免疫学组合物和/或疫苗(例如，其在此可统称为“组合物”)。这样的组合物也可使用标准技术，以冻干形式制备。因此，在一些实施方案中，类毒素免疫学组合物可呈现为可含有，例如，比由此重新构成的组合物(例如，药物产品)更高浓度的甲醛的冻干形式。例如，冻干组合物可包含约0.016%甲醛(w/v)，但为给予宿主而重新构成后，组合物(例如，药物产品)可包含少于0.016%的甲醛(w/v) (例如，约0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.01 (w/v)的任一个)。在一些实施方案中，然后，类毒素A/B免疫学组合物和/或疫苗(例如，“药物产品”)可包含约0.0001%-0.025%的任一个的甲醛(w/v) (例如，约0.001%、0.002%、0.004%、0.005%、0.006%、0.007%、0.008%、0.01%、0.016%、0.02%或0.025% (w/v)的任一个) (例如，“残留的甲醛”)。已发现药物产品中包含的残留甲醛的特别有益之处在于，它可减少和/或防止类毒素A和/或类毒素B分别逆转为毒素A或毒素B，其中组合物维持在较高温度(例如，高于4℃例如室温或37℃)一段时间(例如，约6周)。要注意，在一些情况下，可增加甲醛量以减少毒素灭活时间。最终组合物(例如，免疫学组合物、疫苗)将仅包含残留量的甲醛。如在实施例中所示，这些方法令人吃惊地提供含有免疫学类毒素A/B的组合物，其具有有利的生物化学和功能特性。

在某些实施方案中，在本文描述的方法中的任何方面，调节可能干扰其中甲醛的官能性的某些缓冲液组分的量可能是有益的。例如，TRIS具有可有效地与蛋白竞争甲醛介导的修饰，从而降低反应混合物中的有效的甲醛浓度的胺基。因而维持TRIS在组合物中的量可能是有益的，其中毒素和/或类毒素以低水平产生。例如，毒素制剂中残留的TRIS值可降低至更合适的水平(例如，低于约1-约5 µg/ml (例如，1 µg/ml (例如，低于检测限)或5µg/ml)。如在实施例中所示的，毒素制剂中残留的TRIS值通过使用例如切线流过滤(例如，用平台Millipore PES50K) (例如，与中空-纤维或其它类型的膜相反)，将纯化的毒素A和/或纯化的毒素B渗滤进入25mM Tris (例如，以除去MgCl₂)，然后进入磷酸盐缓冲液(例如，100 mM PO₄，pH 7)，可令人吃惊地降低至更合适的水平(例如，低于1 µg/ml)。在一些实施方案中，生成的更低浓度的TRIS可允许更有效地调整进行类毒素化过程所需的甲醛量。其它实施方案可涉及，例如，使用不含有胺基的缓冲液(例如，MEM、乙酸盐、柠檬酸盐)和/或pH-控制的水性溶液(例如，盐水或水，其中可加入酸或碱)。

因此，在一些优选的实施方案中，Tris可用另一种缓冲液例如磷酸盐缓冲液替换。例如，如在实施例中描述的，澄清的艰难梭状芽孢杆菌培养物滤液可经处理(例如，浓缩和渗滤，例如通过切线流过滤)至Tris缓冲液(例如，50 mM Tris/NaCl/0.2mM EDTA/1mM DTT，pH 7.5)。然后生成的溶液可经过滤(例如，使用膜滤器)，调整硫酸铵浓度至约适宜的量(例如，调整至约0.4M)，然后可执行进一步的过滤(例如，使用膜滤器)。然后可使含有艰难梭状芽孢杆菌毒素A和毒素B的这种水性溶液经历疏水相互作用色谱，并且毒素结合于尺寸排阻(例如，琼脂糖)柱，其可用Tris缓冲液洗涤。然后艰难梭状芽孢杆菌毒素可用含有DTT和IPA的Tris缓冲液洗脱，合并并使用WFI调整至约9mS或更少的导电性。然后这些艰难梭状芽孢杆菌毒素(在合并的洗脱液中)可通过另一种方法，例如涉及用Tris缓冲液平衡的阴离子交换色谱进一步纯化。然后毒素A可用低盐Tris缓冲液洗脱，而毒素B用高盐Tris缓冲液洗脱。然后含有纯化的毒素A或纯化的毒素B的溶液可各自被浓缩和渗滤到磷酸盐缓冲液例如100mM PO₄，pH 7 (其中残留的TRIS值优选地为低于约1-约5 µg/ml)中。已发现更低浓度的磷酸盐(例如，20 mM)可能不是适宜的并可导致增加的多聚化(当可能时，其应该被最小化)。因此，优选的合适的磷酸盐缓冲液可包括从约20 mM以上至高达约200 mM的任何浓度的磷酸盐，例如，约25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、150、155、160、165、170、175、180、185、190、195或200 mM的任何浓度。然后如在本文的实施例中所示，毒素A可通过将毒素A与包含在100 mM PO₄ (pH 7)中的约0.21% (w/v)甲醛的制剂于约25℃混合约6天，转化为类毒素A。而在一些优选的实施方案中，如在本文的实施例中所示，毒素B可通过使毒素B与在100 mM PO₄ (pH 7)中的约0.41%(w/v)甲醛的制剂于约25℃混合约13天，转化为类毒素B。如由本领域普通技术人员将理解的，也期望其它合适的缓冲液。

本领域普通技术人员通过分析特定条件，以确定组合物的特征是否为可接受的，可确定它们(例如，缓冲液(或其化合物)、时间、温度)是否适合用于制备和/或维持类毒素A和/或类毒素B组合物。例如，组合物可使用细胞毒性测定(例如，使用IMR-90细胞系(见，例如实施例)或非洲绿猴肾细胞(Vero cells))、阴离子交换高效液相色谱(AEX-HPLC)、尺寸排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、采用在280nm处的吸光度测量的浓度、逆转分析(见，例如实施例)，和/或体内效能测定(例如，如在实施例中描述的仓鼠效能测定)测试。在有利的条件下制备的组合物通常可显示出以下的任何一种或多种：对在细胞毒性测定中监测的细胞有很少的细胞毒性至没有细胞毒性；AEX-HPLC和/或SEC-HPLC色谱显示有很少的至没有(或在一种条件对比另一种条件下至少更少，更少是优选的)类毒素的多聚化；ELISA/A280值接近于1 (例如，如与在通常可显示出ELISA/A280值大于1的不利条件下制备的组合物比较的)；在测试期中有很少的至没有从类毒素至毒素的逆转；和/或在体内测定期间的免疫原性(例如，在仓鼠效能测定中4.8或更高的Log10效价)。其它方法也可被用来进行这些测定，如可由本领域普通技术人员确定的。

在此描述的方法适用于事实上来自艰难梭状芽孢杆菌的任何菌株的毒素。艰难梭状芽孢杆菌的优选的菌株是产生毒素A和/或B的菌株并包括例如，但不限于毒素型0 (A⁺B⁺CDT^-；例如，VPI10463/ATCC43255 (PCR核糖核酸型087), 630；PCR核糖核酸型001、002、012、014/020等)、III (A⁺B⁺CDT⁺；例如，027/NAP/B1、NAP1/027/BI17、IPP4038 (PCR核糖核酸型027)、CDC 13695#7 (PCR核糖核酸型027)、SP041 (PCR核糖核酸型027))、IV (A⁺B⁺CDT⁺；例如，NK91 (PCR核糖核酸型023))、V (A⁺B⁺CDT⁺；例如，BAA-1875 (PCR核糖核酸型078/126))和/或VIII (A^-B⁺CDT^-；例如，ATCC43598 (PCR核糖核酸型017))的菌株。在一些实施方案中，所述方法提供用于(例如，治疗性或预防性地)对抗所有毒素型0、III、IV、V和VIII的免疫。在一些实施方案中，所述方法提供用于对抗CDT⁺和CDT^-菌株/毒素型二者的免疫。所述方法也适用于使用重组方法生产的艰难梭状芽孢杆菌毒素，除了本领域已认识到从重组毒素制备的类毒素不能提供针对CDT⁺艰难梭状芽孢杆菌菌株的免疫力外，除非CDT亚单位被包含在疫苗中(见，例如，WO 2013/112867)。可使用本领域已知的方法(例如，美国专利号6,669,520)，从艰难梭状芽孢杆菌的培养物滤液纯化毒素(例如，毒素A和/或毒素B)。从艰难梭状芽孢杆菌的培养物滤液纯化毒素的示例性方法在本文的实施例中描述。优选地毒素具有约75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高的任何纯度。毒素可在一起或分开灭活。例如，纯化的毒素可以所需的毒素A:毒素B的比例(例如，3:1、3:2、5:1、1:5)混合，然后灭活或可分开灭活。优选地，毒素被分开灭活以产生类毒素。术语“类毒素”在此被用来描述已部分地或完全地经化学处理灭活的毒素。如果毒素具有比未处理的毒素更小的毒性(例如，100%、99%、95%、90%、80%、75%、60%、55%、50%、25%或10%或更少的毒性)，如例如，通过体外细胞毒性测定或通过体内测定测定的，则其被认为是灭活的。如在此公开的，毒素使用甲醛处理灭活。其它可能的化学方法包括例如，戊二醛、过氧化物、ß-丙内酯或氧处理。

灭活可通过使毒素与防止类毒素逆转为毒素的量的甲醛一起孵育来进行。逆转可通过在含有纯化的毒素A或毒素B的缓冲液中包含合适量的甲醛防止。在缓冲液中的甲醛的量可被调整以维持适宜浓度的甲醛来防止逆转。为此，残留的浓度的甲醛可包含在缓冲液(和/或药用组合物)中。残留浓度的甲醛是防止逆转和/或存在对给予在此描述的组合物的人群的低风险副作用的甲醛。例如，残留的甲醛浓度可在从约0.0001%至0.025%甲醛(w/v)(例如，约0.004%、0.008%、0.016%，或约0.01%的任何浓度)、约0.001%-约0.020% (w/v)、约0.004%-约0.020% (w/v) (例如，约0.016% ± 0.04%)，或约0.004%-0.010% (w/v) (例如，约0.008%)等的任一个的范围内。防止逆转通常于37℃贮存后，通过如在此描述的体外测定(见，例如在实施例中的细胞毒性测定)，未观察到可检测的细胞毒性来发现。“基本上”防止逆转通常意指于37℃贮存后，通过如在实施例中描述的体外测定，10%或更少的类毒素逆转为毒素。合适的体外细胞毒性测定可以是使用，例如，非洲绿猴肾细胞的基于细胞的荧光测定。另一种合适的体外细胞毒性测定可使用IMR90细胞(例如，ATCC^®登记号CCL-186)执行。试验材料(例如，类毒素)的毒性可被确定为与它们的正常有条纹的形态学对比，50%的细胞变成圆形的最小浓度(例如，MC-50)。如在本文的实施例中描述的，包含通过在此描述的方法制得的类毒素和0.008%或更少的甲醛的疫苗组合物显示于37℃贮存后，经体外测定无可检测的细胞毒性。理化分析(例如，阴离子交换色谱)也可被用来确定逆转，但体外细胞毒性测定可能有更多的信息量。类毒素的效能也可通过测量log10抗-毒素A或抗-毒素B IgG效价的均值的仓鼠体内效能测定来测量。

在一些实施方案中，适宜的甲醛量可从37%甲醛的溶液加入到毒素中。在加入甲醛之前，毒素优选在合适的缓冲溶液(例如，100 mM磷酸钠缓冲液，pH 7.0)中。其中的毒素浓度可以是，例如，约0.1-约5 mg/mL (例如，0.5 mg/mL)。为开始灭活过程，毒素首先可与合适的浓度的甲醛(例如，从约0.1%至约0.6%)混合一段合适的时间(例如，10分钟)。例如，纯化的毒素A (0.5 mg/ml纯化的毒素A，在100 mM磷酸钠，pH 7.0中)可与约0.2%甲醛混合约10分钟。而纯化的毒素B (例如，0.5 mg/ml纯化的毒素B，在100 mM磷酸钠，pH 7.0中)可与约0.4%甲醛混合约10分钟。然后这样的混合物可被过滤(例如，使用0.2 µm膜滤器)，以除去可影响通过280 nm的吸光度的蛋白浓度的小蛋白聚集体(例如，允许以预定的类毒素A:类毒素B比例的药用组合物的精确制剂)。然后可通过孵育混合物约1至约21天(例如，约2天、约6天，或约13天)继续灭活。例如，毒素A混合物可于合适的温度(例如，约25℃)孵育13天或更少(例如，约2天或约6天)。和毒素B混合物可于合适的温度(例如，约25℃)孵育21天或更少(例如，约2天、约6天，或约13天)。用这种方法，可提供类毒素A和类毒素B的制剂。这样的制剂通常包含至少约90%、95%、99%或100%的任一个的类毒素(例如，灭活的毒素)。

虽然这些类毒素制剂可直接与缓冲液混合，优选所述制剂被浓缩和渗滤进入适宜的缓冲溶液中。优选地，浓缩和渗滤使用切线流过滤进行以最大限度地减少蛋白质剪切，同时确保除去甲醛并换成缓冲液。缓冲液优选地包含至少一种或多种增加类毒素的稳定性和/或延迟或降低类毒素的聚集的药学上可接受的赋形剂。适合使用的赋形剂包括例如但不限于糖(例如，蔗糖、海藻糖)或糖醇(例如，山梨醇)，和盐(氯化钠、氯化钾、氯化镁、乙酸镁)或其组合。另外地，合适的赋形剂可以是在例如，美国专利公布号2011/045025 (Ser.No. 12/667,864)中描述的任何赋形剂。灭活后，灭活的毒素(即，类毒素)的溶液可被浓缩和/或超滤和/或渗滤并储存在pH 8.0或更少(例如，6.5-7.7例如约6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9或8.0的任一个)的适宜的缓冲液(例如，但不限于，约5至约100 mM (例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95，或100 mM的任何浓度的柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、碳酸盐、碳酸氢盐等缓冲剂) (例如，20 mM柠檬酸盐，pH 7.5)中，其防止，或基本上防止、逆转类毒素成为细胞毒性形式(例如，成为毒素)。示例性缓冲液可以是，例如，20 mM柠檬酸盐，pH 7.5，5%-8%蔗糖，含有合适量的甲醛(例如，0.016% (w/v))。其它缓冲液等也可能是合适的，如将为本领域普通技术人员理解的。

类毒素可被配制用作药用组合物(例如，免疫原性和/或疫苗组合物)。例如，包含艰难梭状芽孢杆菌类毒素的组合物可被制备为用于通过类毒素在药学上可接受的稀释剂(例如，生理盐水)中的悬浮液给予，或通过类毒素与药学上可接受的载体结合给予。这样的药物制剂可包含一种或多种为本领域已知的赋形剂(例如，稀释剂、增稠剂、缓冲剂、防腐剂、佐剂、去垢剂和/或免疫刺激物)。合适的赋形剂应与类毒素和与佐剂(在有佐剂的组合物中)相容，其实例对本领域普通技术人员而言是已知的且可获得的。组合物可呈现为液体形式，或冻干(如按照标准方法)或泡沫干燥的(如例如在美国专利公布号2009/110699中描述的)。示例性冻干疫苗组合物可包含例如，类毒素A和B、20 mM柠檬酸盐、8%蔗糖、0.016%甲醛，pH 7.5。

为制备用于给予的疫苗，干燥的组合物可用水性溶液例如，注射用水，或合适的稀释剂或缓冲溶液重新构成。在某些实例中，稀释剂包括如在此描述的甲醛。稀释剂可包括含或不含甲醛的佐剂(例如，氢氧化铝)。示例性稀释剂可以是NaCl和氢氧化铝的水溶液。这样的稀释剂可被用来重新构成干燥的组合物。药用组合物可包含剂量约10-150 µg/mL (例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150 µg/mL的任一个)的类毒素。通常，用于注射的剂量体积是约0.5 mL或1.0 mL。剂量可以增加或减少以调节在受试者中诱导的免疫反应。类毒素可在佐剂的存在或不存在下给予，其量可由本领域技术人员确定。所用的佐剂包括铝化合物，例如氢氧化铝、磷酸铝和羟基磷酸铝。例如，在实施例描述的动物研究中，组合物包含5µg的类毒素A和类毒素B (二价类毒素)和20 µg或160 µg佐剂(每免疫剂量，相当于1/20的人剂量)。类毒素和佐剂的其它组合可能是合适的，如将为本领域普通技术人员理解的。

免疫学和/或疫苗组合物可通过由本领域技术人员确定是适宜的量和方案，经皮(例如，肌内、静脉内、腹膜内或皮下)、透皮、粘膜途径给予患有症状的艰难梭状芽孢杆菌感染，或处于发生有症状的艰难梭状芽孢杆菌感染的风险中的受试者。疫苗可给予1、2、3、4或更多次。当给予多个剂量时，剂量可以是彼此分开给予的，例如，1周、1个月或数月。因此，本公开内容也提供通过给予宿主药用组合物，引起对抗毒素、类毒素和/或包含所述毒素或类毒素的传染性生物体的免疫反应的方法。这可通过给予在此描述的药用组合物(例如，免疫原性组合物和/或疫苗)至受试者，以使类毒素暴露于受试者的免疫系统实现。因此，免疫原性组合物和/或疫苗可被用来防止和/或治疗有症状的艰难梭状芽孢杆菌感染。

组合物可被包含在药剂盒(例如，疫苗药剂盒)中。例如，药剂盒可包含含有在此描述的呈干燥形式的组合物的第一容器和含有用于重新构成组合物的水性溶液的第二容器。药剂盒可任选地包括用于给予重新构成的液体形式的组合物的装置(例如，皮下注射器、微针阵列)和/或用药说明书。这样的药剂盒是可能的，因为已发现如在此描述的组合物可在适中的温度(例如，在约2-8℃)和较高温度(例如，在约15℃、25℃、37℃或更高)的贮存期后具有良好的稳定性并保持无细胞毒性。在某些实例中，如在下文进一步描述的，组合物在37℃贮存后保持无细胞毒性(例如，无逆转证据)。

因此，本公开内容提供通过例如，与约0.15%-0.5%甲醛(w/v)于约17-32℃一起孵育约2-约21天，灭活纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和/或纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B，产生艰难梭状芽孢杆菌类毒素的方法。在一些实施方案中，毒素A可与约0.2%甲醛于约25℃一起孵育约2天以产生类毒素A，和/或毒素B与约0.4%甲醛于约25℃一起孵育约13天以产生类毒素B。包含通过这样的方法制备的类毒素A和/或类毒素B的组合物也被提供。还提供通过合并纯化的艰难梭状芽孢杆菌类毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌类毒素B与包含残留量(例如，约0.004%、0.008%，或0.016% (w/v))的甲醛的组合物，用于制备包含纯化的艰难梭状芽孢杆菌类毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌类毒素B的免疫原性组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法可提供艰难梭状芽孢杆菌类毒素A和/或纯化的艰难梭状芽孢杆菌类毒素B的组合物，其于37℃持续至多约6周是稳定的。因此，在一些实施方案中，在此描述的方法也可包括通过与约0.15%-0.5%甲醛(w/v)于约17-32℃一起孵育约2-约21天，灭活纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A或纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B；和，合并艰难梭状芽孢杆菌类毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌类毒素B与包含残留量的甲醛的组合物。通过这样的方法制备的艰难梭状芽孢杆菌类毒素A和B组合物可于37℃稳定至多约6周。在这样的组合物中的甲醛的残留量可以是约0.004%、0.008%或0.016% (w/v)的任一个。组合物也可包含约20 mM柠檬酸盐(pH 7.5)、4%-8%蔗糖，和0.016%甲醛。在一些实施方案中，组合物可被冻干。这些方法也可包括提供包含毒素A和毒素B的艰难梭状芽孢杆菌培养物和从培养物纯化毒素A和毒素B。根据这些方法生产的艰难梭状芽孢杆菌类毒素A或B也被提供。在一些实施方案中，这样的组合物是疫苗(例如，提供对抗有症状的艰难梭状芽孢杆菌感染的保护性、预防性和/或治疗性反应)。组合物(例如，疫苗组合物)可包含A:B比例为5:1-1:5例如3:1或3:2的类毒素A和类毒素B。在一些实施方案中，组合物可被冻干、冷冻干燥、喷雾干燥，或泡沫干燥，或呈液体形式。这样的组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲剂例如柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液，或pH-控制的水性溶液，和/或一种或多种糖(例如，蔗糖、海藻糖)和/或糖醇(山梨醇)。其它实施方案对本领域普通技术人员将是显而易见的。

在一些实施方案中，本公开内容提供针对表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株和不表达CDT的艰难梭状芽孢杆菌菌株免疫宿主的方法，该方法包括给予宿主包含通过与甲醛(w/v)与约17-32℃一起孵育约2-约21天灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B的免疫原性组合物，其中毒素A用0.15%-0.5%甲醛(w/v)灭活和毒素B用0.15%-0.8%甲醛(w/v)灭活。所述菌株可具有任何毒素型和核糖核酸型。所述菌株可具有毒素型0、III、IV、V和/或VIII，优选地所有的毒素型0、III、IV、V和VIII。在优选的实施方案中，纯化的毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B源自不表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株，例如艰难梭状芽孢杆菌菌株VPI10463/ATCC43255。

本公开内容也提供通过给予宿主组合物在宿主中诱导抗体的方法，所述抗体具有对一种或多种表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株的特异性，所述组合物包含源自不表达CDT的艰难梭状芽孢杆菌菌株(例如，艰难梭状芽孢杆菌菌株VPI10463 / ATCC43255)的灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B。在一些实施方案中，在给予组合物后产生的抗体可以是中和抗体，如通过毒素中和测定法确定的(见，例如实施例)。在一些实施方案中，抗体可显示出如使用这样的测定法所测定的至少5.4的相对功效(RE)。在一些实施方案中，所述方法可诱导抗体的生产，所述抗体中和由具有选自0、I、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和XII的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株产生的毒素A和/或毒素B。在一些实施方案中，毒素型0菌株可具有选自001、002、012、014、020、014/020、014/020/077、106、018和053的PCR-核糖核酸型；毒素型III菌株可具有PCR-核糖核酸型027或075；毒素型IV菌株可具有PCR-核糖核酸型023；毒素型V菌株可具有选自078、079、122、126和078/126的PCR-核糖核酸型；毒素型VI菌株可具有PCR-核糖核酸型127或66-2；毒素型VII菌株具有PCR-核糖核酸型66-2；毒素型VIII菌株可具有PCR-核糖核酸型017；毒素型IX菌株具有PCR-核糖核酸型019；毒素型XII菌株可具有PCR-核糖核酸型056；和/或艰难梭状芽孢杆菌菌株可具有PCR-核糖核酸型046或369。在一些实施方案中，抗体可中和由具有选自0、III、IV、V和VIII的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株，例如这些毒素型的每一种的菌株生产的毒素A和/或毒素B (即，抗体中和由艰难梭状芽孢杆菌菌株毒素型0、III、IV、V和VIII产生的毒素A和/或毒素B)。在一些这样的实施方案中，抗体毒素型0菌株可具有PCR-核糖核酸型012，毒素型III菌株可具有PCR-核糖核酸型027，毒素型IV菌株可具有PCR-核糖核酸型023，毒素型V菌株可具有PCR-核糖核酸型078，和毒素型VIII菌株可具有PCR-核糖核酸型017。在一些实施方案中，抗体可中和毒素型III、IV和V的艰难梭状芽孢杆菌菌株产生的毒素A和/或毒素B。在一些这样的实施方案中，毒素型III菌株可具有PCR-核糖核酸型027，毒素型IV菌株可具有PCR-核糖核酸型023，和/或毒素型V菌株可具有PCR-核糖核酸型078。本公开内容也涵盖其它实施方案，如将由本领域普通技术人员所理解的。

本公开内容也提供通过给予宿主一种组合物，为宿主对抗一种或多种表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株进行免疫和/或接种疫苗的方法，所述组合物包含源自不表达CDT的艰难梭状芽孢杆菌菌株(例如，艰难梭状芽孢杆菌菌株VPI10463 / ATCC43255)的、灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B。在一些这样的实施方案中，宿主可被分别免疫和/或疫苗接种，以对抗一种或多种具有选自0、III、IV、V和/或VIII的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株。在一些这样的实施方案中，可对宿主进行针对一种或多种具有选自III、IV和V的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株，例如这样的毒素型的每一种的菌株的免疫和/或疫苗接种(即，宿主分别针对具有毒素型III、IV和V的艰难梭状芽孢杆菌菌株进行免疫和/或疫苗接种)。在一些实施方案中，毒素型III菌株可具有PCR-核糖核酸型027，毒素型IV菌株可具有PCR-核糖核酸型023，和毒素型V菌株可具有PCR-核糖核酸型078。在一些实施方案中，对抗由艰难梭状芽孢杆菌引起的疾病和死亡的显著保护作用可提供给由这样的方法产生的宿主。在一些实施方案中，保护作用(例如，免疫和/或疫苗接种)可使用金黄叙利亚仓鼠模型确定。在一些实施方案中，组合物可给予宿主至少3次，其可用充分的时间段例如约7天、10天或14天(2周)的任何时间分开，而给予剂量之间的时间可以是相同或不同的。虽然给予可通过任何途径给予，但在一些实施方案中，组合物可经由肌内途径给予。在一些实施方案中，仓鼠组用艰难梭状芽孢杆菌的CDT⁺菌株攻击后的存活率是约58%-约100%。在一些实施方案中，保护作用可以是统计学意义显著的。在一些实施方案中，统计学显著性可通过具有对数秩检验(log-rank test)的Kaplan-Meïer方法和/或双侧费希尔精确检验(bilateral Fisher exacttest)确定(例如，对于仓鼠组：用Kaplan-Meïer对数秩检验，p=0.0001，而用双侧费希尔精确检验，p=0.0004；用Kaplan-Meïer对数秩检验，p<0.001，而用双侧费希尔精确检验，p-值=0.005；用Kaplan-Meïer对数秩检验和双侧费希尔精确检验二者，p-值≤ 0.0001；和/或用Kaplan-Meïer对数秩检验，p-值=0.0020，而用双侧费希尔精确检验，p=0.0046)。本公开内容也涵盖其它实施方案，如将由本领域普通技术人员所理解的。

因此，在一些实施方案中，组合物包含灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B，其源自不表达CDT或不包含CDT或其亚单位的艰难梭状芽孢杆菌菌株。在一些实施方案中，艰难梭状芽孢杆菌毒素A和毒素B可源自艰难梭状芽孢杆菌毒素型0。在一些实施方案中，纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B可源自艰难梭状芽孢杆菌菌株VPI10463 / ATCC43255。在一些实施方案中，毒素A和毒素B可通过与甲醛于约15-32℃一起孵育约2-约21天灭活，其中毒素A可用0.15%-0.5%甲醛(w/v)灭活和毒素B可用0.15%-0.8%甲醛(w/v)灭活。在一些实施方案中，组合物可包含约0.001%-0.020%甲醛(例如，约0.004%、约0.008%或约0.016%甲醛)。在一些实施方案中，类毒素A和类毒素B可以5:1-1:5的A:B比例(例如，约3:1或3:2)存在于组合物中。在一些实施方案中，组合物可以是冷冻干燥、喷雾干燥，或泡沫干燥的。在一些实施方案中，组合物可以液体形式呈现。在一些实施方案中，组合物可包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，组合物可包含柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、碳酸盐，或碳酸氢盐缓冲液，或pH-控制的水性溶液和/或一种或多种糖和/或糖醇。在一些实施方案中，组合物可包含蔗糖和/或柠檬酸盐。在一些实施方案中，组合物可还包含佐剂，例如包含铝的佐剂(例如，磷酸铝或氢氧化铝)。在一些实施方案中，组合物可包含从约20 µg至约160 µg的氢氧化铝。本公开内容也涵盖其它实施方案，如将由本领域普通技术人员所理解的。

“纯化的”毒素通常意指毒素已经例如从培养物滤液分离并使用本领域已知的方法至少纯化至某种程度。纯化毒素的示例性方法例如在本文描述。在一些实施方案中，纯化的毒素可具有约75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高的任何纯度。类似地，“纯化的”类毒素可以是具有约75%、80%、85%、90%、95%、99%或更高的任何纯度的类毒素。

术语“约”、“大约”等，当在数值的列表或范围的前面时，独立地指在列表或范围中的各个单独的值，犹如在列表或范围中的各个单独的值的前面紧挨着那个术语。所述术语意指所指的值精确地为接近于，或类似于相同的值。例如，术语“约”或“大约”可包括指定值的值+/-10% (例如，“约30℃”可指27℃-33℃之间的任何值，包括，但不限于30℃)。

术语“受试者”和“宿主”在此可互换使用。

术语“孵育”、“混合”和“贮存” (或其同义词和/或派生词)可互换使用。例如，毒素可与包含甲醛的溶液一起孵育。这样一种孵育可任选地意指，例如，组合物通过运动(例如，使用混合棒等)有效地合并或基本上维持在一种静止状态。

任选的或任选地意指随后描述的事件或情形可能发生或可能不发生，并且意指描述包括其中事件或情形发生的例子和其中事件或情形不发生的例子。例如，短语任选地组合物可包含组合意指组合物可包含不同的分子的组合或可不包括组合，以致该描述包括组合和缺乏组合(即，组合的各个成员)二者。

范围在此可表示为从约一个特定值，和/或至约另一个特定值。当表示这样一个范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或至另一个特定值。类似地，当值通过使用先行词约或大约表示为近似值时，应该理解特定值形成另一个方面。还应该理解各范围的端点相对于其它端点，并独立于其它端点，是有意义的。范围(例如，90-100%)意欲包括范围本身以及该范围内的各个独立的值，犹如各个值被单独列出一样。

当术语预防、阻止和防止在此与对给定的疾病给定的治疗结合使用时(例如，预防有症状的感染)，它意味着经治疗的受试者完全不发展为临床上可观察到的水平的疾病，或者疾病发展比他/她未经治疗时更加缓慢和/或严重程度更轻。这些术语并不仅仅限于其中受试者未经历无论什么病症的方面的情形。例如，治疗将被认为预防有症状的感染，如果它导致受试者经历比另外预期的疾病更少和/或更轻微的症状的话。治疗可通过导致受试者仅表现出感染的轻度明显症状来“预防”有症状的感染；它并不意味着必须没有感染微生物进入任何细胞。

类似地，如在此所用的减少、减轻和降低与给定治疗的感染的风险结合使用时(例如，降低有症状的艰难梭状芽孢杆菌感染的风险)，通常指与缺乏治疗(例如，使用公开的类毒素的给予或疫苗接种)时发展感染的对照者或基础水平比较，受试者发展感染更慢或发展至更低的程度。减少有症状的感染的风险可导致受试者仅表现出感染的轻度明显症状或延迟出现感染的症状；它并不意味着必须没有感染微生物进入任何细胞。

在本公开内容中引用的所有的参考文献通过引用以其整体结合到本文中。某些实施方案在以下实施例中进一步描述。这些实施方案仅仅作为实例提供并不打算以任何方式限制权利要求书的范围。

实施例

提供以下实施例仅仅是为了说明的目的并不打算限制本公开内容的范围。当情况可能提出或变得有利时，形式和等同物的替代的变化被涵盖在内。虽然本文已采用特定术语，这样的术语意味着描述性的意义并非用于限制的目的。所用的分子遗传学、蛋白生物化学和免疫学的方法，虽然在本公开内容和这些实施例中未明确描述，但在科学文献中有详细地报告，并且完全在本领域技术人员的能力范围内。

实施例1

一种艰难梭状芽孢杆菌工作种子(菌株VPI10463/ATCC43255)被用来接种包含大豆蛋白胨、酵母提取物、磷酸盐缓冲液和碳酸氢钠，pH 6.35-7.45的预备培养基(SYS培养基)并从4 mL工作细胞库(Working Cell Bank, WCB)小瓶按比例放大至160 L培养物。在达到所需密度和10-12小时孵育期后，对整个160 L的培养物进行处理以澄清和0.2 μm过滤。来自一个以上生产发酵罐的培养物经收获并经历膜过滤(例如，使用Meisner膜滤器)，以除去艰难梭状芽孢杆菌细胞和细胞碎片杂质。生成的澄清培养物滤液通过切线流过滤被浓缩并渗滤到50 mM Tris/NaCl/0.2mM EDTA/1mM DTT (pH 7.5)中。生成的溶液使用膜滤器过滤，硫酸铵的浓度增加(例如，至约0.4M)，然后执行进一步过滤(例如，使用膜滤器)。这种水性溶液含有艰难梭状芽孢杆菌(C. Difficile)毒素A和毒素B。该水性溶液经历疏水相互作用色谱。艰难梭状芽孢杆菌毒素结合于琼脂糖柱。用Tris缓冲液洗涤柱，两部分的艰难梭状芽孢杆菌毒素用含有DTT和IPA的Tris缓冲液洗脱。合并从HIC洗脱的两个毒素部分并使用WFI调整导电性至9mS或更少。艰难梭状芽孢杆菌毒素(在合并的洗脱液中)通过阴离子交换色谱进一步纯化。使洗脱的水性溶液通过阴离子交换柱以使毒素结合于柱。用Tris缓冲液平衡柱，毒素A用低盐Tris缓冲液洗脱，而毒素B用高盐Tris缓冲液洗脱。纯化的毒素A和纯化的毒素B各自被浓缩和渗滤到100 mM PO₄ (pH 7)中。蛋白浓度是约0.5 mg/mL和各毒素的纯度是90%或更高。

将37%甲醛溶液无菌地加入到毒素A渗滤液和毒素B渗滤液的每一种中，以获得0.42%的最终浓度。混合溶液，然后于2-8℃贮存18-22天。灭活后，毒素渗滤液被透析到制剂缓冲液(20 mM柠檬酸盐/5%蔗糖，pH 7.5)中。需要时通过加入37%甲醛溶液调整甲醛浓度。类毒素A和B以3:2 (A:B)的重量比合并并冻干。冻干的产物包含类毒素A (0.24 mg/mL)、类毒素B (0.16 mg/mL)、20 mM柠檬酸钠、5% (w/v)蔗糖和指定浓度的甲醛。

执行逆转分析以观察于37℃经6周时期的潜在逆转。包含类毒素A和类毒素B的组合物用不同量的残留的甲醛(0%、0.008%，和0.016% (w/v))配制，于37℃或者4℃贮存，并每周经由细胞毒性测定测试，持续6周。得自这些研究的数据在表1中列出。于4℃，药物产品通过逆转分析，即使没有残余的甲醛加入。然而，于37℃，需要0.016%残留的甲醛以通过逆转试验。

表1

于37℃贮存的药物产品的逆转分析

4℃	第7天	第14天	第21天	第28天	第35天	第42天
							0%	-	-	-	-	-	-
0.008%	-	-	-	-	-	-
							0.016%	-	-	-	-	-	-
37℃	第7天	第14天	第21天	第28天	第35天	第42天
							0%	+	+	+	+	+	+
0.008%	-	+	+	-	-	-
							0.016%	-	-	-	-	-	-

* - = 未检测到细胞毒性；+ = 细胞毒性

实施例2

在此描述的实验被执行以鉴定将提供于37℃稳定的类毒素的类毒素化方法。艰难梭状芽孢杆菌工作种子(菌株VPI10463/ATCC43255)被用来在无菌一次性袋中接种预备培养基(包含大豆蛋白胨、酵母提取物、磷酸盐缓冲液和D-山梨醇，pH 7.1-7.3)，培养物于35-39℃孵育直至实现目标OD。30L种子1培养物被用来接种在250 L无菌一次性培养袋中的培养基，培养物于35-39℃孵育直至实现目标OD。种子2培养物被用来接种1000L无菌一次性培养袋，培养物于35-39℃孵育直至实现目标OD。培养物从一个以上的生产发酵罐中收获并经历深过滤(例如，使用Pall Depth 700p/80p/0.2um 0.02msq/L)，以除去艰难梭状芽孢杆菌细胞和细胞碎片杂质且同时冷却(例如，约37℃-19℃)以限制蛋白酶活性。生成的澄清培养物滤液被浓缩并于约4℃的温度(为减少蛋白酶活性)，通过切线流过滤，使用平台Millipore渗滤到25 mM Tris/50mM NaCl/0.2mM EDTA (pH 7.5-8.0)中且不加入DTT。生成的溶液使用膜滤器过滤，硫酸铵的浓度增加(例如，至约0.9M)，然后执行进一步的过滤(例如，使用膜滤器)。这种水性溶液含有艰难梭状芽孢杆菌毒素A和毒素B。水性溶液经历疏水相互作用色谱。艰难梭状芽孢杆菌毒素结合于丁基琼脂糖树脂(例如，GE丁基S FF琼脂糖)。用0.9 mM硫酸铵、25 mM Tris (pH 8.0)洗涤柱，艰难梭状芽孢杆菌毒素用25 mM Tris (pH 8.0)洗脱并使用WFI将导电性调整至7mS或更少。艰难梭状芽孢杆菌毒素(在洗脱液中)通过阴离子交换色谱进一步纯化。使洗脱的水性溶液通过阴离子交换柱(例如，Tosoh Q 650 M)以使毒素结合于柱。用25 mM Tris pH 7.5平衡柱，毒素A用27 mM MgCl₂在25mM Tris (pH 8.0)中洗脱，而毒素B用135 mM MgCl₂在25mM Tris (pH 8.0)中洗脱。纯化的毒素A和纯化的毒素B各自被浓缩并先渗滤到25mM Tris中(例如，以除去MgCl₂)，然后渗滤到100 mM PO₄ (pH 7)中。毒素A的平均得量是约0.021 g纯毒素/L发酵(UV280)，通过SDS Page评价的纯度平均是约97.2%。毒素B的平均得量是约0.011 g纯毒素/L发酵(UV280)和通过SDS Page评价的纯度平均是约93.9%。从该过程生成的毒素显示出90%或更高的纯度并且还显示出从现有工艺步骤残留的基质残余物(例如，三(羟甲基)氨基甲烷(TRIS))的降低。来自基本上如实施例1中所述过程的毒素基质中的残留的TRIS值变化约100-800 µg/ml，而来自该实施例中所述纯化过程的毒素基质中的残留TRIS值是低于1 µg/ml (即，低于检测限)。关于与甲醛的类毒素化反应，TRIS具有可有效地与蛋白竞争甲醛介导的修饰的胺基，从而降低反应混合物中的有效的甲醛浓度。因此，数据提示与通过实施例1中所述的过程制备的类毒素的动力学比较，通过该过程制得的类毒素的类毒素化动力学更快。

对类毒素化过程中有关温度和甲醛浓度进行了研究并作为类毒素化孵育期的函数进行分析。目标是开发一种可靠的类毒素化过程，其提供比使用早先过程(如在实施例1中所述)生成的类毒素更好的安全特性和更好的逆转特征，同时维持相同水平的免疫原性。得到于37℃，以最少量的残留甲醛通过逆转分析的药物产品的类毒素化条件是需要的。在这些实验中，毒素浓度固定在0.5 mg/ml并且所有的反应在100 mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)中执行。对各种类毒素化反应评估的温度是4℃、15℃和25℃。甲醛浓度对于类毒素A反应在0.21% (“0.2%”)或0.42% (“0.4%”)之间变化，而对于类毒素B反应在0.42% (“0.4%”)和0.84% (“0.8%”)之间变化。对于各种反应条件，毒素浓度被调整至0.5 mg/ml并以100 ml规模执行。然后加入百分之三十七(37%)甲醛以达到用于各单个反应的目标浓度。将反应温和地搅拌5-10分钟并置于在目标温度的孵育箱中(在孵育1小时内达到目标温度)。每日监测各单个反应至长达21天的时期。抽出样品并通过细胞毒性分析、AEX-HPLC、SEC-HPLC、SDS-PAGE和TNBS测定来分析。在取决于类毒素化条件的某些时间间隔，抽出样品，进行配制和动物研究、逆转分析和ELISA测试。

动力学细胞毒性分析

类毒素化反应后接着细胞毒性分析，因此每日直接从反应混合物抽出样品并提交用于同一天的分析。类毒素化过程后接着对IMR90细胞的细胞毒性，而类毒素化的动力学是单相的，其中毒素A用于细胞毒性中和花费平均5 ± 1天，而毒素B花费接近13 ± 2天(对于整个反应达不到3倍安全界限)。使用一个批次获得的数据在图1中示出。y-轴含有MC50值，其是材料毒性的反映并代表在毒性材料的存在下，50%的细胞变成圆形而不是其正常有条纹的形态学的最小浓度。对于两种毒素的MC 50值相差1000倍；B是更具细胞毒性的，其MC50值在低pg/ml范围内。对于类毒素的绝对MC50值是未知的，因为当在这些实验中以最高浓度200 µg/ml测试时，未有细胞毒性。对灭活过程的总时间段是18-21天。

得自对毒素A和毒素B的类毒素化反应的细胞毒性分析的数据示于表2中。它描述了显示对于甲醛与毒素的各个单独反应的细胞毒性丧失所需的时间量(以天计)。从对于毒素A和毒素B的类毒素化反应的数据，很少有明显的总体趋势。当甲醛浓度增加时，灭活毒素需要的时间减少。另外地，随着反应温度的增加，灭活毒素需要的时间也减少。数据提示类毒素化的速率随着温度或者甲醛浓度的增加而加速。许多有效条件从动力学细胞毒性分析鉴定，数据提示3x安全界限可通过外推细胞毒性3-倍的最初丧失而达到。例如，毒素A于25℃，用0.2%甲醛解毒2天，因此，应用适宜的安全界限将最低限度地继续反应6天。各种类毒素化反应条件满足期望。

表2

动力学研究的细胞毒性结果*

第0天

第1天

第2天

第3天

第4天

第5天

第6天

第7天

第9天

类毒素A, 0.2%, 4℃

+

类毒素A, 0.2%, 15℃

+

-

类毒素A, 0.2%, 25℃

+

-

N.D.

类毒素A, 0.4%, 4℃

+

-

类毒素A, 0.4%, 15℃

+

-

类毒素A, 0.4%, 25℃

+

-

N.D.

类毒素B, 0.8%, 4℃

+

-

类毒素B, 0.8%, 15℃

+

-

类毒素B, 0.8%, 25℃

+

-

类毒素B, 0.4%, 4℃

+

类毒素B, 0.4%, 15℃

+

-

类毒素B, 0.4%, 25℃

+

-

*+：细胞毒性；–：未检测到细胞毒性；N.D.：未测定

DoE反应的动力学AEX-HPLC分析

AEX-HPLC (扩展梯度法)可用作进一步评价不同的类毒素化参数的工具。AEX分布可以是缩小合适的类毒素化条件的有价值的工具。对两个亚群观察在AEX色谱中的两种类毒素A和类毒素B，两者都具有比毒素更长的保留时间。随着反应进展峰群转移，提示对毒素的进一步的修饰。潜在地，这反映了甲醛与毒素上的胺基反应，改变蛋白上的电荷特性为较少正电荷的，从而增加与柱树脂(季铵树脂)的结合亲和力。温度和甲醛浓度可影响和“转移”作为时间函数的峰群分布，指示更多甲醛蛋白修饰；对于毒素A和毒素B类毒素化反应，随着温度和甲醛浓度的增加，对第二峰群的更快转移被观察到。从评价观点来看，在第二个峰位置具有单分散的分布以确保更多的蛋白修饰将是更理想的。对于类毒素A，0.21%甲醛25℃ >6天或0.42%甲醛15℃ > 6天的条件得到所需单分散的第二峰分布。对于类毒素B，0.4%或0.8%甲醛15℃ >10天；或0.4%甲醛25℃ > 5天的条件，导致所需单分散的第二峰分布。重要的是注意到，具有最高甲醛浓度和温度的反应开始产生作为时间函数的更多的类毒素群，提示更广泛的蛋白修饰(特别是在类毒素化A的情况下，0.4%甲醛，25℃)。

动力学SEC-HPLC分析

SE分布在缩小合适的类毒素化条件中可以是有价值的工具。色谱可给出可由于甲醛诱导的分子间交联而发生的多聚化程度的观察。使类毒素的多聚化的量最小化并实现与实施例1中产生的产品类似的分布是需要的。各个反应每日通过SEC-MALS监测并对多聚化出现进行定量分析。对类毒素B反应分析的所有条件显示无多聚化。对于类毒素A，主要对使用最高甲醛浓度的条件，观察到过量多聚化。因此SEC-MALS数据不能关于温度、时间或甲醛浓度的条件区别类毒素B。然而，数据提示较高温度和甲醛浓度一起可导致类毒素A的多聚化。

动力学胺含量(TNBS)分析

福尔马林介导的类毒素化，通过反应形成甲醛基部分，导致蛋白上的游离胺含量减少(例如，赖氨酸的ε-氨基)。对早期材料使用三硝基苯磺酸(TNBS)测定监测修饰的程度的尝试已进行，反应结束时修饰的程度对于类毒素A和B已显示分别是~35%和65% (剩余的游离胺含量反转)。对于此研究，游离胺含量也使用TNBS测定监测。条件显示随着温度和时间增加，%游离胺含量更快速地逼近渐近线。因此胺修饰的程度可最大限度地估计为~ 40% (对于毒素A)和75% (对于毒素B) (剩余的游离胺含量反转)。虽然胺含量与细胞毒性的丧失几乎没有相关性，它可被用来根踪甲醛和毒素的反应的程度。例如在25℃下胺修饰关于A显示在6天内完成，而关于B在~10天内完成。如果反应在更低温度执行，获得相同程度的胺修饰花费的时间增加。因此，数据提示较高温度将导致在较短的时间段内更完全的反应。

抗原性分析

酶联免疫吸附测定(ELISA)也可用作进一步评价不同的类毒素化参数的工具。产品的ELISA分布可被用来缩小合适的类毒素化条件。生成的类毒素经由针对从早期材料生成的抗体的ELISA测量并作为类毒素化时间的函数分析。在此ELISA被用来检测毒素的量并与使用在280 nm处吸光度测量的浓度比较。随着类毒素化反应中抗原的发展，ELISA值可下降，指示从用实施例1类毒素观察到的反应的变化(潜在地指示多聚化)。虽然在分析中注意到变异性，数据提示较高的温度和较高的甲醛浓度导致较低的ELISA反应。例如，于25℃使用0.4%甲醛，导致ELISA值比于25℃使用0.2%甲醛时更快下降。同样，使用0.4%甲醛，25℃的条件，导致ELISA值比于4℃使用0.4%甲醛的那些更快下降。作为一种评价工具，保持70%以上的ELIS反应是需要的；许多条件被鉴定。

免疫原性的分析

采用仓鼠效能测定的免疫原性的测量可被用来评价类毒素化条件。目前的规范提出对于类毒素A和类毒素B的不少于4.8平均Log10 IgG效价反应。从这些研究生成的类毒素根据那些规范评价并被进一步详细检查为不具有来自源自早先条件的类毒素的显著更低的反应。另外地，当所有可能的渗透(相对于时间、温度和甲醛浓度)不能被评价时，根据动力学细胞毒性分析(3x安全界限)以及在此描述的理化特征选择类毒素。为了仓鼠效能测定，类毒素被配制为二价材料(非-冻干)且血清用于IgG反应分析。所有类毒素化条件不仅通过效能规格(4.8 Log10的平均IgG效价反应)，而且具有统计学上与早期(实施例1)材料等同的效价反应(未注意到显著的差异)。另外地，所有的血清被测试(使用体外攻击测定)并发现具有中和抗体活性。作为关键质量属性，数据提示任何这些类毒素化条件可以是可接受的。

药物产品(“DP”)的逆转分析

药物产品(包含类毒素A和B的组合物)使用在评价中采用类毒素化条件制备的类毒素A和B配制。制剂包含任何0%、0.004%，和在一些情况下0.008% (w/v)的残留的甲醛。制剂通过从类毒素A或B组合物除去所有(或基本上所有)的甲醛，然后用指定量的甲醛掺入清除的组合物中来制备。药物产品经历于37℃进行的逆转分析。得自药物产品逆转分析的数据描述于表3中。细胞毒性测试阴性的药物产品注释为(–)。

许多药物产品制剂通过逆转分析(即，于37℃贮存后无可检测的细胞毒性)。两种药物产品(含0.004%或含0.008%甲醛(“残留的甲醛”))于37℃贮存后没有可检测的细胞毒性：(i) 包含通过孵育13天，0.2%甲醛，15℃灭活的类毒素A和通过孵育13天，0.8%甲醛，15℃灭活的类毒素B的药物产品(表3，试验13和14的参数)；和，(ii) 包含通过孵育6天，0.2%甲醛，25℃灭活的类毒素A，孵育13天，0.4%甲醛，25℃灭活的类毒素B的药物产品(表3，试验22和23的参数)。具有0.008%甲醛的几种其它的药物产品于37℃贮存后也没有可检测的细胞毒性，包括例如，包含通过孵育13天，0.4%甲醛，4℃灭活的类毒素A和通过孵育21天，0.8%甲醛，4℃灭活的类毒素B的药物产品和包含孵育13天，0.4%甲醛，4℃灭活的类毒素A和孵育21天，0.8%甲醛和4℃灭活的类毒素B的药物产品。从该分析鉴定的最适类毒素化条件是：毒素A的类毒素化：0.5mg/ml毒素A，0.21%甲醛，25℃在100mM NaPO₄ pH 7中6天；和毒素B的类毒素化：0.5mg/ml毒素B，0.42%甲醛，25℃在100mM NaPO₄ pH 7中13天(表3，试验22的参数)。当通过其它理化测定测量时，这些条件也具有合意的分布。AEX显示每一类毒素的均匀的峰群，SEC MALS显示最小程度的多聚化和TNBS显示各种反应在给定的时间点达到最大的胺修饰。另外地，ELISA (A280)反应被维持。

表3

逆转分析(37℃)

DP=药物产品；Form.=甲醛；+：细胞毒性；–：无可检测的细胞毒性；N.D.：未测定

表1和3指示参数22对于从毒素A和B制备类毒素是最适的。这些条件是：

类毒素A的制备：0.5 mg/ml毒素A，0.21%甲醛，25℃在100 mM NaPO₄, pH 7中6天；和，

类毒素B的制备：0.5 mg/ml毒素B，0.42%甲醛，25℃在100 mM NaPO₄, pH 7中13天。

这些程序也包括10分钟混合步骤，接着0.2 µm过滤，然后6天(类毒素A)或13天(类毒素B)孵育。于37℃逆转测试前，使类毒素A和类毒素B渗滤进入20 mM柠檬酸盐(pH 7.5)、0.004%甲醛中。该程序在图2中说明。也注意到0.008%甲醛也通常提供于37℃的良好的稳定性。

这个数据被令人吃惊的免疫学数据进一步证实(仓鼠中的IgG反应)，显示较长的孵育时间导致对类毒素A的更低ELISA值，提示增加的甲醛-诱导的毒素修饰(ELISA/A280在第6天=0.94；在第12天=0.64)。相比之下，较长的孵育时间导致对类毒素B的更高ELISA值(ELISA/A280在第13天=0.53；在第20天=0.73)。合意的ELISA/A280值是接近于1.0的那些值。本领域普通技术人员应该理解，12天孵育期对于类毒素化毒素A可能是适宜的和20天孵育对于毒素A的类毒素化可能是适宜的。然而，即使考虑到该数据，13天孵育时间对于如上所述的类毒素化毒素B被认为是最适的。

规模分析

使用鉴定的最适类毒素化条件，以较大的规模(1/10^th投放规模(200L发酵))生产类毒素；即是说，毒素A和毒素B使用以下条件灭活：A的类毒素化：0.5 mg/mL毒素A，0.21% (w/v)甲醛，25℃在100 mM NaPO₄ pH 7中6天；和B的类毒素化：0.5 mg/mL毒素B，0.42% (w/v)甲醛，25℃在100 mM NaPO₄ pH 7中13天。类毒素化反应的动力学使用在反应期间的各个时间段采取的类毒素样品评价。与小规模生产的类毒素比较，类毒素具有相同的动力学细胞毒性分布，细胞毒性的丧失在反应的第2天被观察到。此外，类毒素具有与小规模生产的类毒素类似的AEX分布和类似的胺修饰(如通过TNBS分析测量的)。从1/10^th规模类毒素化反应生成的类毒素的免疫原性也通过仓鼠效能测定来评价。如同小规模生产的类毒素，类毒素给出4.8 Log或更高的平均数IgG效价反应并提供在统计学上等同于根据如在实施例1中提出的过程制备的类毒素的效价反应。逆转分析在源自 1/10^th规模类毒素的药物产品上执行并与源自小规模相同的类毒素化条件的药物产品比较。源自1/10^th规模生产的类毒素的药物产品具有与得自小规模的那些相同的逆转特征且甚至在0.004%甲醛下通过逆转。类似的结果用较大规模(例如，使用1000L和2000L发酵培养物)生产的类毒素获得。来自这些研究的数据显示，类毒素化方法是可扩大的。以大规模生产的类毒素具有与以小规模生产的那些类毒素相同的动力学细胞毒性特性、仓鼠效力和逆转特征。关于再现性，用于毒素A和毒素B的类毒素化过程再现超过6次，且分析显示类似的各批次特征。

免疫研究

纯化艰难梭状芽孢杆菌类毒素A和艰难梭状芽孢杆菌类毒素B基本上根据上述方法(例如，表3中的参数22)制备并配制为疫苗组合物。类毒素A和B以3:2的重量比合并，用包含蔗糖(4.0%-6.0% w/v)和甲醛(0.012%-0.020% w/v)的柠檬酸盐缓冲液配制并冻干。各组合物用如下文描述的稀释剂重新构成并在用作在仓鼠攻击模型中评价的疫苗之前用氢氧化铝作为佐剂。叙利亚金黄仓鼠(Syrian gold hamsters)提供一个用于艰难梭状芽孢杆菌疫苗开发的严格的模型。在用单次腹膜内(IP)剂量的克林霉素抗生素预处理后和在接受产毒素的艰难梭状芽孢杆菌生物体胃内(IG)接种后，仓鼠快速地发生暴发性腹泻和出血性盲肠炎并在2-4天(例如，无疫苗接种)内死亡。疫苗用稀释剂(包含0.57%氯化钠和800 µg/mL氢氧化铝)重新构成。系列稀释的重新构成的疫苗被制备。当人剂量(HD)的疫苗含有100 μg/剂量类毒素和400 μg/剂量氢氧化铝时，制备第一稀释液，一种含有5 µg/剂量类毒素、0.008%甲醛和20 µg/剂量铝的1/20 HD。仓鼠(9只仓鼠/组)用不同剂量的艰难梭状芽孢杆菌疫苗(4个稀释度的人剂量(100 µg/剂量) (HD)，通过3次肌内免疫(在0天、14天，和28天)疫苗接种或用安慰剂(AlOOH)注射。在41天，仓鼠用10mg/kg的化学形式的克林霉素-2-磷酸盐抗生素经IP途径预处理。在42天，用抗生素预处理28小时后，仓鼠用致死剂量的源自艰难梭状芽孢杆菌ATCC43255菌株的孢子制备物经IG 途径攻击。通过测量与艰难梭状芽孢杆菌感染和致死性相关的症状出现的动力学评价保护性功效。结果(在图3中叙述)证实疫苗以剂量-依赖性方式保护仓鼠对抗用艰难梭状芽孢杆菌产毒素细菌的致死攻击，具有由用剂量HD/20(5 µg类毒素A+B，在20 µg AlOOH的存在下)疫苗接种诱导的100%保护作用。免疫动物受到保护以对抗死亡和疾病(体重减轻和腹泻)。该研究的结果是代表性的几个体内研究。因此，由在此描述的方法制备的类毒素提供对抗艰难梭状芽孢杆菌疾病的保护性免疫。

实施例3

体外免疫研究

在疫苗制剂中含有的类毒素从毒素型0纯化。为了证实抗-毒素抗体能中和来自其它流行的变异菌株的毒素活性，一项体外交叉-中和研究使用得自疫苗接种的仓鼠血清进行。

A.材料和方法

艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗是一种来自艰难梭状芽孢杆菌参考菌株VPI10463(ATCC43255)的类毒素A和B的福尔马林-灭活的、高度纯化的制剂，并作为用稀释剂重新构成并与氢氧化铝佐剂混合(如上所述)的冻干制剂存在。安慰剂是0.9%盐水。来自087 PCR-核糖核酸型的纯化天然毒素A和B如上所述在内部产生。来自001、002、014、106、027、023和078 PCR-核糖核酸型的纯化天然毒素A和B以及来自017 PCR-核糖核酸型的纯化天然毒素B从TgcBiomics (Bingen, 德国)购得。

菌株VPI10463、630、BAA-1875、ATCC43598从ATCC购得。2007年从法国分离的菌株IPP40348，从M. Popoff (Pasteur Institute, 法国巴黎)获得。菌株CDC13695#7，在2005年从加拿大分离，并从疾病控制中心(CDC)获得。菌株SP041，在2011年从US分离，并从D.Gerding获得。艰难梭状芽孢杆菌的临床分离株从D. Gerding (US和阿根廷)、F. Barbut(欧洲)、P.Vanhems (法国)和T. Riley (亚太地区)获得。艰难梭状芽孢杆菌菌株在大豆酵母提取物盐(Soy Yeast extract Salt, SYS)培养基中厌氧生长16小时，然后在补充有山梨醇的SYS培养基上扩展72小时。然后收获细菌培养物上清液、过滤并用抗-蛋白酶和30%甘油补充。

存在于细菌培养物上清液中的毒素A和B的量化，根据生产商的指示，使用商业ELISA方法(tgcBIOMICS GmbH, Mainz, 德国)执行。简言之，用对毒素A和毒素B二者的捕获抗体涂布的微量滴定板与培养物上清液或标准对照毒素一起于37℃孵育60 min。洗涤未结合的材料后，将对或者毒素A或者毒素B (缀合于辣根过氧化物酶)的特异性单克隆抗体加入到孔中；于37℃孵育微量滴定板60 min。在第二清洗步骤后，加入底物以允许于室温下显色30 min。通过加入H₂SO₄至各孔中停止反应，并用分光光度计于450和620 nm处分析ELISA。

一种生物测定被开发用于体外交叉-中和分析。它改编自熟知的IMR90毒素中和测定。生物测定的设计由预-孵育对抗艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗培育的仓鼠血清(已知中和来自疫苗菌株的纯化毒素的细胞毒活性)，或者具有来自临床上-相关的艰难梭状芽孢杆菌原型菌株的纯化的天然毒素A或B的系列稀释液或者来自原型菌株或临床分离株(含有毒素A和/或B)的过滤细菌上清液的安慰剂血清的预定稀释液组成。将血清-毒素混合物加入到IMR-90细胞，其在加入的前一天被预先接种到Eplates上以达到汇合并附着在电极上。然后将板于37℃孵育。E-Plates是经特别-设计的在底部含有互相交叉的黄金微电极的组织培养微量滴定板。它们打算使用xCELLigence系统以非侵袭性地实时监测细胞活动，使用电子阻抗仪作为读出器，无标记物掺入。由毒素诱导的IMR90细胞变圆将导致电极阻抗降低，其被表示为细胞指数(CI)值。然后将相应的疫苗-和安慰剂-细胞指数绘制为细胞毒性曲线并使用内部软件(in-house software)，通过S形反应曲线(4-参数逻辑的)模仿。用于诱导50%细胞毒性(定义为IC50)的各种临床分离株的细菌上清液稀释被确定。两个曲线在50%细胞毒性之间的移动被计算为相对功效(RE)。RE表示疫苗特异性抗-毒素抗体中和纯化毒素或者临床分离株的毒素-细胞毒活性的能力。得自被认为有统计学显著意义的RE的阈值通过使用特异性抗-毒素抗体和针对安慰剂的无关抗体二者，测定中间准确性建立并因此定义为5.4。

B.结果

首先测试疫苗血清对抗来自流行的毒素型的纯化天然毒素A和B的功效。包含在该试验中的是来自参考菌株VPI10463 (ATCC43225 PCR-核糖核酸型087)和来自PCR-核糖核酸型001、002、014，和023、017 (A^-B⁺CDT^-)的菌株，以及来自所谓的超毒力PCR-核糖核酸型027(A⁺B⁺CDT⁺)和078 (A⁺B⁺CDT⁺)的毒素。首先评价各纯化天然毒素达到50%细胞毒性的浓度。IMR-90细胞对来自测试的不同PCR-核糖核酸型的纯化的毒素A和B是相当敏感的。对于毒素A的IC50浓度是在类似的范围内，即从4.4 ng/mL至15.9 ng/mL的范围。与毒素B相比，IC50浓度取决于选择的PCR-核糖核酸型而变化，且0.2ng/mL-6.2µg/mL之间的范围提示毒素B中的不同的效力。然后如在材料和方法章节中所述评价疫苗特异性抗-毒素抗体中和各纯化的毒素的各自细胞毒活性的相对功效(RE)。如在表4中所示，计算的REs范围在从9.3至818.5，且全部在定义为RE =5.4的正向阈值以上。疫苗血清中和来自PCR-核糖核酸型027、023和078的纯化毒素的相对功效比其它PCR-核糖核酸型更低，但仍在阈值之上。该结果提示疫苗血清能够显著地中和所有测试的纯化毒素的细胞毒性。

表4

中和来自流行毒素型的纯化毒素的细胞毒活性

^aIC50=诱导50%细胞毒性的浓度

^b 3次独立实验的几何平均数

^cRE=相对功效，如果高于阈值5.4，被认为是有统计学显著意义的

^d n.d. =未测定

除了纯化的天然毒素外，评价疫苗特异性抗-毒素抗体中和由艰难梭状芽孢杆菌原型菌株代表性的最流行菌株产生的毒素的相对功效也是重要的，因为大多数循环病原体菌株表达两种毒素。为此，几个原型菌株(表5)基于最流行的类型选择。存在于培养物上清液中的毒素A和毒素B的浓度通过ELISA定量，而对各种原型菌株诱导对IMR-90细胞的50%毒性的细菌上清液的稀释液被计算(IC50)。菌株(VPI10463)，已知为高毒素-产生菌株，在最适培养条件下，产生高水平的毒素A (17.04 µg/mL)和毒素B (7.06 µg/mL)且在诱导毒性方面是非常有效的，伴有在5.6x10⁷的IC50稀释的安慰剂血清。相比之下，其它菌株产生低至几乎无法检测到的毒素水平。毒性与存在于上清液中的毒素的量成比例，因为菌株仍然能够用更低IC50稀释的安慰剂血清(范围从4.4x10³至5.2x10⁶)诱导毒性。令人吃惊地，不论毒性效能(IC50)的各个范围，疫苗-血清能够中和所有细菌上清液的细胞毒活性，因为所有计算的RE (安慰剂血清与疫苗-血清的IC50稀释液之间的转移)都显著高于阈值。类似于纯化的毒素，观察到对抗毒素型III PCR-核糖核酸型027和毒素型V、PCR-核糖核酸型078的菌株的最低RE，但仍然显著高于阈值。

表5

^aIC50=诱导50%细胞毒性的浓度

^b RE=相对功效，如果高于阈值5.4，被认为是有统计学显著意义的

^c 4次独立实验的几何平均数

^d n.d. =未测定

为确保一种广泛代表的流行性循环艰难梭状芽孢杆菌毒素不变异菌株，扩大体外交叉-中和研究至一种大的艰难梭状芽孢杆菌菌株收藏，具有最近的循环临床分离株和用于各毒素型分析的一大组分离株。从预期的临床和世界流行病学研究收集超过500个最近的临床分离株(在2011年，在US和阿根廷内收集超过80个临床分离株；在2005年，在整个欧洲收集超过350个临床分离株和在2010 & 2011年之间从法国收集60个分离株；在2012和2013年之间，在亚太国家(包括澳大利亚、新加坡、日本、韩国、印度尼西亚和台湾地区(Tawain))收集超过30个临床分离株。全世界超过150个艰难梭状芽孢杆菌临床分离株从该收藏中选择用于体外测定。选择基于多个标准例如分离的国家、分子分型和，当可获得时，临床参数例如CDI严重性和CDI事件。临床分离株的地理学和分子分布描述于表6中。

表6

体外研究中测试的临床分离株的概述

^a欧洲国家包括比利时、法国、德国、爱尔兰、匈牙利、意大利、荷兰、波兰、西班牙、瑞士、瑞典、土耳其、希腊、UK

^b亚太国家包括日本、韩国、新加坡、台湾地区和澳大利亚

^c n.d. = 未知的PCR-核糖核酸型

10个毒素型出现在不同的地理区域内，包括5个最流行的毒素型，其中大多数是毒素型0，然后是毒素型III、V、VIII和IV，以及其它例如毒素型I，毒素型IX和XII。考虑核糖核酸型(RT)分布，超过23个核糖核酸型被表示，其中超过13个 RT表示13个核糖核酸型毒素型0。选择反映了5个鉴定为在CDI患者中最流行的谱系/毒素型，其中每个毒素型在世界的不同地方有特定分布：例如，在欧洲大多数为毒素型0菌株，在US大多数为毒素型0和III菌株，而在亚太地区，大多数为毒素型0和VIII，以及其它RT 046。

含有毒素的细菌上清液从临床分离株的体外培养物生成。毒素A和毒素B在培养基中的浓度通过ELISA对各种临床分离株定量。各种临床分离株的体外毒性也通过计算IC50来评价。IC50对存在于各种临床分离株的上清液中的毒素A和B水平作图(图4)。在用宽范围的毒性对每个毒素型的分析中，所有细菌上清液都是毒性的。毒性与存在于细菌上清液中的毒素水平成强烈的正比关系，对毒素A和毒素B分别具有0.88和0.93的相关系数(图4A和图4B)，可能与各种临床分离株在培养基中的生长的能力相关(未示出)。一般来说，临床分离株产生比毒素B更多的毒素A。对于毒素型VIII临床分离株(已知其仅产生毒素B)，毒素A水平是不可检测的。对于一些细菌上清液，在这些培养条件下，毒素B低于检测限(1.E+04)。

然后计算各个临床分离株的RE并对它们的各自细胞毒性指数作图，以评价毒素变异类型中的有效簇群(图5)。所有的细菌上清液用疫苗-诱导的血清中和，因为RE是在阈值以上。相对功效(RE)独立于菌株毒性(IC50)。有趣地，不论相同毒素型中的宽范围的细胞毒性，对于来自相同毒素-变异类型的临床分离株，相似的RE行为被观察到。对于毒素型III、V和VI的RE比对于毒素型0的RE更低，但仍高于阈值。证实这与二元毒素活性无关，因为IMR90细胞对于二元毒素是不敏感的(数据未示出)，但与基于序列比较的毒素A-和毒素B-种系发生相当一致。

这项在仓鼠模型中的广泛研究证实对围绕全球的5个最流行的变异菌株，即毒素型/RT 0/012、III/027、IV/023、V/078和VIII/017的广泛覆盖。艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗在仓鼠模型中生成能够体外中和来自重要毒素型0、III、IV、V、VIII，和其它(I、VI、XII)的毒素A和B的抗-毒素抗体。对毒素型III、V和VI观察到的更低的相对功效(RE)与二元毒素活性无关，而与毒素A和毒素B种系发生一致。重要的是注意到二元毒素的存在与疾病严重性和死亡的风险的显著增加相关。二元毒素的作用尚不知道。

实施例4

交叉-免疫研究

以上描述的关于艰难梭状芽孢杆菌VPI10463/ATCC43255菌株在用VPI 1064631ATCC43255菌株作为攻击菌株的仓鼠模型中的免疫研究使用不同的艰难梭状芽孢杆菌菌株执行，以确定是否相同的菌株可被用来对动物进行针对多个菌株的疫苗接种(即，提供交叉-保护作用)。如下所述研究具有毒素型A⁺B⁺CDT^-、A⁺B⁺CDT⁺，和A^-B⁺CDT^-的菌株。

研究使用基本根据上述方法(例如，在表3中的参数22)制备的，源自相同的艰难梭状芽孢杆菌菌株的纯化艰难梭状芽孢杆菌类毒素A和艰难梭状芽孢杆菌类毒素B，并用氢氧化铝配制为疫苗组合物(5 µg类毒素A+B，在20或160 µg AlOOH的存在下(“艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗”))。

体内交叉-保护作用研究在克林霉素-诱导的致死小肠结肠炎金黄叙利亚仓鼠模型中进行。该模型确实通常用于研究艰难梭状芽孢杆菌(C.difficile)感染的发病机理和由疫苗介导的保护作用。仓鼠，用艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗或稀释剂缓冲液(安慰剂)免疫，用克林霉素-2-磷酸盐溶液预处理，以破坏肠道菌丛并使动物对随后的用来自不同的原型菌株的、富含艰难梭状芽孢杆菌孢子的制剂的致死攻击敏感。

对抗CDI的保护作用通过监测临床体征的发生，包括腹泻，和存活来评价。用于体内交叉-保护作用研究所选择的原型菌株以5个最流行的毒素-变异菌株为代表(表4)。

A.材料和方法

购自Charles River Laboratories (德国)的雌性金黄叙利亚仓鼠(Mesocricetus auratus)，70-90 g，被用于免疫和攻击研究。将动物随机分配到数组中并将它们按3只/每笼800 cm² (3型，réf: LF-3H，供应商Serlab)圈养。在艰难梭状芽孢杆菌攻击后，动物各自在具有等值顶(isocaps)的笼中圈养。根据生物统计学分析，使用9只动物/每组。仓鼠用或者艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗或者铝稀释剂缓冲液(安慰剂对照)经由肌内(IM)途径注射3次，相隔2周。在第41天，经由腹膜内(IP)途径给予10 mg/kg克林霉素-2-磷酸盐溶液。24小时后，用预定的致死剂量的、每个原型菌株的富含活的艰难梭状芽孢杆菌孢子的制剂，使用加药针经胃内(IG)攻击仓鼠。攻击后，观察动物的发病率和死亡率至少一天2次。在克林霉素注射前，在准确的时间也监测体重，然后在临床监测期间1-3次/每周。腹泻疾病报告为各个疾病评分的组平均分数：0 = 无疾病；1 = 稀薄粪便；2 = 湿的尾部和肛周区；3 = 湿的肛周区、腹部和后爪；和4 = 死亡。统计学分析使用SAS v9.2^®和Excel软件进行。具有对数秩检验的Kaplan-Meïer方法被用于从寿命数据估算存活函数。双侧费希尔精确检验被用来比较在攻击后第17天存活动物的百分率。使用5%的误差界限作为因素的影响。

用于攻击的艰难梭状芽孢杆菌原型菌株在硫醇乙酸盐培养基中于37℃厌氧生长24小时。然后将培养物接种到厌氧血琼脂板(CDC, Becton Dickinson)上并于37℃孵育7天以诱导孢子形成。然后将孢子收获到无Ca或Mg的PBS中，然后洗涤两次，再于57℃热休克10分钟以杀死营养细胞。孢子悬浮液以500 g离心30分钟并在PBS 中再悬浮于20%甘油中。于<-70℃冷冻孢子制剂以供长期贮存。活孢子计数(CFU/mL)通过于37℃解冻孢子储备液并在水中执行系列10-倍稀释来评价。在0.1%牛磺胆酸盐(Sigma)的存在下，将稀释液按一式三份平铺到具有酵母提取物的脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基琼脂板上(BHISA,Becton Dickinson)，以提高孢子回收率。在厌氧条件，于37℃孵育板不少于48小时。对菌落计数并计算CFU/mL。

B.结果

对抗同源艰难梭状芽孢杆菌疫苗菌株的保护作用被证实(图6)。在安慰剂组中，急性腹泻的发作早在攻击后的第1天出现(图6A)，而存活率早在攻击后的3.5天快速下降至11%(图6B)。在疫苗组中(实心方形)，在整个研究中观察到非常有限的粪便变化，其中仅1只仓鼠在攻击后2.5天开始显示出短暂的轻微腹泻(2分)，并在攻击后第9天恢复并观察到显著的保护作用，因为在整个研究中存活率保持100%。

为证实对抗来自不同RT的另一个毒素型0菌株的保护作用，使用艰难梭状芽孢杆菌630菌株(图7)。在安慰剂组中，腹泻的发作早在攻击后第3天出现，在攻击第6天达到其最大(图7A)。在疫苗组中，在整个研究中观察到非常有限的粪便变化。图7B中的存活曲线显示，在安慰剂组中(空心圆)，存活率早在攻击后第2天即下降，在攻击后第13天下降达到11%。在疫苗组中(实心方形)，在整个研究中存活率保持100%。在用菌株630攻击后，艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗诱导对抗疾病和死亡的显著保护作用(用费希尔精确检验，p=0.0004，和用Kaplan-Meïer对数秩检验，p=0.0001)。

对抗高毒力氟喹诺酮-抗性毒素型III PCR-核糖核酸型027菌株的保护作用也被评价，所述菌株，除了A⁺B⁺外，还表达二元毒素(CDT⁺)。为此目的，选择3个菌株用于分析：在2007年从法国分离的菌株IPP40348，在2005年从加拿大分离的菌株CDC13695#7，和在2011年从US分离的菌株SP041。用这3个菌株攻击后诱导了急性CDI，急性腹泻早在攻击后第2天开始并在攻击后不到5天内达到100%致死率。

在给予来自上述艰难梭状芽孢杆菌参考菌株VPI10463 (ATCC43255)的类毒素A和B的福尔马林-灭活的、高纯化制剂(与160 µg ALOOH混合)后，低症状和致死性(图8A-B)。经疫苗接种的大多数仓鼠(10/12)未显示出疾病症状并在攻击下幸存，提供显著的保护作用(采用Fisher精确检验和Kaplan-Meïer对数秩检验，p-值<0.001)。仅2只仓鼠在攻击后3天内显示出中度腹泻(评分2，具有0.42的均值/组)并在攻击后6天死亡。

用菌株CDC13695#7攻击后，艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗引起对疾病症状(图9A)和死亡(图9B)的显著的交叉-保护作用(用Fisher精确检验和Kaplan-Meïer对数秩检验，p-值<0.001)。确实，疫苗接种的仓鼠均未显示出任何稀薄粪便并在攻击后保持100%的存活率，而在对照组中，仓鼠在攻击后2天内显示出强烈的腹泻，伴有湿的肛周区、腹部和后爪(评分3)且存活率在攻击后4天内下降至8%。

对于最近的美国临床分离株，菌株SP041，对安慰剂组中的所有仓鼠观察到强烈的急性腹泻(评分3)，在攻击后2天内导致100%致死率(图9C-D)，提示一种高毒力菌株。在用艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗接种的仓鼠中，58% (7/12)无任何疾病症状并在攻击后存活超过17天。剩余的42% (5/12)显示出中度至急性腹泻并在攻击后2-5天内死亡。保护作用仍然是显著的(用Kaplan-Meïer对数秩检验p-值< 0.001，而用费希尔精确检验p-值= 0.005)。

毒素型V PCR-核糖核酸型078高毒力菌株也是世界流行的并且是A+B+CDT+。菌株BAA-1875被用作原型菌株以评价交叉-保护作用。在安慰剂组中(空心圆)，用该菌株攻击导致强烈的和急性腹泻(评分3)， 67%的仓鼠在攻击后2天内观察到腹泻(组均值1.7) (图10A)和攻击后3天内100%死亡(图10B)。艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗诱导显著的交叉-保护作用，在整个研究中，疫苗接种的仓鼠保持100%的存活率(用费希尔精确检验和Kaplan-Meïer对数秩检验，所有p-值≤ 0.0001)且不存在任何疾病症状。

毒素型IV PCR-核糖核酸型023菌株在不同的国家中不断出现。有趣的是，菌株也都是A⁺B⁺CDT⁺。因此，重要的是评价对抗一种原型菌株的交叉-保护作用。菌株NK91，最近从法国医院(2012年)分离的，被用作原型菌株(图11)。在安慰剂组中，大多数仓鼠早在攻击后第1天显示出稀薄粪便(评分1)，在攻击后不到3天出现急性腹泻(评分3) (图11A)，在攻击后6天内导致100%的致死率(图11B)。在整个研究中，艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗诱导显著的交叉-保护作用，其存活率保持100% (用费希尔精确检验和Kaplan-Meïer对数秩检验，p-值<0.001)，伴有在攻击后13天内消除的轻微和短暂腹泻(评分1，稀薄粪便)。

毒素型VIII PCR-核糖核酸型017菌株，其为A^-B⁺CDT^-，是在亚太地区高度流行的。菌株ATCC43598被用作原型菌株以评价交叉-保护作用(图12)。在安慰剂组中，被攻击的仓鼠在攻击后3-5天内显示出强烈的腹泻(图12A)和强烈的体重损失，其可在攻击后9天内降低35% (图12B)。12只有病仓鼠中的7只死于它们的症状，其存活率在攻击后10天内下降至42% (图12C)。然而，一些仓鼠能够从它们的症状中恢复。尽管缺乏毒素A，菌株ATCC43598因而仍是有毒性的，但在仓鼠中具有减少的发病率和减轻的疾病严重性，如已经描述的。令人吃惊地，用艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗接种的所有仓鼠阻止疾病症状(图12A和12B)和死亡(图12C)，且在攻击后存活率保持100% (用费希尔精确分析p-值= 0.0046，用Kaplan-Meïer分析p-值= 0.0020)。

分析的菌株为代表性的5个最流行的毒素型：0、III、IV、V和VIII。令人吃惊地观察到，用毒素型0，PCR-核糖核酸型012，菌株630 (A⁺B⁺CDT^-)；毒素型III PCR-核糖核酸型菌株027菌株(A⁺B⁺CDT⁺) (CDC 13695#7菌株，加拿大，2005年；SP041临床分离株，US，2011年；IPP40348菌株，法国，2007年；毒素型IV PCR-核糖核酸型023 (A⁺B⁺CDT⁺) (临床分离株NK91，法国2012年；毒素型V PCR-核糖核酸型078菌株ATCC BAA-1875 (A⁺B⁺CDT⁺)和毒素型VIII PCR-核糖核酸型017 (ATCC4539 (A^-B⁺CDT^-)攻击后，组合物提供对抗症状和死亡的显著的交叉-保护作用。注意到在对菌株IPP40348的这项研究中，使用包含20 µg氢氧化铝(AlOOH)的组合物，交叉-保护作用是不明显的，但当包含160 µg AlOOH时，交叉-保护作用是显著的。数据概括于表7中

表7

该数据证实艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗可在仓鼠攻击模型中，提供对抗围绕全球的代表临床上相关菌株的5种最流行变异菌株的广泛的保护作用。艰难梭状芽孢杆菌类毒素疫苗诱导针对用毒素型/PCR-核糖核酸型0/012、III/027、IV/023、V/078和VIII/017原型菌株，包括表达二元毒素的那些例如毒素型/PCR-核糖核酸型III/027、IV/023和V/078攻击的广泛的体内保护作用。

虽然某些实施方案已根据优选的实施方案进行了描述，应该理解对本领域技术人员而言，会出现变化和修饰。因此，意欲使所附权利要求覆盖所有这样的落入以下权利要求书范围内的等同变化。

参考文献

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Sambol SP, Tang JK, Merrigan MM, Johnson S, Gerding DN (2001) Infectionof hamsters with epidemiologically important strains of Clostridiumdifficile. J Infect Dis 183: 1760-1766。

Claims

1.一种针对表达艰难梭状芽孢杆菌(C. difficile)二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株和不表达CDT的艰难梭状芽孢杆菌菌株免疫宿主的方法，该方法包括给予宿主包含纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B的免疫原性组合物，所述毒素通过用甲醛(w/v)于约15-32℃孵育约2-约21天灭活，其中毒素A用0.15%-0.5%甲醛(w/v)灭活和毒素B用0.15%-0.8%甲醛(w/v)灭活。

2.权利要求1的方法，其中纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B源自不表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株。

3.权利要求2的方法，其中纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B源自艰难梭状芽孢杆菌菌株VPI10463 / ATCC43255。

4.一种在宿主中诱导抗体的方法，所述抗体具有对一种或多种表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的艰难梭状芽孢杆菌菌株的特异性，该方法包括给予宿主包含源自不表达CDT的艰难梭状芽孢杆菌菌株的灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B的组合物。

5.权利要求4的方法，其中所述抗体是中和性的，如通过毒素中和测定法所测定的。

6.权利要求5的方法，其中所述抗体显示出至少5.4的相对功效(RE)。

7.权利要求4-6的任一项的方法，其中所述抗体中和由具有选自0、I、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX和XII的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株生产的毒素A和/或毒素B。

8.权利要求7的方法，其中：

毒素型0菌株具有选自001、002、012、014、020、014/020、014/020/077、106、018和053的PCR-核糖核酸型；

毒素型III菌株具有PCR-核糖核酸型027或075；

毒素型IV菌株具有PCR-核糖核酸型023；

毒素型V菌株具有选自078、079、122、126和078/126的PCR-核糖核酸型；

毒素型VI菌株具有PCR-核糖核酸型127或66-2；

毒素型VII菌株具有PCR-核糖核酸型66-2；

毒素型VIII菌株具有PCR-核糖核酸型017；

毒素型IX菌株具有PCR-核糖核酸型019；

毒素型XIa菌株具有PCR-核糖核酸型642；

毒素型XII菌株具有PCR-核糖核酸型056。

9.权利要求4-6的任一项的方法，其中所述抗体中和由具有PCR-核糖核酸型046或369的艰难梭状芽孢杆菌菌株生产的毒素A和/或毒素B。

10.权利要求7的方法，其中所述抗体中和由具有选自0、III、IV、V和VIII的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株生产的毒素A和/或毒素B。

11.权利要求7的方法，其中所述抗体中和由艰难梭状芽孢杆菌菌株毒素型0、III、IV、V和VIII生产的毒素A和/或毒素B。

12.权利要求10或11的方法，其中毒素型0菌株具有PCR-核糖核酸型012，毒素型III菌株具有PCR-核糖核酸型027，毒素型IV菌株具有PCR-核糖核酸型023，毒素型V菌株具有PCR-核糖核酸型078，和毒素型VIII菌株具有PCR-核糖核酸型017。

13.权利要求7的方法，其中所述抗体中和毒素型III、IV和V的艰难梭状芽孢杆菌菌株生产的毒素A和/或毒素B。

14.权利要求13的方法，其中毒素型III菌株具有PCR-核糖核酸型027，毒素型IV菌株具有PCR-核糖核酸型023，和毒素型V菌株具有PCR-核糖核酸型078。

15.一种针对表达艰难梭状芽孢杆菌二元毒素(CDT)的一种或多种艰难梭状芽孢杆菌菌株对宿主免疫和/或疫苗接种的方法，该方法包括给予宿主包含源自不表达CDT的艰难梭状芽孢杆菌菌株的灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和灭活的纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B的组合物。

16.权利要求15的方法，其中宿主分别针对一种或多种具有选自0、III、IV、V和/或VIII的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株被免疫和/或疫苗接种。

17.权利要求15或16的方法，其中宿主分别针对一种或多种具有选自III、IV和V的毒素型的艰难梭状芽孢杆菌菌株被免疫和/或疫苗接种。

18.权利要求15或16的方法，其中宿主分别针对一种或多种具有毒素型III、IV和V的艰难梭状芽孢杆菌菌株被免疫和/或疫苗接种。

19.权利要求18的方法，其中毒素型III菌株具有PCR-核糖核酸型027，毒素型IV菌株具有PCR-核糖核酸型023，和毒素型V菌株具有PCR-核糖核酸型078。

20.权利要求15-19的任一项的方法，其中针对由艰难梭状芽孢杆菌引起的疾病和死亡的显著保护作用被提供给宿主。

21.权利要求20的方法，其中保护作用使用金黄叙利亚仓鼠模型测定。

22.权利要求15-21的任一项的方法，其中组合物被给予宿主至少3次。

23.权利要求22的方法，其中组合物经由肌内途径给予。

24.权利要求22或23的方法，其中组合物被给予3次，各次给予之间的间隔为2周。

25.权利要求21-24的任一项的方法，其中仓鼠组的存活率为约58%-约100%。

26.权利要求21-25的任一项的方法，其中保护作用是统计学上显著意义的，如通过具有对数秩检验的Kaplan-Meïer方法和/或双侧费希尔精确检验所确定的。

27.权利要求26的方法，其中，对于仓鼠组：

用Kaplan-Meïer对数秩检验，p=0.0001，而用双侧费希尔精确检验，p=0.0004；

用Kaplan-Meïer对数秩检验，p<0.001，而用双侧费希尔精确检验，p-值=0.005；

用Kaplan-Meïer对数秩检验和双侧费希尔精确检验二者，p-值≤ 0.0001；和/或

用Kaplan-Meïer对数秩检验，p-值=0.0020，而用双侧费希尔精确检验，p=0.0046。

28.权利要求1-27的任一项的方法，其中组合物不包含CDT或其亚单位。

29.权利要求3-28的任一项的方法，其中艰难梭状芽孢杆菌毒素A和毒素B源自艰难梭状芽孢杆菌毒素型0。

30.权利要求29的方法，其中纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素A和纯化的艰难梭状芽孢杆菌毒素B源自艰难梭状芽孢杆菌菌株VPI10463 / ATCC43255。

31.权利要求3-30的任一项的方法，其中毒素A和毒素B通过用甲醛于约15-32℃孵育约2-约21天灭活，并且其中毒素A用0.15%-0.5%甲醛(w/v)灭活和毒素B用0.15%-0.8%甲醛(w/v)灭活。

32.权利要求1-31的任一项的方法，其中组合物包含约0.001%-0.020%甲醛。

33.权利要求32的方法，其中组合物包含约0.004%甲醛。

34.权利要求32的方法，其中组合物包含0.008 %甲醛。

35.权利要求32的方法，其中组合物包含约0.016%甲醛。

36.权利要求1-35的任一项的方法，其中类毒素A和类毒素B以5:1-1:5的A:B比例存在于组合物中。

37.权利要求1-35的任一项的方法，其中类毒素A和类毒素B以3:1或3:2的A:B比例存在于组合物中。

38.权利要求1-37的任一项的方法，其中组合物经冷冻干燥、喷雾干燥，或泡沫干燥。

39.权利要求1-37的任一项的方法，其中组合物以液体形式呈现。

40.权利要求1-39的任一项的方法，组合物还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

41.权利要求40的方法，其中组合物包含柠檬酸盐、磷酸盐、甘氨酸、碳酸盐或碳酸氢盐缓冲液，或pH-控制的水性溶液。

42.权利要求40或41的方法，其还包含糖或糖醇。

43.权利要求40-42的任一项的方法，所述组合物包含蔗糖和柠檬酸盐。

44.权利要求1-43的任一项的方法，其中组合物还包含佐剂。

45.权利要求44的方法，其中佐剂包含铝。

46.权利要求45的方法，其中佐剂包括磷酸铝或氢氧化铝。

47.权利要求46的方法，其中佐剂包括氢氧化铝。

48.权利要求47的方法，其中组合物包含从约20 µg至约160 µg的氢氧化铝。