KR20180011784A - 클로스트리듐 디피실에 대한 면역화 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 일반적으로 클로스트리듐 디피실(씨. 디피실)에 대한 치료적 및/또는 보호적 백신접종 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하는 씨. 디피실 균주 및 CDT를 발현하지 않는 균주에 대해 숙주를 면역화시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법들은 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 정제된 톡신 B를 포함하는 면역원성 조성물을 숙주에게 투여함을 포함한다. 정제된 씨. 디피실 톡신은 CDT를 발현하지 않는 씨. 디피실 균주로부터 유래될 수 있다.

Description

클로스트리듐 디피실에 대한 면역화 방법

관련 출원

본 출원은 2015년 5월 15일자로 출원된 미국 출원 제62/162,357호를 우선권으로 주장한다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 클로스트리듐 디피실(Clostridium difficile)(씨. 디피실)에 대한 치료적 및/또는 보호적 백신접종 분야에 관한 것이다.

씨. 디피실은 다수의 균주 톡시노타입(strain toxinotype)/PCR-리보타입(PCR-ribotype)(RT)을 갖는 널리 분포된 병원체이다. 몇몇 국가들에서 수행된 수많은 분자 역학 연구는 최근 5년에 걸쳐서 공개되었다. 그 결과는 몇몇 톡신 변이체를 암호화하는 순환 균주들이 인간 증후성 씨. 디피실 감염(CDI)의 원인으로서 우세함을 입증하였다. 가장 우세한 5가지는 톡시노타입　0, III, IV, V 및 VIII을 포함한다. 당업계에서는, 특히 백신이 씨. 디피실 2성분 톡신(binary toxin)("CDT"; 예를 들면, CDTa 및/또는 CDTb 서브유닛으로부터의 2성분)을 발현하지 않는 균주로부터 제조되고 면역화가 요망되는 균주가 CDT를 발현하지 않을 경우에, 다수의 씨. 디피실 균주/톡시노타입, 특히 CDT를 발현하는 씨. 디피실 균주/톡시노타입 및 CDT를 발현하지 않는 씨. 디피실 균주/톡시노타입 둘 다에 대한 치료적 및/또는 보호적 면역원성 조성물(예를 들면, 백신)로서 사용하기 위한 씨. 디피실 항원을 포함하는 조성물이 요구된다. 당업계에서는, 예를 들면, 2성분 톡신이 백신에 포함되지 않는다면 재조합 톡신 A(Toxin A) 및 톡신 B(Toxin B)는 CDT를 발현하는 균주에 대한 보호를 제공하지 않을 수 있는 것으로 인식되어 왔다(WO 2013/112867). '867 출원의 실시예 11은 "재조합 TcdA + TcdB 백신은 고 병독성 NAP1/027/BI17 균주(CDT를 발현함)로부터의... 포자...로 시험감염(challenge)된 햄스터의 생존을 실질적으로 증가시킬 수 없었다"고 설명하지만, "2성분 톡신(CDTa 및 CDTb)을 백신에 첨가하는 것은...상기 백신의 보호 효능을 지속적으로 증가시켰다"고도 설명하고 있다. 그리고, 사실상 "TcdA 및 TcdB를 포함하는 두 2성분 톡신 단백질(CDTa 및 CDTb) 모두가...보호를 완전히 회복시켰다"고 설명하고 있다. 이러한 교시들과 대조적으로 그리고 동일한 관점에서 놀랍게도, 이러한 문제는 본 명세서에 기재된 시약들 및 방법들을 사용하여 극복되었다.

[도면의 간단한 설명]

도 1은 세포독성 검정의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. IMR90 세포를 사용하는 세포독성 검정은 기재된 방법에 따라서 불활성화시킨 톡신 A 및 톡신 B 각각의 1개 뱃치로부터의 샘플을 사용하여 수행하였다(실시예 2). 샘플은 톡신을 불활성화하기 위해 포름알데히드를 첨가한 후 0일째 채취하고, 물질의 세포독성을 평가하기 위해 수일이 경과한 후에 채취하였다. y-축은 독성 물질의 존재하에 세포의 50%가 (이의 정상적인 선 모양 형태학과 대조적으로) 원형이 되는 최소 농도(MC50)를 나타낸다. 검정을 위한 검출 값의 하한(LOD)은 파선을 사용하여 확인된다.

도 2는 씨. 디피실 톡신 A 및 톡신 B를 불활성화시키는 예시적 방법을 개략적으로 나타낸 것이다.

도 3은 면역화 연구로부터의 결과를 그래프로 나타낸 것이다. (그룹당 9마리 햄스터로 하여 5개 그룹을 사용하여) 햄스터 시험감염(challenge) 모델에서 수행된 연구에서, 톡소이드 A 및 톡소이드 B를 기재된 방법에 따라서 제조하고 배합하고 동결건조된 조성물로서 제형화하였다. 상기 조성물을 백신접종 전에 재구성하고 어쥬번트(adjuvant)를 첨가하였다. 하나의 햄스터 그룹에게는 위약을 투여하였다. 조성물의 인간 용량(HD)의 4가지의 상이한 희석액(100 pg/용량)을 나머지 4개의 햄스터 그룹 각각에 대해 1개씩 제조하였다. 투여된 조성물(즉, 위약 또는 HD 희석액)은 X-축에 나타내어져 있다. 그래프에 나타난 바와 같이, 씨. 디피실의 시험감염 치사 용량의 투여 후 각 그룹의 생존율%(Y-축)가 측정되었다.

도 4a 내지 4b는 실시예 3에 기재된 바와 같은 다수의 대표적인 톡시노타입 임상적 단리체(clinical isolate)들에 대한 세포독성 검정 결과(IMR-90 세포들을 사용함)를 예시한다. 패널 A에서, 계산된 IC50 결과는 세균 상청액 중에 존재하는 톡신 A의 농도(㎍/ml)에 대해 플롯팅되어 있다. 패널 B에서, 계산된 IC50 결과는 세균 상청액 중에 존재하는 톡신 B의 농도(㎍/ml)에 대해 플롯팅되어 있다.

도 5는 실시예 3에 기재된 바와 같은 교차-중화 검정 결과를 제공한다. 다양한 톡시노타입을 대표하는 임상적 단리체로부터의 세균 상청액의 각 세포독성 활성을 중화시키는 백신 특이적 항체의 상대적 효능(RE)을 검정하였다. 도시된 것은 각각의 세포독성 지수에 대한 각 단리체의 RE이다. 계산된 교차-혈청중화 유의성 역치 RE는 과다면역(hyperimmune) 무관한 햄스터 혈청 및 이종 균주로 수득된 결과에 기초하여 5.4였다.

도 6a 내지 6b는 시험감염 균주로서 씨. 디피실 백신 균주를 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 예시한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군(○)과 비교한 백신 그룹(■)에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군(○)과 비교한 백신 그룹(■)에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다.

도 7a 내지 7b는 시험감염 균주로서 톡시노타입 O PCR-리보타입 012 균주를 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 제공한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군(○)과 비교한 백신 그룹(■)에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다.

도 8a 내지 8b는 시험감염 균주로서 톡시노타입 III PCR-리보타입 027 균주 IPP40348을 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 제공한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹(160㎍ AlOOH를 포함한 백신이 투여됨)에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 160㎍ AlOOH 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다.

도 9a 내지 9b는 시험감염 균주로서 톡시노타입 III PCR-리보타입 027 균주 CDC13695#7을 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 제공한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다.

도 9c 내지 9d는 시험감염 균주로서 톡시노타입 III PCR-리보타입 SP041 균주를 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 제공한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다.

도 10a 내지 10b는 시험감염 균주로서 톡시노타입 IV PCR-리보타입 023 균주를 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 제공한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다.

도 11a 내지 11b는 시험감염 균주로서 톡시노타입 V PCR-리보타입 078 균주를 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 제공한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다.

도 12a 내지 12c는 시험감염 균주로서 톡시노타입 VIII PCR-리보타입 017 균주를 사용하는 실시예 4에 기재된 햄스터 시험감염 연구의 결과를 제공한다. 패널 A에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 분변/스코어(설사 질환)이다. 패널 B에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 생존율%이다. 패널 C에 도시된 것은 위약 대조군과 비교한 백신 그룹에서의 시간 경과에 따른 체중 변화%이다

발명의 요지

본 발명은 다수의 씨. 디피실 균주/톡시노타입, 특히 씨. 디피실 2성분 톡신("CDT"; 예를 들면, 이의 서브유닛 CDTa 및/또는 CDTb로부터의 2성분 톡신)을 발현하는 균주/톡시노타입 및 씨. 디피실 2성분 톡신을 발현하지 않는 균주/톡시노타입 둘 다에 대한 치료적 및/또는 보호적 면역원성 조성물(예를 들면, 백신)로서 사용하기 위한 씨. 디피실 항원을 포함하는 조성물을 제공한다. 당업계의 숙련가들에게 자명할 수 있는 기타 양태들이 본 발명에 제공된다.

본 발명은 다수의 씨. 디피실 균주 및/또는 "톡시노타입"(즉, 톡신 A(예를 들면, TcdA 유전자로부터 발현됨), 톡신 B(예를 들면, TcdB 유전자로부터 발현됨)를 발현하고/발현하거나 씨. 디피실 2성분 톡신(CDTa 및/또는 CDTb 유전자로부터 발현된 "CDT"/"2성분 톡신")을 발현하거나, 상기 단백질들 중 어느 하나 이상도 발현하지 않음)에 대해 숙주를 면역화시키는 방법을 제공한다. 톡신 A를 발현하는 균주 및/또는 톡시노타입은 본원에서 "A⁺"로 표시되고; 톡신 A를 발현하지 않는 균주는 "A^-"로 표시된다. 톡신 B를 발현하는 균주 및/또는 톡시노타입은 본원에서 "B⁺"로 표시되고; 톡신 B를 발현하지 않는 균주는 본원에서 "B^-"로 표시된다. CDT를 발현하는 균주 및/또는 톡시노타입은 본원에서 "CDT⁺"로 표시되고; CDT를 발현하지 않는 균주는 본원에서 "CDT^-"로 표시된다. 균주 및/또는 톡시노타입은 이들 마커 중 어느 하나 이상을 임의로 조합하여 발현함(예를 들면, A⁺B⁺CDT⁺, A⁺B⁺CDT^-, A⁺B^-CDT⁺, A⁺B^-CDT^-, A^-B⁺CDT^-, A^-B^-CDT⁺ 등)을 특징으로 할 수 있다. 예를 들면, 톡시노타입 O는 A⁺B⁺CDT^-이고, 톡시노타입 III은 A⁺B⁺CDT⁺이고, 톡시노타입 IV는 A⁺B⁺CDT⁺이고, 톡시노타입 V는 A⁺B⁺CDT⁺이고, 톡시노타입 VIII은 A^-B⁺CDT^-이다.

씨. 디피실 톡시노타입의 다양한 유형은, 예를 들면, 톡신 유전자 tcdA의 A3 단편 및 톡신 유전자 tcdB의 B1 단편을 동정하기 위해 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용하는 PaLoc 영역(톡신 발현 유전자좌)의 제한 단편 길이 다형성(restriction fragment length polymorphism)(RFLP)에 기초한 방법과 같은 톡시노타입 측정 방법을 사용하여 동정할 수 있다. 일부 균주는 예를 들면, 참조 균주 VPI10463(백신 균주 ATCC43255)과 비교해 TcdA 및/또는 TcdB 유전자의 경미한 변화를 나타낼 수 있다. PCR 리보타입은 또한 16S 내지 23S 리보솜 DNA(rDNA) 사이의 유전자간 스페이서 영역(intergenic spacer region)(ISR)의 가변성을 이용함으로써 측정할 수 있다. 가변성은, 게놈에 존재하는 rDNA의 다수 카피들과 함께, 상이한 균주들에서의 PCR 증폭 후에 다양한 앰플리콘의 증폭을 야기한다. 지금까지, PCR 리보타이핑은 400가지 이상의 별개의 PCR 리보타입을 동정할 수 있다. 7개의 하우스키핑 유전자(MLST 7HG)를 나타내는 대략 300 bp 내지 500 bp 범위의 DNA 단편이 서열분석되는 다좌위 서열-기반 타이핑(Multi-Locus-Sequence-based typing) 방법 또한 사용할 수 있다. 이러한 방법은 클론성 복합체를 동정할 수 있도록 하고; 적어도 5가지의 계통(lineage)이 이러한 방법에 의해 동정되었다. 본원에 기재된 조성물은 이러한 기술들 중 어느 하나 이상 또는 당업계의 숙련가들이 이용 가능한 임의의 다른 기술에 의해 동정된 임의의 하나 이상의 균주 및/또는 톡시노타입에 대해 치료적으로 또는 보호적으로 백신접종하기 위해 사용될 수 있다.

클로스트리듐계 톡소이드의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 클로스트리듐 톡소이드 및 상기 톡소이드를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 본원에서 특히 관심있는 것은 씨. 디피실 톡신 A 및/또는 톡신 B 및/또는 이들의 유도체(예를 들면, 유전적으로 해독된 버젼, 절두된(truncated) 형태 등)이다. 본 발명의 목적상, 톡신 A 및/또는 톡신 B는 당업계의 표준 기술을 사용하여 톡신 A 및/또는 톡신 B로서 동정될 수 있는 어떠한 씨. 디피실 톡신이라도 포함할 수 있다. 예시적 기술은, 예를 들면, ELISA, 돗트 블롯 또는 생체내 검정과 같은 면역검정을 포함할 수 있다. 이러한 동정을 실행하는데 유용한 시약은 예를 들면, 항-톡신 A 토끼 폴리클로날 항혈청(예를 들면, Abcam^® 제품 번호 ab35021 또는 Abcam^® 제품 번호 ab93318) 또는 항-톡신 A 마우스 모노클로날 항체(예를 들면, Abcam^® 제품 번호 ab19953(mAb PCG4) 또는 ab82285(mAb B618M) 중 어느 것), 항-톡신 B 토끼 폴리클로날 항혈청(예를 들면, Abcam^® 제품 번호 ab83066) 또는 항-톡신 B 마우스 모노클로날 항체(예를 들면, Abcam^® 제품 번호 ab77583(mAb B428M), ab130855(mAb B423M) 또는 ab130858(mAb B424M) 중 어느 것)(모두 Abcam^®(마이애미주 캠브리지)로부터 입수 가능함)을 포함한다. 본원에는, 1) 톡신 A 및 톡신 B를 포함하는 씨. 디피실 배양물을 제공하는 단계; 2) 상기 배양물로부터 톡신 A 및 톡신 B를 정제하여 각 톡소이드의 별개의 조성물을 제공하는 단계; 3) 상기 정제된 톡신 A 및 정제된 톡신 B를 적당한 온도(예를 들면, 약 17 내지 32℃(예를 들면, 약 25℃) 중 어느 것)에서 (예를 들면, 각 톡신이 상응하는 톡소이드로 불활성화되도록 하는) 적당량의 시간(예를 들면, 약 2일 내지 약 21일 중 어느 것) 동안 약 0.15% 내지 약 0.5% 포름알데히드(w/v)(예를 들면, 톡소이드 A의 경우 약 0.2%(예를 들면, 약 0.21%) 및/또는 톡소이드 B의 경우 약 0.4%(예를 들면, 약 0.42%)와 같은 약 0.2% 내지 0.8% 중 어느 것)와 함께 항온배양하여 불활성화시킴으로써 각각 톡소이드 A 및 톡소이드 B 조성물을 제조하는 단계; 및 4) 상기 톡소이드들을 배합하여 오직 "잔량"의 포름알데히드(예를 들면, 약 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.01%, 0.016%, 0.02% 또는 0.025%(w/v) 중 어느 것와 같은 약 0.0001% 내지 0.025%(바람직하게는 약 0.004% 또는 0.008%) 중 어느 것)만을 함유하는 톡소이드 면역학적 조성물 및/또는 백신을 제조하는 단계 중 하나 이상에 의해 고온(예를 들면, 37℃)에서 안정하고 소량의 포름알데히드를 함유하는 씨. 디피실 톡소이드 조성물을 제조하는 방법이 제공된다. 조성물에 함유된 포름알데히드의 양이 전형적으로 조성물의 백분율(체중/용적("w/v"))의 측면에서 언급되지만, 단백질 농도와 같은 특정 인자에 기초하여 화학량론을 조정하는 것이 중요할 수 있다. 예를 들면, 본원에서 고려되는 포름알데히드의 적합한 농도는, 폴리펩타이드들을 서로 실질적으로 가교시키지 않으면서(예를 들면, 분자간 가교를 생성하지 않으면서) 개개의 톡신 A 및/또는 톡신 B 폴리펩타이드 내의 분자간 가교를 제공할 수 있는 농도이다. 실시예에 제시된 바와 같이, 0.5 mg/ml 톡신 A를 포함하는 조성물은 단지 0.21%(w/v) 포름알데히드만을 요할 수 있다. 그러나, 보다 높은 농도의 톡신 A를 포함하는 조성물은 상당량의 분자간 가교를 생성하지 않으면서 필요한 분자내 가교(예를 들면, 톡소이드화)를 생성하기 위해 보다 높거나 낮은 농도의 포름알데히드를 요할 수 있다. 동일한 원리는 톡신 B의 톡소이드화에 적용될 수 있다. 특정한 조성물에 적합한 조건은 본원에 기재되어 있거나 당업계에서 이용가능할 수 있는 기술을 사용하여 당업계의 숙련가들에 의해 측정될 수 있다. 예를 들면, 특정량의 포름알데히드가 조성물 중의 특정 톡신의 톡소이드화에 효과적인지 여부는 실시예 단락에 기재된 세포독성 검정, 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 아민 함량 분석, 항원성 및 면역원성 검정 중 어느 하나 이상을 사용하여 측정할 수 있다.

포름알데히드가 본원에서 사용되지만, 당업계의 숙련가들에 의해 결정될 수 있는 다른 유사한 제제가 이를 대체할 수 있음이 또한 이해되어야 한다. 예를 들면, 일부 양태에서, 포름알데히드는 글루타르알데히드로 대체될 수 있다. 이러한 대체를 실행하기 위해 상이한 농도가 요구될 수 있지만, 이러한 대체에 적합한 조건은 본원에 기재된 기술(예를 들면, 실시예 단락에 기재된 세포독성 검정, 음이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 아민 함량 분석, 항원성 및 면역원성 검정 중 어느 하나 이상)을 사용하여 결정할 수 있다.

특정 양태에서, 톡신 A는 적당량의 시간(예를 들면, 10분과 같은 약 1분 내지 60분 중 어느 것) 동안 적당량의 포름알데히드(예를 들면, 약 0.2% 포름알데히드)와 혼합하여 톡소이드 A를 생성하고 이어서 적당한 온도(예를 들면, 약 25℃)에서 적당량의 시간(예를 들면, 약 6일 내지 12일 중 어느 것과 같은 약 2일 내지 21일 중 어느 것(예를 들면, 약 6일)) 동안 항온배양할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 본원의 실시예에 제시된 바와 같이, 톡신 A는, 약 0.21%(w/v) 포름알데히드를 포함하는 제형 중의 톡신 A를 약 25℃에서 약 6일 내지 약 12일 동안 항온배양함으로써 톡소이드 A로 전환시킬 수 있다. 특정 양태에서, 톡신 B를 적당량의 시간(예를 들면, 10분과 같은 약 1분 내지 60분 중 어느 것) 동안 적당량의 포름알데히드(예를 들면, 약 0.42%)와 혼합하고 이어서 적당한 온도(예를 들면, 약 25℃)에서 적당량의 시간(예를 들면, 약 13일 내지 21일 중 어느 것과 같은 약 2일 내지 30일(예를 들면, 약 21일)) 동안 항온배양하여 톡소이드 B를 생성할 수 있다. 일부 바람직한 양태에서, 본원의 실시예에 제시된 바와 같이, 톡신 B를 약 0.42%(w/v) 포름알데히드를 포함하는 제형 중에서 약 25℃에서 약 13일 내지 약 20일 동안 항온배양함으로써 톡신 B를 톡소이드 B로 전환시킬 수 있다. 포름알데히드를 37% 포름알데히드의 스톡 용액으로부터 톡신 A 또는 톡신 B를 포함하는 용액 중으로 목적하는 양으로 도입시킨 다음, 일정 기간(예를 들면, 5분 내지 10분) 동안 항온배양하고 적당한 온도 및 시간(예를 들면, 수일 동안 2 내지 8℃) 동안 저장할 수 있다. 특정 양태에서, 정제된 톡신 A와 정제된 톡신 B를 배합한 다음, 적당량의 시간(예를 들면, 10분 같은 약 1분 내지 60분 중 어느 것) 동안 적당량의 포름알데히드(예를 들면, 약 0.42%)와 혼합한 다음, 적당한 온도(예를 들면, 약 25℃)에서 적당량의 시간(예를 들면, 약 13일 내지 21일 중 어느 것과 같은 약 2일 내지 30일(예를 들면, 약 21일)) 동안 항온배양하여 톡소이드 A 및 톡소이드 B를 생성할 수 있다. 상기 톡소이드들은 적합한 완충액(예를 들면, 약 20 내지 150 mM 포스페이트(예를 들면, 100 mM), pH 7.0)에 함유될 수 있다. 이어서, 톡소이드 A 및 톡소이드 B 조성물을 적합한 완충액 중에서 (예를 들면, 20 mM 시트레이트, pH 7.5, 5% 내지 8% 슈크로스(예를 들면, 8%)와 같은 적당한 완충액으로 투석여과에 의해)배합하여 톡소이드 A/B 면역원성 조성물 및/또는 백신(예를 들면, 이는 본원에서 "조성물"로 총칭될 수 있다)을 생성할 수 있다. 이러한 조성물은 또한 표준 기술을 사용하여 동결건조된 형태로 제조할 수도 있다. 따라서, 일부 양태에서, 톡소이드 면역학적 조성물은, 예를 들면, 이로부터 재구성된 조성물(예를 들면, 의약품)보다 더 높은 농도의 포름알데히드를 함유할 수 있는 동결건조된 형태일 수 있다. 예를 들면, 동결건조된 조성물은 약 0.016% 포름알데히드(w/v)를 포함할 수 있지만, 숙주에게 투여하기 위해 재구성한 후에 조성물(예를 들면, 의약품)은 0.016% 미만의 포름알데히드(w/v)(예를 들면, 약 0.001%, 0.002%, 0.003%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007%, 0.008%, 0.01 (w/v) 중 어느 것)를 포함할 수 있다. 이어서, 일부 양태에서, 톡소이드 A/B 면역학적 조성물 및/또는 백신(예를 들면, "의약품")은 약 0.0001% 내지 0.025% 포름알데히드(w/v) 중 어느 것(예를 들면, 약 0.001%, 0.002%, 0.004%, 0.005%, 0.006%, 0.007% 0.008%, 0.01%, 0.016%, 0.02% 또는 0.025%(w/v) 중 어느 것)(예를 들면, "잔류 포름알데히드")을 포함할 수 있다. 의약품 중에 잔류 포름알데히드를 포함시키는 것은, 이것이 조성물이 일정 기간(예를 들면, 약 6주) 동안 보다 고온(예를 들면, 예를 들면 실온 또는 37℃와 같은 4℃ 초과)에서 유지될 경우에 톡소이드 A 및/또는 톡소이드 B의 톡신 A 또는 톡신 B로의 각각의 회귀를 감소시킬 수 있고/있거나 방지할 수 있다는 점에서 특히 유익할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 일부 사례에서는 포름알데히드의 양을 증가시켜 톡신 불활성화 시간을 감소시킬 수 있음이 주지된다. 최종 조성물(예를 들면, 면역학적 조성물, 백신)은 단지 잔량의 포름알데히드만을 포함할 것이다. 실시예에 제시된 바와 같이, 이러한 공정들은 놀랍게도 유리한 생화학적 및 기능적 특성들을 갖는 면역학적 톡소이드 A/B-함유 조성물을 제공한다.

특정 양태에서, 본원에 기재된 방법들의 어떠한 시점에서라도, 그 방법에서의 포름알데히드의 기능성을 방해할 수 있는 특정 완충제 성분의 양을 조정하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들면, TRIS는 포름알데히드-매개 변형에 대해 단백질과 효과적으로 경쟁할 수 있는 아민 그룹을 가지며, 이로써 반응 혼합물 중의 유효 포름알데히드 농도를 저하시킬 수 있다. 따라서, 톡신 및/또는 톡소이드가 생성되는 조성물 중에서 TRIS의 양을 낮은 수준으로 유지시키는 것이 유익할 수 있다. 예를 들면, 톡신 제제 중의 잔류 TRIS 값을 보다 적합한 수준(예를 들면, 약 1 내지 약 5 ㎍/ml 미만(예를 들면, 1 ㎍/ml(예를 들면, 검출 한계치 미만) 또는 5 ㎍/ml))까지 저하시킬 수 있다. 실시예에 제시된 바와 같이, 톡신 제제 중의 잔류 TRIS 값은 놀랍게도, 정제된 톡신 A 및/또는 정제된 톡신 B를, 예를 들면, 접선 유동 여과(예를 들면, 플랫 스톡 Millipore PES50K를 이용함)(예를 들면, 중공 섬유 또는 기타 막 유형과 반대되는)를 사용하여 25mM Tris(예를 들면, MgCl₂를 제거하기 위해)로 투석여과한 다음, 포스페이트 완충액(예를 들면, 100 mM PO₄, pH 7)으로 투석여과함으로써 보다 적합한 수준으로 저하시킬 수 있다. 생성된 낮은 농도의 TRIS는, 일부 양태에서, 톡소이드화 공정을 실시하는데 요구되는 포름알데히드의 양을 보다 효과적으로 조정할 수 있게 한다. 기타 양태는, 예를 들면, 아민 그룹을 함유하지 않는 완충액(예를 들면, MEM, 아세테이트, 시트레이트) 및/또는 pH-제어 수용액(예를 들면, 산 또는 염기가 첨가될 수 있는 염수 또는 물)을 사용함을 수반할 수 있다.

따라서, 일부 바람직한 양태에서, Tris는 포스페이트 완충액과 같은 또 다른 완충액으로 대체될 수 있다. 예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같이, 정화된 씨. 디피실 배양 여액(예를 들면, 접선 유동 여과에 의해 농축 및 투석여과됨)을 Tris 완충액(예를 들면, 50 mM Tris/NaCl/0.2mM EDTA/1mM DTT, pH 7.5)으로 가공할 수 있다. 이어서, 생성된 용액을 (예를 들면, 막 필터를 사용하여) 여과하고 황산암모늄 농도를 대략 적당량(예를 들면, 약 0.4M)으로 조정한 다음, (예를 들면, 막 필터를 사용하여) 추가 여과를 수행할 수 있다. 이어서, 씨. 디피실 톡신 A 및 톡신 B를 함유하는 상기 수용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용시키고, 톡신을 Tris 완충액으로 세척할 수 있는 크기 배제(예를 들면, 세파로스) 컬럼에 결합시킬 수 있다. 이어서, 씨. 디피실 톡신을 DTT 및 IPA를 함유하는 Tris 완충액으로 용출시키고 풀링(pooling)하고 WFI를 사용하여 약 9mS 이하의 전도도로 조정할 수 있다. 이어서, (풀링된 용출물 중의) 이들 씨. 디피실 톡신을 Tris 완충액과의 평형을 수반하는 음이온 교환 크로마토그래피와 같은 또 다른 방법에 의해 추가 정제할 수 있다. 이어서, 톡신 A를 저염 Tris 완충액으로 용출시킬 수 있고, 톡신 B를 고염 Tris 완충액으로 용출시킬 수 있다. 이어서, 정제된 톡신 A를 함유하는 용액 또는 정제된 톡신 B를 함유하는 용액을 각각 농축시키고 100 mM PO₄, pH 7과 같은 포스페이트 완충액으로 투석여과시킬 수 있다(여기서, 잔류 TRIS 값은 바람직하게는 약 1 내지 약 5 ㎍/ml 미만이다). 보다 낮은 농도의 포스페이트(예를 들면, 20 mM)는 적절하지 않을 수 있고, 증가된 다량체화(이는 가능하다면 최소화되어야 한다)를 유도할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 바람직한 적합한 포스페이트 완충액은 예를 들면, 약 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195 또는 200 mM 중 어느 것와 같은 약 20 mM 초과 내지 약 200 mM 이하의 임의의 포스페이트 농도를 포함할 수 있다. 이어서, 본원의 실시에에 제시된 바와 같이, 톡신 A를 약 25℃에서 약 6일 동안 pH 7의 100 mM PO₄ 중에 약 0.21%(w/v) 포름알데히드를 포함하는 제형과 혼합하여 톡신 A를 톡소이드 A로 전환시킬 수 있다. 그리고, 일부 바람직한 양태에서, 본원의 실시예에 제시된 바와 같이, 톡신 B를 약 25℃에서 약 13일 동안 100 mM PO₄(pH 7) 중의 약 0.41%(w/v) 포름알데히드의 제형과 혼합하여 톡신 B를 톡소이드 B로 전환시킬 수 있다. 당업계의 숙련가들에 의해 이해될 수 있는 바와 같은 기타 적합한 완충액도 또한 고려된다.

당업계의 숙련가들은 특정한 조건들을 검정하여 조성물의 특징이 허용되는지 여부를 결정함으로써 특정한 조건들(예를 들면, 완충액(또는 이의 성분), 시간, 온도)이 상기 톡소이드 A 및/또는 톡소이드 B 조성물을 제조 및/또는 유지하는데 있어 사용하기에 적합한지 여부를 결정할 수 있다. 예를 들면, 조성물을 세포독성 검정(예를 들면, IMR-90 세포주(예를 들면 본원 실시예 참조) 또는 Vero 세포를 사용함), 음이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피(AEX-HPLC), 크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC), 효소-결합 면역흡착 검정(ELISA), 280nm에서의 흡광도를 사용하여 측정된 농도, 회귀 분석(예를 들면, 본원 실시예 참조) 및/또는 생체내 효능 검정(예를 들면, 본원 실시예에 기재된 햄스터 효능 검정)을 사용하여 시험할 수 있다. 유리한 조건하에 제조된 조성물은 전형적으로 다음 중 어느 하나 이상을 나타낼 수 있다: 세포독성 검정에서 모니터링된 세포에 대해 세포독성이 거의 없거나 전혀 없음; 톡소이드(들)의 다량체화를 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는 AEX-HPLC 및/또는 SEC-HPLC 크로마토그램; 1에 가까운 ELISA/A280 값(예를 들면, 전형적으로 1에서 먼 ELISA/A280 값을 나타낼 수 있는 불리한 조건하에 제조된 조성물과 비교해); 시험 기간 동안 톡소이드에서 톡신으로의 회귀가 거의 없거나 전혀 없음; 및/또는 생체내 검정 동안 면역원성(예를 들면, 햄스터 효능 검정에서 4.8 이상의 Log10 역가). 당업계의 숙련가들에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 이러한 결정을 수행하기 위해 기타 방법들을 사용할 수도 있다.

본원에 기재된 방법들은 사실상 씨. 디피실의 어떠한 균주로부터의 톡신에라도 적용될 수 있다. 씨. 디피실의 바람직한 균주는 톡신 A 및/또는 B를 생산하는 균주이며, 예를 들면, 톡시노타입 0(A⁺B⁺CDT^-; 예를 들면, VPI10463/ATCC43255(PCR 리보타입 087), 630; 특히 PCR 리보타입 001, 002, 012, 014/020), III(A⁺B⁺CDT⁺; 예를 들면, 027/NAP/B1, NAP1/027/BI17, IPP4038(PCR 리보타입 027), CDC 13695#7(PCR 리보타입 027), SP041(PCR 리보타입 027)), IV(A⁺B⁺CDT⁺; 예를 들면, NK91(PCR 리보타입 023)), V(A⁺B⁺CDT⁺; 예를 들면, BAA-1875(PCR 리보타입 078/126)) 및/또는 VIII(A^-B⁺CDT^-; 예를 들면, ATCC43598 (PCR 리보타입 017))의 균주들을 포함하나 이들로 제한되지 않는다. 일부 양태에서, 상기 방법들은 모든 톡시노타입 0, III, IV, V 및 VIII에 대한 면역화(예를 들면, 치료적으로 또는 보호적으로)를 제공한다. 일부 양태에서, 상기 방법들은 CDT⁺ 및 CDT^- 균주/톡시노타입 둘 다에 대한 면역화를 제공한다. 당업계가 CDT 서브유닛이 백신에 포함되지 않는 한, 재조합 톡신으로부터 제조된 톡소이드가 CDT⁺ 씨. 디피실 균주에 대한 면역을 제공할 수 없다고 인식하여 왔다는 점(예를 들면, WO 2013/112867 참조)을 제외하면, 방법들은 재조합 방법을 사용하여 생산된 씨. 디피실 톡신에도 적용될 수 있다. 톡신(예를 들면, 톡신 A 및/또는 톡신 B)은 당업계에 공지된 방법(예를 들면, 미국 특허 제6,669,520호)을 사용하여 씨. 디피실의 배양 여액으로부터 정제할 수 있다. 씨. 디피실의 배양 여액으로부터 톡신을 정제하는 예시적 방법은 본원의 실시예에 기재되어 있다. 바람직하게는, 톡신은 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 중 어느 것의 순도를 갖는다. 톡신은 함께 또는 개별적으로 불활성화시킬 수 있다. 예를 들면, 정제된 톡신을 목적하는 톡신 A:톡신 B 비(예를 들면, 3:1, 3:2, 5:1, 1:5)로 혼합하고 이어서 불성화시킬 수 있거나 개별적으로 불활성화시킬 수 있다. 바람직하게는, 톡신을 개별적으로 불활성화시켜 톡소이드를 생성한다. 용어 "톡소이드"는 본원에서 화학적 처리에 의해 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 톡신을 설명하기 위해 사용된다. 톡신은, 예를 들면, 시험관내 세포독성 검정 또는 생체내 검정에 의해 측정시, 미처리된 톡신보다 적은 독성(예를 들면, 100%, 99%, 95%, 90%, 80%, 75%, 60%, 55%, 50%, 25% 또는 10% 미만의 독성)을 가질 경우에 불성화된 것으로 언급된다. 본원에 개시된 바와 같이, 톡신은 포름알데히드 처리를 사용하여 불활성화시킨다. 기타 사용 가능한 화학적 수단은 예를 들면, 글루타르알데히드, 퍼옥사이드, β-프리오피오락톤 또는 산소 처리를 포함한다.

불활성화는 톡신(들)을 톡소이드의 톡신으로의 회귀를 방지하는 양의 포름알데히드와 함께 항온배양하여 수행할 수 있다. 회귀는 정제된 톡신 A 또는 톡신 B를 포함하는 완충액 중에 적합한 양의 포름알데히드를 포함시켜 방지할 수 있다. 완충액 중의 포름알데히드의 양은 회귀를 방지하기에 적당한 농도의 포름알데히드를 유지하도록 조정할 수 있다. 이를 위해, 포름알데히드의 잔류 농도를 완충액(및/또는 약제학적 조성물)에 포함시킬 수 있다. 포름알데히드의 잔류 농도는 회귀를 방지하고/방지하거나 본원에 기재된 조성물이 투여되는 개체에게 적은 부작용 위험성을 나타내는 농도이다. 예를 들면, 잔류 포름알데히드 농도는 특히 약 0.0001% 내지 0.025% 포름알데히드(w/v)(예를 들면, 약 0.004%, 0.008%, 0.016% 또는 약 0.01% 중 어느 것), 약 0.001% 내지 약 0.020%(w/v), 약 0.004% 내지 약 0.020%(w/v)(예를 들면, 약 0.016% ± 0.04%) 또는 약 0.004% 내지 0.010%(w/v)(예를 들면, 약 0.008%) 중 어느 것의 범위일 수 있다. 회귀의 방지는 전형적으로 37℃에서 저장 후 검출가능한 세포독성이 본원에 기재된 시험관내 검정(예를 들면, 실시예의 세포독성 검정을 참조)에 의해 관찰되지 않을 때에 확인된다. 회귀의 "실질적" 방지는 전형적으로 실시예에 기재된 시험관내 검정에 의거해 37℃에서의 저장 후 톡소이드의 10% 미만이 톡신으로 회귀하는 것을 의미한다. 적합한 시험관내 세포독성 검정은 예를 들면 Vero 세포를 사용하는 세포-기반 형광 검정일 수 있다. 또 다른 적합한 시험관내 세포독성 검정은 IMR90 세포(예를 들면, ATCC^® 수탁번호 CCL-186)를 사용하여 수행할 수 있다. 시험 물질(예를 들면, 톡소이드)의 독성은 세포의 50%가 이의 정상적인 선 모양 형태학과 대조적으로 원형이 되는 최소 농도로서(예를 들면, MC-50) 정의될 수 있다. 본원의 실시예에 기재되어 있는 바와 같이, 본원에 기재된 방법에 의해 제조된 톡소이드 및 0.008% 이하의 포름알데히드를 포함하는 백신 조성물은 37℃에서의 저장 후 시험관내 검정에 의해 검출 가능한 세포독성을 나타내지 않았다. 물리화학적 분석(예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피)도 또한 회귀를 평가하기 위해 사용될 수 있지만, 시험관내 세포독성 검정이 보다 유용할 수 있다. 톡소이드의 효능은 또한 log10 항-톡신 A 또는 항-톡신 B IgG 역가의 평균을 측정하는 햄스터 생체내 효능 검정에 의해서도 측정할 수 있다.

일부 양태에서, 적당량의 포름알데히드를 37% 포름알데히드의 용액으로부터 톡신에 첨가할 수 있다. 톡신은 바람직하게는 포름알데히드를 첨가하기 전에 적합한 완충 용액(예를 들면, 100mM 인산나트륨 완충액, pH 7.0) 중에 존재한다. 그 안의 톡신 농도는, 예를 들면, 약 0.1 내지 약 5 mg/mL(예를 들면, 0.5 mg/mL)일 수 있다. 불활성화 공정을 시작하기 위해, 톡신을 먼저 적합한 시간(예를 들면, 10분) 동안 적합한 농도의 포름알데히드(예를 들면, 약 0.1% 내지 약 0.6%)와 혼합할 수 있다. 예를 들면, 정제된 톡신 A(pH 7.0의 100 mM 인산나트륨 중의 0.5 mg/ml의 정제된 톡신 A)는 약 10분 동안 약 0.2% 포름알데히드와 혼합할 수 있다. 그리고, 정제된 톡신 B(예를 들면, pH 7.0의 100 mM 인산나트륨 중의 0.5 mg/ml의 정제된 톡신 B)는 약 10분 동안 약 0.4% 포름알데히드와 혼합할 수 있다. 이어서, 이러한 혼합물을 (예를 들면, 0.2㎛ 막 필터를 사용하여) 여과하여, 280 nm에서의 흡광도에 의해 단백질 농도에 영향을 줄 수 있는 소형 단백질 응집체를 제거할 수 있다(예를 들면, 의도된 톡소이드 A:톡소이드 B 비에서의 약제학적 조성물의 정밀한 제형화가 가능하다). 이어서, 상기 혼합물을 약 1일 내지 21일(예를 들면, 약 2일, 약 6일 또는 약 13일) 동안 항온배양하여 불활성화를 지속할 수 있다. 예를 들면, 톡신 A 혼합물은 적합한 온도(예를 들면, 약 25℃)에서 13일 이하(예를 들면, 약 2일 또는 약 6일) 동안 항온배양할 수 있다. 그리고 톡신 B 혼합물은 적합한 온도(예를 들면, 약 25℃)에서 21일 이하(예를 들면, 약 2일, 약 6일 또는 약 13일) 동안 항온배양할 수 있다. 이러한 방식으로, 톡소이드 A 및 톡소이드 B의 제제가 제공될 수 있다. 이러한 제제들은 전형적으로 적어도 약 90%, 95%, 99% 또는 100% 톡소이드(예를 들면, 불활성화된 톡신) 중 어느 것을 포함한다.

이러한 톡소이드 제제들을 직접 완충액과 혼합할 수 있지만, 바람직하게는 제제들을 농축시키고 적절한 완충 용액으로 투석여과한다. 바람직하게는, 농축 및 투석여과는 포름알데히드의 제거 및 완충액으로의 교환을 보장하면서 단백질 전단을 최소화하기 위해 접선 유동 여과을 사용하여 수행한다. 완충액은 바람직하게는 톡소이드의 안정성을 증가시키고/증가시키거나 톡소이드의 응집을 지연 또는 감소시키는 적어도 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함한다. 사용에 적합한 부형제는, 예를 들면, 당(예를 들면, 슈크로스, 트레할로스) 또는 당 알코올(예를 들면, 소르비톨) 및 염(염화나트륨, 염화칼륨, 염화마그네슘, 마그네슘 아세테이트) 또는 이들의 조합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 추가로, 적합한 부형제는, 예를 들면, 미국 특허공보 제2011/045025호(일련번호 12/667,864)에 기재된 것들 중 임의의 것일 수 있다. 불활성화 후, 불활성화된 톡신(즉, 톡소이드)의 용액은, 농축 및/또는 한외여과 및/또는 투석여과하고, 톡소이드의 세포독성 형태(예를 들면, 톡신)로의 회귀를 방지하거나 실질적으로 방지하는 pH 8.0 이하(예를 들면, 약 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9 또는 8.0 중 어느 것과 같은 6.5 내지 7.7)의 적절한 완충액(예를 들면, 약 5 내지 약 100 mM(예를 들면, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 mM 중 어느 것)의 시트레이트, 포스페이트, 글리신, 카보네이트, 바이카보네이트 등과 같으나 이들로 제한되지 않는 완충액)(예를 들면, pH 7.5의 20 mM 시트레이트) 중에서 저장할 수 있다. 예시적 완충액은, 예를 들면, 적합한 양의 포름알데히드(예를 들면, 0.016%(w/v))를 함유하는 20 mM 시트레이트, pH 7.5, 5% 내지 8% 슈크로스일 수 있다. 당업계의 숙련가들에 이해될 수 있는 기타 양태도 또한 적합할 수 있다.

톡소이드는 약제학적 조성물(예를 들면, 면역원성 및/또는 백신 조성물)로서 사용하기 위해 제형화할 수 있다. 예를 들면, 씨. 디피실 톡소이드를 포함하는 조성물은, 톡소이드를 약제학적으로 허용되는 희석제(예를 들면, 생리 식염수)에 현탁시키거나 톡소이드를 약제학적으로 허용되는 담체와 회합시킴으로써 투여용으로 제조될 수 있다. 이러한 약제학적 제형은 당업계에 공지된 하나 이상의 부형제(예를 들면, 희석제, 증점제, 완충제, 보존제, 어쥬번트, 세제 및/또는 면역자극제)를 포함할 수 있다. 적합한 부형제는 톡소이드와 그리고 어쥬번트(어쥬번트 첨가된 조성물에서)와 상용성일 것이며, 이의 예는 공지되어 있고 당업계의 숙련가들이 입수 가능하다. 조성물은 액체 형태 또는 (표준 방법에 따라서) 동결건조된 형태 또는 발포 건조된(예를 들면, 미국 특허공보 제2009/110699호 기재된 바와 같음) 형태일 수 있다. 예시적인 동결건조된 백신 조성물은, 예를 들면, 톡소이드 A 및 B, 20 mM 시트레이트, 8% 슈크로스, pH 7.5의 0.016% 포름알데히드를 포함할 수 있다.

투여용 백신을 제조하기 위해, 건조된 조성물을, 예를 들면, 주사용 수 또는 적합한 희석제 또는 완충 용액과 같은 수용액으로 재구성할 수 있다. 특정 예에서, 희석제는 본원에 기재된 바와 같은 포름알데히드를 포함한다. 희석제는 포름알데히드의 존재 또는 부재하의 어쥬번트(예를 들면, 수산화알루미늄)를 포함할 수 있다. 예시적 희석제는 NaCl 및 수산화알루미늄의 수용액일 수 있다. 이러한 희석제는 건조된 조성물을 재구성하기 위해 사용할 수 있다. 약제학적 조성물은 약 10 내지 150㎍/mL(예를 들면, 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140 또는 150㎍/mL 중 어느 것) 용량의 톡소이드를 포함할 수 있다. 전형적으로, 주사를 위한 용량의 용적은 약 0.5 mL 또는 1.0 mL이다. 투여량은 대상체에서 유도될 면역 반응을 조정하도록 증가되거나 감소될 수 있다. 톡소이드는 어쥬번트의 존재 또는 부재하에, 당업계의 숙련가들에 의해 결정될 수 있는 양으로 투여될 수 있다. 유용한 어쥬번트는 수산화알루미늄, 인산알루미늄 및 알루미늄 하이드록실 포스페이트와 같은 알루미늄 화합물을 포함한다. 예를 들면, 실시예에 기재된 동물 실험에서, 조성물은 5㎍의 톡소이드 A 및 톡소이드 B(2가 톡소이드) 및 20㎍ 또는 160㎍ 어쥬번트(면역화 용량에 따름, 인간 용량의 1/20에 상응함)를 포함한다. 당업계의 숙련가들에 의해 이해될 수 있는 톡소이드와 어쥬번트의 기타 조합이 적합할 수 있다.

면역학적 및/또는 백신 조성물은 증후성 씨. 디피실 감염을 갖거나 증후성 씨. 디피실 감염의 발병 위험에 처한 대상체에게 당업계의 숙련가들에 의해 적당한 것으로 결정된 양 및 용법으로 경피(percutaneous)(예를 들면, 근육내, 정맥내, 복강내 또는 피하), 피부통과(transdermal), 점막 경로에 의해 투여될 수 있다. 백신은 1회, 2회, 3회, 4회 이상 투여될 수 있다. 다수의 용량들이 투여될 경우, 그 용량들은, 예를 들면, 1주, 1개월 또는 수 개월만큼 서로 떨어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하여 톡신, 톡소이드 및/또는 이들을 포함하는 감염성 유기체에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다. 이것은 본원에 기재된 약제학적 조성물(예를 들면, 면역원성 조성물 및/또는 백신)을 대상체에게 투여하여 이 대상체의 면역계에 톡소이드 노출을 초래함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 상기 면역원성 조성물 및/또는 백신은 증후성 씨. 디피실 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해 사용될 수 있다.

조성물은 키트(예를 들면, 백신 키트)에 포함될 수 있다. 예를 들면, 키트는 본원에 기재된 조성물을 건조된 형태로 함유하는 제1 용기 및 상기 조성물을 재구성하기 위한 수용액을 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 키트는 조성물의 재구성된 액체 형태를 투여하기 위한 장치(예를 들면, 피하 주사기, 미세바늘 어레이) 및/또는 사용 지침서를 임의로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 조성물이 우수한 안정성을 갖고 중간 정도의 온도(예를 들면, 약 2 내지 8℃) 및 고온(예를 들면, 약 15℃, 25℃, 37℃ 이상)에서의 저장 기간 후에 비독성을 유지하는 것으로 밝혀졌기 때문에 이러한 키트가 사용 가능하다. 특정 예에서, 하기에서 추가로 기재되는 바와 같이, 조성물은 37℃에서의 저장 후에도 비독성(예를 들면, 회귀의 증거 없이)을 유지하였다.

따라서, 본 발명은, 예를 들면, 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및/또는 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 약 17 내지 32℃에서 약 2일 내지 약 21일 동안 약 0.15% 내지 0.5% 포름알데히드(w/v)와 함께 항온배양하여 불활성화시킴으로써 씨. 디피실 톡소이드를 생산하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 톡신 A를 약 25℃에서 약 2일 동안 약 0.2% 포름알데히드와 함께 항온배양하여 톡소이드 A를 생산할 수 있고/있거나 톡신 B를 약 25℃에서 약 13일 동안 약 0.4% 포름알데히드와 함께 항온배양하여 톡소이드 B를 생산한다. 이러한 방법에 의해 제조된 톡소이드 A 및/또는 톡소이드 B를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 정제된 씨. 디피실 톡소이드 A 및 정제된 씨. 디피실 톡소이드 B를 잔량의 포름알데히드(예를 들면, 약 0.004%, 0.008% 또는 0.016%(w/v))를 포함하는 조성물과 배합하여, 정제된 씨. 디피실 톡소이드 A 및 정제된 씨. 디피실 톡소이드 B를 포함하는 면역원성 조성물을 제조하는 방법이 또한 제공된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 37℃에서 최대 약 6주 동안 안정한 씨. 디피실 톡소이드 A 및/또는 정제된 씨. 디피실 톡소이드 B의 조성물을 제공할 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 기재된 방법은 정제된 씨. 디피실 톡신 A 또는 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 약 17 내지 32℃에서 약 2일 내지 약 21일 동안 약 0.15% 내지 0.5% 포름알데히드(w/v)와 함께 항온배양하여 불활성화시키고; 씨. 디피실 톡소이드 A 및 정제된 씨. 디피실 톡소이드 B를 잔량의 포름알데히드를 포함하는 조성물과 배합함을 또한 포함할 수 있다. 이러한 방법에 의해 제조된 씨. 디피실 톡소이드 A 및 B 조성물은 37℃에서 최대 약 6주 동안 안정하다. 이러한 조성물 중의 포름알데히드의 잔량은 약 0.004%, 0.008% 또는 0.016%(w/v) 중 어느 것일 수 있다. 조성물은 또한 pH 7.5의 약 20 mM 시트레이트, 4% 내지 8% 슈크로스 및 0.016% 포름알데히드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 동결건조될 수 있다. 이러한 방법들은 또한 톡신 A 및 톡신 B를 포함하는 씨. 디피실 배양물을 제공하고 상기 배양물로부터 톡신 A 및 톡신 B를 정제함을 포함할 수 있다. 이러한 방법들에 따라 생산된 씨. 디피실 톡소이드 A 또는 B가 또한 제공된다. 일부 양태에서, 이러한 조성물은 백신(예를 들면, 증후성 씨. 디피실 감염에 대한 보호적, 예방적 및/또는 치료적 반응을 제공한다)이다. 상기 조성물(예를 들면, 백신 조성물)은 톡소이드 A 및 톡소이드 B를 3:1 또는 3:2와 같은 5:1 내지 1:5의 A:B 비로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 동결건조되거나, 냉동 건조되거나, 분무 건조되거나, 발포 건조되거나, 액체 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제, 완충액, 예를 들면, 시트레이트, 포스페이트, 글리신, 카보네이트 또는 바이카네이트 완충액, 또는 pH-제어된 수용액, 및/또는 하나 이상의 당(예를 들면, 슈크로스, 트레할로스) 및/또는 당 알콜(소르비톨)을 포함할 수 있다. 기타 양태가 당업계의 숙련가들에게 자명할 것이다.

일부 양태에서, 본 발명은 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하는 씨. 디피실 균주 및 CDT를 발현하지 않는 씨. 디피실 균주에 대해 숙주를 면역화시키는 방법을 제공하며, 상기 방법은 약 17 내지 32℃에서 약 2일 내지 약 21일 동안 포름알데히드(w/v)와 함께 항온배양함으로써 불활성화시킨 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 포함하는 면역원성 조성물을 숙주에게 투여함을 포함하고, 여기서 톡신 A는 0.15% 내지 0.5% 포름알데히드(w/v)로 불활성화시키고 톡신 B는 0.15% 내지 0.8% 포름알데히드(w/v)로 불활성화시킨다. 균주는 어떠한 톡시노타입 및 리보타입의 것일 수 있다. 균주는 톡시노타입 0, III, IV, V 및/또는 VIII, 바람직하게는 모든 톡시노타입 0, III, IV, V 및 VIII의 것일 수 있다. 바람직한 양태에서, 정제된 톡신 A 및 정제된 씨. 디피실 톡신 B는 씨. 디피실 균주 VPI10463/ATCC43255와 같은, 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하지 않는 씨. 디피실 균주로부터 유래된다.

본 발명은 또한, CDT를 발현하지 않는 씨. 디피실 균주(예를 들면, 씨. 디피실 균주 VPI10463/ATCC43255)로부터 유래된 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 포함하는 조성물을 숙주에게 투여함으로써, 상기 숙주에서 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대한 특이성을 갖는 항체를 유도하는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 조성물의 투여 후 생산된 항체는 톡신 중화 검정(예를 들면, 실시예를 참조)에 의해 측정시 중화 항체일 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 이러한 검정을 사용하여 측정시 적어도 5.4의 상대적 효능(RE)을 나타낼 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법은 0, I, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX 및 XII로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입을 갖는 씨. 디피실 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시키는 항체의 생산을 유도할 수 있다. 일부 양태에서, 톡시노타입 0 균주는 001, 002, 012, 014, 020, 014/020, 014/020/077, 106, 018 및 053으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 PCR-리보타입을 가질 수 있고; 톡시노타입 III 균주는 PCR-리보타입 027 또는 075를 가질 수 있고; 톡시노타입 IV 균주는 PCR-리보타입 023을 가질 수 있고; 톡시노타입 V 균주는 078, 079, 122, 126 및 078/126으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 PCR-리보타입을 가질 수 있고; 톡시노타입 VI 균주는 PCR-리보타입 127 또는 66-2를 가질 수 있고; 톡시노타입 VII 균주는 PCR-리보타입 66-2를 가질 수 있고; 톡시노타입 VIII 균주는 PCR-리보타입 017을 가질 수 있고; 톡시노타입 IX 균주는 PCR-리보타입 019를 가질 수 있고; 톡시노타입 XII 균주는 PCR-리보타입 056을 가질 수 있고/있거나; 씨. 디피실 균주는 PCR-리보타입 046 또는 369를 가질 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 0, III, IV, V 및 VIII로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입을 갖는 씨. 디피실 균주, 예를 들면, 이들 톡시노타입 각각의 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시킬 수 있다(즉, 항체는 씨. 디피실 균주 톡시노타입 0, III, IV, V 및 VIII에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시킨다). 일부 이러한 양태에서, 톡시노타입 0 균주는 PCR-리보타입 012를 가질 수 있고, 톡시노타입 III 균주는 PCR-리보타입 027을 가질 수 있고, 톡시노타입 IV 균주는 PCR-리보타입 023을 가질 수 있고, 톡시노타입 V 균주는 PCR-리보타입 078을 가질 수 있고, 톡시노타입 VIII 균주는 PCR-리보타입 017을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 항체는 톡시노타입 III, IV 및 V의 씨. 디피실 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시킬 수 있다. 일부 이러한 양태에서, 톡시노타입 III 균주는 PCR-리보타입 027을 가질 수 있고/있거나, 톡시노타입 IV 균주는 PCR-리보타입 023을 가질 수 있고/있거나, 톡시노타입 V 균주는 PCR-리보타입 078을 가질 수 있다. 당업계의 숙련가들에 의해 이해될 수 있는 기타 양태도 또한 본 발명에 의해 고려된다.

본 발명은 또한 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하지 않는 씨. 디피실 균주(예를 들면, 씨. 디피실 균주 VPI10463/ATCC43255)로부터 유래된 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 포함하는 조성물을 숙주에게 투여함으로써 CDT를 발현하는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대해 숙주를 면역화시키고/면역화시키거나 백신접종하는 방법을 제공한다. 일부 이러한 양태에서, 숙주는 각각 0, III, IV, V 및/또는 VIII로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입을 갖는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대해 면역화되고/면역화되거나 백신접종될 수 있다. 일부 이러한 양태에서, 숙주는 III, IV 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입을 갖는 하나 이상의 씨. 디피실 균주, 예를 들면, 이러한 톡시노타입 각각의 균주에 대해 면역화되고/면역화되거나 백신접종될 수 있다(즉, 숙주는 각각 톡시노타입 III, IV 및 V를 갖는 씨. 디피실 균주들에 대해 면역화되고/면역화되거나 백신접종된다). 일부 양태에서, 톡시노타입 III 균주는 PCR-리보타입 027을 가질 수 있고, 톡시노타입 IV 균주는 PCR-리보타입 023을 가질 수 있고, 톡시노타입 V 균주는 PCR-리보타입 078을 가질 수 있다. 일부 양태에서, 씨. 디피실에 의해 유발되는 질환 및 사망에 대한 유의적 보호는 이러한 방법에 의해 숙주에게 제공될 수 있다. 일부 양태에서, 보호(예를 들면, 면역화 및/또는 백신접종)은 골든 시리안 햄스터 모델(Golden Syrian hamster model)을 사용하여 측정할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 적어도 3회 숙주에게 투여될 수 있고, 이러한 횟수는 약 7일, 10일 또는 14일(2주) 중 어느 것과 같은 충분한 시간으로 분리될 수 있고, 투여 사이의 시간은 동일하거나 상이할 수 있다. 어떠한 투여 경로에 의해서도 투여될 수 있지만, 일부 양태에서, 조성물은 근육내 경로를 통해 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 씨. 디피실의 CDT⁺ 균주로의 시험감염 후 햄스터 그룹의 생존율은 약 58% 내지 약 100%이다. 일부 양태에서, 보호는 통계학적으로 유의적일 수 있다. 일부 양태에서, 통계학적 유의성은 로그 순위 검정(log-rank test)을 사용하는 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법 및/또는 양방향 피셔 정확 검정(bilateral Fisher exact test)에 의해 측정할 수 있다(예를 들면, 햄스터 그룹의 대해: 카플란 마이어 로그 순위 검정을 이용시 p=0.0001 및 양방향 피셔 정확 검정을 이용시 p=0.0004; 카플란 마이어 로그 순위 검정을 이용시 p<0.001 및 양방향 피셔 정확 검정을 이용시 p-값=0.005; 카플란 마이어 로그 순위 검정 및 양방향 피셔 정확 검정 둘 다를 이용시 p-값 ≤ 0.0001; 및/또는 카플란 마이어 로그 순위 검정을 이용시 p-값=0.0020 및 양방향 피셔 정확 검정을 이용시 p=0.0046). 당업계의 숙련가들에 의해 이해될 수 있는 기타 양태도 또한 본 발명에 의해 고려될 수 있다.

따라서, 일부 양태에서, 조성물은 CDT를 발현하지 않고 CDT 또는 이의 서브유닛을 포함하지 않는 씨. 디피실 균주로부터 유래된 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 포함한다. 일부 양태에서, 씨. 디피실 톡신 A 및 톡신 B는 씨. 디피실 톡시노타입 0으로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 정제된 씨. 디피실 톡신 B는 씨. 디피실 균주 VPI10463/ATCC43255로부터 유래될 수 있다. 일부 양태에서, 톡신 A 및 톡신 B는 약 15 내지 32℃에서 약 2일 내지 약 21일 동안 포름알데히드와 함께 항온배양하여 불활성화시킬 수 있고, 여기서 톡신 A는 0.15% 내지 0.5% 포름알데히드(w/v)로 불활성화시킬 수 있고, 톡신 B는 0.15% 내지 0.8% 포름알데히드(w/v)로 불성화시킬 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 약 0.001% 내지 0.020% 포름알데히드(예를 들면, 약 0.004%, 약 0.008% 또는 약 0.016% 포름알데히드)를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 톡소이드 A 및 톡소이드 B는 5:1 내지 1:5의 A: B 비(예를 들면, 약 3:1 또는 3:2)로 조성물 중에 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 동결건조되거나, 분무 건조되거나, 발포 건조될 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 액체 형태일 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 시트레이트, 포스페이트, 글리신, 카보네이트 또는 바이카보네이트 완충액 또는 pH-제어 수용액 및/또는 하나 이상의 당 및/또는 당 알코올을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 슈크로스 및/또는 시트레이트를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 알루미늄을 포함하는 어쥬번트(예를 들면, 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄)와 같은 어쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 조성물은 약 20 ㎍ 내지 약 160 ㎍ 수산화알루미늄을 포함할 수 있다. 당업계의 숙련가들에 이해될 수 있는 기타 양태도 또한 본 발명에 의해 고려될 수 있다.

"정제된" 톡신은 전형적으로 톡신이, 예를 들면, 배양 여액으로부터 단리되었고, 당업계에 공지된 방법을 사용하여 적어도 어느 정도로 정제되었음을 의미한다. 톡신을 정제하는 예시적인 방법은, 예를 들면, 본원에 기재되어 있다. 일부 양태에서, 정제된 톡신은 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 중 어느 것의 순도를 가질 수 있다. 유사하게, "정제된" 톡소이드는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상 중 어느 것의 순도를 갖는 톡소이드일 수 있다.

용어 "약", "대략" 등은, 수치 값 또는 범위의 목록 앞에 있는 경우, 이 용어가 목록 또는 범위 내의 각각의 개별 값의 바로 앞에 오는 것처럼 독립적으로 목록 또는 범위 내의 각각의 개별 값을 나타낸다. 상기 용어는 이것이 나타내는 값이 이것과 정확히 같거나 이에 가깝거나 유사함을 의미한다. 예를 들면, 용어 "약" 또는 "대략"은 제시된 값의 +/-10% 값을 포함할 수 있다(예를 들면, "약 30℃"는 30℃를 포함하지만 이에 제한되지 않는 27℃ 내지 33℃ 사이의 어떠한 값도 의미할 수 있다).

용어 "대상체" 및 "숙주"는 본원에서 상호교환 가능하게 사용된다.

용어 "항온배양하는", "혼합하는" 및 "저장하는"(또는 이들의 동의어 및/또는 파생어)은 상호교환 가능하게 사용될 수 있다. 예를 들면, 톡신은 포름알데히드를 포함하는 용액과 함께 항온배양될 수 있다. 이러한 항온배양은 임의로, 예를 들면, 조성물이 (예를 들면, 혼합 막대 등을 사용하여) 움직임에 의해 능동적으로 배합되거나, 본질적으로 고정 상태로 유지됨을 의미할 수 있다.

임의의(optional) 또는 임의로(optionally)는 후속적으로 기재된 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않을 수 있으며, 설명이 사건 또는 상황이 발생한 경우와 발생하지 않은 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들면, 임의로 조성물은 배합물을 포함할 수 있다라는 어구는, 설명이 배합물 및 배합물의 부재(즉, 배합물의 개별 구성원) 둘 다를 포함하도록, 조성물이 상이한 분자들의 배합물을 포함할 수 있거나 배합물을 포함하지 않을 수 있음을 의미한다.

범위는 약 하나의 특정 값 내지 및/또는 약 또 다른 특정 값으로서 본원에서 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 경우, 또 다른 양상은 하나의 특정 값 내지 및/또는 다른 특정 값을 포함한다. 유사하게, 선행하는 약 또는 대략의 사용에 의해 값이 근사치로서 표현되는 경우, 특정 값이 다른 양상을 형성하는 것으로 이해될 것이다. 범위의 각각의 종점은 다른 종점과 관련하여 그리고 다른 종점과 무관하게 둘 다 유의적인 것으로 추가로 이해될 것이다. 범위(예를 들면, 90 내지 100%)는 이 범위 자체뿐만 아니라 각각의 값이 개별적으로 열거된 것처럼 각각의 독립적인 값들을 포함하는 것으로 의도된다.

용어 예방하다, 예방하는 및 예방이 소정의 병태를 위한 소정의 치료(예를 들면, 증후성 감염을 예방하는)와 연관하여 본원에서 사용될 경우, 이것은 치료된 대상체에서 임상적으로 관찰 가능한 수준의 병태가 전혀 발병하지 않거나, 치료를 받지 않았을 때보다 더 느리게 그리고/또는 덜한 정도로 발병함을 전달하기 위해 의도된다. 이러한 용어들은 단지 대상체가 병태의 양상을 전혀 경험하지 않는 상황으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 치료가 예상했던 것보다 더 적은 그리고/또는 더 경미한 증상을 대상체가 경함하도록 한다면, 치료는 증후성 감염을 예방하였다고 언급될 것이다. 치료는 대상체가 감염의 단지 경미한 현성 증상들을 나타내도록 함으로써 증후성 감염을 "예방"할 수 있으며; 이것은 감염 미생물에 의한 어떠한 세포 침투도 없었어야 함을 의미하는 것은 아니다.

유사하게, (예를 들면, 증후성 씨. 디피실 감염의 위험을 감소시키는) 소정의 치료에 의한 감염 위험과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 감소하다, 감소하는 및 감소는 전형적으로, 치료(예를 들면, 개시된 톡소이드를 사용한 투여 또는 백신접종)의 부재하의 대조 또는 기저 수준의 감염 발병과 비교해 대상체에서 감염이 더 느리게 또는 덜한 정도로 발병함을 나타낸다. 증후성 감염 위험의 감소는 대상체가 감염의 단지 경미한 현성 증상 또는 감염의 지연된 증상만을 나타내도록 할 수 있으며; 이것은 감염 미생물에 의한 어떠한 세포 침투도 없었어야 함을 의미하는 것은 아니다.

본 발명에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 특정 양태들이 하기 실시예에 추가로 기재된다. 이러한 양태들은 단지 예로서 제공되며 어떠한 방식으로든 청구범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

실시예

하기 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 상황들이 방편들을 시사하거나 제공할 수 있기 때문에 형태의 변화 및 등가물 치환이 고려된다. 특정 용어들이 본원에서 사용되지만, 이러한 용어들은 서술적 의미로 의도되며 제한하기 위한 목적은 아니다. 사용되는 분자유전학, 단백질 생화학 및 면역학의 방법들은 본 명세서 및 이들 실시예에 명백히 기재되지는 않았지만, 과학문헌에 상세히 보고되어 있으며, 당업계의 숙련가들의 능력 내에서 충분히 할 수 있다.

실시예 1

씨. 디피실 제조용 종균(working seed)(균주 VPI10463/ATCC43255)을 사용하여 대두 펩톤, 효모 추출물, 포스페이트 완충액 및 중탄산나트륨(SYS 배지)을 포함하는 pH 6.35 내지 7.45의 예비컨디셔닝된(preconditioned) 배양 배지에 접종하고, 4mL 제조용 세포 은행(Working Cell Bank)(WCB) 바이알로부터 160L 배양물로 되도록 규모 확대시켰다. 목적하는 밀도에 도달하고, 10 내지 12시간 항온배양한 후, 전체 160L의 배양물을 청정화 및 0.2㎛ 여과를 위해 가공하였다. 하나 이상의 생산 발효기로부터의 배양물을 수거하고, (예를 들면, Meisner 막 필터를 사용하여) 막 여과에 적용하여, 씨. 디피실 세포 및 세포 잔사 불순물을 제거하였다. 생성된 정화된 배양 여액을 농축시키고, 접선 유동 여과에 의해 pH 7.5의 50mM Tris/NaCl/0.2mM EDTA/1mM DTT로 투석여과하였다. 생성된 용액을 막 필터를 사용하여 여과하고, 황산암모늄의 농도를 (예를 들면, 약 0.4M로) 증가시킨 다음, (예를 들면, 막 필터를 사용하여) 추가의 여과를 수행하였다. 상기 수용액은 씨. 디피실 톡신 A 및 톡신 B를 함유하였다. 상기 수용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하였다. 씨. 디피실 톡신이 세파로스 컬럼에 결합하였다. 컬럼을 Tris 완충액으로 세척하고, 씨. 디피실 톡신의 2개의 분획을 DTT 및 IPA를 함유하는 Tris 완충액으로 용출시켰다. HIC로부터 용출된 2개의 톡신 분획을 풀링하고, WFI를 사용하여 전도율을 9mS 이하로 조정하였다. (풀링된 용출물 중의) 씨. 디피실 톡신을 음이온 교환 크로마토그래피로 추가로 정제하였다. 용출된 수용액을 음이온 교환 컬럼을 통해 통과시켜 톡신을 컬럼에 결합시켰다. 컬럼을 Tris 완충액으로 평형화시키고, 톡신 A는 저염 Tris 완충액으로 용출시키고, 톡신 B는 고염 Tris 완충액으로 용출시켰다. 정제된 톡신 A 및 정제된 톡신 B를 각각 농축시키고 pH 7의 100mM PO₄로 투석여과하였다. 단백질 농도는 약 0.5mg/mL이고, 각 톡신의 순도는 90% 이상이었다.

37% 포름알데히드 용액을 톡신 A 투석 여액 및 톡신 B 투석 여액 각각에 무균적으로 첨가하여 0.42%의 최종 농도를 수득하였다. 상기 용액들을 혼합한 다음, 2 내지 8℃에서 18 내지 22일 동안 저장하였다. 불활성화 후, 톡신 투석 여액을 제형화 완충액(20mM 시트레이트/5% 슈크로스, pH 7.5)으로 투석시켰다. 필요에 따라 37% 포름알데히드 용액을 첨가하여 포름알데히드 농도를 조정하였다. 톡소이드 A 및 B를 3:2(A:B) 중량비로 배합하고 동결건조시켰다. 동결건조된 생성물은 톡소이드 A(0.24mg/mL), 톡소이드 B(0.16mg/mL), 20mM 나트륨 시트레이트, 5%(w/v) 슈크로스 및 제시된 농도의 포름알데히드를 포함하였다.

회귀 분석을 수행하여 37℃에서 6주간에 걸쳐 잠재적인 회귀를 관찰하였다. 톡소이드 A 및 톡소이드 B를 포함하는 조성물을 잔류 포름알데히드의 양(0%, 0.008%, 및 0.016%(w/v))을 달리하여 제형화하고, 37℃ 또는 4℃에서 저장하고, 6주 동안 매주 세포독성 검정을 통해 시험하였다. 본 연구로부터의 데이터가 표 1에 제시되어 있다. 4℃에서, 의약품은 잔류 포름알데히드가 첨가되지 않고도 회귀 분석을 통과한다. 그러나, 37℃에서는, 회귀 시험을 통과하기 위해 0.016% 잔류 포름알데히드가 필요하다.

실시예 2

본원에 기재된 실험은 37℃에서 안정한 톡소이드를 제공하는 톡소이드화 방법을 동정하기 위해 수행하였다. 씨. 디피실 제조용 종균(균주 VPI10463/ATCC43255)을 사용하여 멸균 1회용 백 내의 예비컨디셔닝된 배양 배지(대두 펩톤, 효모 추출물, 포스페이트 완충액 및 D-소르비톨 포함, pH 7.1 내지 7.3)에 접종하고, 배양물을 표적 OD가 달성될 때까지 35 내지 39℃에서 항온배양하였다. 30L 종균 1 배양물을 사용하여 250L 멸균 1회용 배양물 백 내의 배양 배지에 접종하고, 배양물을 표적 OD가 달성될 때까지 35 내지 39℃에서 항온배양하였다. 종균 2 배양물을 사용하여 1000L 멸균 1회용 배양물 백에 접종하고, 배양물을 표적 OD가 달성될 때까지 35 내지 39℃에서 항온배양하였다. 하나 이상의 생산 발효기로부터의 배양물을 수거하고, (예를 들면, Pall Depth 700p/80p/0.2um 0.02msq/L를 사용하여) 심층 여과(depth filtration)에 적용하여 씨. 디피실 세포 및 세포 잔사 불순물을 제거하면서 동시에 냉각(예를 들면, 약 37℃ 내지 19℃)시켜 프로테아제 활성을 제한하였다. 생성된 정화된 배양 여액을 농축시키고, 플랫 스톡 Millipore를 사용하여 약 4℃의 온도에서(감소된 프로테아제 활성을 위함) 접선 유동 여과에 의해 DTT는 첨가하지 않고서 pH 7.5 내지 8.0의 25mM Tris/50mM NaCI/0.2mM EDTA로 투석여과하였다. 생성된 용액을 막 필터를 사용하여 여과하고, 황산암모늄의 농도를 (예를 들면, 약 0.9M로) 증가시킨 다음, (예를 들면, 막 필터를 사용하여) 추가의 여과를 수행하였다. 이러한 수용액은 씨. 디피실 톡신 A 및 톡신 B를 함유하였다. 수용액을 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용하였다. 씨. 디피실 톡신이 부틸 세파로스 수지(예를 들면, GE Butyl S FF 세파로스)에 결합하였다. 컬럼을 pH 8.0의 0.9mM 황산암모늄 25mM Tris로 세척하고, 씨. 디피실 톡신을 pH 8.0의 25mM Tris로 용출시키고, WFI를 사용하여 전도율을 7mS 이하로 조정하였다. (용출물 중의) 씨. 디피실 톡신을 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가로 정제하였다. 용출된 수용액을 음이온 교환 컬럼(예를 들면, Tosoh Q 650M)을 통해 통과시켜 톡신을 컬럼에 결합시켰다. 컬럼을 pH 7.5의 25mM Tris로 평형화시키고, 톡신 A는 pH 8.0의 25mM Tris 중의 27mM MgCl₂로 용출시키고, 톡신 B는 pH 8.0의 25mM Tris 중의 135mM MgCl₂로 용출시켰다. 정제된 톡신 A 및 정제된 톡신 B를 각각 농축시키고, 먼저 25mM Tris(예를 들면, MgCl₂를 제거하기 위함)로 투석여과한 다음, pH 7의 100mM PO₄로 투석여과하였다. 톡신 A의 평균 수율은 약 0.021g 순수 톡신/L 발효(UV280)이고, SDS Page로 평가한 순도는 평균 약 97.2%이었다. 톡신 B의 평균 수율은 약 0.011g 순수 톡신/L 발효(UV280)이고, SDS Page로 평가한 순도는 평균 약 93.9%이었다. 이러한 공정으로부터 생성된 톡신은 90% 이상의 순도를 나타내고, 또한 이전 공정 단계로부터 남겨진 매트릭스 잔류물(예를 들면, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS))의 감소를 나타낸다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 실질적인 공정으로부터의 톡신 매트릭스 중의 잔류 TRIS 값은 약 100 내지 800㎍/ml로 다양한 반면, 본 실시예에 기재된 정제 공정으로부터의 톡신 매트릭스 중의 잔류 TRIS 값은 1㎍/ml 미만(즉, 검출 한계 미만)이다. 포름알데히드를 사용한 톡소이드화 반응과 관련하여, TRIS는 포름알데히드-매개 변형에 대해 단백질과 효과적으로 경쟁할 수 있는 아민 그룹을 가짐으로써, 반응 혼합물 중의 유효 포름알데히드 농도를 저하시킬 수 있다. 따라서, 데이터는, 본 공정에 의해 제조되는 톡소이드에 대한 톡소이드화 동역학이 실시예 1에 기재된 공정에 의해 제조된 톡소이드에 대한 동역학과 비교하여 더 빠르다는 것을 시사한다.

온도 및 포름알데히드 농도와 관련하여 톡소이드화 공정에 대한 연구를 수행하고, 톡소이드화 항온배양 기간의 함수로서 분석하였다. 그 목적은, 이전 공정(실시예 1에 기재된 바와 같음)을 사용하여 생성된 톡소이드보다 더 우수한 안전성 프로파일 및 더 우수한 회귀 특징을 제공하면서 동일한 수준의 면역원성을 유지하는 강력한 톡소이드화 공정을 개발하는 것이었다. 최소량의 잔류 포름알데히드로 37℃에서의 회귀 분석을 통과하는 의약품을 산출할 수 있는 톡소이드화 조건이 요망된다. 이러한 실험에서, 톡신 농도는 0.5mg/ml로 고정하였고, 모든 반응은 pH 7.0의 100mM 인산나트륨 완충액에서 수행하였다. 톡소이드화 반응 각각에 대해 평가된 온도는 4℃, 15℃ 및 25℃이었다. 포름알데히드 농도는 톡소이드 A 반응에 대해서는 0.21%("0.2%") 내지 0.42%("0.4%")로 다양하였고, 톡소이드 B 반응에 대해서는 0.42%("0.4%") 내지 0.84%("0.8%")로 다양하였다. 각각의 반응 조건에 대해, 톡신 농도를 0.5mg/ml로 조정하고, 100ml 규모에서 수행하였다. 이후, 각각의 개별 반응에 대해 표적화된 농도에 도달하도록 37% 포름알데히드를 첨가하였다. 반응물을 5 내지 10분 동안 온화하게 교반하고, 표적화된 온도(표적 온도는 1시간 이내의 항온배양으로 달성됨)에서 항온배양기에 위치시켰다. 각각의 개별 반응을 최대 21일 동안 매일 모니터링하였다. 샘플을 꺼내어 세포독성 분석, AEX-HPLC, SEC-HPLC, SDS-PAGE 및 TNBS 검정으로 분석하였다. 톡소이드화 조건에 따라 특정 시간 간격에서, 샘플을 꺼내어 제형화하고 동물 연구, 회귀 분석 및 ELISA 시험을 수행하였다.

동역학적(kinetic) 세포독성 분석

톡소이드화 반응에 이어서 세포독성 분석을 수행하였고, 이에 따라, 샘플을 반응 혼합물로부터 직접 매일 꺼내어 동일자 분석을 위해 제출하였다. 톡소이드화 공정에 이어서 IMR90 세포에 대한 세포독성을 수행하였으며, 톡소이드화의 동역학은 단일상이며, 톡신 A는 세포독성 중화를 위해 평균 5 ± 1일이 소요되고 톡신 B는 13 ± 2일(전체 반응 동안 3배 안전 마진(safety margin)에 미치지 못함)에 가깝게 소요되었다. 하나의 뱃치를 사용하여 수득된 데이터가 도 1에 도시되어 있다. y-축은 물질의 독성의 반영이면서 세포의 50%가 독성 물질의 존재하에 이의 정상적인 선 모양 형태학 대신에 원형이 되는 최소 농도를 나타내는 MC50 값을 함유한다. 2가지 톡신에 대한 MC50 값은 1000배 차이가 났다; B는 낮은 pg/ml 범위의 MC50 값을 가지며 보다 세포독성이었다. 이러한 실험에서 200㎍/ml의 최고 농도에서 시험한 경우 세포독성이 없었기 때문에 톡소이드에 대한 절대 MC50 값은 알 수 없었다. 불활성화 공정을 위한 총 시간은 18 내지 21일이었다.

톡신 A 및 톡신 B의 톡소이드화 반응에 대한 세포독성 분석으로부터의 데이터는 표 2에 제시되어 있다. 이것은 포름알데히드와 톡신의 개별적 반응 각각에 대해 세포독성 상실을 나타내는데 필요한 시간의 양(단위: 일)을 도시한다. 톡신 A 및 톡신 B의 톡소이드화 반응에 대한 데이터로부터 몇 가지 일반적인 경향이 명백하다. 포름알데히드 농도가 증가함에 따라, 톡신을 불활성화시키는데 필요한 시간이 감소한다. 추가로, 반응을 위한 온도가 증가함에 따라, 톡신을 불활성화시키는데 필요한 시간 또한 감소한다. 데이터는 톡소이드화 속도가 온도 또는 포름알데히드 농도의 증가에 따라 가속화됨을 시사한다. 동역학적 세포독성 분석으로부터 다수의 잠재적 조건들이 동정되며, 데이터는 세포독성의 초기 상실을 3배로 추정함으로써 3× 안전 마진이 달성될 수 있음을 시사한다. 예를 들면, 톡신 A는 25℃에서 0.2% 포름알데히드로 2일째에 해독되며, 따라서, 적절한 안전 마진을 적용하는 것은 반응을 6일 동안 최소로 지속시킨다. 각종 톡소이드화 반응 조건은 기대를 충족한다.

DoE 반응의 동역학적 AEX-HPLC 분석

AEX-HPLC(확장 구배 방법)를 상이한 톡소이드화 파라미터를 추가로 평가하기 위한 도구로서 사용할 수 있다. AEX 프로파일은 적합한 톡소이드화 조건을 좁히는데 있어서 귀중한 도구일 수 있다. 둘 다 톡신보다 긴 체류 시간을 갖는 AEX 크로마토그램에서 톡소이드 A & 톡소이드 B 둘 다에 대해 2개의 부분집단(subpopulation)이 관찰된다. 피크의 집단은 반응이 진행됨에 따라 이동하며, 이것은 톡신의 추가 변형을 시사한다. 잠재적으로, 이것은 포름알데히드가 톡신 상의 아민 그룹과 반응하여 단백질의 전하 특성을 덜 양성이 되도록 변화시킴으로써, 컬럼 수지(4급 암모늄 수지)와의 결합 친화도를 증가시킴을 반영한다. 온도 및 포름알데히드 농도는 시간의 함수로서 피크 집단 프로파일에 영향을 미치고 "이동"시킬 수 있으며, 이것은 보다 많은 포름알데히드 단백질 변형을 나타내며; 톡신 A 및 톡신 B 톡소이드화 반응 둘 다에 대해, 온도 및 포름알데히드 농도가 증가함에 따라 제2 피크 집단으로의 보다 신속한 이동이 관찰된다. 평가 관점에서, 더 많은 단백질 변형을 보장하기 위해 제2 피크 위치에 단분산 프로파일을 갖는 것이 보다 바람직할 것이다. 톡소이드 A의 경우, 25℃, > 6일에서 0.21% 포름알데히드 또는 15℃, > 6일에서 0.42% 포름알데히드를 이용한 조건이, 바람직한 단분산 제2 피크 프로파일을 제공한다. 톡소이드 B의 경우, 15℃에서 > 10일 동안 0.4% 또는 0.8% 포름알데히드; 또는 25℃에서 > 5일 동안 0.4% 포름알데히드를 이용한 조건이 목적하는 단분산 제2 피크 프로파일을 초래한다. 최고 포름알데히드 농도 및 온도를 사용한 반응은 시간의 함수로서 더 많은 톡소이드 집단을 생성하기 시작하며, 이것이 보다 광범위한 단백질 변형을 시사함을 주지하는 것이 중요하다(특히 0.4% 포름알데히드, 25℃에서 톡소이드화 A의 경우).

동역학적 SEC-HPLC 분석

SEC 프로파일은 적합한 톡소이드화 조건을 좁히는데 있어서 귀중한 도구일 수 있다. 크로마토그램은 포름알데히드 유도된 분자간 가교결합의 결과로서 발생할 수 있는 다량체화의 정도에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 톡소이드에서의 다량체화 양을 최소화하고 실시예 1에서 생성된 생성물과 유사한 프로파일을 달성하는 것이 바람직하다. 개별적 반응을 SEC-MALS로 매일 모니터링하고, 다량체화의 출현에 대해 정성적으로 분석하였다. 톡소이드 B 반응에 대해 분석된 모든 조건들은 다량체화를 나타내지 않았다. 톡소이드 A의 경우, 주로 최고 포름알데히드 농도를 갖는 조건의 경우에 과도한 다량체화가 관찰되었다. 따라서, SEC-MALS 데이터는 온도, 시간 또는 포름알데히드 농도에 관한 톡소이드 B 조건을 식별하지 않는다. 그러나, 데이터는 보다 높은 온도와 포름알데히드 농도가 함께 톡소이드 A에 대해 다량체화를 유도할 수 있음을 시사한다.

동역학적 아민 함량(TNBS) 분석

포르말린 매개된 톡소이드화는 포름알데히드계 모이어티(moiety)를 형성하는 반응을 통해 단백질상의 유리 아민 함량(예를 들면, 리신의 ε-아미노 그룹)의 감소를 야기한다. 초기 물질에 대한 트리니트로벤젠 설폰산(TNBS) 검정을 사용하여 변형 정도를 모니터링하고자 하는 시도가 이루어졌으며, 반응 말기의 변형 정도는 톡소이드 A 및 B에 대해 각각 약 ~35% 및 65%인 것으로 나타났다(남아있는 유리 아민 함량의 역수). 본 연구를 위해, 유리 아민 함량도 또한 TNBS 검정을 사용하여 모니터링하였다. 조건은 온도 및 시간이 증가함에 따라 % 유리 아민 함량은 보다 빨리 점근선(asymptote)에 접근함을 보여준다. 따라서, 아민 변형의 정도는 톡신 A에 대해 ~40%, 톡신 B에 대해 75%로 최대로 추정될 수 있다(남아있는 유리 아민 함량의 역수). 아민 함량은 세포독성의 상실과 거의 상관성이 없지만, 포름알데히드와 톡신의 반응 정도를 추적하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 아민 변형은 25℃에서 A의 경우에는 6일 내에, B의 경우에는 ~10일 내에 완료되는 것으로 보인다. 반응이 보다 낮은 온도에서 수행된다면, 동일한 정도의 아민 변형을 달성하는데 소요되는 시간이 증가한다. 따라서, 데이터는 보다 높은 온도가 보다 짧은 시간량 내에 보다 완전한 반응을 유도할 수 있음을 시사한다.

항원성의 분석

효소-결합 면역흡착 검정(ELISA)도 또한 상이한 톡소이드화 파라미터를 추가로 평가하기 위한 도구로서 사용될 수 있다. 생성물의 ELISA 프로파일을 사용하여 적합한 톡소이드화 조건을 좁힐 수 있다. 생성된 톡소이드는 초기 물질로부터 생성된 항체에 대하여 ELISA를 통해 측정하였으며, 톡소이드화 시간의 함수로서 분석하였다. 여기서 ELISA를 사용하여 톡신의 양을 검출하고, 280nm에서의 흡광도를 사용하여 측정된 농도와 비교하였다. 항원이 톡소이드화 반응을 진행함에 따라, ELISA 값이 저하될 수 있으며, 이것은 실시예 1 톡소이드에서 관찰된 반응으로부터의 변화를 나타낸다(잠재적으로 다량체화를 나타냄). 검정에서 변동성이 나타나기는 하지만, 데이터는 보다 높은 온도 및 보다 높은 포름알데히드 농도가 보다 낮은 ELISA 반응을 야기함을 시사한다. 예를 들면, 25℃에서의 0.4% 포름알데히드의 사용은 25℃에서의 0.2% 포름알데히드보다 더 빨리 ELISA 값이 하락하게 한다. 마찬가지로, 0.4% 포름알데히드, 25℃를 갖는 조건은 4℃에서의 0.4% 포름알데히드의 조건보다도 더 빨리 ELISA 값이 하락하게 한다. 평가 도구로서, ELISA 반응을 70% 초과로 유지하는 것이 바람직하며; 다수의 조건이 확인되었다.

면역원성의 분석

햄스터 효능 검정에 의한 면역원성의 측정을 사용하여 톡소이드화 조건을 평가할 수 있다. 현재의 사양은 톡소이드 A 및 톡소이드 B에 대해 4.8 이상인 평균 Log10 IgG 역가 반응을 달성하였다. 이러한 연구로부터 생성된 톡소이드를 이러한 사양에 따라 평가하였으며, 초기 조건으로부터 유도된 톡소이드로부터의 반응을 상당히 저하시키지 않는 것으로 추가로 검토되었다. 게다가, (시간, 온도 및 포름알데히드 농도에 대한) 모든 가능한 침투를 평가할 수는 없기 때문에, 동역학적 세포독성 분석(3× 안전 마진)뿐만 아니라 본원에 기재된 물리화학적 특징에 기초하여 톡소이드를 선택하였다. 톡소이드를 햄스터 효능 검정을 위한 2가 물질(비-동결건조됨)로서 제형화하고, 혈청을 IgG 반응에 대해 분석하였다. 모든 톡소이드화 조건은 효능 사양(potency specification)(4.8 Log 10의 평균 IgG 역가 반응)을 통과했을 뿐만 아니라, 초기(실시예 1) 물질에 통계학적으로 동등한 역가 반응을 가졌다(유의차는 보이지 않음). 추가로, 모든 혈청을 (시험관내 시험감염 검정을 사용하여) 시험하였으며, 중화 항체 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 중요한 품질 특성으로서, 데이터는 이러한 톡소이드화 조건들 중 어느 것이라도 허용될 수 있음을 시사한다.

의약품("DP")의 회귀 분석

의약품(톡소이드 A 및 B를 포함하는 조성물)을 평가 중인 톡소이드화 조건을 사용하여 제조한 톡소이드 A 및 B를 사용하여 제형화하였다. 제형은 0%, 0.004%, 및 일부 경우에 0.008%(w/v) 잔류 포름알데히드를 포함하였다. 제형은 톡소이드 A 또는 B 조성물로부터 모든(또는 본질적으로 모든) 포름알데히드를 제거한 다음, 세정된 조성물에 제시된 양의 포름알데히드를 스파이킹(spiking)함으로써 제조하였다. 의약품을 37℃에서 수행되는 회귀 분석에 적용하였다. 의약품 회귀 분석으로부터의 데이터가 표 3에 도시되어 있다. 세포독성에 대해 음성인 것으로 시험된 의약품은 (-)로 나타냈다.

다수의 의약품 제형이 회귀 분석을 통과하였다(즉, 37℃에서 저장 후 검출 가능한 세포독성을 갖지 않음). 2가지 의약품(0.004% 또는 0.008% 포름알데히드("잔류 포름알데히드")를 가짐)은 37℃에서 저장 후 검출 가능한 세포독성을 갖지 않았다: (i) 13일, 0.2% 포름알데히드, 15℃에서의 항온배양에 의해 불활성화된 톡소이드 A 및 13일, 0.8% 포름알데히드, 15℃에서의 항온배양에 의해 불활성화된 톡소이드 B를 포함하는 의약품(표 3, 시험 13 및 14의 파라미터); 및 (ii) 6일간 0.2% 포름알데히드, 25℃에서의 항온배양에 의해 불활성화된 톡소이드 A 및 13일간 0.4% 포름알데히드, 25℃에서 불활성화된 톡소이드 B를 포함하는 의약품(표 3, 시험 22 및 23의 파라미터). 예를 들면, 13일, 0.4% 포름알데히드, 4℃에서의 항온배양에 의해 불활성화된 톡소이드 A 및 21일, 0.8%, 4℃에서의 항온배양에 의해 불활성화된 톡소이드 B를 포함하는 의약품 및 13일, 0.4% 포름알데히드, 4℃에서 불활성화된 톡소이드 A 및 21일, 0.8% 포름알데히드 및 4℃에서 불활성화된 톡소이드 B를 포함하는 의약품을 포함하여 0.008% 포름알데히드를 갖는 기타 몇몇 의약품도 37℃에서 저장 후 검출 가능한 세포독성을 갖지 않았다. 이러한 분석으로부터 동정된 최적의 톡소이드화 조건은 다음과 같다: 톡신 A의 톡소이드화: 0.5mg/ml 톡신 A, 0.21% 포름알데히드, 25℃의 pH 7의 100mM NaPO₄에서 6일; 및 톡신 B의 톡소이드화: 0.5mg/ml 톡신 B, 0.42% 포름알데히드, 25℃의 pH 7의 100mM NaPO₄에서 13일(표 3, 시험 22의 파라미터). 이러한 조건들은 다른 물리화학적 검정에 의해 측정하는 경우에도 바람직한 프로파일을 나타냈다. AEX는 각각의 톡소이드에 대해 균일한 피크 집단을 나타냈으며, SEC MALS는 최소한의 다량체화를 나타냈고, TNBS는 각각의 반응이 소정의 시점에서 최대의 아민 변형을 달성함을 나타냈다. 또한, ELISA(A280) 반응이 유지되었다.

표 1 및 표 3은 파라미터 22가 톡신 A 및 B로부터 톡소이드를 제조하는데 있어 최적임을 나타낸다. 이러한 조건들은 다음과 같다:

톡소이드 A의 제조: 0.5mg/ml 톡신 A, 0.21% 포름알데히드, 25℃의 pH 7의 100mM NaPO₄에서 6일; 및

톡소이드 B의 제조: 0.5mg/ml 톡신 B, 0.42% 포름알데히드, 25℃의 pH 7의 100mM NaPO₄에서 13일.

이러한 절차는 또한 6일(톡소이드 A) 또는 13일(톡소이드 B)간의 항온배양 전에 10분의 혼합 단계에 이어서 0.2㎛ 여과를 포함하였다. 37℃에서의 회귀에 대해 시험하기 전에, 톡소이드 A 및 톡소이드 B를 pH 7.5의 20mM 시트레이트, 0.004% 포름알데히드로 투석여과하였다. 이러한 절차는 도 2에 예시되어 있다. 0.008% 포름알데히드도 전형적으로 37℃에서 우수한 안정성을 제공한다는 것을 또한 주지한다.

본 데이터는 보다 긴 항온배양 시간이 톡소이드 A에 대해 보다 낮은 ELISA 값을 야기함을 보여주는 놀라운 면역학적 데이터(햄스터에서의 IgG 반응)에 의해 더욱 확실해지며, 이것은 증가된 포름알데히드-유도된 톡신 변형을 시사한다(6일째에서의 ELISA/A280=0.94; 12일째=0.64). 대조적으로, 보다 긴 항온배양 시간은 톡소이드 B의 경우에 보다 높은 ELISA 값을 초래하였다(13일째에서의 ELISA/A280=0.53; 20일째=0.73). 바람직한 ELISA/A280 값은 1.0에 가까운 값이다. 당업계의 숙련가들은 톡신 A의 톡소이드화를 위해서는 12일의 항온배양 기간이 적당할 수 있고 톡신 A의 톡소이드화를 위해서는 20일의 항온배양 기간이 적당할 수 있음을 이해해야 한다. 그러나, 이러한 데이터를 고려하더라도, 13일의 항온배양 시간이 상기한 바와 같이 톡신 B를 톡소이드화하기 위해 최적인 것으로 간주되었다.

규모 분석

톡소이드를 동정된 최적의 톡소이드화 조건을 사용하여 보다 큰 규모로 제조하였다(1/10분위 착수 규모(200L 발효)); 즉, 톡신 A 및 톡신 B를 다음의 조건들을 사용하여 불활성화시켰다: A의 톡소이드화: 0.5mg/ml 톡신 A, 0.21%(w/v) 포름알데히드,25℃의 pH 7의 100mM NaPO₄에서 6일; 및 B의 톡소이드화: 0.5mg/ml 톡신 B, 0.42%(w/v) 포름알데히드, 25℃의 pH 7의 100mM NaPO₄에서 13일. 톡소이드화 반응의 동역학을 반응 동안 다양한 기간에 채취한 톡소이드 샘플을 사용하여 평가하였다. 소규모로 생산된 톡소이드와 비교하여, 상기 톡소이드는 동일한 동역학적 세포독성 프로파일을 가졌으며, 반응 2일째에 세포독성의 상실이 관찰되었다. 또한, 상기 톡소이드는 소규모로 생산된 톡소이드와 유사한 AEX 프로파일 및 유사한 아민 변형(TNBS 검정으로 측정됨)을 가졌다. 1/10분위 규모 톡소이드화 반응으로부터 생성된 톡소이드의 면역원성을 또한 햄스터 효능 검정으로 평가하였다. 소규모로 생산된 톡소이드와 같이, 상기 톡소이드는 4.8 Log 이상의 평균 IgG 역가 반응을 제공하며, 실시예 1에 제시된 바와 같은 공정에 따라 생산된 톡소이드와 통계학적으로 동등한 역가 반응을 제공하였다. 회귀 분석을 1/10분위 규모 톡소이드로부터 유도된 의약품에 대해 수행하고, 소규모에서 동일한 톡소이드화 조건으로부터 유도된 의약품과 비교하였다. 1/10분위 규모의 톡소이드로부터 유도된 의약품은 소규모에서 유도된 것과 동일한 회귀 특징을 가지며, 0.004% 포름알데히드에서도 회귀를 통과하였다. (예를 들면, 1000L 및 2000L 발효 배양물을 사용하여) 보다 큰 규모에서 생산된 톡소이드에서도 유사한 결과가 수득되었다. 이러한 연구로부터의 데이터는 톡소이드화 방법이 규모확대 가능함(scalable)을 보여준다. 큰 규모에서 생산된 톡소이드는 작은 규모로 제조한 것과 동일한 동역학적 세포독성 프로파일, 햄스터 효능 및 회귀 특징을 갖는다. 재현성과 관련하여, 톡신 A 및 톡신 B에 대한 톡소이드화 공정은 6회 이상 재현되었으며, 분석은 유사한 로트간 특징(lot to lot characteristics)을 나타냈다.

면역화 연구

정제된 씨. 디피실 톡소이드 A 및 씨. 디피실 톡소이드 B를 실질적으로 상기한 방법에 따라 제조하고(예를 들면, 표 3의 파라미터 22) 백신 조성물로서 제형화하였다. 톡소이드 A 및 B를 3:2의 중량비로 배합하고, 슈크로스(4.0% 내지 6.0% w/v) 및 포름알데히드(0.012% 내지 0.020% w/v)를 포함하는 시트레이트 완충액으로 제형화하고, 동결건조시켰다. 각각의 조성물을 햄스터 시험감염 모델에서의 평가를 위한 백신으로 사용하기 전에 하기 기재된 바와 같은 희석제로 재구성하고 수산화알루미늄 어쥬번트를 첨가하였다. 시리안 골드 햄스터(Syrian gold hamster)는 씨. 디피실 백신 개발을 위한 엄격한 모델을 제공한다. 단일 복강내(IP) 용량의 클린다마이신 항생제로 전처리한 후 및 톡신생성 씨. 디피실 유기체를 위내(IG) 접종한 후, 햄스터는 전격성 설사 및 출혈성 맹장염이 급속히 발병하여 2일 내지 4일 이내에 사망한다(예를 들면, 백신접종 부재하). 백신을 (0.57% 염화나트륨 및 800㎍/mL 수산화알루미늄을 포함하는) 희석제로 재구성하였다. 재구성된 백신의 연속 희석액을 제조하였다. 백신의 인간 용량(HD)이 100㎍/용량 톡소이드 및 400㎍/용량 수산화알루미늄을 함유하기 때문에, 제조된 첫번째 희석액인 1/20 HD는 5㎍/용량 톡소이드, 0.008% 포름알데히드 및 20㎍/용량 알루미늄을 함유하였다. 햄스터(9마리 햄스터/그룹)를 상이한 용량의 씨. 디피실 백신(인간 용량(100㎍/용량)(HD)의 4가지 희석액)을 3회 근육내 면역화(0일째, 14일째, 및 27일째에)에 의해 백신접종하거나, 위약(AlOOH)을 주사하였다. 41일째에, 햄스터를 IP 경로에 의해 10mg/kg으로 클린다마이신-2-포스페이트 항생제의 화학 형태로 전처리하였다. 42일째에, 항생제로 전처리한지 28시간 후, 햄스터를 IG 경로에 의해 씨. 디피실 ATCC43255 균주로부터 유래된 치사량의 포자 제제로 시험감염시켰다. 씨. 디피실 감염과 연관된 증상의 발현 및 치사율의 동역학을 측정함으로써 보호 효능을 평가하였다. 결과(도 3에 제시됨)는 본 백신이 씨. 디피실 톡신생성 세균으로의 치사 시험감염으로부터 용량-의존적 방식으로 햄스터를 보호하며, 용량 HD/20의 백신접종에 의해 100% 보호가 유도됨을 입증하였다(20㎍ AlOOH의 존재하의 5㎍ 톡소이드 A+B). 면역화된 동물은 사망 및 질환(체중 감소 및 설사)으로부터 보호되었다. 본 연구의 결과는 몇몇 생체내 연구를 대표한다. 따라서, 본원에 기재된 방법들에 의해 제조되는 톡소이드는 씨. 디피실 질환에 대해 보호 면역(protective immunity)을 제공한다.

실시예 3

시험관내 면역화 연구

백신 제형에 함유된 톡소이드를 톡시노타입 0로부터 정제하였다. 항-톡신 항체가 기타 우세한 변이 균주로부터의 톡신 활성을 중화시킬 수 있음을 입증하기 위해, 백신접종된 햄스터로부터의 혈청을 사용하여 시험관내 교차-중화 연구를 수행하였다.

A. 재료 및 방법

씨. 디피실 톡소이드 백신은 씨. 디피실 참조 균주 VPI10463(ATCC43255)으로부터의 톡소이드 A 및 B의, 포르말린-불활성화된 고도로 정제된 제제였으며, 희석제로 재구성되고 수산화알루미늄 어쥬번트(상기한 바와 같음)와 혼합된 동결건조된 제제로서 제시되었다. 위약은 0.9% 식염수였다. 087 PCR-리보타입으로부터 정제된 천연(native) 톡신 A 및 B는 상기한 바와 같이 내부에서 생산하였다. 001, 002, 014, 106, 027, 023 및 078 PCR-리보타입으로부터 정제된 천연 톡신 A 및 017 PCR-리보타입으로부터 정제된 천연 톡신 B는 TgcBiomics(독일 빙겐)로부터 구입하였다.

균주 VPI10463, 630, BAA-1875, ATCC43598는 ATCC로부터 구입하였다. 2007년에 프랑스에서 단리된 균주 IPP40348은 엠. 포포프(M. Popoff)(Pasteur Institute, 프랑스 파리)로부터 입수하였다. 2005년에 캐나다에서 단리된 균주 CDC13695#7은 질병관리센터(Center for Disease Corntol)(CDC)로부터 입수하였다. 2011년에 미국에서 단리된 균주 SP041은 디. 거딩(D. Gerding)으로부터 입수하였다. 씨. 디피실의 임상 변이체는 디. 거딩(미국 및 아르헨티나), 에프. 바벗(F. Barbut)(유럽), 피. 반헴스(P.Vanhems)(프랑스) 및 티. 라일리(T. Riley)(아시아태평양)로부터 입수하였다. 씨. 디피실 균주를 대두 효모 추출물 염(SYS) 배지에서 16시간 동안 혐기성으로 성장시킨 다음, 소르비톨이 보충된 SYS 배지에서 72시간 동안 증대(expand)시켰다. 이어서, 세균 배양물 상청액을 수거하고 여과하고 항-프로테아제 및 30% 글리세롤을 보충하였다.

상기 세균 배양물 상청액 중에 존재하는 톡신 A 및 톡신 B의 정량을 제조업자의 지침에 따라서 시판 ELISA 방법(tgcBIOMICS GmbH, 독일 마인츠)을 사용하여 수행하였다. 간략하게 언급하면, 톡신 A 및 톡신 B 둘 다에 대한 포획 항체로 코팅된 미세역가 플레이트를 37℃에서 60분 동안 배양 상청액 또는 표준 대조군 톡신과 함께 항온배양하였다. 미결합된 물질을 세척한 후, (호스래디쉬 퍼옥시다제에 접합된) 톡신 A 또는 톡신 B에 대한 특이적 모노클로날 항체를 웰에 가하고; 미세역가 플레이트를 37℃에서 60분 동안 항온배양하였다. 제2 세척 단계 후에, 기질을 첨가하여 실온에서 30분 동안 발색되도록 하였다. H₂SO₄를 각 웰에 첨가하여 반응을 중단시키고, ELISA를 450 및 620 nm에서 분광광도계에 의해 분석하였다.

시험관내 교차-중화 분석을 위해 생물검정을 개발하였다. 이는 널리 공지된 IMR90 톡신 중화 검정으로부터 개조된 것이다. 본 생물검정의 디자인은, 백신 균주로부터 정제된 톡신의 세포독성 활성을 중화시키는 것으로 공지된 씨. 디피실 톡소이드 백신에 대해 발생된 햄스터 혈청 또는 위약 혈청의 예정된 희석액을, 임상적으로 관련된 씨. 디피실 프로토타입 균주으로부터 정제된 천연 톡신 A 또는 B, 또는 톡신 A 및/또는 톡신 B를 함유하는, 프로토타입 균주 또는 임상적 단리체로부터 여과된 세균 상청액의 연속적 희석액과 함께 항온배양하는 것으로 이루어졌다. 혈청-톡신 혼합물을 IMR-90 세포에 첨가하고, 이를 E플레이트에 접종하기 하루 전날에 예비씨딩하여 컨플루언스(confluence)에 도달하고 전극상에 부착되도록 하였다. 이어서, 플레이트를 37℃에서 항온배양하였다. E-플레이트는 바닥에 교차 금 미세전극을 함유하는 특수하게 디자인된 조직 배양 미세역가 플레이트이다. 상기 플레이트는 표지의 혼입 없이, 판독으로서 전기 임피던스를 사용하여 실시간으로 세포 사건을 비침습적으로 모니터링하기 위해 xCELLigence 시스템과 함께 사용하기 위한 것이다. 톡신에 의해 유도되는 IMR90 세포 원형화는 전극 임피던스의 감소를 초래할 것이며, 이는 세포 지수(CI) 값으로서 표시된다. 이어서, 상응하는 백신- 및 위약-세포 지수를 사내 소프트웨어를 사용하여 세포독성 곡선으로서 플롯팅하고 시그모이드 반응 곡선(4-파라미터 로지스틱)에 의해 모델링하였다. IC50으로서 정의된, 50% 세포독성을 유도하는 각 임상적 단리체의 세균 상청액 희석율을 결정하였다. 50% 세포독성에서의 두 곡선들 간의 이동을 상대적 효능(Relative Efficacy)(RE)으로서 계산하였다. RE는 정제된 톡신 또는 임상 분리체의 톡신-세포독성 활성을 중화시키는 백신 특이적 항-톡신 항체의 성능을 나타낸다. 특이적 항-톡신 항체 및 위약에 대해 무관한 항체 둘 다를 사용하여 실험실내 정밀성(intermediate precision)을 측정함으로써, RE가 통계학적으로 유의적인 것으로 간주되는 역치를 확립하였고, 이에 따라 상기 역치는 5.4로서 정의되었다.

B. 결과

백신 혈청의 효능은 먼저 우세한 톡시노타입으로부터 정제된 천연 톡신 A 및 B에 대해 시험하였다. 본 시험에 포함된 것은 참조 균주 VPI10463(ATCC43225 PCR-리보타입 087) 및 PCR-리보타입 001, 002, 014 및 023, 017의 균주(A^-B⁺CDT^-)로부터의 톡신뿐만 아니라 소위 과병독성(hypervirulent) PCR-리보타입 027(A⁺B⁺CDT⁺) 및 078(A⁺B⁺CDT⁺)로부터의 톡신이었다. 50% 세포독성이 달성되는 각각의 정제된 천연 톡신의 농도를 먼저 평가하였다. IMR-90 세포는 시험된 상이한 PCR-리보타입들로부터 정제된 톡신 A 및 B에 대해 매우 민감성이다. 톡신 A에 대한 IC50 농도는 4.4 ng/mL 내지 15.9 ng/mL의 범위로 유사한 범위 내에 있었다. 대조적으로, 톡신 B의 경우 IC50 농도는 선택된 PCR-리보타입에 따라 달랐으며 0.2ng/mL 내지 6.2㎍/mL의 범위였으며, 이는 톡신 B 간에 상이한 효능을 시사한다. 이어서, 각 정제된 톡신의 각각의 세포독성 활성을 중화시키는 백신 특이적 항-톡신 항체의 상대적 효능(RE)을 재료 및 방법에 기재된 바와 같이 평가하였다. 표 4에 제시된 바와 같이, 계산된 RE는 9.3 내지 818.5의 범위이며, 이는 모두 RE=5.4로서 정의된 양성 역치를 상회하였다. PCR-리보타입 027, 023 및 078로부터 정제된 톡신을 중화시키는 백신 혈청의 상대적 효능은 다른 PCR-리보타입들과 비교해 더 낮았지만, 여전히 역치를 상회하였다. 본 결과는, 백신 혈청이 모든 시험된 정제된 톡신들의 세포독성을 유의적으로 중화시킬 수 있었음을 시사한다.

대다수의 순환 병원성 균주는 두 톡신을 모두 발현하기 때문에, 정제된 천연 톡신 이외에도, 가장 우세한 균주들을 대표하는 씨. 디피실 프로토타입 균주에 의해 생산되는 톡신을 중화시키는 백신 특이적 항-톡신 항체의 상대적 효능을 평가하는 것이 또한 중요하였다. 이를 위해, 몇몇 프로토타입 균주들(표 5)을 가장 우세한 유형에 기초하여 선택하였다. 배양 상청액 중에 존재하는 톡신 A 및 톡신 B의 농도를 ELISA에 의해 정량하고, IMR-90 세포에서 50% 독성을 유도하는 세균 상청액의 희석율을 각 프로토타입 균주에 대해 계산하였다(IC50). 최적의 배양 조건에서 고 톡신-생산자 균주인 것으로 공지된 균주 ATCC^®43255^™(VPI10463)는 높은 수준의 톡신 A(17.04㎍/mL) 및 톡신 B(7.06㎍/mL)를 생산하고, 독성을 유도하는데 있어서 매우 강력하였으며, 이때 위약 혈청의 IC50 희석율은 5.6×10⁷이었다. 비교하면, 다른 균주들은 낮은 수준 내지 거의 검출 불가능한 수준의 톡신을 생산하였다. 4.4×10³ 내지 5.2×10⁶ 범위에 이르는 위약 혈청의 더 낮은 IC50 희석율에서도 균주가 여전히 독성을 유도할 수 있었기 때문에, 독성은 상청액 중에 존재하는 톡신의 양에 비례하였다. 놀랍게도, 모든 계산된 RE(위약 혈청과 백신-혈청 간의 IC50 희석율의 이동)가 모두 유의성 역치를 상회하였기 때문에, 독성 효능(IC50)의 다양한 범위에도 불구하고, 백신-혈청은 모든 세균 상청액의 세포독성 활성을 중화시킬 수 있었다. 정제된 톡신과 유사하게, 관찰된 최저 RE는 톡시노타입 III PCR-리보타입 027 및 톡시노타입 V, PCR-리보타입 078의 균주들에 대한 것이었지만, 여전히 유의성 역치를 상회하였다.

우세한 순환 씨. 디피실 톡신 변이체 균주를 광범위하게 대표함을 보장하기 위해, 시험관내 교차-중화 연구를 최근의 순환 임상적 단리체 및 각 톡시노타입에 대해 분석된 단리체의 거대 패널을 갖는 거대 씨. 디피실 균주 컬렉션까지 확장시켰다. 전세계의 전향적 임상 연구 및 역학적 연구로부터의 500가지 이상의 최근의 임상적 단리체들이 수집되었다(80가지 이상의 임상적 단리체들은 2011년에 미국 및 아르헨티나에서 수집되었고; 350가지 이상의 임상적 단리체들은 2005년에 유럽 전역에서 수집되었고, 60가지의 단리체들은 2010년 내지 2011년에 프랑스로부터 수집되었고; 30가지 이상의 임상적 단리체들은 2012년 내지 2013년에 오스트레일리아, 싱가포르, 일본, 한국, 인도네시아 및 타이완을 비롯한 아시아태평양 국가들에서 수집되었다). 150가지 이상의 전세계적인 씨. 디피실 임상적 단리체들을 시험관내 분석을 위해 상기 컬렉션으로부터 선택하였다. 선택은 단리된 국가, 분자유형 결정(molecular typing)과 같은 다수의 기준 및 경우에 따라 CDI 중증도 및 CDI 에피소드와 같은 임상 파라미터에 기초하였다. 임상적 단리체들의 지리적 및 분자적 분포는 하기 표 6에 기재되어 있다.

대다수가 톡시노타입 0이고 그 다음으로 톡시노타입 III, V, VIII 및 IV인 5가지의 가장 우세한 톡시노타입뿐만 아니라 톡시노타입 I, 톡시노타입 IX 및 XII과 같은 나머지 톡시노타입을 포함하는 10가지의 톡시노타입이 상이한 지리적 지역에서 대표되었다. 리보타입(RT) 분포를 고려하여, 톡시노타입 0에 대한 13가지 이상의 리보타입(RT)을 포함하여 23가지 이상의 리보타입이 대표된다. 이러한 선택은 세계의 다른 지역에서의 각 톡시노타입의 특정한 분포로 CDI 환자에서 가장 우세한 것으로 확인된 5가지 계통/톡시노타입을 반영한다: 예를 들면, 유럽에서는 대다수가 톡시노타입 0 균주이고, 미국에서는 대다수가 톡시노타입 0 및 III 균주이고, 아시아태평양에서는 대다수가 톡시노타입 0 및 VIII뿐만 아니라 기타 RT 046이다.

톡신을 함유하는 세균 상청액을 임상적 단리체의 시험관내 배양물로부터 생성시켰다. 배양 배지 중 톡신 A 및 톡신 B의 농도를 각 임상적 단리체에 대한 ELISA에 의해 정량하였다. 또한, 각 임상적 단리체의 시험관내 독성을 IC50을 계산하여 평가하였다. 상기 IC50을 각 임상적 단리체의 상청액 중에 존재하는 톡신 A 및 톡신 B의 수준에 대하여 플롯팅하였다(도 4). 모든 세균 상청액은 검정에서 독성이었으며, 각 톡시노타입에 대한 광범위한 독성을 나타냈다. 독성은 세균 상청액에 존재하는 톡신의 수준에 매우 비례하였으며, 이때 톡신 A 및 톡신 B 각각에 대한 상관계수는 0.88 및 0.93으로서(도 4a 및 도 4b), 배양물에서 성장하는 각 임상적 단리체의 능력과 관련될 가능성이 있다(도시되지 않음). 일반적으로, 임상적 단리체들은 톡신 B보다 톡신 A를 더 많이 생산한다. 톡신 A 수준은 오직 톡신 B만을 생산하는 것으로 공지된 톡시노타입 VIII 임상적 단리체의 경우에만 검출 불가능하였다. 일부 세균 상청액의 경우, 톡신 B는 이러한 배양 조건하에 검출 한계치(1.E+04) 미만이었다.

이어서, 톡신 변이체 유형들 간의 잠재적 클러스터(cluster)를 평가하기 위해, 각 임상적 단리체의 RE를 계산하고 이들의 각각의 세포독성 지수에 대하여 플롯팅하였다(도 5). RE가 역치를 상회하였기 때문에, 모든 세균 상청액은 백신-유도된 혈청에 의해 중화되었다. 상대적 효능(RE)은 균주 독성(IC50)과 관계가 없었다. 흥미롭게도, 동일한 톡시노타입 간의 광범위한 세포독성에도 불구하고, 동일한 톡신-변이체 유형으로부터의 임상적 단리체에 대해 균일한 RE 거동이 관찰되었다. 톡시노타입 III, V 및 VI에 대한 RE는 톡시노타입 0에 대한 RE에 비해 낮았지만, 여전히 역치를 상회하였다. 이것은, IMR90 세포가 2성분 톡신에 대해 민감성이 아니기 때문에, 2성분 톡신 활성과 관련되지 않고 오히려 서열 비교에 기초하여 톡신 A- 및 톡신 B-계통발생과 일치하는 것으로 입증되었다.

햄스터 모델에서의 본 비교 연구는 전세계적으로 순환되는 5가지의 가장 우세한 변이체 균주들, 즉 톡시노타입/RT 0/012, III/027, IV/023, V/078 및 VIII/017에 대한 광범위한 보호 범위를 입증한다. 씨. 디피실 톡소이드 백신은 햄스터 모델에서 주요 톡시노타입 0, III, IV, V, VIII 및 기타(I, VI, XII)로부터의 시험관내 톡신 A 및 톡신 B를 중화시킬 수 있는 항-톡신 항체를 생성한다. 톡시노타입 III, V 및 VI의 경우에 관찰된 더 낮은 상대적 효능(RE)은, 2성분 톡신 활성과 관련되지 않으며 톡신 A 및 톡신 B 계통발생과 일치한다. 2성분 톡신의 존재가 질환 중증도 및 사망 위험의 현저한 증가와 연관되었음을 주목하는 것이 중요하다. 2성분 톡신의 역할은 알지 못한다.

실시예 4

교차-면역화 연구

햄스터 모델에서의 씨. 디피실 VPI10463/ATCC43255 균주와 시험감염 균주로서의 VPI 1064631 ATCC43255 균주와 관련하여 상기한 면역화 연구를 상이한 씨. 디피실 균주들을 사용하여 수행하여, 상기 상이한 씨. 디피실 균주들이 다수의 균주들에 대해 동물들을 백신접종하기 위해 사용될 수 있는지 여부(즉, 교차-보호를 제공하는지 여부)를 결정하였다. 톡시노타입 A⁺B⁺CDT^-를 갖는 균주, A⁺B⁺CDT⁺를 갖는 균주 및 A^-B⁺CDT^-를 갖는 균주를 하기 기재하는 바와 같이 연구하였다.

본 연구는 실질적으로 상기한 방법(예를 들면, 표 3의 파라미터 22)에 따라서 제조되었고 수산화알루미늄을 이용하여 백신 조성물(20 또는 160㎍ AlOOH의 존재하의 5㎍ 톡소이드 A+B("씨. 디피실 톡소이드 백신"))로서 제형화된, 동일한 씨. 디피실 균주로부터 유래된 정제된 씨. 디피실 톡소이드 A 및 씨. 디피실 톡소이드 B를 사용하였다.

생체내 교차-보호 연구를 클리다마이신-유도된 치사 소장결장염 골든 시리안 햄스터 모델에서 수행하였다. 상기 모델은 실제로 씨. 디피실 감염의 병원성 및 백신에 의해 매개된 보호를 연구하기 위해 통상적으로 사용되고 있다. 씨. 디피실 톡소이드 백신 또는 희석된 완충액(위약)으로 면역화된 햄스터를 클린다마이신-2-포스페이트 용액으로 전처리하여, 장내 미생물을 파괴하고 동물이 상이한 프로토타입 균주로부터의 씨. 디피실 포자-풍부한 제제로의 후속적 치사적 시험감염에 대하여 감수성이 되도록 만들었다.

설사를 포함하는 임상 징후의 발병 및 생존을 모니터링함으로써 CDI에 대한 보호를 평가하였다. 생체내 교차-보호 연구를 위해 선택되는 프로토타입 균주는 5가지의 가장 우세한 톡신-변이체 균주를 대표한다(표 4).

A. 재료 및 방법

찰스 리버 래보러터리즈(Charles River Laboratories)(독일)로부터의 70 내지 90g 암컷 골든 시리안 햄스터(메소크리세투스 아우라투스(Mesocricetus auratus))를 면역화 및 시험감염 연구를 위해 사용하였다. 동물들은 그룹내에 무작위로 분포시켰으며, 800cm² 케이지(타입 3, 참조번호: LF-3H, 공급자 Serlab)당 3마리씩 사육하였다. 씨. 디피실 시험감염 후, 동물들을 이소캡(isocap)을 갖는 케이지에서 개별적으로 사육하였다. 생물통계학 분석에 기초하여, 그룹당 9마리의 동물을 사용하였다. 햄스터에게 근육내(IM) 경로를 통해서 씨. 디피실 톡소이드 백신 또는 알루미늄 희석 완충액(위약 대조군)을 2주 간격으로 하여 3회 투여하였다. 41일째에, 복강내(IP) 경로를 통해 10mg/kg의 클린다마이신-2-포스페이트 용액을 투여하였다. 24시간 후, 햄스터를 공급 니들을 사용하여 각 프로토타입 균주의 살아있는 씨. 디피실 포자-풍부한 제제의 예정된 치사 용량으로 위내(IG) 시험감염시켰다. 시험감염 후, 동물들을 이환율 및 사망률에 대해 하루에 적어도 2회 관찰하였다. 또한, 체중을 클린다마이신 주사 전에 정확한 시간에 모니터링하고, 이어서 임상적 모니터링 동안 1주마다 1회 내지 3회 모니터링하였다. 설사 질환은 개별적 질환 스코어의 그룹 중간 스코어로서 보고하였다: 0 = 질환 없음; 1 = 묽은 변; 2 = 젖은 꼬리 및 항문주위 영역; 3 = 젖은 항문주위 영역, 복부 및 뒷발; 및 4= 사망. 통계학적 분석을 SAS v9.2^® 및 엑셀 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 로그 순위 검정을 이용한 카플란-마이어(Kaplan Meier) 방법을 사용하여 수명 데이터로부터 생존 함수를 추정하였다. 양방향 피셔 정확 검정(bilateral Fisher exact test)을 사용하여 시험감염 후 17일째에서의 생존 동물의 백분율을 비교하였다. 5%의 오차 범위를 인자들의 효과를 위해 사용하였다.

시험감염용 씨. 디피실 프로토타입 균주를 37℃에서 24시간 동안 티오글리콜레이트 배지에서 혐기성으로 성장시켰다. 이어서, 배양물을 혐기성 혈액 아가 플레이트(CDC, Becton Dickinson)에 접종하고 37℃에서 7일 동안 항온배양하여 포자 형성을 유도하였다. 이어서, 포자를 Ca 또는 Mg가 없는 PBS로 수거하고 2회 세척한 다음, 57℃에서 10분 동안 열 충격을 가하여 영양세포를 사멸시켰다. 포자 현탁액을 30분 동안 500g로 원심분리하고 PBS 중의 20% 글리세롤에 재현탁시켰다. 포자 제제를 장기간 저장을 위해 -70℃ 미만에서 동결시켰다. 포자 스톡을 37℃에서 해동시키고 수중에서 연속적 10배 희석을 수행하여 생존 포자 계수(viable spore count)(CFU/mL)를 평가하였다. 희석액을 포자 회수율을 향상시키는 0.1%의 타우로콜레이트(Sigma)의 존재하에 효모 추출물 아가 플레이트(BHISA, Becton Dickinson)를 이용하여 뇌심장 침출 배지에 3중으로 플레이팅하였다. 플레이트를 혐기성 조건하에 37℃에서 48시간 이상 동안 항온배양하였다. 콜로니를 계수하고 CFU/mL를 계산하였다.

B. 결과

동종 씨. 디피실 백신 균주에 대한 보호가 입증되었다(도 6). 위약 그룹에서는, 급성 설사의 발병이 시험감염 1일 후로 일찍 나타났고(도 6a), 생존율이 시험감염 3.5일 후로 일찍 11%까지 급속히 하락하였다(도 6b). 백신 그룹(검은색 사각형)에서는, 연구 전반에 걸쳐서 매우 제한된 분변 변화가 관찰되었으며, 오직 1마리 햄스터만이 시험감염 후 2.5일째에 시작한 일시적인 경미한 설사(스코어 2)를 나타냈고 9일째에 회복되었고, 생존율이 연구 전반에 걸쳐서 100%로 유지되었기 때문에 유의적 보호가 관찰되었다.

상이한 RT로부터 또 다른 톡시노타입 0 균주에 대한 보호를 입증하기 위해, 씨. 디피실 630 균주를 사용하였다(도 7). 설사의 발병은 위약 그룹에서 시험감염 3일 후로 일찍 나타나서 시험감염 6일 후에 최대치에 도달하였다(도 7a). 백신 그룹에서는, 연구 전반에 걸쳐서 매우 제한된 분변 변화가 관찰되었다. 도 7b의 생존 곡선은, 위약 그룹(흰색 원)에서 생존율이 시험감염 2일 후로 일찍 하락하여 시험감염 13일 후에는 11%에 도달하였음을 보여준다. 백신 그룹(검은색 사각형)에서, 생존율은 연구 전반에 걸쳐서 100%로 유지되었다. 씨. 디피실 톡소이드 백신은 균주 630으로 시험감염 후 질환 및 사망에 대한 유의적 보호(피셔 정확 검정 이용시 p=0.0004 및 카플란 마이어 로그 순위 검정 이용시 p=0.0001)를 유도하였다.

A⁺B⁺ 이외에도 2성분 톡신(CDT⁺)을 발현하는 과병독성 플루오로퀴놀론-내성 톡시노타입 III PCR-리보타입 027 균주에 대한 보호를 또한 평가하였다. 이러한 목적을 위해, 3가지 균주를 본 분석을 위해 선택하였다: 2007년에 프랑스에서 단리된 균주 IPP40348, 2005년에 캐나단에서 단리된 균주 CDC13695#7 및 2011년에 미국에서 단리된 균주 SP041. 상기 3가지 균주로 시험감염한 후, 시험감염 2일 후로 일찍 시작된 급성 설사와 함께 급성 CDI가 유도되었고, 시험감염 후 5일도 안되서 100% 치사율이 달성되었다.

160㎍ AlOOH와 혼합된, 상기한 씨. 디피실 참조 균주 VPI10463(ATCC43255)로부터 고도로 정제된 포르말린-불활성화된 톡소이드 A 및 톡소이드 B의 제제를 투여한 후, 낮은 증상 및 치사율 둘 다가 관찰되었다(도 8a 내지 8b). 백신접종된 햄스터의 대부분(10/12)은 질환 증상을 나타내지 않았으며 시험감염에서 생존하였는데, 이는 유의적 보호를 제공하였다(피셔 정확 검정 및 카플란 마이어 로그 순위 검정 둘 다를 이용시 p-값 <0.001). 오직 2마리 햄스터만이 시험감염 후 3일 이내에 중간 정도의 설사(스코어 2, 0.42의 평균/그룹)를 나타냈으며 시험감염 6일 후에 쓰러졌다.

균주 CDC13695#7로 시험감염한 후, 씨. 디피실 톡소이드 백신은 질환 증상(도 9a) 및 사망(도 9b)에 대한 유의적 교차-보호를 유발하였다(피셔 정확 검정 및 카플란 마이어 로그 순위 검정 둘 다를 이용시 p-값 <0.001). 확실히, 백신접종된 햄스터 중 어떠한 것도 어떠한 묽은 변을 나타내지 않았으며 생존율은 시험감염 후 100%에서 유지된 반면에, 대조군 그룹에서 햄스터는 시험감염 후 2일 이내에 상당한 설사와 함께 젖은 항문주위 영역, 복부 및 뒷발(스코어 3)을 나타냈고 생존율은 시험감염 후 4일 이내에 8%로 저하되었다.

최근 미국의 임상적 단리체인 균주 SP041의 경우, 위약 그룹의 모든 햄스터에서 상당한 급성 설사(스코어 3)가 관찰되었으며 시험감염 후 2일 이내에 100% 치사율이 초래되었으며(도 9c 내지 9d), 이는 고 병독성 균주를 시사한다. 씨. 디피실 톡소이드 백신이 접종된 햄스터들 중에서, 58%(7/12)는 어떠한 질환 증상도 나타내지 않았으며 17일 넘도록 시험감염에서 생존하였다. 나머지 42%(5/12)는 중간 정도 내지 급성 설사를 나타냈으며 시험감염 후 2일 내지 5일 이내에 사망하였다. 그럼에도 불구하고 보호는 유의적이었다(카플란 마이어 로그 순위 검정 이용시 p-값 < 0.001 및 피셔 정확 검정 이용시 p-값 = 0.005).

톡시노타입 V PCR-리보타입 078 과병독성 균주도 전세계적으로 우세하며 이는 A⁺B⁺CDT⁺이다. 균주 BAA-1875를 교차-보호를 평가하기 위한 프로토타입 균주로서 사용하였다. 위약 그룹(흰색 원)에서, 상기 균주로의 시험감염은 시험감염 후 2일 이내에 67% 햄스터(그룹 평균 1.7)에서 관찰된 상당한 급성 설사(스코어 3)(도 10a) 및 시험감염 3일 이내에 100% 치사율(도 10b)을 초래하였다. 씨. 디피실 톡소이드 백신은 유의적인 교차-보호를 유도하였으며, 생존율은 연구 전반에 걸쳐서 100%로 유지되었고(피셔 정확 검정 및 카플란 마이어 로그 순위 검정 둘 다를 이용시 모든 p-값 ≤ 0.0001), 백신접종된 햄스터에서 어떠한 질환 증상도 없었다.

톡시노타입 IV PCR-리보타입 023 균주는 여러 국가에서 새로이 대두되고 있다. 흥미롭게도, 상기 균주도 또한 A⁺B⁺CDT⁺이다. 따라서, 1가지 프로토타입 균주에 대한 교차-보호를 평가하는 것이 중요하였다. 2012년에 프랑스 병원에서 최근에 단리된 균주 NK91을 프로토타입 균주로서 사용하였다(도 11). 위약 그룹에서, 대부분의 햄스터는 시험감염 1일 후로 일찍 묽은 변(스코어 1) 내지 급성 설사(스코어 3)을 나타냈고(도 11a) 시험감염 후 6일 이내에 100% 치사율로 이어졌다(도 11b). 씨. 디피실 톡소이드 백신은 유의적 교차-보호를 유도하였고, 이때 생존율은 연구 전반에 걸쳐서 100%로 유지되었고(피셔 정확 검정 및 카플란 마이어 로그 순위 검정 둘 다를 이용시 p-값 <0.001), 경미한 일시적 설사(스코어 1, 묽은 변)는 시험감염 후 13일 이내에 해결되었다.

A^-B⁺CDT^-인 톡시노타입 VIII PCR-리보타입 017 균주는 아시아태평양 지역에 매우 우세하다. 균주 ATCC43598을 교차-보호를 평가하기 위한 프로토타입 균주로서 사용하였다(도 12). 위약 그룹에서, 시험감염된 햄스터들은 시험감염 후 3일 내지 5일 이내에 상당한 설사를 나타냈고(도 12a) 시험감염 후 9일 이내에 35% 감소될 수 있는 상당한 체중 감소를 나타냈다(도 12b). 12마리의 병든 햄스터들 중 7마리는 이러한 증상들로 인해 쓰러졌으며, 생존율은 시험감염 후 10일 이내에 42%로 하락하였다(도 12c). 그러나, 일부 햄스터들은 이러한 증상들로부터 회복될 수 있었다. 따라서, 톡신 A의 부재에도 불구하고, 균주 ATCC43598은 여전히 병독성이지만, 이미 기재한 바와 같이 햄스터에서의 질환의 발생률 및 중증도는 감소되었다. 놀랍게도, 씨. 디피실 톡소이드 백신이 접종된 모든 햄스터들은 질환 증상(도 12a 및 12b) 및 사망(도 12c)에 대해 보호되었으며, 생존율은 시험감염 후 100%로 유지되었다(피셔 정확 분석시 p-값 = 0.0046, 카플란 마이어 분석시 p-값 = 0.0020).

검정된 균주들은 5가지의 가장 우세한 톡시노타입: 0, III, IV, V 및 VIII을 대표한다. 놀랍게도, 본 조성물이 톡시노타입 0, PCR-리보타입 012, 균주 630(A⁺B⁺CDT^-); 톡시노타입 III PCR-리보타입 균주 027 균주(A⁺B⁺CDT⁺)(CDC 13695#7 균주, 캐나다, 2005; SP041 임상적 단리체, 미국, 2011; IPP40348 균주, 프랑스, 2007); 톡시노타입 IV PCR-리보타입 023(A⁺B⁺CDT⁺)(임상적 단리체 NK91, 프랑스 2012); 톡시노타입 V PCR-리보타입 078 균주 ATCC BAA-1875(A⁺B⁺CDT⁺) 및 톡시노타입 VIII PCR-리보타입 017(ATCC4539(A^-B⁺CDT^-)로 시험감염 후 증상 및 사망에 대한 유의적인 교차-보호를 제공하였다는 것이 관찰되었다. 교차-보호는, 20㎍ 수산화알루미늄(AlOOH)을 포함하는 조성물을 사용하는 균주 IPP40348에 대한 본 연구에서는 유의적이지 않았지만, 160㎍ AlOOH가 포함되었을 경우에는 유의적이었음이 주지된다. 데이터는 표 7에 요약되어 있다.

상기 데이터는 씨. 디피실 톡소이드 백신이 햄스터 시험감염 모델에 있어서 전세계적으로 순환되는 5가지의 가장 우세한 변이체 균주들을 대표하는 임상적으로 관련된 균주들에 대한 광범위한 보호를 제공할 수 있음을 입증한다. 씨. 디피실 톡소이드 백신은 톡시노타입/PCR-리보타입 III/027, IV/023 및 V/078과 같은 2성분 톡신을 발현하는 균주들을 포함하여 톡시노타입/PCR-리보타입 0/012, III/027, IV/023, V/078 및 VIII/017 프로토타입 균주들로의 시험감염에 대해 생체내에서 광범위한 보호를 유도한다.

특정 양태들이 바람직한 양태의 측면에서 기재되어 있지만, 당업계의 숙련가들에게 변화 및 변형이 발생할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 첨부된 청구범위는 하기 청구범위 내에 속하는 이러한 균등한 변형 모두를 포함하는 것으로 의도된다.

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2. Buckley AM, Spencer J, Maclellan LM, Candlish D, Irvine JJ, et al. (2013) Susceptibility of hamsters to Clostridium difficile isolates of differing toxinotype. PLoS One 8: e64121.

3. Sambol SP, Tang JK, Merrigan MM, Johnson S, Gerding DN (2001) Infection of hamsters with epidemiologically important strains of Clostridium difficile. J Infect Dis 183: 1760-1766.

Claims (48)

1. 씨. 디피실(C. difficile) 2성분 톡신(binary toxin)(CDT)을 발현하는 씨. 디피실 균주 및 CDT를 발현하지 않는 씨. 디피실 균주에 대해 숙주를 면역화하는 방법으로서, 상기 방법은 약 15 내지 32℃에서 약 2일 내지 약 21일 동안 포름알데히드(w/v)와 함께 항온배양함으로써 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 포함하는 면역원성 조성물을 상기 숙주에게 투여함을 포함하고, 여기서 톡신 A는 0.15% 내지 0.5% 포름알데히드(w/v)로 불활성화시키고 톡신 B는 0.15% 내지 0.8% 포름알데히드(w/v)로 불활성화시키는, 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 정제된 씨. 디피실 톡신 B가 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하지 않는 씨. 디피실 균주로부터 유래되는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 정제된 씨. 디피실 톡신 B가 씨. 디피실 균주 VPI10463/ATCC43255로부터 유래되는, 방법.
4. 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대한 특이성을 갖는 항체를 숙주에서 유도하는 방법으로서, 상기 방법은 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하지 않는 씨. 디피실 균주로부터 유래된 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 포함하는 조성물을 숙주에게 투여함을 포함하는, 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 항체가 톡신 중화 검정에 의한 측정시 중화 항체인, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 항체가 적어도 5.4의 상대적 효능(relative efficacy)(RE)을 나타내는, 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 0, I, III, IV, V, VI, VII, VIII, IX 및 XII로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입(toxinotype)을 갖는 씨. 디피실 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시키는, 방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 톡시노타입 0 균주가 001, 002, 012, 014, 020, 014/020, 014/020/077, 106, 018 및 053으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 PCR-리보타입을 갖고;
   상기 톡시노타입 III 균주가 PCR-리보타입 027 또는 075를 갖고;
   상기 톡시노타입 IV 균주가 PCR-리보타입 023을 갖고;
   상기 톡시노타입 V 균주가 078, 079, 122, 126 및 078/126으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 PCR-리보타입을 갖고;
   상기 톡시노타입 VI 균주가 PCR-리보타입 127 또는 66-2를 갖고;
   상기 톡시노타입 VII 균주가 PCR-리보타입 66-2를 갖고;
   상기 톡시노타입 VIII 균주가 PCR-리보타입 017을 갖고;
   상기 톡시노타입 IX 균주가 PCR-리보타입 019를 갖고;
   상기 톡시노타입 XIa 균주가 PCR-리보타입 642를 갖고;
   상기 톡시노타입 XII 균주가 PCR-리보타입 056을 갖는, 방법.
9. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 PCR-리보타입 046 또는 369를 갖는 씨. 디피실 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시키는, 방법.
10. 제7항에 있어서, 상기 항체가 0, III, IV, V 및 VIII로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입을 갖는 씨. 디피실 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시키는, 방법.
11. 제7항에 있어서, 상기 항체가 톡시노타입 0, III, IV, V 및 VIII을 갖는 씨. 디피실 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시키는, 방법.
12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 톡시노타입 0 균주가 PCR-리보타입 012를 갖고, 상기 톡시노타입 III 균주가 PCR-리보타입 027을 갖고, 상기 톡시노타입 IV 균주가 PCR-리보타입 023을 갖고, 상기 톡시노타입 V 균주가 PCR-리보타입 078을 갖고, 상기 톡시노타입 VIII 균주가 PCR-리보타입 017을 갖는, 방법.
13. 제7항에 있어서, 상기 항체가 톡시노타입 III, IV 및 V의 씨. 디피실 균주에 의해 생산된 톡신 A 및/또는 톡신 B를 중화시키는, 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 톡시노타입 III 균주가 PCR-리보타입 027을 갖고, 상기 톡시노타입 IV 균주가 PCR-리보타입 023을 갖고, 상기 톡시노타입 V 균주가 PCR-리보타입 078을 갖는, 방법.
15. 씨. 디피실 2성분 톡신(CDT)을 발현하는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대해 숙주를 면역화하고/면역화하거나 백신접종하는 방법으로서, 상기 방법은 CDT를 발현하지 않는 씨. 디피실 균주로부터 유래된 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 불활성화된 정제된 씨. 디피실 톡신 B를 포함하는 조성물을 숙주에게 투여함을 포함하는, 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 숙주가 각각 0, III, IV, V 및/또는 VIII로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입을 갖는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대해 면역화되고/면역화되거나 백신접종되는, 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 숙주가 각각 III, IV 및 V로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 톡시노타입을 갖는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대해 면역화되고/면역화되거나 백신접종되는, 방법.
18. 제15항 또는 제16항에 있어서, 상기 숙주가 각각 톡시노타입 III, IV 및 V를 갖는 하나 이상의 씨. 디피실 균주에 대해 면역화되고/면역화되거나 백신접종되는, 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 톡시노타입 III 균주가 PCR-리보타입 027을 갖고, 상기 톡시노타입 IV 균주가 PCR-리보타입 023을 갖고, 상기 톡시노타입 V 균주가 PCR-리보타입 078을 갖는, 방법.
20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 씨. 디피실에 의해 유발되는 질환 및 사망에 대한 유의적 보호가 숙주에게 제공되는, 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 보호가 골든 시리안 햄스터 모델(Golden Syrian hamster model)을 사용하여 측정되는, 방법.
22. 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 상기 숙주에게 적어도 3회 투여되는, 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 조성물이 근육내 경로를 통해 투여되는, 방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 조성물이 투여 간격을 2주로 하여 3회 투여되는, 방법.
25. 제21항 내지 제24항에 있어서, 햄스터 그룹의 생존율이 약 58% 내지 약 100%인, 방법.
26. 제21항 내지 제25항에 있어서, 보호가, 로그 순위 검정(log-rank test)을 사용하는 카플란-마이어(Kaplan Meier) 방법 및/또는 양방향 피셔 정확 검정(bilateral Fisher exact test)에 의해 측정시 통계학적으로 유의적인, 방법.
27. 제26항에 있어서, 햄스터의 그룹에 대해,
    카플란 마이어 로그 순위 검정을 이용시 p=0.0001 및 양방향 피셔 정확 검정을 이용시 p=0.0004;
    카플란 마이어 로그 순위 검정을 이용시 p<0.001 및 양방향 피셔 정확 검정을 이용시 p-값=0.005;
    카플란 마이어 로그 순위 검정 및 양방향 피셔 정확 검정 둘 다를 이용시 p-값 ≤ 0.0001; 및/또는
    카플란 마이어 로그 순위 검정을 이용시 p-값=0.0020 및 양방향 피셔 정확 검정을 이용시 p=0.0046인, 방법.
28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 CDT 또는 이의 서브유닛을 포함하지 않는, 방법.
29. 제3항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 씨. 디피실 톡신 A 및 톡신 B가 씨. 디피실 톡시노타입 0로부터 유래되는, 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 정제된 씨. 디피실 톡신 A 및 정제된 씨. 디피실 톡신 B가 씨. 디피실 균주 VPI10463/ATCC43255로부터 유래되는, 방법.
31. 제3항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 톡신 A 및 톡신 B가 약 15 내지 32℃에서 약 2일 내지 약 21일 동안 포름알데히드(w/v)와 함께 항온배양함으로써 불활성화되고, 여기서 톡신 A가 0.15% 내지 0.5% 포름알데히드(w/v)로 불활성화되고 톡신 B가 0.15% 내지 0.8% 포름알데히드(w/v)로 불활성화되는, 방법.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.001% 내지 0.020% 포름알데히드를 포함하는, 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.004% 포름알데히드를 포함하는, 방법.
34. 제32항에 있어서, 상기 조성물이 0.008% 포름알데히드를 포함하는, 방법.
35. 제32항에 있어서, 상기 조성물이 약 0.016% 포름알데히드를 포함하는, 방법.
36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 톡신 A 및 톡신 B가 5:1 내지 1:5의 A:B 비로 상기 조성물 중에 존재하는, 방법.
37. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 톡신 A 및 톡신 B가 3:1 또는 3:2의 A:B 비로 상기 조성물 중에 존재하는, 방법.
38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 동결건조, 분무 조 또는 발포 건조되는, 방법.
39. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 액체 형태인, 방법.
40. 제1항 내지 제39항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
41. 제40항에 있어서, 상기 조성물이 시트레이트, 포스페이트, 글리신, 카보네이트 또는 바이카보네이트 완충액 또는 pH-제어된 수용액을 포함하는, 방법.
42. 제40항 또는 제41항에 있어서, 상기 조성물이 당 또는 당 알코올을 추가로 포함하는, 방법.
43. 제40항 내지 제42항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 슈크로스 및 시트레이트를 포함하는, 방법.
44. 제1항 내지 제43항에 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 어쥬번트(adjuvant)를 추가로 포함하는, 방법.
45. 제44항에 있어서, 상기 어쥬번트가 알루미늄을 포함하는, 방법.
46. 제45항에 있어서, 상기 어쥬번트가 인산알루미늄 또는 수산화알루미늄을 포함하는, 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 어쥬번트가 수산화알루미늄을 포함하는, 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 조성물이 약 20㎍ 내지 약 160㎍의 수산화알루미늄을 포함하는, 방법.

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