JP2018521967A - クロストリジウム・ディフィシルに対する免疫方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、概して、クロストリジウム・ディフィシル（C. difficile）に対する治療的及び／又は予防的ワクチン接種の分野に関する。より詳細には、本開示は、Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現するＣ．ディフィシル株及びＣＤＴを発現しない株に対して宿主を免疫する方法に関する。これらの方法は、宿主に対する、不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及び精製トキシンＢを含む免疫原性組成物の投与を包含する。精製されたＣ．ディフィシルトキシンは、ＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株から誘導することができる。

Description

関連出願の相互参照

本出願は、２０１５年５月１５日出願の米国仮特許出願第６２／１６２，３５７号に対する優先権を主張する。

本開示は、概して、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile；C.difficile）に対する治療的接種及び／又は予防接種の分野に関する。

Ｃ．ディフィシルは、複数の株の毒素遺伝子変異型（toxinotypes）／ＰＣＲ−リボタイプ（ＲＴ）を有する、広く分布する病原菌である。数か国にわたって行われた多くの分子疫学研究が、過去５年間にわたり公開されている。結果は、幾つかのトキシン変異体をコードする流行株が、ヒトの症候性Ｃ．ディフィシル感染症（ＣＤＩ）の原因として一般的であることを実証している。５つの最も一般的なものとして、毒素遺伝子変異型０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩＩＩが挙げられる。複数のＣ．ディフィシル株／毒素遺伝子変異型、とりわけＣ．ディフィシル二元毒素（「ＣＤＴ」；例えば、ＣＤＴａ及び／又はＣＤＴｂサブユニットに由来）を発現するもの及び発現しないものの両方に対する治療的及び／又は予防的免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として使用するためのＣ．ディフィシル抗原を含む組成物は、とりわけ、ワクチンがＣＤＴを発現しない株から調製され、免疫付与が所望される株がＣＤＴを発現する場合に、当技術分野で必要とされている。二元毒素がワクチンに含まれない限り、例えば、組み換えトキシンＡ及びトキシンＢは、ＣＤＴを発現する株に対する防御をもたらさないであろうことは、当技術分野で認識されている（特許文献１）。特許文献１の明細書の実施例１１には、「組み換えＴｃｄＡ＋ＴｃｄＢワクチンは、強毒性のＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７株（ＣＤＴを発現する）から誘導される…胞子…を用いてチャレンジしたハムスターの生存率を実質的に増加させることができなかった」が、「ワクチンへの二元毒素（ＣＤＴａ及びＣＤＴｂ）の添加は…このワクチンの防御効果を一貫して増加させた」と説明されている。また、実際に、「ＴｃｄＡ及びＴｃｄＢを有する二元毒素タンパク質（ＣＤＴａ及びＣＤＴｂ）の両方」の包含によってのみ、「…防御が完全に回復した」。これらの教示とは対照的に、これらの観点から驚くべきことに、このような問題が、本開示に記載される試薬及び方法を使用して克服された。

国際公開第２０１３／１１２８６７号

本開示は、複数のＣ．ディフィシル株／毒素遺伝子変異型に対する、とりわけＣ．ディフィシル二元毒素（「ＣＤＴ」；例えば、そのサブユニットＣＤＴａ及び／又はＣＤＴｂに由来）を発現するもの及び発現しないものの両方に対する、治療的及び／又は予防的免疫原性組成物（例えば、ワクチン）として使用するためのＣ．ディフィシル抗原を含む組成物を提供する。好ましい実施形態では、組成物は、ＣＤＴ又はそれらのサブユニット（又はそれらの免疫原）を含まない。当業者にとって明白なように、他の実施形態もまた本開示において提供される。

細胞毒性アッセイの結果のグラフ。記載される方法（実施例２）に従って不活化させたトキシンＡ及びトキシンＢの各々の１つのバッチ由来の試料を用いて、ＩＭＲ９０細胞を使用する細胞毒性アッセイを行った。ホルムアルデヒドを添加してトキシンを不活化後０日目及びその数日後に試料を採取し、物質の細胞毒性について評価した。ｙ軸は、毒性物質の存在下で５０％の細胞が丸くなった（それらの正常な線状形態とは対照的に）最小濃度（ＭＣ５０）を特定する。アッセイの検出値の下限（ＬＯＤ）は、破線を使用して特定される。 Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及びトキシンＢを不活化する例となる方法のスキーム 免疫付与試験の結果のグラフ。ハムスターチャレンジモデル（９匹のハムスター／群で５つの群を使用）において行われた研究（実施例２に記載される）では、トキソイドＡ及びトキソイドＢは、記載される方法に従って調製され、混合され、かつ凍結乾燥された組成物として調合された。組成物は、ワクチン接種の前に、再構成され、アジュバント化された。１つのハムスター群にはプラセボを投与した。ヒト投与量（ＨＤ）の組成物（１００ｐｇ／用量）の４つの異なる希釈物を、４つの他のハムスター群のそれぞれに１つずつ、調製した。投与される組成物（すなわち、プラセボ又はＨＤ希釈物）は、Ｘ軸上に特定されている。致死的チャレンジ用量のＣ．ディフィシルの投与後の各群の％生存率（Ｙ軸）を、グラフに示されているように決定した。 実施例３に記載される多数の代表的な毒素遺伝子変異型の臨床分離株についての細胞毒性アッセイ（ＩＭＲ−９０細胞を使用）の結果を示すグラフ。計算したＩＣ５０の結果が、細菌の上清中に存在するトキシンＡの濃度（μｇ／ｍｌ）に対してプロットされている。 実施例３に記載される多数の代表的な毒素遺伝子変異型の臨床分離株についての細胞毒性アッセイ（ＩＭＲ−９０細胞を使用）の結果を示すグラフ。計算したＩＣ５０の結果が、細菌の上清中に存在するトキシンＢの濃度（μｇ／ｍｌ）に対してプロットされている。 実施例３に記載される交差中和アッセイの結果を示すグラフ。さまざまな毒素遺伝子変異型の代表的臨床分離株に由来する細菌の上清のそれぞれの細胞毒性活性を中和するためのワクチン特異的抗体の相対効果（ＲＥ）についてアッセイされた。それらのそれぞれの細胞毒性指数に対する各分離株のＲＥが示されている。計算した交差血清中和有意性閾値のＲＥは、高度免疫無関係(hyperimmune irrelevant)ハムスター血清及び異種株を用いて得られた結果に基づいて、５．４であった。 チャレンジ株としてＣ．ディフィシルワクチン株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群（○）と比較したワクチン群（■）における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株としてＣ．ディフィシルワクチン株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群（○）と比較したワクチン群（■）における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型０ ＰＣＲ−リボタイプ０１２株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群（○）と比較したワクチン群（■）における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型０ ＰＣＲ−リボタイプ０１２株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０２７株ＩＰＰ４０３４８を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群（１６０μｇのＡｌＯＯＨを含んだワクチンを使用）における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０２７株ＩＰＰ４０３４８を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較した１６０μｇのＡｌＯＯＨワクチン群における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０２７株ＣＤＣ１３６９５＃７を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０２７株ＣＤＣ１３６９５＃７を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプＳＰ０４１株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプＳＰ０４１株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＶ ＰＣＲ−リボタイプ０２３株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＩＶ ＰＣＲ−リボタイプ０２３株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型Ｖ ＰＣＲ−リボタイプ０７８株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型Ｖ ＰＣＲ−リボタイプ０７８株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０１７株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時による排泄物／スコアリング（下痢疾患）が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０１７株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時によるパーセント生存率が示されている。 チャレンジ株として毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０１７株を使用する実施例４に記載されるハムスターチャレンジ研究の結果を示すグラフ。プラセボ対照群と比較したワクチン群における経時によるパーセント体重変化が示されている。

本開示は、複数のＣ．ディフィシル株及び／又は「毒素遺伝子変異型」（すなわち、トキシンＡを発現する（例えば、ＴｃｄＡ遺伝子から発現）、トキシンＢを発現する（例えば、ＴｃｄＢ遺伝子から発現）、及び／又は、Ｃ．ディフィシル二元毒素を発現する（「ＣＤＴ」／「二元毒素」、ＣＤＴａ及び／又はＣＤＴｂ遺伝子から発現）、若しくはそれらのタンパク質のいずれか１つ以上を発現しない）に対し、宿主を免疫する方法を提供する。トキシンＡを発現する株及び／又は毒素遺伝子変異型は、本明細書では「Ａ^＋」と特定される；トキシンＡを発現しない株は、本明細書では「Ａ⁻」と特定される。トキシンＢを発現する株及び／又は毒素遺伝子変異型は、本明細書では「Ｂ^＋」と特定される；トキシンＢを発現しない株は、本明細書では「Ｂ⁻」と特定される。ＣＤＴを発現する株及び／又は毒素遺伝子変異型は、本明細書では「ＣＤＴ^＋」と特定される；ＣＤＴを発現しない株は、本明細書では「ＣＤＴ⁻」と特定される。株及び／又は毒素遺伝子変異型は、これらのマーカーのいずれか１つ以上の任意の組合せにおける発現によって特徴付けられうる（例えば、Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋、Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ⁻、Ａ^＋Ｂ⁻ＣＤＴ^＋、Ａ^＋Ｂ⁻ＣＤＴ⁻、Ａ⁻Ｂ^＋ＣＤＴ⁻、Ａ⁻Ｂ⁻ＣＤＴ^＋など）。例えば、毒素遺伝子変異型０はＡ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ⁻であり、毒素遺伝子変異型ＩＩＩはＡ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋であり、毒素遺伝子変異型ＩＶはＡ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋であり、毒素遺伝子変異型ＶはＡ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋であり、毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩはＡ⁻Ｂ^＋ＣＤＴ⁻である。

さまざまな種類のＣ．ディフィシル毒素遺伝子変異型は、トキシン遺伝子ｔｃｄＡのＡ３断片及びトキシン遺伝子ｔｃｄＢのＢ１断片を特定するためにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、例えば、ＰａＬｏｃ領域（トキシン発現遺伝子座）の制限酵素断片長多型（ＲＦＬＰ）をベースとしたものなど、毒素遺伝子変異型の決定のための方法を使用して、特定されうる。幾つかの株は、例えば参考株ＶＰＩ１０４６３（ワクチン株ＡＴＣＣ４３２５５）と比較して、ＴｃｄＡ及び／又はＴｃｄＢ遺伝子に僅かな変化を示しうる。ＰＣＲリボタイプは、１６Ｓ及び２３ＳリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）間の遺伝子間スペーサ領域（ＩＳＲ）の変動性を利用することによっても決定されうる。変動性は、ゲノム中に存在するｒＤＮＡの複数の複製と組み合わせて、異なる株でのＰＣＲ増幅後に、さまざまなアンプリコンの増幅を生じる。今日までに、ＰＣＲリボタイピングは、４００超の異なるＰＣＲリボタイプを特定することが可能である。およそ３００〜５００ｂｐの範囲にあり、かつ、７つのハウスキーピング遺伝子（ＭＬＳＴ ７ＨＧ）を表すＤＮＡ断片が配列される、多遺伝子座配列タイピング方法も用いられうる。この方法は、クローン複合体の同定を可能にする；少なくとも５つの系統が、この方法によって特定されている。本明細書に記載される組成物は、これらの技法のいずれか１つ以上、又は当業者に利用可能でありうるその他の方法によって特定された、いずれか１つ以上の株及び／又は毒素遺伝子変異型に対し、治療的又は防御的にワクチン接種するために用いられうる。

クロストリジウムトキソイドの調製方法、これらの方法によって調製されたクロストリジウムトキソイド、及びこれらのトキソイドを含む組成物もまた提供される。本明細書における特定の対象は、Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及び／又はＢ及び／又はそれらの誘導体（例えば遺伝的に無毒化された変型、切断型など）である。本開示の目的では、トキシンＡ及び／又はトキシンＢは、当技術分野における標準的な技法を使用してトキシンＡ及び／又はトキシンＢと特定されうる任意のＣ．ディフィシルトキシンを含みうる。例となる技法としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ドットブロット又はインビボアッセイなどの免疫アッセイが挙げられうる。このような特定を行うのに有用な試薬としては、例えば、抗トキシンＡウサギポリクローナル抗血清（例えば、Ａｂｃａｍ（登録商標）製品番号ａｂ３５０２１又は「Ａｂｃａｍ」製品番号ａｂ９３３１８）、又は抗トキシンＡマウスモノクローナル抗体（例えば、「Ａｂｃａｍ」製品番号ａｂ１９９５３（ｍＡｂ ＰＣＧ４）又はａｂ８２２８５（ｍＡｂ Ｂ６１８Ｍ）のいずれか）、抗トキシンＢウサギポリクローナル抗血清（例えば、「Ａｂｃａｍ」製品番号ａｂ８３０６６）、又は抗トキシンＢマウスモノクローナル抗体（例えば、「Ａｂｃａｍ」製品番号ａｂ７７５８３（ｍＡｂ Ｂ４２８Ｍ）、ａｂ１３０８５５（ｍＡｂ Ｂ４２３Ｍ）、又はａｂ１３０８５８（ｍＡｂ Ｂ４２４Ｍ）のいずれか）が挙げられうる（すべて、「Ａｂｃａｍ」社（米国マサチューセッツ州ケンブリッジ所在）から市販される）。以下の工程の１つ以上によって、高温（例えば、３７℃）で安定であり、かつ、少量のホルムアルデヒドを含む、Ｃ．ディフィシル・トキソイド組成物を生成する方法が本明細書に提供される：１）トキシンＡ及びトキシンＢを含むＣ．ディフィシル培養物を提供する工程；２）培養物からトキシンＡ及びトキシンＢを精製して、各トキソイドの分離組成物を提供する工程；３）トキソイドＡについては約０．１５％〜約０．５％のいずれか（例えば、約０．２％（例えば、約０．２１％）のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）など、約０．２％〜０．８％のいずれか、及び／又は、トキソイドＢについては約０．４％（例えば、約０．４２％））で、適温（例えば、約１７〜３２℃のいずれか（例えば、約２５℃））で、適当な時間量で（例えば、約２〜約２１日間）、インキュベーションすることによって（例えば、それぞれのトキシンが対応するトキソイドへと不活化されるように）、精製されたトキシンＡ及び精製されたトキシンＢを不活化して、それぞれ、トキソイドＡ及びトキソイドＢ組成物を生成する工程；及び、４）トキソイドを合わせて、「残存量」のホルムアルデヒド（例えば、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．０１％、０．０１６％、０．０２％又は０．０２５％（ｗ／ｖ）のいずれか（好ましくは約０．００４％又は０．００８％のいずれか）など、約０．０００１％〜０．０２５％のいずれか）のみを含む、トキソイド免疫学的組成物及び／又はワクチンを生成する工程。組成物に含まれるホルムアルデヒドの量は、典型的には、組成物のパーセンテージ（質量／体積（「ｗ／ｖ」））を単位として記載されるが、タンパク質濃度などのある特定の因子に基づいて化学量論を調整することが重要でありうる。例えば、本明細書で予定されているホルムアルデヒドの適切な濃度は、ポリペプチドを互いに実質的に架橋させることなく（例えば、分子間架橋を生成せずに）、個々のトキシンＡ及び／又はトキシンＢポリペプチド内に分子間架橋をもたらす濃度である。実施例に示されるように、０．５ｍｇ／ｍｌのトキシンＡを含む組成物は、０．２１％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドのみを必要としうる。しかしながら、より高濃度のトキシンＡを含む組成物は、かなりの量の分子間架橋を生成することもなしに、必要とされる分子内架橋を生成するために（例えば、トキソイド化）、より高濃度又はより低濃度のホルムアルデヒドを必要としうる。同じ原理がトキシンＢのトキソイド化についても適用されうる。特定の組成物について適切な条件は、本明細書に記載される又は当技術分野で利用可能でありうる技法を使用して、当業者によって決定されうる。例えば、特定の量のホルムアルデヒドが組成物中の特定のトキシンのトキソイド化に有効かどうかは、実施例のセクションに記載される細胞毒性アッセイ、アニオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アミン含量分析、抗原性及び免疫原性アッセイのうちのいずれか１つ以上を使用して決定されうる。

本明細書ではホルムアルデヒドが用いられているが、当業者によって決定されうる他の同様の薬剤がそれらの代わりに使用されうることも理解されるべきである。例えば、幾つかの実施形態では、ホルムアルデヒドに代えてグルタルアルデヒドが用いられうる。このような代用を行うには、異なる濃度が必要とされうるが、このような代用にとって適切な条件は、本明細書に記載される技法（例えば、実施例のセクションに記載される細胞毒性アッセイ、アニオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、アミン含量分析、抗原性及び免疫原性アッセイのうちのいずれか１つ以上）を用いて決定することができる。

ある特定の実施形態では、トキシンＡは、適当な時間量（例えば、１０分間など、約１〜６０分間のいずれか）、適量のホルムアルデヒド（例えば、約０．２％ホルムアルデヒド）と混合されて、トキソイドＡを生成し、次に、適温（例えば、約２５℃）で、適当な時間量（例えば、約６〜１２日間のいずれか（例えば約６日間）など、約２〜２１日間）、インキュベートされうる。幾つかの好ましい実施形態では、本明細書の実施例に示されるように、トキシンＡを、約０．２１％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドを含む調合物中、約２５℃で約６〜約１２日間、インキュベートすることによって、トキシンＡはトキソイドＡに変換されうる。ある特定の実施形態では、トキシンＢは、適当な時間量（例えば、１０分間など、約１〜６０分間のいずれか）の間、適量のホルムアルデヒド（例えば、約０．４２％）と混合され、次に、適温（例えば、約２５℃）で適当な時間量（例えば、約１３〜２１日間のいずれか（例えば、約２１日間）など、約２〜３０日間）、インキュベートされて、トキソイドＢを生成しうる。幾つかの好ましい実施形態では、本明細書の実施例に示されるように、トキシンＢを約０．４２％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドを含む調合物中、約２５℃で約１３〜約２０日間、インキュベートすることによって、トキシンＢはトキソイドＢに変換されうる。ホルムアルデヒドは、３７％のホルムアルデヒド原液からトキシンＡ又はトキシンＢを含む溶液中へと、所望の量まで導入されてよく（例えば、無菌的に）、続いて、ある期間（例えば、５〜１０分間）インキュベーションされ、適切な温度及び時間（例えば、２〜８℃で複数日間）、保管されてもよい。ある特定の実施形態では、精製されたトキシンＡ及び精製されたトキシンＢは、合わされ、次に、適当な時間量（例えば、１０分間など、約１〜６０分間のいずれか）、適量のホルムアルデヒド（例えば、約０．４２％）と混合され、次に、適温（例えば、約２５℃）で適当な時間量（例えば、約１３〜２１日間のいずれか（例えば、約２１日間）など、約２〜３０日間）、インキュベートされて、トキソイドＡ及びＢを生成しうる。トキソイドは、適切なバッファ（例えば、約２０〜１５０ｍＭのいずれかのリン酸（例えば、１００ｍＭ）、ｐＨ７．０）中に含まれうる。トキソイドＡ及びトキソイドＢ組成物は、次に、適切なバッファ中で合わされて（例えば、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ７．５、５％〜８％スクロース（例えば、８％）などの適切なバッファ中への透析濾過によって）、トキソイドＡ／Ｂの免疫学的組成物及び／又はワクチンを生成しうる（例えば、本明細書中では集合的に「組成物」と称される場合がある）。このような組成物はまた、標準的な技法を使用して、凍結乾燥形態で調製されてもよい。よって、幾つかの実施形態では、トキソイド免疫学的組成物は、例えば、その形態から再構成された組成物（例えば製剤）より高濃度でホルムアルデヒドを含みうる、凍結乾燥された形態であってもよい。例えば、凍結乾燥された組成物は、約０．０１６％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）を含みうるが、宿主に投与するために再構成された後は、組成物（例えば、製剤）は、０．０１６％未満のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）（例えば、約０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．０１（ｗ／ｖ）のいずれか）を含みうる。幾つかの実施形態では、次に、トキソイドＡ／Ｂ免疫学的組成物及び／又はワクチン（例えば、「製剤」）は、約０．０００１％〜０．０２５％のいずれかのホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）（例えば、約０．００１％、０．００２％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．０１％、０．０１６％、０．０２％又は０．０２５％（ｗ／ｖ）のいずれか）を含みうる（例えば、「残存ホルムアルデヒド」）。製剤中に残存ホルムアルデヒドを包含することにより、組成物が、より高い温度（例として４℃超、例えば、室温又は３７℃など）で、ある期間（例えば、約６週間）、維持された場合に、残存ホルムアルデヒドが、トキソイドＡ及び／又はトキソイドＢのトキシンＡ又はトキシンＢへのそれぞれの復帰を低減及び／又は防止しうるという点で、とりわけ有益であることが見出された。幾つかの事例では、トキシンの不活化時間を低下させるために、ホルムアルデヒドの量を増加させてよいことに留意されたい。最終的な組成物（例えば、免疫学的組成物、ワクチン）は、残存量のホルムアルデヒドしか含まない。実施例に示されるように、これらのプロセスは、驚くべきことに、好ましい生化学的及び機能的特性を有する免疫学的トキソイドＡ／Ｂ含有組成物をもたらす。

ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法におけるいずれの時点でも、それに含まれるホルムアルデヒドの官能性に干渉しうる特定のバッファ成分の量を調整することは、有益であろう。例えば、トリスは、ホルムアルデヒド媒介修飾についてタンパク質と事実上競合可能なアミン基を有しており、それによって、反応混合物中のホルムアルデヒドの有効濃度を低下させる。したがって、トキシン及び／又はトキソイドが生成される組成物中のトリスの量を低レベルに維持することは有益であろう。例えば、トキシン調製物中の残存トリス値は、より適切なレベル（例えば、約１〜約５μｇ／ｍｌ未満（例えば、１μｇ／ｍｌ（例えば、検出限界未満）又は５μｇ／ｍｌ））まで低下させることができる。実施例に示されるように、トキシン調製物中の残存トリス値は、驚くべきことに、精製されたトキシンＡ及び／又は精製されたトキシンＢを、２５ｍＭのトリス（例えば、ＭｇＣｌ_２を除去するため）中に透析濾過し、次に、例えば、タンジェンシャルフロー濾過を使用（例えば、フラットストックＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ＰＥＳ５０Ｋを使用）してリン酸バッファ（例えば、１００ｍＭのＰＯ_４、ｐＨ７）中に透析濾過することによって、より適切なレベル（例えば、１μｇ／ｍｌ未満）に低下させることができる（例えば、中空繊維又は他の種類の膜とは対照的に）。結果として得られた、より低濃度のトリスは、幾つかの実施形態では、トキソイド化プロセスの実施に必要とされるホルムアルデヒドの量をより効果的に調整可能にしうる。他の実施形態は、例えば、アミン基を含まないバッファ（例えば、ＭＥＭ、酢酸塩、クエン酸塩）及び／又はｐＨ調整された水溶液（例えば、酸又は塩基が添加されてもよい、生理食塩水又は水）を使用することを包含しうる。

よって、幾つかの好ましい実施形態では、トリスに代えて、リン酸バッファなどの別のバッファを用いてもよい。例えば、実施例に記載されるように、清澄化されたＣ．ディフィシル培養濾液は、トリスバッファ（例えば、５０ｍＭのトリス／ＮａＣｌ／０．２ｍＭのＥＤＴＡ／１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５）中に処理（例えば、タンジェンシャルフロー濾過などによって濃縮かつ透析濾過）されうる。結果として得られる溶液は、次に、濾過されてよく（例えば、メンブレンフィルタを使用）、硫酸アンモニウム濃度は、ほぼ適量（例えば、約０．４Ｍ）に調整され、次いで、さらなる濾過が行われうる（例えば、メンブレンフィルタを使用）。Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及びトキシンＢを含むこの水溶液は、次に、疎水性相互作用クロマトグラフィに供されて、トキシンが、トリスバッファで洗浄可能なサイズ排除（例えば、セファロース）カラムに結合されうる。Ｃ．ディフィシルトキシンは、次に、ＤＴＴ及びＩＰＡを含むトリスバッファによって溶出し、プールされ、ＷＦＩを使用して約９ｍＳ以下の伝導度に調整されうる。これらのＣ．ディフィシルトキシン（プールされた溶出液中）は、次に、トリスバッファでの平衡化を包含する、アニオン交換クロマトグラフィなどの別の方法によってさらに精製されうる。次に、トキシンＡは低塩トリスバッファによって溶出し、トキシンＢは高塩トリスバッファによって溶出しうる。精製されたトキシンＡ又は精製されたトキシンＢを含む溶液は、各々、次に、濃縮され、１００ｍＭのＰＯ_４、ｐＨ７などのリン酸バッファ中に透析濾過されうる（ここで、残存トリス値は、好ましくは約１〜約５μｇ／ｍｌ未満である）。より低濃度のリン酸塩（例えば、２０ｍＭ）は適当でない場合があり、多量体化の増加を引き起こしうることが分かった（可能な場合には最小限に抑えるべきである）。よって、好ましい適切なリン酸バッファは、例えば、約２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００ｍＭのいずれかなど、約２０ｍＭ超から最高で約２００ｍＭのリン酸濃度を含みうる。本明細書の実施例に示されるように、次に、トキシンＡは、該トキシンＡを、ｐＨ７の１００ｍＭ ＰＯ_４中、約０．２１％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドを含む調合物と、約２５℃で約６日間、混合することによって、トキソイドＡに変換されうる。また、幾つかの好ましい実施形態では、本明細書の実施例に示されるように、トキシンＢは、該トキシンＢを、ｐＨ７の１００ｍＭ ＰＯ_４中、約０．４１％（ｗ／ｖ）のホルムアルデヒドを含む調合物と、約２５℃で約１３日間、混合することによって、トキソイドＢに変換されうる。当業者に理解されるように、他の適切なバッファもまた、予定されている。

当業者は、トキソイドＡ及び／又はトキソイドＢ組成物を分析して組成物の特性が許容可能かどうかを決定することにより、特定の条件（例えば、バッファ（又はその成分）、時間、温度）がトキソイドＡ及び／又はトキソイドＢ組成物の調製及び／又は維持に適しているかどうかを決定することができる。例えば、組成物は、細胞毒性アッセイ（例えば、ＩＭＲ−９０細胞株（例えば、実施例を参照）又はベロ細胞を使用）、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィ（ＡＥＸ−ＨＰＬＣ）、サイズ排除高速液体クロマトグラフィ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、２８０ｎｍにおける吸光度を使用して測定される濃度、復帰分析（例えば、実施例を参照）、及び／又はインビボ力価アッセイ（例えば、実施例に記載されるハムスター力価アッセイ）を使用して試験されうる。好ましい条件下で調製された組成物は、典型的には、次のうちの１つ以上を示しうる：細胞毒性アッセイでモニタリングされた細胞には、ほとんどあるいは全く細胞毒性がない；ＡＥＸ−ＨＰＬＣ及び／又はＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムは、トキソイドの多量体化がほとんどあるいは全くないことを示す（又は、別の条件に対し、ある条件下では、少なくともより少なくなり、これは好ましいことである）；１により近いＥＬＩＳＡ／Ａ２８０値（例えば、典型的には１に程遠いＥＬＩＳＡ／Ａ２８０値を示す、好ましくない条件下で調製された組成物と比較して）；試験期間中に、トキソイドからトキシンへの復帰がほとんどあるいは全くない；及び／又は、インビボアッセイ中の免疫原性（例えば、ハムスター力価アッセイにおける４．８以上のＬｏｇ１０力価）。当業者によって決定されうる他の方法もまた、これらの決定に用いられうる。

本明細書に記載される方法は、事実上Ｃ．ディフィシルのあらゆる株から誘導されるトキシンに適用可能である。Ｃ．ディフィシルの好ましい株は、トキシンＡ及び／又はＢを産生する株であり、例えば、毒素遺伝子変異型０（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ⁻；例えば、なかでもとりわけ、ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５（ＰＣＲリボタイプ０８７）、６３０；ＰＣＲリボタイプ００１、００２、０１２、０１４／０２０）、ＩＩＩ（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋；例えば、０２７／ＮＡＰ／Ｂ１、ＮＡＰ１／０２７／ＢＩ１７、ＩＰＰ４０３８（ＰＣＲリボタイプ０２７）、ＣＤＣ１３６９５＃７（ＰＣＲリボタイプ０２７）、ＳＰ０４１（ＰＣＲリボタイプ０２７））、ＩＶ（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋；例えば、ＮＫ９１（ＰＣＲリボタイプ０２３））、Ｖ（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋；例えば、ＢＡＡ−１８７５（ＰＣＲリボタイプ０７８／１２６））及び／又はＶＩＩＩ（Ａ⁻Ｂ^＋ＣＤＴ⁻；例えば、ＡＴＣＣ４３５９８（ＰＣＲリボタイプ０１７））の株が挙げられるが、それらに限定されない。幾つかの実施形態では、本方法は、毒素遺伝子変異型０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩＩＩのすべてに対し、免疫付与（例えば、治療的に又は防御的に）をもたらす。幾つかの実施形態では、本方法は、ＣＤＴ^＋及びＣＤＴ⁻株／毒素遺伝子変異型の両方に対し、免疫付与をもたらす。本方法はまた、組み換えトキシンから調製されたトキソイドが、ＣＤＴサブユニットがワクチンに含まれない限り、ＣＤＴ^＋のＣ．ディフィシル株に対して免疫をもたらさない場合があることが当技術分野で認識されていることを除き、組み換え方法を使用して産生されたＣ．ディフィシルトキシンにも適用することができる（例えば、国際公開第２０１３／１１２８６７号参照）。トキシン（例えば、トキシンＡ及び／又はトキシンＢ）は、当技術分野で知られた方法を使用して、Ｃ．ディフィシルの培養濾液から精製されうる（例えば、米国特許第６，６６９，５２０号明細書）。Ｃ．ディフィシルの培養濾液からトキシンを精製する例となる方法は、本明細書の実施例に記載されている。好ましくは、トキシンは、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上のいずれかの純度を有する。トキシンは、一緒に不活化されても、別々に不活化されてもよい。例えば、精製されたトキシンは、所望されるトキシンＡ：トキシンＢの比（例えば、３：１、３：２、５：１、１：５）で混合され、次に不活化されてよく、あるいは、個別に不活化されてもよい。好ましくは、トキシンは、個別に不活化されて、トキソイドを生成する。用語「トキソイド」は、本明細書では、化学処理によって部分的に又は完全に不活化されたトキシンを説明するために用いられる。トキシンは、例えば、インビトロでの細胞毒性アッセイ又はインビボアッセイで測定して、未処理のトキシンよりも少ない毒性（例えば、１００％、９９％、９５％、９０％、８０％、７５％、６０％、５５％、５０％、２５％又は１０％、若しくはそれ以下の毒性）を有する場合に、不活化されているとされる。本明細書に開示されるように、トキシンは、ホルムアルデヒド処理を使用して不活化される。他の可能な化学的手段としては、例えば、グルタルアルデヒド、過酸化物、β−プロピオラクトン又は酸素処理が挙げられる。

不活化は、トキソイドがトキシンへと復帰するのを防止する、ある量のホルムアルデヒドで、トキシンをインキュベートすることにより、行われうる。復帰は、精製されたトキシンＡ又はトキシンＢを含むバッファ中に適量のホルムアルデヒドを含むことによって防止されうる。バッファ中のホルムアルデヒドの量は、ホルムアルデヒドを適切な濃度に維持して復帰を防止するように調整されうる。この目的のため、残存濃度のホルムアルデヒドがバッファ（及び／又は医薬組成物）中に含まれうる。ホルムアルデヒドの残存濃度は、復帰を防止する濃度、及び／又は、本明細書に記載される組成物が投与される対象に対して危険性の低い副作用を示す濃度である。例えば、残存ホルムアルデヒド濃度は、それらの範囲の中でもとりわけ、約０．０００１％〜０．０２５％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）のいずれか（例えば、約０．００４％、０．００８％、０．０１６％、又は約０．０１％のいずれか）、約０．００１％〜約０．０２０％（ｗ／ｖ）、約０．００４％〜約０．０２０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．０１６％±０．０４％）、又は約０．００４％〜０．０１０％（ｗ／ｖ）（例えば、約０．００８％）の範囲でありうる。復帰の防止は、典型的には、３７℃での保管後に、本明細書に記載されるインビトロアッセイによって、検出可能な細胞毒性が観察されない場合に見られる（例えば、実施例の細胞毒性アッセイを参照）。復帰の「実質的な」防止は、典型的には、３７℃での保管後に、実施例に記載されるインビトロアッセイによって、トキソイドの１０％以下がトキシンに復帰することを意味する。適切なインビトロ細胞毒性アッセイは、例えばベロ細胞を使用する、細胞ベースの蛍光アッセイでありうる。別の適切なインビトロ細胞毒性アッセイは、ＩＭＲ９０細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）寄託番号ＣＣＬ−１８６）を使用して実施されうる。試験物質（例えば、トキソイド）の毒性は、５０％の細胞がその正常な線状形態と比較して丸くなる最小濃度（例えば、ＭＣ−５０）として決定されうる。本明細書の実施例に記載されるように、本明細書に記載される方法で製造されたトキソイドと０．００８％以下のホルムアルデヒドとを含むワクチン組成物は、３７℃での保管後に、インビトロアッセイで、検出可能な細胞毒性を示さなかった。物理化学的分析（例えば、アニオン交換クロマトグラフィ）を使用して復帰を確認することもできるが、インビトロ細胞毒性アッセイの方が有益であろう。トキソイドの力価を、抗トキシンＡ又は抗トキシンＢのｌｏｇ１０ＩｇＧ力価の平均を測定する、ハムスターインビボ力価アッセイによって測定することもできる。

幾つかの実施形態では、３７％のホルムアルデヒド溶液から適量のホルムアルデヒドをトキシンに加えてもよい。トキシンは、ホルムアルデヒドの添加前には、好ましくは、適切なバッファ溶液（例えば、１００ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ、ｐＨ７．０）中にある。その中のトキシン濃度は、例えば、約０．１〜約５ｍｇ／ｍＬ（例えば、０．５ｍｇ／ｍＬ）でありうる。不活化プロセスを開始するために、トキシンは、最初に、適切な時間（例えば、１０分間）、適切な濃度のホルムアルデヒド（例えば、約０．１％〜約０．６％）と混合されうる。例えば、精製されたトキシンＡ（ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム中、０．５ｍｇ／ｍｌの精製トキシンＡ）は、約０．２％ホルムアルデヒド中で約１０分間、混合されうる。また、精製されたトキシンＢ（例えば、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウム中、０．５ｍｇ／ｍｌの精製トキシンＢ）は、約０．４％ホルムアルデヒド中で約１０分間、混合されうる。このような混合物は、次に、濾過（例えば、０．２μｍのメンブレンフィルタを使用）されて、２８０ｎｍにおける吸光度によってタンパク質濃度に影響を与えうる小さいタンパク質凝集物が除去されうる（例えば、意図されたトキソイドＡ：トキソイドＢ比の医薬組成物の正確な調合を可能にする）。不活化は、次に、混合物を約１〜約２１日間（例えば、約２日間、約６日間、又は約１３日間）、インキュベートすることによって継続されうる。例えば、トキシンＡ混合物は、適温（例えば、約２５℃）で１３日間以下（例えば、約２日間又は約６日間）の期間、インキュベートされうる。また、トキシンＢ混合物は、適温（例えば、約２５℃）で２１日間以下の期間（例えば、約２日間、約６日間、又は約１３日間）、インキュベートされうる。このようにして、トキソイドＡ及びトキソイドＢの調製物がもたらされうる。このような調製物は、典型的には、少なくとも約９０％、９５％、９９％又は１００％のいずれかのトキソイド（例えば、不活化されたトキシン）を含む。

これらのトキソイド調製物は、バッファと直接混合されうるが、好ましくは、調製物は、濃縮され、適切なバッファ溶液中に透析濾過される。好ましくは、濃度及び透析濾過は、ホルムアルデヒドの除去及びバッファ中への交換を確実にしつつ、タンパク質の剪断を最小限に抑えるために、タンジェンシャルフロー濾過を使用して行われる。バッファは、好ましくは、トキソイドの安定性を増大する、及び／又は、トキソイドの凝集を遅延若しくは低減する、少なくとも１種類以上の薬学的に許容される賦形剤を含む。使用に適した賦形剤としては、例えば、糖（例えば、スクロース、トレハロース）又は糖アルコール（例えば、ソルビトール）、及び塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウム）、若しくはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限られない。加えて、適切な賦形剤は、例えば、米国特許出願公開第２０１１／０４５０２５号（米国特許出願第１２／６６７，８６４号）明細書に記載されるもののいずれかでありうる。不活化後、不活化されたトキシン（すなわち、トキソイド）の溶液は、濃縮、及び／又は限外濾過、及び／又は、透析濾過されてよく、かつ、トキソイドが細胞毒性形態へ（例えば、トキシンへ）と復帰するのを防止又は実質的に防止する、適切なバッファ中で保管されうる（例えば、限定はしないが、約５〜約１００ｍＭ（例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は１００ｍＭのいずれかのクエン酸、リン酸、グリシン、炭酸、重炭酸などのバッファ）、ｐＨ８．０以下（例えば、６．５〜７．７、例として、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９又は８．０など）、（例えば、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ７．５）など）。例示的なバッファは、適量のホルムアルデヒド（例えば、０．０１６％（ｗ／ｖ））を含む、例えば、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ７．５、５％〜８％スクロースでありうる。当業者に理解されるように、他のバッファなども好適でありうる。

トキソイドは、医薬組成物（例えば、免疫原性及び／又はワクチン組成物）として使用するために配合されうる。例えば、Ｃ．ディフィシル・トキソイドを含む組成物は、薬学的に許容される希釈剤（例えば生理食塩水）中、トキソイドの懸濁液によって、又はトキソイドと薬学的に許容される担体との会合によって、投与用に調製されうる。このような医薬製剤は、当技術分野で知られた１つ以上の賦形剤（例えば、希釈剤、増粘剤、バッファ、保存料、アジュバント、洗浄剤及び／又は免疫賦活剤）を含みうる。適切な賦形剤は、トキソイドと、並びにアジュバント（アジュバント化された組成物中の）と相容性であり、それらの例は当業者に知られており、入手可能である。組成物は、液体形態であっても、又は凍結乾燥（標準的な方法通りに）されていても、あるいは泡沫乾燥（例えば、米国特許出願公開第２００９／１１０６９９号明細書に記載されるように）されていてもよい。例示的な凍結乾燥されたワクチン組成物は、例えば、トキソイドＡ及びＢ、２０ｍＭクエン酸、８％スクロース、０．０１６％ホルムアルデヒド、ｐＨ７．５を含みうる。

投与用ワクチンを調製するために、乾燥組成物は、例えば、注射用水、若しくは、適切な希釈剤又はバッファ溶液などの水溶液で再構成されうる。ある特定の実施例では、希釈剤は本明細書に記載されるホルムアルデヒドを含む。希釈剤は、ホルムアルデヒドとともに、又はホルムアルデヒドなしに、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）を含みうる。例示的な希釈剤は、ＮａＣｌ及び水酸化アルミニウムの水溶液でありうる。このような希釈剤を使用して、乾燥組成物を再構成してもよい。医薬組成物は、約１０〜１５０μｇ／ｍＬ（例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０又は１５０μｇ／ｍＬのいずれか）の用量のトキソイドを含みうる。典型的には、注入用量の体積は、約０．５ｍＬ又は１．０ｍＬである。投与量は、対象に誘発される免疫反応を調節するために増減させることができる。トキソイドは、アジュバントの存在下又は不存在下において、当業者によって決定される量で投与されうる。使用されるアジュバントには、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム及びヒドロキシリン酸アルミニウムなどのアルミニウム化合物が含まれる。例えば、実施例に記載される動物実険において、組成物は、５μｇのトキソイドＡ及びトキソイドＢ（二価のトキソイド）並びに２０μｇ又は１６０μｇのアジュバント（免疫用量あたり、ヒト投与量の１／２０に対応する）を含む。当業者に理解されるように、トキソイド及びアジュバントの他の組合せもまた、適切でありうる。

免疫学的組成物及び／又はワクチン組成物は、症候性のＣ．ディフィシル感染症を有する、又はそれを発症する危険性がある対象に対し、当業者によって適切に決定された量及び投与計画で、経皮（percutaneous）（例えば、筋肉内、静脈内、腹腔内又は皮下）、経皮（transdermal）、粘膜経路で、投与されうる。ワクチンは、１回、２回、３回、４回又はそれ以上の回数で、投与されうる。複数回用量が投与される場合、投与は、互いに、例えば、１週間、１ヵ月又は数ヵ月、間隔が空けられうる。よって、本開示はまた、医薬組成物を宿主に投与することによって、トキシン、トキソイド、及び／又は、それらを含む感染性微生物に対し、免疫反応を誘発する方法も提供する。これは、本明細書に記載される医薬組成物（例えば、免疫原性組成物及び／又はワクチン）を対象に投与して、対象の免疫系にトキソイドを曝露させることによって達成されうる。よって、免疫原性組成物及び／又はワクチンは、症候性のＣ．ディフィシル感染症の予防及び／又は治療に用いられうる。

組成物をキット（例えば、ワクチンキット）に含めてもよい。例えば、キットは、本明細書に記載される組成物を乾燥形態で含む第１の容器、及び、組成物を再構成するための水溶液を含む第２の容器を含みうる。キットは、必要に応じて、再構成された液体形態の組成物を投与するためのデバイス（例えば、皮下注射器、マイクロニードル・アレイ）、及び／又は使用説明書を含みうる。本明細書に記載される組成物は良好な安定性を有し、中程度の温度（例えば、約２〜８℃）及びより高い温度（例えば、約１５℃、２５℃、３７℃又はそれ以上）での保管期間後に非細胞毒性のまま維持されうることが分かったことから、このようなキットが可能である。ある特定の例では、以下にさらに記載されるように、組成物は、３７℃での保管後に非細胞毒性のままであった（例えば、復帰の形跡を示さない）。

よって、本開示は、例えば、約０．１５％〜０．５％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）とともに、約１７〜３２℃で約２〜約２１日間インキュベーションすることによって、精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ及び／又は精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢを不活化することによる、Ｃ．ディフィシル・トキソイドを生成する方法を提供する。幾つかの実施形態では、トキシンＡは、約０．２％のホルムアルデヒドとともに約２５℃で約２日間インキュベートされて、トキソイドＡを生成することができ、及び／又は、トキシンＢは、約０．４％のホルムアルデヒドとともに、約２５℃で約１３日間インキュベートされてトキソイドＢを生成する。このような方法によって調製されたトキソイドＡ及び／又はトキソイドＢを含む組成物もまた提供される。精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＡ及び精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＢを、ある残存量（例えば、約０．００４％、０．００８％、又は０．０１６％（ｗ／ｖ））のホルムアルデヒドを含む組成物と組み合わせることによる、精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＡ及び精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＢを含む免疫原性組成物を調製する方法も提供される。幾つかの実施形態では、本方法は、３７℃において最長で約６週間安定な、Ｃ．ディフィシル・トキソイドＡ及び／又は精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＢの組成物をもたらしうる。よって、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される方法はまた、約０．１５％〜０．５％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）とともに約１７〜３２℃で約２〜約２１日間インキュベーションすることによって、精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ又は精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢを不活化する工程；及び、Ｃ．ディフィシル・トキソイドＡ及び精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＢを、ある残存量のホルムアルデヒドを含む組成物と合わせる工程も含みうる。このような方法によって調製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＡ及びＢ組成物は、３７℃において最長で約６週間安定でありうる。このような組成物中のホルムアルデヒドの残存量は、約０．００４％、０．００８％、又は０．０１６％（ｗ／ｖ）のいずれかでありうる。組成物はまた、約２０ｍＭクエン酸、ｐＨ７．５、４％〜８％スクロース、及び０．０１６％ホルムアルデヒドも含みうる。幾つかの実施形態では、組成物は凍結乾燥されうる。これらの方法はまた、トキシンＡ及びトキシンＢを含むＣ．ディフィシル培養物を提供する工程、及び培養物からトキシンＡ及びトキシンＢを精製する工程も含みうる。これらの方法に従って生成されたＣ．ディフィシル・トキソイドＡ又はＢもまた提供される。幾つかの実施形態では、このような組成物は、ワクチン（例えば、症候性のＣ．ディフィシル感染症に対する防御、予防、及び／又は治療反応をもたらす）である。組成物（例えば、ワクチン組成物）は、トキソイドＡ及びトキソイドＢを、３：１又は３：２など、５：１〜１：５のＡ：Ｂ比で含みうる。幾つかの実施形態では、組成物は、凍結乾燥、フリーズドライ、噴霧乾燥、又は泡沫乾燥されてよく、あるいは液体形態であってもよい。このような組成物は、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤、例えばクエン酸、リン酸、グリシン、炭酸、又は重炭酸バッファなどのバッファ、若しくはｐＨ調整された水溶液、及び／又は１つ以上の糖（例えば、スクロース、トレハロース）及び／又は糖アルコール（ソルビトール）を含みうる。他の実施形態は当業者にとって明白であろう。

幾つかの実施形態では、本開示は、Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現するＣ．ディフィシル株及びＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株に対して宿主を免疫する方法を提供し、該方法は、ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）とともに約１７〜３２℃で約２〜約２１日間インキュベーションすることによって不活化された、精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ及び精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢを含む免疫原性組成物を宿主に投与することを含み、ここで、トキシンＡは０．１５％〜０．５％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化され、トキシンＢは０．１５％〜０．８％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化される。株は、毒素遺伝子変異型及びリボタイプのものでありうる。株は、毒素遺伝子変異型０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及び／又はＶＩＩＩのものであってよく、好ましくは毒素遺伝子変異型０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及びＶＩＩＩのすべてでありうる。好ましい実施形態では、精製されたトキシンＡ及び精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢは、Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５など、Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現しないＣ．ディフィシル株に由来する。

本開示はまた、ＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株（例えば、Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）に由来する、不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及び不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＢを含む組成物を宿主に投与することによって、Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対する特異性を有する抗体を宿主において誘導する方法も提供する。幾つかの実施形態では、組成物の投与後に産生される抗体は、毒素中和アッセイ（例えば、実施例を参照）によって決定して、抗体を中和しうる。幾つかの実施形態では、抗体は、このようなアッセイを使用して決定して、少なくとも５．４の相対効果（ＲＥ）を示しうる。幾つかの実施形態では、本方法は、０、Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸＩＩからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有するＣ．ディフィシル株によって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和する抗体の産生を誘発しうる。幾つかの実施形態では、毒素遺伝子変異型０株は、００１、００２、０１２、０１４、０２０、０１４／０２０、０１４／０２０／０７７、１０６、０１８、及び０５３からなる群より選択されるＰＣＲ−リボタイプを有しうる；毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株は、ＰＣＲ−リボタイプ０２７又は０７５を有しうる；毒素遺伝子変異型ＩＶ株は、ＰＣＲ−リボタイプ０２３を有しうる；毒素遺伝子変異型Ｖ株は、０７８、０７９、１２２、１２６、及び０７８／１２６からなる群より選択されるＰＣＲ−リボタイプを有しうる；毒素遺伝子変異型ＶＩ株は、ＰＣＲ−リボタイプ１２７又は６６−２を有しうる；毒素遺伝子変異型ＶＩＩ株はＰＣＲ−リボタイプ６６−２を有する；毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ株は、ＰＣＲ−リボタイプ０１７を有しうる；毒素遺伝子変異型ＩＸ株はＰＣＲ−リボタイプ０１９を有する；毒素遺伝子変異型ＸＩＩ株は、ＰＣＲ−リボタイプ０５６を有しうる；及び／又は、Ｃ．ディフィシル株は、ＰＣＲ−リボタイプ０４６又は３６９を有しうる。幾つかの実施形態では、抗体は、０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩＩＩからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有するＣ．ディフィシル株、例えば、これらの毒素遺伝子変異型の各々の株などによって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和しうる（すなわち、Ｃ．ディフィシル株の毒素遺伝子変異型０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩＩＩによって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和する抗体）。幾つかのこのような実施形態では、毒素遺伝子変異型０株はＰＣＲ−リボタイプ０１２を有してよく、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株はＰＣＲ−リボタイプ０２７を有してよく、毒素遺伝子変異型ＩＶ株はＰＣＲ−リボタイプ０２３を有してよく、毒素遺伝子変異型Ｖ株はＰＣＲ−リボタイプ０７８を有してよく、毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ株はＰＣＲ−リボタイプ０１７を有しうる。幾つかの実施形態では、抗体は、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、ＩＶ及びＶのＣ．ディフィシル株によって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和しうる。幾つかのこのような実施形態では、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株はＰＣＲ−リボタイプ０２７を有してよく、毒素遺伝子変異型ＩＶ株はＰＣＲ−リボタイプ０２３を有してよく、及び／又は、毒素遺伝子変異型Ｖ株はＰＣＲ−リボタイプ０７８を有しうる。当業者が理解するように、他の実施形態もまた本開示において予定されている。

本開示はまた、ＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株（例えば、Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）に由来する、不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及び不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＢを含む組成物を宿主に投与することによる、Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対し、宿主に免疫及び／又はワクチン接種する方法も提供する。幾つかのこのような実施形態では、宿主は、０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及び／又はＶＩＩＩからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対して、それぞれ、免疫及び／又はワクチン接種されうる。幾つかのこのような実施形態では、宿主は、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有する１種類以上のＣ．ディフィシル株、例えばこのような毒素遺伝子変異型の各々の株などに対して、免疫及び／又はワクチン接種されうる（すなわち、宿主は、それぞれ、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、ＩＶ及びＶを有するＣ．ディフィシル株に対して、免疫及び／又はワクチン接種される）。幾つかの実施形態では、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株はＰＣＲ−リボタイプ０２７を有してよく、毒素遺伝子変異型ＩＶ株はＰＣＲ−リボタイプ０２３を有してよく、毒素遺伝子変異型Ｖ株はＰＣＲ−リボタイプ０７８を有しうる。幾つかの実施形態では、このような方法から生じる、Ｃ．ディフィシルによって引き起こされる疾患及び死亡に対する有意な防御が、宿主にもたらされうる。幾つかの実施形態では、防御（例えば、免疫付与及び／又はワクチン接種）は、ゴールデンシリアンハムスターモデルを使用して決定されうる。幾つかの実施形態では、組成物を、少なくとも３回、宿主に投与することができ、その間隔は、７日間、１０日間、又は１４日間（２週間）のいずれかなどの十分な期間とすることができ、投与間隔は同一であっても異なっていてもよい。投与は、いずれかの投与経路で行うことができるが、幾つかの実施形態では、組成物は、筋肉内経路によって投与されうる。幾つかの実施形態では、Ｃ．ディフィシルのＣＤＴ^＋株を用いたチャレンジ後のハムスターの群についての生存率は、約５８％〜約１００％である。幾つかの実施形態では、防御は、統計学的に有意でありうる。幾つかの実施形態では、統計学的有意性は、ログ・ランク検定を用いたカプラン・マイヤーの方法、及び／又は、フィッシャーの正確両側確率検定によって決定されうる（例えば、ハムスターの群についてなど：カプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ＝０．０００１及びフィッシャーの正確両側確率検定でｐ＝０．０００４；カプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ＜０．００１及びフィッシャーの正確両側確率検定でｐ値＝０．００５；カプラン・マイヤーログ・ランク検定及びフィッシャーの正確両側確率検定の両方でｐ値≦０．０００１；及び／又は、カプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ＝０．００４６及びフィッシャーの正確両側確率検定でｐ値＝０．００２０）。当業者に理解されるように、他の実施形態もまた本開示において予定されている。

よって、幾つかの実施形態では、ＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株に由来する、不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及び不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＢを含む組成物は、ＣＤＴ又はそれらのサブユニットを含まない。幾つかの実施形態では、Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及びトキシンＢは、Ｃ．ディフィシル毒素遺伝子変異型０に由来しうる。幾つかの実施形態では、精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ及び精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢは、Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５に由来しうる。幾つかの実施形態では、トキシンＡ及びトキシンＢは、ホルムアルデヒドとともに約１５〜３２℃で約２〜約２１日間インキュベーションすることによって、不活化することができ、ここで、トキシンＡは、０．１５％〜０．５％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化され、トキシンＢは、０．１５％〜０．８％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化されうる。幾つかの実施形態では、組成物は、約０．００１％〜０．０２０％のホルムアルデヒド（例えば、約０．００４％、約０．００８％、又は約０．０１６％のホルムアルデヒド）を含みうる。幾つかの実施形態では、トキソイドＡ及びトキソイドＢは、５：１〜１：５のＡ：Ｂ比（例えば、約３：１又は３：２）で組成物中に存在しうる。幾つかの実施形態では、組成物は、フリーズドライ、噴霧乾燥、又は泡沫乾燥されうる。幾つかの実施形態では、組成物は液体形態でありうる。幾つかの実施形態では、組成物は、１種類以上の薬学的に許容される賦形剤を含みうる。幾つかの実施形態では、組成物は、クエン酸、リン酸、グリシン、炭酸、又は重炭酸のバッファ、あるいは、ｐＨ調整された水溶液及び／又は１つ以上の糖及び／又は糖アルコールを含みうる。幾つかの実施形態では、組成物は、スクロース及び／又はクエン酸を含みうる。幾つかの実施形態では、組成物は、アルミニウム（例えば、リン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウム）を含むものなど、アジュバントをさらに含みうる。幾つかの実施形態では、組成物は、約２０μｇ〜約１６０μｇの水酸化アルミニウムを含みうる。当業者に理解されるように、他の実施形態もまた本開示において予定されている。

「精製された」トキシンとは、典型的には、トキシンが、当技術分野で知られた方法を使用して、例えば培養濾液から、単離され、かつ、少なくともある程度、精製されていることを意味する。トキシンを精製する例となる方法は、例えば本明細書に記載される。幾つかの実施形態では、精製されたトキシンは、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上のいずれかの純度を有しうる。同様に、「精製された」トキソイドは、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％又はそれ以上のいずれかの純度を有するトキソイドでありうる。

「約」、「およそ」、及び同様の用語は、数値のリスト又は範囲に先行する場合、リスト又は範囲内の各個別の値があたかもその用語の直後にあったかのように、独立して、リスト又は範囲内の各個別の値を指す。用語は、その値が、正確にその値である、その値に近い、またはその値と類似していることを指すことを意味する。例えば、用語「約」又は「およそ」は、指示値の±１０％の値を含みうる（例えば、「約３０℃」は、３０℃を含むがそれに限られない、２７℃〜３３℃のいずれかの値を意味しうる）。

用語「対象」及び「宿主」は、本明細書では互換的に用いられうる。

用語「インキュベート」、「混合」、及び「保管」（若しくはそれらの同義語及び／又は派生語）は、互換的に用いられうる。例えば、トキシンは、ホルムアルデヒドを含む溶液とともにインキュベートされうる。このようなインキュベーションは、必要に応じて、例えば、組成物、が運動によって（例えば、ミキシングバーなどを使用して）積極的に混合されていること、あるいは、本質的に定常状態で維持されていることを意味しうる。

随意的な又は必要に応じてとは、その後に記載される事象又は状況が生じても生じなくてもよいこと、及び、その説明が、その事象又は状況が生じる場合と生じない場合とを含むことを意味する。例えば、組成物が必要に応じてある組合せを含みうるという表現は、組成物が異なる分子の組合せを含んでも含まなくてもよいことを意味し、したがって、その説明は、組合せ及び組合せの欠如の両方（すなわち、組合せの個別の成員）を含む。

範囲は、本明細書では、約１つの特定の値から、及び／又は、約別の特定の値までとして表される。このような範囲が表される場合、別の態様は、その１つの特定の値から、及び／又は、他の特定の値までを含む。同様に、値が先行詞約又はおよそを使用して近似値で表される場合、その特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び他の端点とは独立してのいずれにおいても重要であることもさらに理解されよう。範囲（例えば、９０〜１００％）は、その範囲自体、並びに、あたかも各値が個別に列挙されているかのように、該範囲内の各個別の値を含むことが意図されている。

用語予防する（prevent、preventing）、及び予防（prevention）という用語が、所与の疾患のための所与の処置（例えば、症候性感染症の予防）に関して本明細書中で用いられる場合、臨床的に観察可能なレベルの疾患を全く発症させないか、あるいは、彼／彼女が、処置がない場合に有するであろうよりもゆっくりと及び／又は低い度合いで発症することを意味することが意図される。これらの用語は、対象がそうした状態の態様を全く経験しない状況だけに限られない。例えば、処置は、そうでない場合に予想される疾患の症状よりも少ない及び／又は軽い症状を対象が経験する結果をもたらす場合に、症候性感染症を予防したとされる。処置は、感染症の軽度の顕性症状のみを示す対象をもたらすことによって、症候性感染症を「予防」できるのであり、感染微生物による細胞への浸透がなかったに違いないということを含意するものではない。

同様に、所与の処置とともに症候性感染症の危険性に関連して本明細書で用いられる、低減する（reduce、reducing）、及び低減（reduction）（例えば、症候性のＣ．ディフィシル感染症の危険性の低減）とは、典型的には、対象が、処置（例えば、開示されるトキソイドを用いる投与又はワクチン接種）をされない場合に感染症を発症する対照又は基礎レベルと比較して、よりゆっくりと又は低い度合いで感染症を発症することを指す。症候性感染症の危険性の低減によって、感染症の軽度の顕性症状又は感染症の遅延症状しか示さない対象をもたらしうるが、これは、感染微生物による細胞への浸透がなかったに違いないということを含意するものではない。

本開示内で引用される参考文献はすべて、その全体が参照することにより本明細書に取り込まれる。ある特定の実施形態が以下の実施例にさらに記載される。これらの実施形態は、単なる例として提供されるのであって、多少なりとも特許請求の範囲を限定することは意図されていない。

以下の実施例は、単に説明の目的で提供されるのであって、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。形態の変更及び等価物の置換は、状況が示唆しうる、又は適切な方法を与えうる場合には、企図されている。本明細書において特定の用語が用いられてきたが、このような用語は説明的な意味において企図されるものであって、限定の目的ではない。本開示及びこれらの実施例において使用されるが明示的に説明されていない、分子遺伝学、タンパク質生化学、及び免疫学の方法は、科学文献に詳細に報告されており、当業者の能力の範囲に十分に入る。

実施例１
Ｃ．ディフィシル・ワーキングシード（株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）を使用して、大豆ペプトン、酵母抽出物、リン酸バッファ及び重炭酸ナトリウムを含む、ｐＨ６．３５〜７．４５の事前調整された培地（ＳＹＳ培地）に植菌し、４ｍＬのワーキングセルバンク（ＷＣＢ）バイアルから１６０Ｌの培養へとスケールアップした。所望の密度及び１０〜１２時間のインキュベーション期間に達した後、１６０Ｌの培養物全体を、清澄化及び０．２μｍ濾過の目的で処理した。もう１つの生産発酵槽から培養物を採取し、膜濾過（例えば、メンブレンフィルタを使用）に供して、Ｃ．ディフィシル細胞及び細胞破片不純物を除去した。結果として得られた清澄化された培養濾液を濃縮し、タンジェンシャルフロー濾過によって、ｐＨ７．５の５０ｍＭトリス／ＮａＣｌ／０．２ｍＭ ＥＤＴＡ／１ｍＭ ＤＴＴ中に透析濾過した。結果として得られた溶液を、メンブレンフィルタを使用して濾過し、硫酸アンモニウムの濃度を上昇させ（例えば約０．４Ｍまで）、次に、さらなる濾過を行った（例えば、メンブレンフィルタを使用）。この水溶液は、Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及びトキシンＢを含んでいた。該水溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィに供した。Ｃ．ディフィシルトキシンをセファロースカラムに結合させた。該カラムをトリスバッファで洗浄し、Ｃ．ディフィシルトキシンの２つの画分を、ＤＴＴ及びＩＰＡを含むトリスバッファを用いて溶出させた。ＨＩＣから溶出させた２つのトキシン画分をプールし、ＷＦＩを使用して伝導度を９ｍＳ以下に調整した。Ｃ．ディフィシルトキシン（プールされた溶出液中）を、アニオン交換クロマトグラフィによってさらに精製した。溶出した水溶液をアニオン交換カラムに通し、トキシンをカラムに結合させた。該カラムをトリスバッファで平衡化し、トキシンＡを低塩トリスバッファで溶出し、トキシンＢを高塩トリスバッファで溶出した。精製されたトキシンＡ及び精製されたトキシンＢを各々濃縮し、ｐＨ７の１００ｍＭ ＰＯ_４中に透析濾過した。タンパク質濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬであり、各トキシンの純度は９０％以上であった。

３７％のホルムアルデヒド溶液をトキシンＡ透析濾過液及びトキシンＢ透析濾過液の各々に無菌的に加え、０．４２％の最終濃度を得た。溶液を混合し、その後２〜８℃で１８〜２２日間、保管した。不活化後、トキシン透析濾過液を調製用バッファ（２０ｍＭクエン酸／５％スクロース、ｐＨ７．５）中に透析した。３７％のホルムアルデヒド溶液を加えることによって、必要に応じてホルムアルデヒド濃度を調整した。トキソイドＡ及びＢを３：２の重量比（Ａ：Ｂ）で合わせ、凍結乾燥した。凍結乾燥された生成物は、トキソイドＡ（０．２４ｍｇ／ｍＬ）、トキソイドＢ（０．１６ｍｇ／ｍＬ）、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、５％（ｗ／ｖ）スクロース、及び指示濃度のホルムアルデヒドを含んでいた。

３７℃で６週間にわたり、復帰の可能性を観察するために、復帰分析を行った。トキソイドＡ及びトキソイドＢを含む組成物に、異なる量の残存ホルムアルデヒド（０％、０．００８％、及び０．０１６％（ｗ／ｖ））を調合し、３７℃又は４℃のいずれかで保管し、毎週１回、６週間の細胞毒性アッセイによって試験した。これらの試験データを表１に記載する。４℃では、製剤は、残存ホルムアルデヒドを添加しない場合であっても、復帰分析に合格する。しかしながら、３７℃では、復帰試験に合格するには０．０１６％の残存ホルムアルデヒドを必要とする。

実施例２
３７℃で安定なトキソイドをもたらすであろうトキソイド化方法を特定するために、本明細書に記載される実験を行った。Ｃ．ディフィシル・ワーキングシード（株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５）を使用して、無菌の使い捨てバッグ内の事前調整された培地（大豆ペプトン、酵母抽出物、リン酸バッファ及びＤ−ソルビトール含有、ｐＨ７．１〜７．３）に植菌し、目標とするＯＤが達成されるまで、培養物を３５〜３９℃でインキュベートした。３０Ｌのシード１培養物を使用して、２５０Ｌの無菌の使い捨ての培養バッグ中の培地に植菌し、目標とするＯＤが達成されるまで、培養物を３５〜３９℃でインキュベートした。シード２培養物を使用して、１０００Ｌの無菌の使い捨ての培養バッグに植菌し、目標とするＯＤが達成されるまで、培養物を３５〜３９℃でインキュベートした。もう１つの生産発酵槽から培養物を採取し、深層濾過（例えば、Ｐａｌｌ Ｄｅｐｔｈ ７００ｐ／８０ｐ／０．２μｍ ０．０２ｍ^２／Ｌを使用）に供し、Ｃ．ディフィシル細胞及び細胞破片不純物を除去し、同時に冷却して（例えば、約３７℃〜１９℃）、プロテアーゼ活性を制限した。結果として得られた清澄化された培養濾液を濃縮し、フラットストックＭｉｌｌｉｐｏｒｅを使用するタンジェンシャルフロー濾過によって、約４℃の温度で（プロテアーゼ活性を低下させるため）、ＤＴＴを加えずに、ｐＨ７．５〜８．０の２５ｍＭトリス／５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．２ｍＭ ＥＤＴＡ中に、透析濾過した。結果として得られた溶液を、メンブレンフィルタを使用して濾過し、硫酸アンモニウム濃度を上昇させ（例えば約０．９Ｍまで）、その後さらなる濾過を行った（例えば、メンブレンフィルタを使用）。この水溶液は、Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及びトキシンＢを含んでいた。該水溶液を疎水性相互作用クロマトグラフィに供した。Ｃ．ディフィシルトキシンをブチルセファロース樹脂（例えば、ＧＥブチルＳ ＦＦ セファロースなど）に結合させた。カラムを、ｐＨ８．０の０．９ｍＭ硫酸アンモニウム、２５ｍＭトリスで洗浄し、Ｃ．ディフィシルトキシンをｐＨ８．０の２５ｍＭのトリスで溶出し、ＷＦＩを使用して、伝導度を７ｍＳ以下に調整した。Ｃ．ディフィシルトキシン（溶出液中）を、アニオン交換クロマトグラフィによってさらに精製した。溶出した水溶液をアニオン交換カラム（例えば、Ｔｏｓｏｈ Ｑ ６５０ Ｍ）に通し、トキシンをカラムに結合させた。該カラムをｐＨ７．５の２５ｍＭのトリスで平衡化し、トキシンＡをｐＨ８．０の２５ｍＭのトリス中、２７ｍＭのＭｇＣｌ_２で溶出し、トキシンＢをｐＨ８．０の２５ｍＭのトリス中、１３５ｍＭのＭｇＣｌ_２で溶出した。精製されたトキシンＡ及び精製されたトキシンＢを各々濃縮し、最初に、２５ｍＭのトリス中に透析濾過し（例えば、ＭｇＣｌ_２の除去のため）、その後、ｐＨ７の１００ｍＭ ＰＯ_４中に透析濾過した。トキシンＡの平均収量は、発酵１Ｌあたり純粋なトキシン約０．０２１ｇであり（ＵＶ２８０）、ＳＤＳ Ｐａｇｅで評価した純度は平均で約９７．２％であった。トキシンＢの平均収量は、発酵１Ｌあたり純粋なトキシン約０．０１１ｇであり（ＵＶ２８０）、ＳＤＳ Ｐａｇｅで評価した純度は平均で約９３．９％であった。このプロセスから生成されるトキシンは、９０％以上の純度を示し、また、以前のプロセス工程で残されたマトリクス残渣（例えば、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス））の低下も示している。実質的に実施例１に記載されるプロセスに起因する、トキシンマトリクス中の残存トリス値は、およそ１００〜８００μｇ／ｍｌ変動したのに対し、この実施例に記載される精製プロセスに由来するトキシンマトリクス中の残存トリス値は１μｇ／ｍｌ未満（すなわち、検出限界未満）である。ホルムアルデヒドとのトキソイド化反応に関しては、トリスは、ホルムアルデヒド媒介修飾についてタンパク質と効果的に競合可能なアミン基を有し、それによって、反応混合物中の有効ホルムアルデヒド濃度を低下させる。したがって、データは、このプロセスで生成されるトキソイドについてのトキソイド化速度論が、実施例１に記載されるプロセスによって調製されたトキソイドについての速度論と比較して速いことを示唆している。

トキソイド化プロセスにおいて、温度及びホルムアルデヒド濃度に関して実験を行い、トキソイド化インキュベーション期間の関数として解析した。本目的は、先のプロセス（実施例１に記載される）を使用して生成したトキソイドと比べて、同レベルの免疫原性を維持しつつ、より良好な安全性プロファイル及びより良好な復帰特性をもたらす、確固たるトキソイド化プロセスを開発することであった。最小量の残存ホルムアルデヒドしか有さずに、３７℃で復帰分析に合格する製剤を生産するであろうトキソイド化条件が所望された。これらの実験では、トキシン濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに固定し、反応はすべて、ｐＨ７．０の１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファ中で行った。トキソイド化反応の各々について評価した温度は、４℃、１５℃及び２５℃であった。ホルムアルデヒド濃度は、トキソイドＡの反応については０．２１％（「０．２％」）〜０．４２％（「０．４％」）の間で変動し、トキソイドＢの反応については０．４２％（「０．４％」）〜０．８４％（「０．８％」）の間で変動した。各反応条件について、トキシン濃度を０．５ｍｇ／ｍｌに調整し、１００ｍｌスケールで行った。次に、個別の反応の各々について目標濃度に達するように、３７パーセント（３７％）のホルムアルデヒドを加えた。反応を５〜１０分間、穏やかに攪拌し、目標温度でインキュベータ内に置いた（インキュベーション１時間以内に目標温度に達した）。個別の反応の各々を毎日、最長２１日間にわたり、モニタした。試料を抜き取り、細胞毒性分析、ＡＥＸ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＴＮＢＳアッセイによって分析した。トキソイド化条件に応じたある特定の時間間隔で、試料を抜き取り、調合し、動物実険、復帰分析及びＥＬＩＳＡ試験を行った。

速度論的細胞毒性分析
トキソイド化反応に続き、細胞毒性分析を行い、したがって、試料を反応混合物から毎日直接抜き取り、同日分析に供した。トキソイド化プロセスに続いて、ＩＭＲ９０細胞において細胞毒性分析を行い、トキソイド化の速度論は単相性であり、トキシンＡは細胞毒性の中和に平均５±１日かかり、トキシンＢは１３±２日近くかかった（反応全体では３倍の安全マージンを満たしていない）。１つのバッチを使用して得られたデータを図１に示す。ｙ軸は、物質の毒性の反映であり、毒性物質の存在下で、５０％の細胞が正常な線状形態の代わりに丸くなる、最小濃度を表す、ＭＣ５０値を含む。２つのトキシンのＭＣ５０値は１０００倍異なっていた；Ｂは、低いｐｇ／ｍｌ範囲のＭＣ５０値を有し、より細胞毒性であった。これらの実験において２００μｇ／ｍｌの最高濃度で試験した場合に細胞毒性がなかったことから、トキソイドについての絶対ＭＣ５０値は不明あった。不活化プロセスの全期間は１８〜２１日間であった。

トキシンＡ及びトキシンＢのトキソイド化反応についての細胞毒性分析データを表２に示す。表２は、ホルムアルデヒドとトキシンとの別々の反応の各々について、細胞毒性の損失を示すのに必要とされる時間量（日数による）を示している。トキシンＡ及びトキシンＢについてのトキソイド化反応のデータから、幾つかの一般的な傾向が明らかになっている。ホルムアルデヒド濃度が上昇するにつれて、トキシンの不活化に必要な時間は減少する。加えて、反応の温度が上昇するにつれて、トキシンの不活化に必要な時間はやはり減少する。データは、温度又はホルムアルデヒド濃度のいずれかの上昇に伴い、トキソイド化の速度が加速されることを示唆している。多くの可能性のある条件が速度論的細胞毒性分析から特定されており、データは、細胞毒性の初期喪失の３倍を外挿することによって、３倍の安全マージンが達成されうることを示唆している。例えば、トキシンＡは、０．２％ホルムアルデヒドを用いて２５℃で２日間で無毒化され、したがって、適切な安全マージンを適用すると、反応は、最小限で６日間、継続されることになろう。さまざまなトキソイド化反応条件が期待に沿うものである。

ＤｏＥ反応の速度論的ＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析
ＡＥＸ−ＨＰＬＣ（拡張勾配方法）を、異なるトキソイド化パラメータをさらに評価するためのツールとして使用することができる。ＡＥＸプロファイルは、適切なトキソイド化条件の絞り込みに有益な手段でありうる。トキソイドＡ及びトキソイドＢのいずれについても、ＡＥＸクロマトグラムにおいて、いずれもトキシンより長い保持時間を有する、２つの部分母集団が観察される。ピーク母集団は、反応が進行するにつれてシフトし、トキシンに対するさらなる修飾が示唆される。潜在的に、これは、タンパク質の電荷特性を正電荷がより少なくなるように変化させ、それによってカラム樹脂（第四級アンモニウム樹脂）との結合親和力を高める、トキシン上のアミン基と反応するホルムアルデヒドを反映している。温度及びホルムアルデヒド濃度は、より多くのホルムアルデヒドタンパク質修飾を示す、時間の関数としてのピーク母集団プロファイルに影響を及ぼし、「シフト」させうる；トキシンＡ及びトキシンＢのいずれのトキソイド化反応についても、温度及びホルムアルデヒド濃度の上昇とともに、第２のピーク母集団へのより急速なシフトが観察される。評価の見地から、より多くのタンパク質修飾を確実にするために、第２のピーク位置に単分散プロファイルを有することがより望ましいであろう。トキソイドＡについては、０．２１％ホルムアルデヒド、２５℃、＞６日間、又は０．４２％ホルムアルデヒド、１５℃、＞６日間の条件で、所望の単分散型の第２のピークプロファイルを得た。トキソイドＢについては、０．４％又は０．８％ホルムアルデヒド、１５℃、＞１０日間；又は、０．４％ホルムアルデヒド、２５℃、＞５日間の条件で、所望の単分散型の第２のピークプロファイルを結果的に生じた。ホルムアルデヒドの最高濃度及び最高温度での反応が、時間の関数として、より多くのトキソイド母集団の生成を開始し、より広範なタンパク質修飾が示唆される（特に、０．４％ホルムアルデヒド、２５℃におけるＡのトキソイド化の場合）ことに留意することが重要である。

速度論的ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
ＳＥＣプロファイルは、適切なトキソイド化条件の絞り込みに有益な手段でありうる。クロマトグラムは、ホルムアルデヒド誘導性の分子間架橋の結果として起こりうる多量体化の程度に対する洞察を与えることができる。トキソイドにおける多量体化の量を最小限に抑え、かつ、実施例１で生成された生成物を用いた場合と同様のプロファイルを達成することが所望される。個々の反応をＳＥＣ−ＭＡＬＳで毎日モニタリングし、多量体化の発現について定性的に分析した。トキソイドＢの反応について分析した条件はすべて、多量体化を示さなかった。トキソイドＡについては、主に、ホルムアルデヒドの最高濃度を用いた条件で、過剰の多量体化が観察された。よって、ＳＥＣ−ＭＡＬＳデータでは、温度、時間又はホルムアルデヒド濃度に関して、トキソイドＢ条件は識別されない。しかしながら、データは、温度及びホルムアルデヒド濃度がともに高くなると、トキソイドＡの多量体化を生じうることを示唆している。

速度論的アミン含量（ＴＮＢＳ）分析
ホルマリン介在性のトキソイド化により、反応を通じてタンパク質における遊離アミン含量（例えば、リシンのε−アミノ基）が結果的に低下し、ホルムアルデヒドをベースとした部分が形成される。以前の物質に対し、トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）アッセイを使用して修飾の度合いをモニタリングする試みがなされ、反応終了時における修飾の度合いは、トキソイドＡ及びＢについて、それぞれ、およそ３５％及び６５％であることが分かった（残りの遊離アミン含量から逆算）。この実験では、ＴＮＢＳアッセイを使用して、遊離アミン含量についてもモニタリングした。条件は、温度及び時間が増加するにつれて、％遊離アミン含量は、漸近線により急速に近づくことを示している。よって、アミン修飾の度合いは、最大でトキシンＡについてはおよそ４０％、トキシンＢについては７５％（残りの遊離アミン含量から逆算）と推定されうる。アミン含量は、細胞毒性の損失とほとんど相関関係がないが、ホルムアルデヒドとトキシンとの反応の度合いの追跡に使用することができる。例えば、アミン修飾は、２５℃において、Ａに関しては６日間及びＢに関してはおよそ１０日間で完了するように見える。反応がより低温で行われる場合、同程度のアミン修飾の達成に要する時間は増加する。よって、データから、温度が高くなると、より短期間でより完全な反応を生じるであろうことが示唆される。

抗原性の解析
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）は、異なるトキソイド化パラメータをさらに評価するためのツールとしても用いられうる。生成物のＥＬＩＳＡプロファイルを使用して、適切なトキソイド化条件を絞り込むことができる。生成されたトキソイドを、以前の物質から生成された抗体に対してＥＬＩＳＡによって測定し、トキソイド化時間の関数として解析した。ここでは、ＥＬＩＳＡを使用してトキシン量を検出し、２８０ｎｍにおける吸光度を使用して測定された濃度と比較した。抗原がトキソイド化反応において進行するにつれて、ＥＬＩＳＡ値は低下する場合があり、実施例１のトキソイドで観察された反応からの変化が示唆される（多量体化を示唆する可能性）。アッセイにおいて変動性が示されたが、データは、より高温及びより高いホルムアルデヒド濃度によって、より低いＥＬＩＳＡ応答がもたらされることを示唆している。例えば、２５℃での０．４％ホルムアルデヒドの使用により、２５℃での０．２％ホルムアルデヒドよりも速い、ＥＬＩＳＡ値の低下が生じる。同じように、０．４％ホルムアルデヒド、２５℃の条件では、４℃での０．４％ホルムアルデヒドにおけるものよりも速い、ＥＬＩＳＡ値の低下が生じる。評価ツールとして、ＥＬＩＳＡ応答を７０％超に保つことが所望され、多くの条件が特定された。

免疫原性の分析
ハムスター力価アッセイによる免疫原性の測定を用いて、トキソイド化条件を評価することができる。現行仕様書は、トキソイドＡ及びトキソイドＢについて４．８以上の平均Ｌｏｇ１０ＩｇＧ力価応答を設定している。これらの実験から生成されたトキソイドを、これらを仕様書に従って評価し、以前の条件から誘導されたトキソイドから有意に低下した応答を有しなかったことから、さらに精査した。加えて、全ての可能性がある広がり（時間、温度及びホルムアルデヒド濃度に関して）について評価できるわけではないため、本明細書に記載される速度論的細胞毒性分析（３×安全マージン）並びに生理化学的特性に基づいて、トキソイドを選択した。トキソイドを、ハムスター力価アッセイ用に二価の物質（非凍結乾燥）として調合し、ＩｇＧ応答について血清を分析した。すべてのトキソイド化条件が、力価の仕様（４．８Ｌｏｇ１０の平均ＩｇＧ力価応答）に合格しただけでなく、以前（実施例１）の物質に対する力価応答と統計学的に同等の力価応答も有していた（有意差は示されなかった）。加えて、すべての血清について試験し（インビトロチャレンジアッセイを使用）、中和抗体活性を有していることが分かった。重要な品質特性として、データは、これらのトキソイド化条件がいずれも許容されうることを示唆している。

製剤（「ＤＰ」）の復帰分析
評価段階にあるトキソイド化条件を使用して調製したトキソイドＡ及びＢを使用して、製剤（トキソイドＡ及びＢを含む組成物）を調合した。調合物は、０％、０．００４％のいずれか、及び、幾つかの事例では０．００８％（ｗ／ｖ）の残存ホルムアルデヒドを含んでいた。トキソイドＡ又はＢ組成物からすべて（又は実質的にすべて）のホルムアルデヒドを除去し、次に、清澄化された組成物に指示量のホルムアルデヒドを混合することによって、調合物を調製した。製剤を３７℃で行われる復帰分析に供した。製剤復帰分析のデータを表３に示す。試験において細胞毒性が陰性だった製剤は（−）と記されている。

多くの製剤調合物が復帰分析に合格した（すなわち、３７℃での保管後に検出可能な細胞毒性を有しなかった）。２つの製剤（０．００４％又は０．００８％ホルムアルデヒド（「残存ホルムアルデヒド」）を含む）は、３７℃での保管後に、検出可能な細胞毒性を有しなかった：（ｉ）０．２％ホルムアルデヒド、１５℃で１３日間のインキュベーションによって不活化されたトキソイドＡと、０．８％ホルムアルデヒド、１５℃で１３日間のインキュベーションによって不活化されたトキソイドＢとを含む製剤（表３、試験１３及び１４のパラメータ）；及び、（ｉｉ）０．２％ホルムアルデヒド、２５℃で６日間のインキュベーションによって不活化されたトキソイドＡと、０．４％ホルムアルデヒド、２５℃で１３日間不活化されたトキソイドＢとを含む製剤（表３、試験２２及び２３のパラメータ）。例えば、０．４％ホルムアルデヒド、４℃で１３日間のインキュベーションによって不活化されたトキソイドＡ及び０．８％、４℃で２１日間不活化されたトキソイドＢを含む製剤と、０．４％ホルムアルデヒド、４℃で１３日間不活化されたトキソイドＡ及び０．８％ホルムアルデヒド、４℃で２１日間不活化されたトキソイドＢを含む製剤とを含む、０．００８％ホルムアルデヒドを含む幾つかの他の製剤もまた、３７℃で保管後に、検出可能な細胞毒性を有していなかった。この分析から特定された最適なトキソイド化条件は次の通りであった：トキシンＡのトキソイド化：１００ｍＭ ＮａＰＯ_４中、０．５ｍｇ／ｍｌのトキシンＡ、０．２１％ホルムアルデヒド、２５℃、ｐＨ７で６日間；及び、トキシンＢのトキソイド化：１００ｍＭ ＮａＰＯ_４中、０．５ｍｇ／ｍｌのトキシンＢ、０．４２％ホルムアルデヒド、２５℃、ｐＨ７で１３日間（表３、試験２２のパラメータ）。これらの条件はまた、他の生理化学的アッセイで測定した場合にも、望ましいプロファイルを有していた。ＡＥＸは各トキソイドについて均質なピーク母集団を示し、ＳＥＣ ＭＡＬＳは最小限の多量体化を示し、ＴＮＢＳは、各反応が所与の時点で最大のアミン修飾を達成することを示した。加えて、ＥＬＩＳＡ（Ａ２８０）応答が維持された。

表１及び３は、パラメータ２２が、トキシンＡ及びＢからトキソイドを調製するために最適であることを示している。これらの条件は以下の通りである：
トキソイドＡの調製：１００ｍＭのＮａＰＯ_４中、０．５ｍｇ／ｍｌのトキシンＡ、０．２１％ホルムアルデヒド、２５℃、ｐＨ７で６日間；及び、
トキソイドＢの調製：１００ｍＭのＮａＰＯ_４中、０．５ｍｇ／ｍｌのトキシンＢ、０．４２％ホルムアルデヒド、２５℃、ｐＨ７で１３日間。

これらの手順には、６日間（トキソイドＡ）又は１３日間（トキソイドＢ）のインキュベーションの前に、１０分間の混合工程と、それに続く０．２μｍの濾過工程が含まれていた。３７℃での復帰試験の前に、トキソイドＡ及びトキソイドＢを、２０ｍＭクエン酸、ｐＨ７．５、０．００４％ホルムアルデヒド中に透析濾過した。この手順を図２に示す。０．００８％ホルムアルデヒドが、典型的には、３７℃において良好な安定性ももたらすことも示されている。

このデータは、インキュベーション時間が長くなると、結果的に、トキソイドＡのＥＬＩＳＡ値がより低くなったことを示す、驚くべき免疫学的データ（ハムスターにおけるＩｇＧ応答）によってさらに確認され、ホルムアルデヒド誘導性のトキシン修飾が増加したことが示唆される（６日目におけるＥＬＩＳＡ／Ａ２８０＝０．９４；１２日目＝０．６４）。対照的に、インキュベーション時間が長くなると、トキソイドＢのＥＬＩＳＡ値がより高くなった（１３日目におけるＥＬＩＳＡ／Ａ２８０＝０．５３；２０日目＝０．７３）。望ましいＥＬＩＳＡ／Ａ２８０値は、１．０により近い値である。当業者は、トキシンＡのトキソイド化のための１２日のインキュベーション期間は適切でありうること、及び、２０日のインキュベーションは、トキシンＢのトキソイド化にとって適切でありうることを理解すべきである。しかしながら、このデータを考慮しても、１３日のインキュベーション期間が、上述のようにトキシンＢのトキソイド化にとって最適であると判断された。

スケール分析
特定された最適なトキソイド化条件を使用して、より大きいスケール（発売スケール（２００Ｌ発酵）の１／１０）でトキソイドを生成した；すなわち、トキシンＡ及びトキシンＢを、以下の条件を使用して不活化した：Ａのトキソイド化：１００ｍＭのＮａＰＯ_４中、０．５ｍｇ／ｍＬのトキシンＡ、０．２１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒド、２５℃、ｐＨ７で６日間；及び、Ｂのトキソイド化：１００ｍＭのＮａＰＯ_４中、０．５ｍｇ／ｍＬのトキシンＢ、０．４２％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒド、２５℃、ｐＨ７で１３日間。反応の間のさまざまな時期に採取したトキソイド試料を使用して、トキソイド化反応の速度論を評価した。小スケールで生産されたトキソイドと比較して、トキソイドは、同一の速度論的細胞毒性プロファイルを有しており、反応の２日目に細胞毒性の損失が確認された。加えて、トキソイドは、小スケールで生産されたトキソイドと同様のＡＥＸプロファイル及び同様のアミン修飾（ＴＮＢＳアッセイにより測定）を有していた。１／１０スケールのトキソイド化反応によって生成されたトキソイドの免疫原性ついても、ハムスター力価アッセイによって評価した。小スケールで生産されたトキソイドと同様に、トキソイドは、４．８Ｌｏｇ以上の平均ＩｇＧ力価応答を与え、実施例１に記載されるプロセスに従って調製されたトキソイドのものと統計学的に同等の力価応答をもたらした。１／１０スケールのトキソイドから誘導された製剤について復帰分析を行い、小スケールで同一のトキソイド化条件から誘導された製剤と比較した。１／１０スケールでトキソイドから誘導された製剤は、小スケールで誘導されたものと同じ復帰特性を有しており、０．００４％ホルムアルデヒドにおいてさえも復帰分析に合格した。より大きいスケール（例えば、１０００Ｌ及び２０００Ｌの発酵培養物を使用）で生産されたトキソイドでも、同様の結果が得られた。これらの実験データは、トキソイド化方法がスケール変更可能であることを示している。大スケールで生産されたトキソイドは、小スケールで生産されたものと同一の速度論的細胞毒性プロファイル、ハムスター力価及び復帰特性を有する。再現性に関しては、トキシンＡ及びトキシンＢについてのトキソイド化プロセスが７回以上再現され、解析は、類似したロット間特性を示した。

免疫付与実験
精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＡ及びＣ．ディフィシル・トキソイドＢを、実質的に上述の方法（例えば、表３のパラメータ２２）に従って調製し、ワクチン組成物として調合した。トキソイドＡ及びＢを３：２の質量比で合わせ、スクロース（４．０％〜６．０％ ｗ／ｖ）及びホルムアルデヒド（０．０１２％〜０．０２０％ ｗ／ｖ）を含むクエン酸バッファを用いて調合し、凍結乾燥した。ハムスターチャレンジモデルでの評価用のワクチンとして使用する前に、各組成物を、下記の希釈剤を用いて再構成し、水酸化アルミニウムでアジュバント化した。シリアゴールデンハムスターは、Ｃ．ディフィシルワクチン開発のためのストリンジェントなモデルを提供する。単一腹腔内（ＩＰ）用量のクリンダマイシン抗生物質で前処置した後、及び、毒素原性Ｃ．ディフィシル生物の胃内（ＩＧ）接種を受けた後に、ハムスターは、劇症下痢及び出血性虫垂炎を急速に発症し、２〜４日以内に死亡する（例えば、ワクチン接種なしで）。希釈剤（０．５７％塩化ナトリウム及び８００μｇ／ｍＬ水酸化アルミニウムを含む）を用いて、ワクチンを再構成した。再構成されたワクチンの段階希釈物を調製した。ヒト投与量（ＨＤ）のワクチンは、１００μｇ／用量のトキソイド及び４００μｇ／用量の水酸化アルミニウムを含んでいるため、最初の希釈物を調製し、１／２０ＨＤは、５μｇ／用量のトキソイド、０．００８％ホルムアルデヒド、及び２０μｇ／用量のアルミニウムを含んでいた。ハムスター（９匹のハムスター／群）に、異なる用量のＣ．ディフィシルワクチン（ヒト投与量（１００μｇ／用量）（ＨＤ）の４種類の希釈物）を用いて、３回の筋肉内免疫付与（０日目、１４日目、及び２８日目）により、ワクチン接種した、あるいは、プラセボ（ＡｌＯＯＨ）を注射した。４１日目に、ＩＰ経路によって１０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシン−２−リン酸という化学形態の抗生物質を用いて、ハムスターを前処置した。４２日目に、抗生物質を用いた前処置の２８時間後、致死量のＣ．ディフィシルＡＴＣＣ４３２５５株に由来した胞子調製物を、ＩＧ経路によってハムスターにチャレンジした。Ｃ．ディフィシル感染症に関連する症状の出現の速度論及び死亡率を測定することによって、防御効果を評価した。結果（図３に記載）は、ワクチンが、用量依存的な態様でＣ．ディフィシル毒素産生細菌を用いた致死的チャレンジに対して、ハムスターを防御することを実証したとともに、ＨＤ／２０の用量（２０μｇのＡｌＯＯＨの存在下、５μｇのトキソイドＡ＋Ｂ）を用いたワクチン接種によって１００％の防御が誘導された。免疫された動物は、死亡及び疾患（体重減少及び下痢）に対して防御された。この実験結果は、幾つかのインビボ実験を代表するものである。したがって、本明細書に記載される方法によって調製されたトキソイドは、Ｃ．ディフィシル疾患に対する防御免疫を提供する。

実施例３
インビトロにおける免疫実験
ワクチン調合物中に含まれるトキソイドを毒素遺伝子変異型０から精製した。抗トキシン抗体が他の一般的な変異株由来のトキシン活性を中和できることを実証するため、ワクチン接種されたハムスター由来の血清を使用して、インビトロ交差中和実験を行った。

Ａ．材料及び方法
Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンは、Ｃ．ディフィシル参考株ＶＰＩ１０４６３（ＡＴＣＣ４３２５５）由来のトキソイドＡ及びＢのホルマリンで不活化された、高度に精製された調製物であり、フリーズドライ調製物として提示され、これを希釈剤で再構成し、水酸化アルミニウムアジュバントと混合した（上述のように）。プラセボは０．９％生理食塩水であった。０８７ＰＣＲ−リボタイプ由来の精製された天然トキシンＡ及びＢを、上述のように内部生産した。００１、００２、０１４、１０６、０２７、０２３及び０７８のＰＣＲ−リボタイプ由来の精製された天然トキシンＡ及びＢ、並びに、０１７のＰＣＲ−リボタイプ由来の精製された天然トキシンＢを、ＴｇｃＢｉｏｍｉｃｓ社（ドイツ国ビンゲン所在）から購入した。

株ＶＰＩ１０４６３、６３０、ＢＡＡ−１８７５、ＡＴＣＣ４３５９８をＡＴＣＣから購入した。２００７年にフランスで単離された株ＩＰＰ４０３４８を、Ｍ．Ｐｏｐｏｆｆ（パスツール研究所、フランス国パリ所在）から入手した。２００５年にカナダで単離された株ＣＤＣ１３６９５＃７を、疾病管理センター（ＣＤＣ）から入手した。２０１１年に米国で単離された株ＳＰ０４１を、Ｄ．Ｇｅｒｄｉｎｇから入手した。Ｃ．ディフィシルの臨床分離株を、Ｄ．Ｇｅｒｄｉｎｇ（米国及びアルゼンチン）、Ｆ．Ｂａｒｂｕｔ（欧州）、Ｐ．Ｖａｎｈｅｍｓ（フランス）及びＴ．Ｒｉｌｅｙ（アジア太平洋）から入手した。Ｃ．ディフィシル株を、大豆酵母抽出物塩（ＳＹＳ）培地中で１６時間、嫌気的に成長させ、次に、ソルビトールを補充したＳＹＳ培地上で７２時間、増殖させた。次に、細菌の培養上清を採取し、濾過し、抗プロテアーゼ及び３０％グリセロールを補充した。

細菌の培養上清中に存在するトキシンＡ及びＢの定量化を、製造業者の指示書に従って、市販のＥＬＩＳＡ法（ｔｇｃＢＩＯＭＩＣＳ ＧｍｂＨ社、ドイツ国マインツ所在）を使用して実施した。簡潔に言うと、トキシンＡ及びトキシンＢの両方に対する捕捉抗体でコーティングされたマイクロタイタープレートを、培養上清又は標準的な対照トキシンとともに、３７℃で６０分間、インキュベートした。未結合の物質の洗浄後、トキシンＡ又はトキシンＢのいずれかに対する特異的モノクローナル抗体（ホースラディッシュペルオキシダーゼに共役した）をウェルに加えた；マイクロタイタープレートを、３７℃で６０分間、インキュベートした。２回目の洗浄工程の後、基質を加えて、室温で３０分間、発色させた。各ウェルにＨ_２ＳＯ_４を添加することによって反応を停止し、４５０及び６２０ｎｍで分光光度計によってＥＬＩＳＡを解析した。

インビトロ交差中和分析のためのバイオアッセイを開発した。良く知られているＩＭＲ９０毒素中和アッセイを出典とした。バイオアッセイの設計は、ワクチン株由来の精製されたトキシンの細胞毒性活性を中和することが知られているＣ．ディフィシル・トキソイドワクチンに対するハムスター血清、又は、プラセボ血清のいずれかの所定の希釈物を、臨床的に関連するＣ．ディフィシル原型株由来の精製された天然トキシンＡ又はＢのいずれかの段階希釈物、若しくは、トキシンＡ及び／又はＢを含む、原型株又は臨床分離株由来の濾過した細菌上清のいずれかとともに、プレインキュベートすることからなる。血清−トキシン混合物をＩＭＲ−９０細胞に加え、該細胞がコンフルエンスに達し、電極上に付着するように、前日にＥプレート上に事前に播種した。次に、プレートを３７℃でインキュベートした。Ｅプレートは、底部に交互嵌合された金微小電極を含む、特別に設計された組織培養マイクロタイタープレートである。それらは、標識を取り込むことなく、読み出しに電気インピーダンスを使用して、リアルタイムで細胞事象を非侵襲的にモニタリングするために、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅシステムとともに使用されることが意図されている。トキシンによって誘発されたＩＭＲ９０細胞の丸まりは、電極インピーダンスの低下につながり、細胞指数（ＣＩ）値として表示される。次に、対応するワクチン及びプラセボの細胞指数を、細胞毒性曲線としてプロットし、社内ソフトウェアを使用して、シグモイド応答曲線（４パラメータ・ロジスティック）によってモデル化した。ＩＣ５０として定義される、５０％の細胞毒性を誘発する各臨床分離株の細菌上清希釈物を決定した。５０％の細胞毒性における両曲線間のシフトを、相対効果（ＲＥ）として計算した。ＲＥは、精製されたトキシン又は臨床分離株のいずれかの、トキシン−細胞毒性活性を中和するためのワクチン特異的抗トキシン抗体の能力を表す。ＲＥが統計学的に有意であるとみなされた閾値を、特異的抗トキシン抗体及び無関係な抗体の両方をプラセボに対して使用する中間精度の決定によって確立し、それによって５．４と定めた。

Ｂ．結果
最初に、一般的な毒素遺伝子変異型由来の精製された天然トキシンＡ及びＢに対するワクチン血清の有効性を試験した。本試験には、参考株ＶＰＩ１０４６３（ＡＴＣＣ４３２２５ ＰＣＲ−リボタイプ０８７）及び、ＰＣＲ−リボタイプ００１、００２、０１４、及び０２３、０１７（Ａ⁻Ｂ^＋ＣＤＴ⁻）、並びに、所謂高毒性のＰＣＲ−リボタイプ０２７（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋）及び０７８（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋）の株由来のトキシンが含まれていた。各精製された天然トキシンについての５０％の細胞毒性が達成される濃度を、最初に評価した。ＩＭＲ−９０細胞は、試験される異なるＰＣＲ−リボタイプリボタイプに由来する精製されたトキシンＡ及びＢに対して、かなり感受性である。トキシンＡについてのＩＣ５０濃度は、４．４ｎｇ／ｍＬ〜１５．９ｎｇ／ｍＬの範囲の類似した範囲内にあった。対照的に、トキシンＢでは、ＩＣ５０濃度は、選択されるＰＣＲ−リボタイプに応じて変動し、０．２ｎｇ／ｍＬ〜６．２μｇ／ｍＬの範囲にあり、トキシンＢの中で異なる力価が示唆された。次に、各精製されたトキシンのそれぞれの細胞毒性活性を中和するワクチン特異的抗トキシン抗体の相対効果（ＲＥ）を、材料及び方法の項に記載されるように評価した。表４に示されるように、ＲＥの計算値は９．３〜８１８．５の範囲にあり、これらはすべて、ＲＥ＝５．４と定められた正の閾値を上回った。ＰＣＲ−リボタイプ０２７、０２３及び０７８に由来する精製されたトキシンを中和するワクチン血清の相対効果は、他のＰＣＲ−リボタイプと比較して低かったが、それでもなお閾値を上回っていた。この結果は、ワクチン血清が、試験したすべての精製トキシンの細胞毒性を有意に中和することが可能であったことを示唆している。

流行する病原性の株の大部分が両トキシンを発現することから、精製された天然トキシンに加えて、最も一般的な株の代表であるＣ．ディフィシル原型株が産生したトキシンを中和するワクチン特異的抗トキシン抗体の相対効果を評価することもまた重要であった。この目的のため、最も一般的な型をベースとして、幾つかの原型株（表５）を選択した。培養上清中に存在するトキシンＡ及びトキシンＢの濃度をＥＬＩＳＡによって定量化し、各原型株について、ＩＭＲ−９０細胞における５０％の毒性を誘導する細菌上清の希釈を計算した（ＩＣ５０）。最適な培養条件において高トキシン産生株であることが知られている株ＡＴＣＣ（登録商標）４３２５５（商標）（ＶＰＩ１０４６３）は、高レベルのトキシンＡ（１７．０４μｇ／ｍＬ）及びトキシンＢ（７．０６μｇ／ｍＬ）を産生し、５．６×１０^７でのプラセボ血清のＩＣ５０希釈物を用いた毒性の誘導において非常に強力であった。比較すると、他の株は、トキシンを低レベルからほとんど検出不能なレベルで産生した。株は、４．４×１０^３〜５．２×１０^６の範囲にある、より低い、プラセボ血清のＩＣ５０希釈物を用いてさえも、毒性を誘導することが依然として可能であったことから、毒性は、上清中に存在するトキシンの量に対して比例していた。すべてのＲＥ計算値（プラセボ血清からワクチン−血清へのＩＣ５０希釈物のシフト）が、有意な閾値をすべて上回ったことから、驚くべきことに、さまざまな範囲の毒性力価（ＩＣ５０）にもかかわらず、ワクチン−血清は、すべての細菌上清の細胞毒性活性を中和することが可能であった。精製されたトキシンと同様に、観察された最低のＲＥ値は、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０２７及び毒素遺伝子変異型Ｖ、ＰＣＲ−リボタイプ０７８の株に対するものであったが、それでもなお有意な閾値を上回っていた。

一般的な流行するＣ．ディフィシルトキシン変異株の広範囲にわたる代表を確実にするため、インビトロ交差中和実験をＣ．ディフィシル株の大きいコレクションに拡大し、各毒素遺伝子変異型について、最近流行する臨床分離株及び大パネルの分離株を分析した。世界的なプロスペクティブ臨床研究及び疫学研究に由来する５００を超える最近の臨床分離株を収集した（米国及びアルゼンチン内で８０を超える臨床分離株を２０１１年に収集した；欧州全体にわたり３５０を超える臨床分離株を２００５年に収集し、６０の分離株をフランスから２０１０〜２０１１年に収集した；オーストラリア、シンガポール、日本、韓国、インドネシア及び台湾を含むアジア太平洋諸国において、３０を超える臨床分離株を２０１２〜２０１３年に収集した）。このコレクションから、インビトロ分析用に、１５０を超える世界中のＣ．ディフィシル臨床分離株を選択した。選択は、単離した国、分子タイプ、及び、利用可能な場合には、ＣＤＩ重症度及びＣＤＩエピソード等の臨床パラメータなど、複数の基準に基づいていた。臨床分離株の地理的分布及び分子分布は表６に記載されている。

５つの最も一般的な毒素遺伝子変異型を含む、１０の毒素遺伝子変異型を、異なる地理的地域内の代表とし、これらには、毒素遺伝子変異型０の大多数、次に、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩＩ及びＩＶ、並びに、毒素遺伝子変異型Ｉ、毒素遺伝子変異型ＩＸ及びＸＩＩなどの他の型が含まれていた。リボタイプ（ＲＴ）分布を考慮して、２３を超えるリボタイプを代表とし、毒素遺伝子変異型０の１３のリボタイプについては１３を超えるＲＴを有していた。選択は、ＣＤＩ患者において最も一般的であると特定された５つの系統／毒素遺伝子変異型を反映しており、世界の異なる区域における各毒素遺伝子変異型の特異的分布は以下の通りである：例えば、欧州では大半が毒素遺伝子変異型０株であり、米国では大半が毒素遺伝子変異型０及びＩＩＩ株であり、アジア太平洋では大半が毒素遺伝子変異型０及びＶＩＩＩ、並びに、その他のＲＴ０４６である。

トキシンを含む細菌上清を、臨床分離株のインビトロ培養物から生成した。各臨床分離株について、培地中のトキシンＡ及びトキシンＢの濃度を、ＥＬＩＳＡによって定量した。各臨床分離株のインビトロ毒性についても、ＩＣ５０を計算することによって評価した。ＩＣ５０を各臨床分離株の上清中に存在するトキシンＡ及びＢのレベルに対してプロットした（図４）。細菌上清はすべて、各毒素遺伝子変異型について広範囲にわたる毒性を伴って、アッセイにおいて毒性であった。毒性は、細菌上清中に存在するトキシンのレベルに強く比例し、トキシンＡ及びトキシンＢについてそれぞれ、０．８８及び０．９３の相関係数を有しており（図４Ａ及び図４Ｂ）、各臨床分離株が培養において成長する能力に関連する可能性が大きい（図示せず）。概して、臨床分離株は、トキシンＢよりもトキシンＡを多く産生する。トキシンＡのレベルは、トキシンＢのみを産生することが知られている毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ臨床分離株では検出不能であった。幾つかの細菌上清については、トキシンＢは、これらの培養条件下で検出限界（１．Ｅ＋０４）未満であった。

次に、トキシン変異型のなかでクラスタ化の可能性を評価するため、各臨床分離株のＲＥを計算し、それらのそれぞれの細胞毒性指数に対してプロットした（図５）。ＲＥが閾値を上回っていたことから、細菌上清はすべて、ワクチン誘導性の血清によって中和された。相対効果（ＲＥ）は、株の毒性（ＩＣ５０）とは無関係であった。興味深いことに、同一毒素遺伝子変異型間での広範ににわたる細胞毒性にもかかわらず、同じトキシン−変異型由来の臨床分離株では同質的ＲＥ挙動が観察された。毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、Ｖ及びＶＩについてのＲＥは、毒素遺伝子変異型０のＲＥより低かったが、それでもなお閾値を上回っていた。これは、ＩＭＲ９０細胞が二元毒素に対して感受性ではなく（データ示さず）、むしろ、配列比較に基づいてトキシンＡ及びトキシンＢの系統発生と一致したことから、二元毒素活性とは関連していないことが実証された。

このハムスターモデルにおける包括的研究は、世界中に流行する５つの最も一般的な変異株、すなわち、０／０１２、ＩＩＩ／０２７、ＩＶ／０２３、Ｖ／０７８及びＶＩＩＩ／０１７の毒素遺伝子変異型／ＲＴに対する、広範囲にわたるカバレッジを実証している。Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンは、キーとなる毒素遺伝子変異型０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩ、及びその他（Ｉ、ＶＩ、ＸＩＩ）に由来するトキシンＡ及びＢをインビトロで中和することが可能な抗トキシン抗体を、ハムスターモデルにおいて生成する。毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、Ｖ及びＶＩについて観察された、より低い相対効果（ＲＥ）は、二元毒素活性には関連しておらず、トキシンＡ及びトキシンＢの系統発生と一致する。二元毒素の存在が疾患重症度及び死亡危険性の著しい増加と関連していたことに着目することが重要である。二元毒素の役割は不明である。

実施例４
交差免疫実験
チャレンジ株としてＶＰＩ１０６４６３１／ＡＴＣＣ４３２５５株を用いて、ハムスターモデルにおけるＣ．ディフィシルＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５株に関する上述の免疫実験を、異なるＣ．ディフィシル株を使用して実施し、それらが複数の株に対して動物をワクチン接種するのに使用可能（すなわち、交差防御をもたらす）かどうかを決定した。毒素遺伝子変異型Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ⁻、Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋、及びＡ⁻Ｂ^＋ＣＤＴ⁻を有する株について、以下に記載されるように実験した。

本実験には、上述の方法（例えば、表３のパラメータ２２）に従って実質的に調製された同じＣ．ディフィシル株に由来する、精製されたＣ．ディフィシル・トキソイドＡ及びＣ．ディフィシル・トキソイドＢを使用し、水酸化アルミニウムを含むワクチン組成物（２０又は１６０μｇのＡｌＯＯＨの存在下、５μｇのトキソイドＡ＋Ｂ（「Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチン」））として調合した。

クリンダマイシン誘導性致死的全腸炎ゴールデンシリアンハムスターモデルにおいて、インビボ交差防御実験を行った。このモデルは、実際に、Ｃ．ディフィシル感染症の病因及びワクチンが介在する防御の研究に一般に用いられている。Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチン又は希釈剤バッファ（プラセボ）のいずれかで免疫されたハムスターをクリンダマイシン−２−リン酸溶液で前処置して、腸内微生物叢を破壊し、異なる原型株から誘導されるＣ．ディフィシル胞子を豊富に含む調製物を用いたその後の致死的チャレンジの影響を動物が受け易くなるようにした。

下痢を含む臨床兆候の発症、及び生存をモニタリングすることによって、ＣＤＩに対する防御を評価した。インビボ交差防御実験用に選択された原型株は、５つの最も一般的なトキシン−変異株の代表である（表４）。

Ａ．材料及び方法
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（ドイツ国所在）から入手した、７０〜９０ｇの雌ゴールデンシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）を、免疫付与及びチャレンジ実験に使用した。動物を群内に無秩序に分配し、ケージ８００ｃｍ^２（タイプ３、参照番号：ＬＦ−３Ｈ、Ｓｅｒｌａｂ社製）あたり３匹で収容した。Ｃ．ディフィシルチャレンジ後、動物をアイソキャップ（isocaps）を有するケージ内に個別に収容した。生物統計学者の分析に基づいて、１群あたり９匹の動物を使用した。ハムスターに、Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチン又はアルミニウム希釈剤バッファ（プラセボ対照）のいずれかを、筋肉内（ＩＭ）経路で、２週間間隔で３回、注射した。４１日目に、１０ｍｇ／ｋｇのクリンダマイシン−２−リン酸溶液を腹腔内（ＩＰ）経路によって投与した。２４時間後、各原型株の生存Ｃ．ディフィシル胞子を豊富に含む調製物を所定の致死量で用い、給液針を使用して、ハムスターに胃内（ＩＧ）経路でチャレンジした。チャレンジ後、罹患率及び死亡率について１日に少なくとも２回、動物を観察した。体重についても、クリンダマイシン注射前、及びその後は臨床モニタリング中、週に１〜３回、正確な時間にモニタリングした。下痢疾患を、個々の疾病スコア（illness scores）の群メジアンスコアとして報告した：０＝疾患なし；１＝軟便；２＝尾及び肛門周囲領域の湿潤；３＝肛門周囲領域、腹部及び後ろ足の湿潤；及び４＝死亡。ＳＡＳ ｖ９．２（登録商標）及びＥｘｃｅｌソフトウェアを使用して、統計学的分析を行った。生存期間データから累積生存率を評価するために、ログ・ランク検定を用いたカプラン・マイヤーの方法を使用した。フィッシャーの正確両側確率検定を使用して、チャレンジ後１７日目における生存動物のパーセンテージを比較した。因子の影響について５％の誤差範囲を使用した。

チャレンジのため、Ｃ．ディフィシル原型株を３７℃で２４時間、チオグリコレート培地で嫌気的に成長させた。次に、培養物を嫌気的血液寒天プレート（ＣＤＣ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）上に植菌し、３７℃で７日間インキュベートして、胞子形成を誘導した。次に、胞子をＣａ又はＭｇを含まないＰＢＳ中に採取し、２回洗浄後、５７℃で１０分間の熱ショックを与えて栄養細胞を死滅させた。胞子懸濁液を５００ｇで３０分間遠心分離にかけ、ＰＢＳ中２０％グリセロールに再懸濁した。胞子調製物を長期保管のために＜−７０℃で凍結した。胞子ストックを３７℃で解凍し、水中で１０倍の段階希釈を行うことにより、生存胞子数（ＣＦＵ／ｍＬ）を評価した。希釈物を、０．１％のタウロコラート（Ｓｉｇｍａ社）の存在下、酵母抽出物寒天プレート（ＢＨＩＳＡ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を用いたＢｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ培地上に３連で載せ、胞子の回復を促進した。プレートを、嫌気的条件下、３７℃で４８時間以上インキュベートした。コロニー数をカウントし、ＣＦＵ／ｍＬを計算した。

Ｂ．結果
相同のＣ．ディフィシルワクチン株に対する防御が実証された（図６）。プラセボ群では、チャレンジ後１日目に早くも急性下痢の発症が観察され（図６Ａ）、生存率はチャレンジ後３．５日間で早くも１１％まで急速に下降した（図６Ｂ）。ワクチン群（■）では、１匹のハムスターのみがチャレンジ後２．５日目に始まり９日目に回復した一時的な軽度の下痢（スコア２）を示しただけで、実験全体を通じて非常に限られた糞便の変化しか観察されず、生存率は実験全体を通じて１００％に維持されたことから、有意な防御が観察された。

異なるＲＴに由来する別の毒素遺伝子変異型０株に対する防御を実証するため、Ｃ．ディフィシル６３０株を使用した（図７）。プラセボ群では、チャレンジ後３日間で早くも下痢の発症が見られ、チャレンジ後６日間で最大に達した（図７Ａ）。ワクチン群では、実験全体を通じて、非常に限られた糞便の変化しか観察されなかった。図７Ｂの生存曲線は、プラセボ群（○）では、生存率がチャレンジ後２日間で早くも下降し、チャレンジ後１３日間で１１％に達したことを示している。ワクチン群（■）では、生存率は、実験全体を通じて１００％に維持された。Ｃ．ディフィシルトキソイドワクチンは、株６３０を用いたチャレンジ後に、疾患及び死亡に対して有意な防御を誘導した（フィッシャーの直接確率検定でｐ＝０．０００４及びカプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ＝０．０００１）。

Ａ^＋Ｂ^＋に加えて二元毒素（ＣＤＴ^＋）も発現する高毒性のフルオロキノロン耐性毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０２７株に対する防御についても評価した。この目的のため、３つの株：２００７年にフランスから単離された株ＩＰＰ４０３４８、２００５年にカナダから単離された株ＣＤＣ１３６９５＃７、及び２０１１年に米国で単離された株ＳＰ０４１を分析用に選択した。３つの株を用いたチャレンジ後に、急性ＣＤＩが誘発され、チャレンジ後２日間で早くも急性下痢が始まり、チャレンジ後５日未満で１００％の致死に達した。

１６０μｇのＡＬＯＯＨと混合した、上述のＣ．ディフィシル参考株ＶＰＩ１０４６３（ＡＴＣＣ４３２５５）由来の、ホルマリンで不活化され、高度に精製されたトキソイドＡ及びＢの調製物の投与後、症状及び死亡率はいずれも低かった（図８Ａ〜Ｂ）。ワクチン接種されたハムスターのほとんど（１０／１２）が、疾患症状を示さず、チャレンジを生き抜き、有意な防御をもたらした（フィッシャーの正確確率検定及びカプラン・マイヤーログ・ランク検定の両方でｐ値＜０．００１）。２匹のハムスターのみが、チャレンジ後３日以内に中程度の下痢（スコア２、平均／群０．４２）を示し、チャレンジ後６日間で死亡した。

株ＣＤＣ１３６９５＃７を用いたチャレンジ後、Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンは、疾患症状（図９Ａ）及び死亡（図９Ｂ）に対する有意な交差防御を誘発した（フィッシャーの正確確率検定及びカプラン・マイヤーログ・ランク検定の両方でｐ値＜０．００１）。実際、ワクチン接種されたハムスターのいずれも軟便を示さず、生存率はチャレンジ後に１００％で維持されたのに対し、対照群では、ハムスターは、チャレンジ後２日以内に肛門周囲領域、腹部及び後ろ足の湿潤（スコア３）とともに強い下痢を示し、生存率はチャレンジ後４日以内に８％に下降した。

最近の米国の臨床分離株である、株ＳＰ０４１については、プラセボ群の全ハムスターに強い急性の下痢（スコア３）が観察され、チャレンジ後２日以内に死亡率は１００％に達し（図９Ｃ−Ｄ）、強毒性の株であることが示唆された。Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンをワクチン接種されたハムスターのなかで、５８％（７／１２）はいかなる疾患症状もなく、１７日間より長く、チャレンジを生き抜いた。残りの４２％（５／１２）は中程度から急性の下痢を示し、チャレンジ後２〜５日以内に死亡した。それにもかかわらず、防御は有意であった（カプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ値＜０．００１、及びフィッシャーの直接確率検定でｐ値＝０．００５）。

毒素遺伝子変異型Ｖ ＰＣＲ−リボタイプ０７８の高毒性株もまた、世界中で一般的であり、Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋である。株ＢＡＡ−１８７５を原型株として使用し、交差防御を評価した。プラセボ群（○）では、株を用いたチャレンジは、チャレンジ後２日以内に６７％のハムスター（群平均１．７）において強い急性の下痢（スコア３）が観察され（図１０Ａ）、チャレンジ後３日以内に１００％の死亡率に達した（図１０Ｂ）。Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンは、実験全体を通じて生存率を１００％に維持しつつ、有意な交差防御を誘導し（フィッシャーの正確確率検定及びカプラン・マイヤーログ・ランク検定の両方で、すべてのｐ値≦０．０００１）、ワクチン接種されたハムスターにはいかなる疾患症状もなかった。

毒素遺伝子変異型ＩＶ ＰＣＲ−リボタイプ０２３株は、さまざまな国において新たに出現している。興味深いことに、この株もまたＡ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋である。したがって、１つの原型株に対して交差防御を評価することは重要である。２０１２年にフランスの病院で新たに単離された株ＮＫ９１を原型株として使用した（図１１）。プラセボ群では、ほとんどのハムスターが、チャレンジ後１日目に早くも軟便（スコア１）を示し、チャレンジ後３日未満に急性下痢（スコア３）に達し（図１１Ａ）、チャレンジ後６日以内に１００％の死亡率に達した（図１１Ｂ）。Ｃ．ディフィシルトキソイドワクチンは、実験全体を通じて生存率を１００％に維持しつつ、有意な交差防御を誘導し（フィッシャーの正確確率検定及びカプラン・マイヤーログ・ランク検定の両方で、ｐ値＜０．００１）、チャレンジ後１３日以内に、中程度かつ一時的な下痢（スコア１、軟便）が消散した。

Ａ⁻Ｂ^＋ＣＤＴ⁻である、毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０１７株は、アジア太平洋地域では非常に一般的である。株ＡＴＣＣ４３５９８を原型株として使用して、交差防御を評価した（図１２）。プラセボ群では、チャレンジされたハムスターは、チャレンジ後３〜５日以内に強い下痢を示し（図１２Ａ）、チャレンジ後９日以内に３５％も減少しうる、大幅な体重減少を示した（図１２Ｃ）。１２匹の病気のハムスターのうちの７匹は、それらの症状のために死亡し、生存率は、チャレンジ後１０日以内に４２％まで下降した（図１２Ｂ）。しかしながら、一部のハムスターは、それらの症状を回復することができた。したがって、トキシンＡが存在しないにもかかわらず、株ＡＴＣＣ４３５９８は依然として毒性であるが、すでに説明したように、ハムスターにおける疾患の発生率及び重症度は低下した。驚くべきことに、Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンをワクチン接種されたハムスターはすべて、疾患症状（図１２Ａ及び１２Ｃ）及び死亡（図１２Ｂ）に対し防御されており、生存率は、チャレンジ後に１００％を保持した（フィッシャーの正確確率分析でｐ値＝０．００４６、カプラン・マイヤー分析でｐ値＝０．００２０）。

アッセイ株は、５つの最も一般的な毒素遺伝子変異型：０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩＩＩの代表である。驚くべきことに、組成物が、毒素遺伝子変異型０、ＰＣＲ−リボタイプ０１２、株６３０（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ⁻）；毒素遺伝子変異型ＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０２７株（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋）（ＣＤＣ１３６９５＃７株、カナダ、２００５年；ＳＰ０４１臨床分離株、米国、２０１１年；ＩＰＰ４０３４８株、フランス、２００７年）；毒素遺伝子変異型ＩＶ ＰＣＲ−リボタイプ０２３（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋）（臨床分離株ＮＫ９１、フランス、２０１２年）；毒素遺伝子変異型Ｖ ＰＣＲ−リボタイプ０７８株ＡＴＣＣ ＢＡＡ−１８７５（Ａ^＋Ｂ^＋ＣＤＴ^＋）、及び、毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ ＰＣＲ−リボタイプ０１７株ＡＴＣＣ４５３９（Ａ⁻Ｂ^＋ＣＤＴ⁻）を用いたチャレンジ後に、症状及び死亡に対し、有意な交差防御をもたらすことが観察された。２０μｇの水酸化アルミニウム（ＡｌＯＯＨ）を含む組成物を使用した、株ＩＰＰ４０３４８についてのこの実験では、交差防御は有意ではなかったが、１６０μｇのＡｌＯＯＨを含む場合には有意であったことは、注目に値する。データは表７にまとめられている。

このデータは、Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンが、ハムスターチャレンジモデルにおいて、世界中に流行する５つの最も一般的な変異株を代表する臨床的に関連する株に対し、広範な防御を与えうることを実証している。Ｃ．ディフィシル・トキソイドワクチンは、毒素遺伝子変異型／ＰＣＲ−リボタイプＩＩＩ／０２７、ＩＶ／０２３及びＶ／０７８などの二元毒素を発現するものを含む、毒素遺伝子変異型／ＰＣＲ−リボタイプ０／０１２、ＩＩＩ／０２７、ＩＶ／０２３、Ｖ／０７８及びＶＩＩＩ／０１７原型株を用いたチャレンジに対して、インビボにおいて広範な防御を誘発する。

ある特定の実施形態を好ましい実施形態に関して説明してきたが、変形及び修正が当業者に想起されることが理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、このような等価のバリエーションのすべてに及び、以下の特許請求の範囲内に入ることが意図されている。

参照文献
１．Khanafer N, Barbut F, Eckert C, Perraud M, Demont C, et al. (2016) Factors predictive of severe Clostridium difficile infection depend on the definition used. Anaerobe 37: 43-48.
２．Buckley AM, Spencer J, Maclellan LM, Candlish D, Irvine JJ, et al. (2013) Susceptibility of hamsters to Clostridium difficile isolates of differing toxinotype. PLoS One 8: e64121.
３．Sambol SP, Tang JK, Merrigan MM, Johnson S, Gerding DN (2001) Infection of hamsters with epidemiologically important strains of Clostridium difficile. J Infect Dis 183: 1760-1766。

Claims (48)

1. Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現するＣ．ディフィシル株及びＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株に対し、宿主を免疫する方法であって、該方法が、約１５〜３２℃で約２〜約２１日間、ホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）とともにインキュベーションすることによって不活化された、精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ及び精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢを含む免疫原性組成物を前記宿主に投与することを含み、ここで、前記トキシンＡが０．１５％〜０．５％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化され、前記トキシンＢが０．１５％〜０．８％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化される、方法。
2. 前記精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ及び前記精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢが、Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現しないＣ．ディフィシル株に由来することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ及び前記精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢが、Ｃ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５に由来することを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 宿主において抗体を誘導する方法であって、前記抗体が、Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対して特異性を有し、前記方法が、ＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株に由来する、不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及び不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＢを含む組成物を前記宿主に投与することを含む、方法。
5. 毒素中和アッセイによって決定して、前記抗体が中和していることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗体が、少なくとも５．４の相対効果（ＲＥ）を示すことを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記抗体が、０、Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、及びＸＩＩからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有するＣ．ディフィシル株によって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記毒素遺伝子変異型０株が、００１、００２、０１２、０１４、０２０、０１４／０２０、０１４／０２０／０７７、１０６、０１８、及び０５３からなる群より選択されるＰＣＲ−リボタイプを有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ０２７又は０７５を有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＩＶ株がＰＣＲ−リボタイプ０２３を有し、
   前記毒素遺伝子変異型Ｖ株が０７８、０７９、１２２、１２６、及び０７８／１２６からなる群より選択されるＰＣＲ−リボタイプを有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＶＩ株がＰＣＲ−リボタイプ１２７又は６６−２を有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＶＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ６６−２を有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ０１７を有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＩＸ株がＰＣＲ−リボタイプ０１９を有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＸＩａ株がＰＣＲ−リボタイプ６４２を有し、
   前記毒素遺伝子変異型ＸＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ０５６を有する
   ことを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記抗体が、ＰＣＲ−リボタイプ０４６又は３６９を有するＣ．ディフィシル株によって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和することを特徴とする、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記抗体が、０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩＩＩからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有するＣ．ディフィシル株によって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
11. 前記抗体が、Ｃ．ディフィシル株の毒素遺伝子変異型０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、及びＶＩＩＩによって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
12. 前記毒素遺伝子変異型０株がＰＣＲ−リボタイプ０１２を有し、前記毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ０２７を有し、前記毒素遺伝子変異型ＩＶ株がＰＣＲ−リボタイプ０２３を有し、前記毒素遺伝子変異型Ｖ株がＰＣＲ−リボタイプ０７８を有し、前記毒素遺伝子変異型ＶＩＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ０１７を有することを特徴とする、請求項１０又は１１に記載の方法。
13. 前記抗体が、毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、ＩＶ及びＶのＣ．ディフィシル株によって産生されたトキシンＡ及び／又はトキシンＢを中和することを特徴とする、請求項７に記載の方法。
14. 前記毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ０２７を有し、前記毒素遺伝子変異型ＩＶ株がＰＣＲ−リボタイプ０２３を有し、前記毒素遺伝子変異型Ｖ株がＰＣＲ−リボタイプ０７８を有することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. Ｃ．ディフィシル二元毒素（ＣＤＴ）を発現する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対して宿主に免疫及び／又はワクチン接種する方法であって、該方法が、ＣＤＴを発現しないＣ．ディフィシル株に由来する、不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及び不活化された精製Ｃ．ディフィシルトキシンＢを含む組成物を前記宿主に投与することを含む、方法。
16. 前記宿主が、０、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ及び／又はＶＩＩＩからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対して、それぞれ、免疫及び／又はワクチン接種されることを特徴とする、請求項１５に記載の方法。
17. 前記宿主が、ＩＩＩ、ＩＶ及びＶからなる群より選択される毒素遺伝子変異型を有する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対して、それぞれ、免疫及び／又はワクチン接種されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
18. 前記宿主が、前記毒素遺伝子変異型ＩＩＩ、ＩＶ及びＶを有する１種類以上のＣ．ディフィシル株に対して、それぞれ、免疫及び／又はワクチン接種されることを特徴とする、請求項１５又は１６に記載の方法。
19. 前記毒素遺伝子変異型ＩＩＩ株がＰＣＲ−リボタイプ０２７を有し、前記毒素遺伝子変異型ＩＶ株がＰＣＲ−リボタイプ０２３を有し、前記毒素遺伝子変異型Ｖ株がＰＣＲ−リボタイプ０７８を有することを特徴とする、請求項１８に記載の方法。
20. Ｃ．ディフィシルによって引き起こされる疾患及び死亡に対する有意な防御が前記宿主にもたらされることを特徴とする、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記防御が、ゴールデンシリアンハムスターモデルを使用して決定されることを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
22. 前記組成物が、少なくとも３回、前記宿主に投与されることを特徴とする、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記組成物が、筋肉内経路によって投与されることを特徴とする、請求項２２に記載の方法。
24. 前記組成物が、２週間の投与間隔で３回投与されることを特徴とする、請求項２２又は２３に記載の方法。
25. ハムスターの群についての生存率が約５８％〜約１００％であることを特徴とする、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記防御が、ログ・ランク検定を用いたカプラン・マイヤーの方法、及び／又は、フィッシャーの正確両側確率検定によって決定して、統計学的に有意であることを特徴とする、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
27. ハムスターの群について：
    カプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ＝０．０００１及びフィッシャーの正確両側確率検定でｐ＝０．０００４；
    カプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ＜０．００１及びフィッシャーの正確両側確率検定でｐ値＝０．００５；
    カプラン・マイヤーログ・ランク検定及びフィッシャーの正確両側確率検定の両方でｐ値≦０．０００１；及び／又は
    カプラン・マイヤーログ・ランク検定でｐ値＝０．００２０及びフィッシャーの正確両側確率検定でｐ＝０．００４６
    であることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
28. 前記組成物が、ＣＤＴ又はそれらのサブユニットを含まないことを特徴とする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記Ｃ．ディフィシルトキシンＡ及びトキシンＢがＣ．ディフィシル毒素遺伝子変異型０に由来することを特徴とする、請求項３〜２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記精製されたＣ．ディフィシルトキシンＡ及び前記精製されたＣ．ディフィシルトキシンＢがＣ．ディフィシル株ＶＰＩ１０４６３／ＡＴＣＣ４３２５５に由来することを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
31. 前記トキシンＡ及び前記トキシンＢが、約１５〜３２℃で約２〜約２１日間、ホルムアルデヒドとともにインキュベーションすることによって不活化され、ここで、前記トキシンＡが０．１５％〜０．５％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化され、前記トキシンＢが０．１５％〜０．８％のホルムアルデヒド（ｗ／ｖ）で不活化されることを特徴とする、請求項３〜３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記組成物が約０．００１％〜０．０２０％のホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記組成物が約０．００４％のホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
34. 前記組成物が０．００８％のホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
35. 前記組成物が約０．０１６％のホルムアルデヒドを含むことを特徴とする、請求項３２に記載の方法。
36. 前記トキソイドＡ及び前記トキソイドＢが５：１〜１：５のＡ：Ｂ比で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 前記トキソイドＡ及び前記トキソイドＢが、３：１又は３：２のＡ：Ｂ比で前記組成物中に存在することを特徴とする、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記組成物が、フリーズドライ、噴霧乾燥、又は泡沫乾燥されることを特徴とする、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記組成物が液体形態であることを特徴とする、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記組成物が１種類以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記組成物が、クエン酸、リン酸、グリシン、炭酸、又は重炭酸バッファ、又はｐＨ調整された水溶液を含むことを特徴とする、請求項４０に記載の方法。
42. 糖、又は糖アルコールをさらに含むことを特徴とする、請求項４０又は４１に記載の方法。
43. 前記組成物がスクロース及びクエン酸を含むことを特徴とする、請求項４０〜４２のいずれか一項に記載の方法。
44. 前記組成物がアジュバントをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 前記アジュバントがアルミニウムを含むことを特徴とする、請求項４４に記載の方法。
46. 前記アジュバントがリン酸アルミニウム又は水酸化アルミニウムを含むことを特徴とする、請求項４５に記載の方法。
47. 前記アジュバントが水酸化アルミニウムを含むことを特徴とする、請求項４６に記載の方法。
48. 前記組成物が、約２０μｇ〜約１６０μｇの水酸化アルミニウムを含むことを特徴とする、請求項４７に記載の方法。