CN103212060B - 蛋白及其组合物与在制备预防、诊断或治疗ehec感染产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了蛋白及其组合物与在制备预防、诊断或治疗EHEC感染产品中的应用。本发明提供如下A-D中任一所示的物质在制备具有如下1）和/或2）功能的产品中的应用：1）预防、诊断和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病；2）降低病原菌EHEC对肠道感染损伤。本发明的实验证明，本发明通过基因工程技术获取Z0390蛋白和Z4191蛋白，体内外评估蛋白的免疫学功能等实验研究，证实这两种蛋白及其组合物是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作为抗原试剂用于感染诊断；可以防治O157：H7感染，表明该蛋白可以作为针对EHEC引发疾病的疫苗或药物。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白及其组合物与在制备预防、诊断或治疗EHEC感染产品中的应用。
背景技术
肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhage E．coli，EHEC）是毒力最强、致病性也最强的大肠杆菌，受到广泛的关注。EHEC感染可使人患腹泻、出血性结肠炎（HC），还可引发溶血性尿毒综合症（HUS）及血栓性血小板减少紫癜（TTP）等严重并发症，严重者可导致死亡，致死率达5%～10%。2011年4月，德国暴发了肠出血性大肠杆菌O104：H4感染和溶血性尿毒综合征（HUS）疫情，蔓延到欧洲和北美洲的16个国家。同年四、五月间，日本富山地区暴发了新感染疫情，血清型为O111，某些病例在引起HUS之后，出现了神经症状，并发弥散型血管内凝血和脑病。在EHEC中，致病性强、危害大的还有O157：H7。自1975年被首次分离、1982年被确认为致病菌以来的20多年中，世界各地包括中国都有不同规模的暴发流行。1999年在我国江苏、安徽两省有过大规模暴发流行，患者超过2万例，死亡177例。EHEC感染已经成为欧美国家儿童肾衰的首位病因，对人们的健康构成了巨大威胁。另外，作为一种重要的人兽共患病病原体，EHEC病原菌可长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中，造成动物的腹泻，并污染畜禽的肉奶蛋制品以及水源和农作物等，给农牧业生产造成巨大的损失。因此，EHEC感染已经成为全球性的公共卫生问题。
目前，临床针对EHEC感染主要采取对症治疗，因为抗生素治疗具有加剧病情的危险性而被谨慎使用，没有可以使用的疫苗和特异治疗药物。如果能发现和获得病原菌的核心抗原或优势保护性抗原，就可以进一步发展新型的疫苗、治疗药物和诊断试剂。
目前，由多抗原组分制备多价重组蛋白疫苗是EHEC疫苗发展的热点，备受关注。其研制成功的关键在于选择强免疫原性的候选抗原，而已经被证实具有良好免疫原性和一定保护力的有Intimin，Tir，EspB，EspA，Hly和外毒素Stxs抗原组分等。不同抗原组分的组合尝试也一直在进行：PotterAA等研制以Tir和EspA为免疫原制备的防止牛感染EHEC O157：H7的新型疫苗，试验显示有效率达59%。易勇等利用基因重组技术分别构建了Stx2B-IntiminC300融合蛋白疫苗，以致死剂量的EHEC O157：H7菌超声破菌液对免疫小鼠进行攻毒实验，免疫保护作用为65%，后又相继构建了Intimin、EspA及Hly等多价亚单位融合基因工程疫苗，在小鼠定植和致死动物模型中的实验证明同时具有抗定植和抗毒素的作用。本发明人也曾先后制备Intimin、Stx1B、Stx2B、Stx2B-Stx1B、Stx2B-Stx1B-Intimin以及SAmB等单一组分和多组分抗原，还新发现了Paa抗原，并证实均有不同程度的抗EHEC O157：H7感染的能力。
尽管如此，由于EHEC病原菌致病岛涉及基因复杂多样，很多毒力因子的功能尚未阐明。虽然Genbank中已公开了大量的EHEC病原菌的全基因组，但是基因组的功能注释并不完全，大量的编码蛋白的功能没有得到确认，特别是可用于诊断和防治药物开发的功能蛋白还没有全面被发现，还有很大空间去鉴定发现新的具有临床应用价值的功能分子。
发明内容
本发明的第一个目的是提供如下A-D中任一所示的物质的新用途。
本发明提供的如下A-D中任一所示的物质在制备具有如下1）和/或2）功能的产品中的应用：
1）预防和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病；
2）降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；
A、Z0390蛋白、B、含有Z0390蛋白的蛋白组合物、C、含有Z0390蛋白的融合蛋白、D、含有Z0390蛋白的融合蛋白的蛋白组合物；
所述Z0390蛋白为如下（1）-（3）中任一所示的蛋白：
（1）序列表中的序列2所示的氨基酸组成的蛋白质；
（2）序列2自N’末端第1-370位氨基酸组成的蛋白质；
（3）将1）或2）所示蛋白的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
上述含有Z0390蛋白的融合的蛋白为由Z0390蛋白和其他蛋白形成的融合蛋白。
上述应用中，所述含有Z0390蛋白的蛋白组合物为由所述Z0390蛋白和其他蛋白组成的组合物，
所述含有Z0390蛋白的融合蛋白的蛋白组合物为由所述含有Z0390蛋白的融合蛋白和其他蛋白组成的组合物；
所述其他蛋白为修饰蛋白、标签蛋白或功能蛋白；
所述含有Z0390蛋白的蛋白组合物为如下a-c中任一种：a为由所述Z0390蛋白和Z4191蛋白组成的组合物、b为由所述Z0390蛋白和Intimin蛋白组成的组合物、c为由所述Z0390和SAmB蛋白组成的组合物；
所述Z4191蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4或序列4自N’末端第1-190位氨基酸；
所述Intimin蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列5；
所述SAmB蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。
上述应用中，a所示的蛋白组合物中，所述Z0390蛋白和所述Z4191蛋白的质量比为1:1；
b所示的蛋白组合物中，所述Z0390蛋白和所述Intimin蛋白的质量比为1:1；
c所示的蛋白组合物中，所述Z0390蛋白和所述SAmB蛋白的质量比为1:1；
所述产品为疫苗或药物。
上述应用中，所述肠道为人或动物肠道；所述病原菌EHEC为EHEC O157：H7。
上述应用中的所述A-D中任一所示的物质作为靶标或检测标志物在开发或制备诊断感染病原菌EHEC的产品中的应用。
本发明的第二个目的是提供一种产品。
本发明提供的产品，其活性成分为上述A-D中任一所示的物质；所述产品为具有如下1）或2）中至少一种功能的产品：
1）预防、诊断和/或治疗由病原菌EHEC引发疾病；
2）降低病原菌EHEC对肠道感染损伤。
Z0390蛋白作为抗原制备的抗体也是本发明保护的范围；
或Z4191蛋白作为抗原制备的抗体也是本发明保护的范围；
所述Z0390蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2或序列2自N’末端第1-370位氨基酸；
所述Z4191蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4或序列4自N’末端第1-190位氨基酸。
上述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，在本发明的实施例中为多克隆抗体。
检测上述Z0390蛋白的产品在制备用于诊断病原菌EHEC产品中的应用；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7；检测上述Z0390蛋白的产品进一步具体为上述的Z0390蛋白作为抗原制备的抗体；
或检测上述Z4191蛋白的产品在制备用于诊断病原菌EHEC产品中的应用；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7；检测上述Z4191蛋白的产品进一步具体为上述的Z4191蛋白作为抗原制备的抗体。
上述的抗体在制备提高宿主抗病原菌EHEC感染产品中的应用也是本发明保护的范围；所述宿主具体为人或动物；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7。
或一种产品，其活性成分为权利要求7或8所述的抗体；
所述产品为具有如下1）和/或2）功能的产品也是本发明保护的范围：
1）用于检测病原菌EHEC；
2）提高宿主抗病原菌EHEC感染；
所述宿主具体为人或动物；所述病原菌EHEC具体为EHEC O157：H7。
本发明的实验证明，本发明将Z0390蛋白（含有HIS标签）及其与其他蛋白如Z4191蛋白（含有HIS标签）、Intimin蛋白或SAmB蛋白形成的组合物，在体内外评估蛋白或蛋白组合物的免疫学功能等实验研究，证实（1）该蛋白及其组合物可被O157：H7感染血清所特异的、高效的识别，是EHEC病原菌重要的核心抗原，可作为抗原试剂用于感染诊断；（2）该蛋白及其组合物免疫的小鼠可以抵制O157：H7攻毒，表明该蛋白或其组合物可以作为针对EHEC引发疾病的疫苗；（3）该蛋白可用来制备抗体或抗血清，该抗体或抗血清可以特异识别EHEC菌体蛋白，能够作为抗体试剂检测EHEC病原菌；（4）该蛋白或其组合物可激发机体产生特异应答，具有高水平的免疫原性，通过诱导高效免疫效应，抵抗病原菌感染所造成的损伤或死亡。
附图说明
图1为Z0390的蛋白纯化及WB鉴定
图2为Z4191的蛋白纯化及WB鉴定
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
部分材料如下：
1、载体与菌株
EHEC O157：H7EDL933株可由ATCC提供，目录号：700927；公众也可从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获得，该菌株EDL933株记载在L.W.Riley,R.S.Remis,S.D.Helgerson,H.B.McGee,J.G.Wells,B.R.Davis,R.J.Hebert,E.S.Olcott,L.M.Johnson,N.T.Hargrett,P.A.Blake,M.L.Cohen,Hemorrhagic colitis associated with a rare Escherichia coli serotype,N.Engl,J.Med.308(1983)681685.中。pEASY-T1载体、E.coli DH5α、E.coli BL21（DE3）感受态细胞购自TransGen公司，pET-22b(+)购自Novagen。
2、试剂与培养基
NdeI和XhoI限制性核酸内切酶及T4连接酶购自NEB公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG抗体及HRP标记的组氨酸抗体购自Pierce公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG1抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG2a、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG2b抗体、辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG3抗体及辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgA抗体均购自Sigma公司；PCR所用的Taq酶以及DNAmarker（DL2000）购自TransGen公司；质粒小提试剂盒和琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自北京博迈德公司；其他化学试剂均为化学纯或分析纯；镍柱购自GE公司。
EHEC O157：H7细菌培养采用Luria-Bertani（LB，Oxoid LTD，Basingstok，Hampshire，England）液体培养基及LB平板。工程菌培养均采用含氨苄青霉素终浓度100μg/ml的LB液体培养基及LB平板。
3、生化与分子生物学试剂
山梨醇麦康凯基础琼脂及山梨醇麦康凯琼脂添加剂购自青岛高科园海博生物技术有限公司；DEME培养基购自GIBCO公司；标准胎牛血清购自Biochrom公司；双抗购自Hyclone公司。
4、配制方法
LB培养基的配制方法（1L）：Nacl10g；酵母粉5g；蛋白胨10g。
表1SDS-PAGE分离胶与浓缩胶的配制方法
5、实验动物
大耳白兔（雄性、2.5kg）、BALB/c小鼠（雌性、14-16g）均购自军事医学科学院实验动物中心。
实施例1、蛋白及其组合物的获得及其对感染EHEC血清的识别
1、目的基因的扩增
根据GenBank公布的EHEC O157:H7的目的基因核苷酸序列，考虑蛋白纯化的要求在下游引物引入6×His标签（CACCACCACCACCACCAC）设计并合成引物。
表1、为引物名称、序列及酶切位点
以提取的EHEC O157:H7基因组为模板，分别用Z0390的上下游引物和Z4191的上下游引物进行PCR扩增，得到1137bp的PCR产物和597bp的PCR产物。
上述PCR扩增所需的50μl的扩增反应体系为：上下游引物各1μl、模板基因组DNA为1μl、dNTP为4μl，10×Buffer为5μl、Taq酶1μl、无菌水37μl。
上述PCR扩增按以下循环参数进行反应：94℃预变性5min；按94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；最后72℃延伸10min；4℃冷却。
分别回收上述1137bp的PCR产物和597bp的PCR产物，并分别连接到pEASY-T1载体上，连接产物转化感受态受体菌E.coli DH5α中，以含有氨苄及X-Gal/IPTG的LB琼脂平板筛选，进行PCR鉴定（PCR鉴定的引物即为扩增所需的引物）。结果为阳性的PCR送上海生工生物工程有限公司测序。
结果1137bp的PCR产物具有序列表中的序列1所示的核苷酸；其中，该PCR产物所示的基因命名为Z0390-HIS，该基因编码的重组蛋白命名为Z0390-HIS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2。
序列1所示Z0390-HIS，其中，序列1自5’末端第1-6位核苷酸为NdeI酶位点的基因,序列1自5’末端第4-1110位核苷酸为Z0390基因，序列1自5’末端第1111-1128位核苷酸为HIS标签的基因,序列1自5’末端第1129-1131位核苷酸为终止子，序列1自5’末端第1132-1137位核苷酸为XhoⅠ酶位点的基因；
序列2所示Z0390-HIS，其中，序列2自5’末端第1-370位氨基酸为Z0390蛋白，序列2自5’末端第371-376位氨基酸为HIS标签；
597bp的PCR产物具有序列表中的序列3所示的核苷酸；其中，该PCR产物所示的基因命名为Z4191-HIS，该基因编码的重组蛋白命名为Z4191-HIS，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4。
序列3所示Z4191-HIS，其中，序列3自5’末端第1-6位核苷酸为NdeI酶位点的基因,序列3自5’末端第4-570位核苷酸为Z4191基因，序列3自5’末端第571-588位核苷酸为HIS标签的基因,序列3自5’末端第589-591位核苷酸为终止子，序列3自5’末端第592-597位核苷酸为XhoⅠ酶位点的基因；
序列4所示Z4191-HIS，其中，序列4自5’末端第1-190位氨基酸为Z4191蛋白，序列4自5’末端第191-196位氨基酸为HIS标签。
2、重组表达载体和基因工程菌的构建
将1137bp的PCR产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，与经过同样酶切的pET22b（+）载体连接，得到重组载体，经过测序，该载体为将序列表中序列1自5’末端第4-1131位核苷酸插入pET22b（+）载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点间得到的载体；命名为pET22b（+）-Z0390-HIS，即为重组表达载体。
将597bp的PCR产物用NdeⅠ和XhoⅠ双酶切，与经过同样酶切的pET22b（+）载体连接，得到重组载体，经过测序，该载体为将序列表中序列3自5’末端第4-591位插入pET22b（+）载体的NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点间得到的载体；命名为pET22b（+）-Z4191-HIS，即为重组表达载体。
将pET22b（+）-Z0390-HIS和pET22b（+）-Z4191-HIS分别转入感受态受体菌E.coli DH5α中，以含有氨苄及X-Gal/IPTG的LB琼脂平板筛选转化成功的细菌，得到重组菌1和重组菌2。
提取重组菌1的质粒，经过测序为pET22b（+）-Z0390-HIS，将含有该质粒的重组菌1命名为E.coli DH5α/pET22b（+）-Z039-HIS；
提取重组菌2的质粒，经过测序为pET22b（+）-Z4191-HIS，将含有该质粒的重组菌2命名为E.coli DH5α/pET22b（+）-Z4191-HIS。
采用同样的方法将空载体pET22b（+）导入E.coli DH5α中，得到E.coli DH5α/pET22b（+）。
3、重组蛋白的诱导表达和纯化
1）诱导表达
将E.coli DH5α/pET22b（+）-Z0390-HIS和E.coli DH5α/pET22b（+）-Z4191-HIS分别接种于含有氨苄抗性的LB液体培养基，37℃震荡培养至吸光度（A）约为0.6时加入诱导剂IPTG（终浓度1mmol/L），继续培养4h，离心收集诱导表达重组菌的菌体，再进行冰浴超声破菌，400W，工作时间3s，间隔5s，循环99次，共破碎时间为20min。5000rpm20min离心上述破碎产物，收集上清液和沉淀（包涵体），将上清液进行SDS-PAGE，结果E.coli DH5α/pET22b（+）-Z0390-HIS经诱导表达出约41KD的重组蛋白Z0390-HIS（与预期大小一致）；E.coli DH5α/pET22b（+）-Z4191-HIS经诱导表达出约25KD的重组蛋白Z4191-HIS（与预期大小一致）。
2）纯化
将上述E.coli DH5α/pET22b（+）-Z0390-HIS和E.coli DH5α/pET22b（+）-Z4191-HIS经诱导表达、菌体破碎的上清液分别用0.45μm滤膜过滤，除去杂质，收集过滤产物。
将各菌的过滤产物分别用带有组氨酸的镍柱亲和层析纯化，平衡液中咪唑浓度为40mmol（20mmol/L磷酸钠、500mmol/L氯化钠、40mmol/L咪唑、pH7.4），洗脱液中咪唑浓度都为400mmol（洗脱液配方如下：20mmol/L磷酸钠、500mmol/L氯化钠、400mmol/L咪唑、pH7.4）；收集1柱体积的洗脱液为纯化重组蛋白Z0390-HIS或纯化重组蛋白Z4191-HIS。
然后用SDS-PAGE鉴定纯化重组蛋白Z0390-HIS和纯化重组蛋白Z4191-HIS抗原纯度，用Bradford（以牛血清蛋白为标准）测定蛋白浓度。
纯化重组蛋白Z0390-HIS的结果如图1所示，其中，M：蛋白marker、1为Z0390-HIS的纯化结果，可以看出，纯化重组蛋白Z0390-HIS的大小约为41KD与预期大小一致）；其浓度为3.2mg/ml。
纯化重组蛋白Z4191-HIS的结果如图2所示，其中，M：蛋白marker、1为Z4191-HIS的纯化结果，可以看出，纯化重组蛋白Z4191-HIS的大小约为25KD（与预期大小一致）；其浓度为2.8mg/ml。
以E.coli DH5α/pET22b（+）为对照，未得到41KD或25KD的目标蛋白。
4、纯化重组蛋白对EHEC感染血清的识别
将纯化重组蛋白Z0390-HIS和纯化重组蛋白Z4191-HIS分别进行Western blot，探针均为鼠抗-EHEC O157:H7全菌蛋白多抗（EHEC O157：H7感染BALB/c小鼠得到的抗血清），二抗为抗鼠IgG抗体（辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG的抗体）。纯化重组蛋白Z0390-HIS的结果如图1中的泳道2和3所示，在41KD出现了一条特异条带，说明重组蛋白Z0390-HIS能被鼠抗-O157：H7全菌蛋白多抗识别，具有良好的免疫反应性，说明重组蛋白Z0390-HIS为EHEC O157：H7抗原，可以用来诊断EHEC感染；
纯化重组蛋白Z4191-HIS的结果如图2中的泳道2所示，在25KD出现了一条特异条带，说明重组蛋白Z4191-HIS能被鼠抗-O157：H7全菌蛋白多抗识别，具有良好的免疫反应性，说明重组蛋白Z4191-HIS为EHEC O157：H7抗原，可以用来诊断EHEC感染。
再将纯化重组蛋白Z0390-HIS和纯化重组蛋白Z4191-HIS混合（质量比1：1）进行Western blot，方法同上，结果纯化重组蛋白Z0390-HIS和纯化重组蛋白Z4191-HIS可以同时被O157：H7感染血清识别，具有良好的免疫反应性，说明重组蛋白Z0390-HIS和Z4191-HIS可以同时用来诊断EHEC感染。
由于HIS仅为标签，不会影响Z0390和Z4191的功能，因此上述结果也证明，Z0390和Z4191也分别可以识别EHEC感染血清，具有良好的抗原反应性，说明Z0390和Z4191均为EHEC O157：H7抗原，可以用来诊断EHEC感染。
因此，下面对重组蛋白Z0390-HIS和Z4191-HIS组成的组合物，也对重组蛋白Z0390-HIS和其他蛋白（如Intimin蛋白或SAmB蛋白）组成的组合物进行研究；其中组合物中，各蛋白的质量比为1:1。
实施例2、蛋白或蛋白组合物的免疫原性及对EHEC感染的保护作用
雌性BALB/c小鼠14-16g随机分为2组，每组10只，下述实验均重复三次：
Z0390免疫组：腹腔途径免疫由实施例1得到的纯化重组蛋白Z0390-HIS作为抗原；
Z4191免疫组：腹腔途径免疫由实施例1得到的纯化重组蛋白Z4191-HIS作为抗原；
Z0390/Z4191混合免疫组I：腹腔途径免疫由实施例1得到的纯化重组蛋白Z0390-HIS和纯化重组蛋白Z4191-HIS作为免疫原；纯化重组蛋白Z0390-HIS和纯化重组蛋白Z4191-HIS的质量比为1：1；
Z0390/Intimin混合免疫组II：腹腔途径免疫由实施例1得到的纯化重组蛋白Z0390-HIS和Intimin蛋白（制备方法参见文献，高翔等，肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析，军事医学科学院院刊，2008，32（4）：316-318，Intimin蛋白的氨基酸序列作为序列5）作为免疫原；纯化重组蛋白Z0390-HIS和Intimin蛋白的质量比为1：1；
Z0390/SAmB混合免疫组III：腹腔途径免疫由实施例1得到的纯化重组蛋白Z0390-HIS和SAmB蛋白（制备方法参见文献，Cai K.et al,Enhanced Immunogenicity of anovel Stx2Am-Stx1B fusion protein in a mice model of Enterohemorrhagic Escherichia coliO157:H7infection.Vaccine,2011,29(5):946-952，SAmB蛋白的氨基酸序列作为序列5）作为免疫原；纯化重组蛋白Z0390-HIS和SAmB蛋白的质量比为1：1；
BSA对照组：腹腔途径免疫BSA作为免疫原。
免疫方式：首次免疫采用等体积的弗氏完全佐剂(总体积100μl)，加强免疫采用弗氏不完全佐剂与抗原等体积混合(总体积100μl)，每次免疫间隔2周，共免疫三次。首次免疫单独的蛋白作为免疫原的剂量为25μg，混合免疫组中免疫原蛋白总剂量也为25μg，各蛋白的质量比为1：1；加强免疫时单独蛋白作为免疫原的剂量为50μg，混合免疫组中免疫原蛋白总剂量也为50μg，各蛋白的质量比为1：1。末次免疫后10天，各组小鼠均给予5g/L链霉素的饮水，饮用3天，然后断食断水24h后分别以109CFU(10MLD)和5×109CFU(50MLD)EHEC O157：H7EDL933进行经口灌胃攻毒，观察小鼠状态和存活情况。
1、Z0390或Z0390蛋白组合物的免疫原性检测
将上述各个免疫组小鼠分别于第46天尾静脉取血收集并分离血清。采用ELISA方法检测血清IgG水平，4种不同蛋白（Z0390-HIS、Z4191-HIS、Intimin蛋白、SAmB蛋白）分别为抗原包被（包被量为50ng/孔），收集的小鼠血清为待检抗体，HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体（辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗小鼠IgG的抗体）作为二抗。以BSA对照组作对照。
BSA对照组小鼠的血清中针对Z0390、Z4191、Intimin、SAmB没有IgG的ELISA效价检出；
Z0390免疫组小鼠的血清中只检出针对Z0390的IgG的ELISA效价为1.02×106；
Z4191免疫组小鼠的血清中只检出针对Z4191的IgG的ELISA效价为1.28×105；
Z0390/Z4191混合免疫组I小鼠的血清中检出针对Z0390的IgG的ELISA效价为1.02×106，针对Z4191的IgG的ELISA效价为5.12×105；
Z0390/Intimin混合免疫组II小鼠的血清中检出针对Z0390的IgG的ELISA效价为2.05×106，针对Intimin的IgG的ELISA效价为8.19×106；
Z0390/SAmB混合免疫组III小鼠的血清中检出针对Z0390的IgG的ELISA效价为2.05×106，针对Intimin的IgG的ELISA效价为6.55×104；
从上述结果可以看出，与BSA对照组相比，单独免疫组和混合免疫组小鼠可检测出针对特异抗原的血清抗体，在第三次免疫后处于高抗体效价水平。说明，重组蛋白Z0390-HIS、重组蛋白Z4191-HIS是良好的免疫抗原，而且重组蛋白Z0390-HIS分别与重组蛋白Z4191-HIS、Intimin、SAmB形成的组合物均为良好的免疫抗原，具有较强的免疫原性。
2、存活率统计
在对受试动物的大菌量（过致死剂量）攻毒试验中，病原菌攻击三次免疫小鼠时，攻毒后观察10天统计小鼠存活率。
结果显示，当攻击受试动物的病原菌剂量为10MLD时，在攻毒后第10天，Z0390免疫组、Z4191免疫组、Z0390/Z4191混合免疫组I、Z0390/Intimin混合免疫组II、Z0390/SAmB混合免疫组III的受试动物存活率均为100%（10只/10只），而BSA对照组在第七天小鼠全部死亡（0/10）。
当攻击受试动物的病原菌剂量为50MLD时，在攻毒后第10天，Z0390免疫组、Z4191免疫组、Z0390/Z4191混合免疫组I、Z0390/Intimin混合免疫组II、Z0390/SAmB混合免疫组III的受试动物存活率分别为80%（8只/10只）、50%（5只/10只）、100%（10只/10只）、100%（10只/10只）、100%（10只/10只），而BSA对照组在第五天小鼠全部死亡（0/10）。
上述实验表明，重组蛋白Z0390-HIS和重组蛋白Z4191-HIS可以单独或共同作为疫苗组分预防和/或治疗病原菌EHEC引发疾病、重组蛋白Z0390-HIS也可以和别的蛋白共同作为疫苗组分预防和/或治疗病原菌EHEC引发疾病。
由于HIS仅为标签，不会影响Z039和Z4191的功能，因此上述结果也证明，Z039和Z4191也可以单独或共同作为疫苗组分预防和/或治疗病原菌EHEC引发疾病Z0390也可以和别的蛋白共同作为疫苗组分预防和/或治疗病原菌EHEC引发疾病。
实施例3、抗蛋白抗原的抗体或抗体组的制备及应用
1、蛋白抗原抗血清的制备与鉴定
将浓度达到1mg/ml、纯度达到95%以上由实施例1得到的纯化重组蛋白Z0390-HIS、纯化重组蛋白Z4191-HIS分别作为抗原，分别免疫大耳白兔（雄性、2.5kg）。分别在第四周（25μg/只）和第八周（50μg/只）加强免疫。当效价（ELISA检测）达到并稳定在1:105以上，对大耳白心脏取血，5000g离心10min分离血清，并用2μm一次性滤器（Millipore）过滤血清，过滤后的血清用亲和层析的方法进行纯化，（Protein A Hitrap，GE公司，操作按说明书进行），收集1.2柱体积的为抗Z0390抗体（多克隆抗体），收集1.2柱体积的为抗Z4191抗体（多克隆抗体），纯化后-80℃保存。
分别培养EHEC O157：H7和大肠杆菌DH5a，收集菌体，超声破碎，收集全菌蛋白。以EHEC O157：H7全菌蛋白、大肠杆菌DH5a全菌蛋白分别作包被抗原进行ELISA分析，BSA为对照，检测抗Z0390抗体、抗Z4191抗体识别菌体蛋白、检测病原菌的能力，ELISA检测时分别以免疫前兔血清、抗Z0390抗体和抗Z4191抗体为一抗，以辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG抗体为二抗。
结果显示，对比BSA对照的OD490值0.053，1:1000稀释的抗Z0390抗体、抗Z4191抗体分别检测EHEC O157:H7菌体蛋白均呈阳性，ELISA测定OD490值分别为1.651和1.248，而检测大肠杆菌DH5a菌体蛋白均为阴性，ELISA测定OD490值为0.065。可以看出抗Z0390抗体、抗Z4191抗体均能够识别EHEC O157：H7全菌蛋白，具有病原菌抗原识别能力；说明抗Z0390、抗Z4191抗血清均为O157：H7的抗体，可用于诊断EHEC O157：H7病原菌。
Claims (7)
1.如下A或B所示的物质在制备具有如下1)和/或2)功能的产品中的应用：
1)预防、诊断和/或治疗由病原菌EHEC感染或引发的疾病；
2)降低病原菌EHEC对肠道感染损伤；
A、Z0390蛋白、B、含有Z0390蛋白的蛋白组合物；所述Z0390蛋白为如下(1)或(2)的蛋白：
(1)序列表中的序列2所示的氨基酸组成的蛋白质；
(2)序列2自N’末端第1-370位氨基酸组成的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：
所述含有Z0390蛋白的蛋白组合物为由所述Z0390蛋白和其他蛋白组成的组合物，
所述其他蛋白为Z4191蛋白、Intimin蛋白或SAmB蛋白；
所述含有Z0390蛋白的蛋白组合物为如下a-c中任一种：a为由所述Z0390蛋白和Z4191蛋白组成的组合物、b为由所述Z0390蛋白和Intimin蛋白组成的组合物、c为由所述Z0390和SAmB蛋白组成的组合物；
所述Z4191蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列4或序列4自N’末端第1-190位氨基酸；
所述Intimin蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列5；
所述SAmB蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列6。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：
a所示的蛋白组合物中，所述Z0390蛋白和所述Z4191蛋白的质量比为1:1；
b所示的蛋白组合物中，所述Z0390蛋白和所述Intimin蛋白的质量比为1:1；
c所示的蛋白组合物中，所述Z0390蛋白和所述SAmB蛋白的质量比为1:1；
所述产品为疫苗或药物。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肠道为人或动物肠道；所述病原菌EHEC为EHEC O157：H7。
5.权利要求1-4中所述应用中的所述A或B所示的物质作为靶标或检测标志物在开发或制备诊断感染病原菌EHEC的产品中的应用。
6.检测权利要求1-4中所述应用中的所述Z0390蛋白的产品在制备用于诊断病原菌EHEC产品中的应用；所述病原菌EHEC为EHEC O157：H7；检测权利要求1-4中所述应用中的所述Z0390蛋白的产品为所述的Z0390蛋白作为抗原制备的抗体。
7.Z0390蛋白作为抗原制备的抗体在制备提高宿主抗病原菌EHEC感染产品中的应用；所述宿主为人或动物；所述病原菌EHEC为EHEC O157：H7。
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