CN101717779B - 一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白的制备。该融合蛋白的编码基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。该融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。本发明为炭疽抗毒素和疫苗的制备与应用创造了新的生物材料。

Description

一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白的制备。

发明背景

炭疽病(Anthrax)是由革兰氏阳性的炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)引起的人、家畜和野生动物共患的一种急性、热性、败血性传染病，在农牧业上造成巨大的经济损失。此外，炭疽杆菌产生的芽胞具有很强的耐高温，抗消毒剂，抗辐射，不易清除的特性。这一特点使得炭疽杆菌成为传统生物武器和生物恐怖袭击的首先材料。因此，世界各国尤其是欧美发达国家近几年都加速了炭疽药物或者疫苗的开发。

炭疽病的致病因子主要包括由内生质粒pOX-1编码的细菌荚膜和由质粒pOX-2编码的外毒素。前者的组成为带负电荷的多聚D谷氨酸，它能够抵御吞噬细胞的吞噬作用以及血清中的阳离子的降解，从而使菌体细胞能够在体能大量繁殖。后者是炭疽芽胞杆菌主要的致病因子，由保护性抗原(PA，83KDa)，致死因子(LF，90KDa)和水肿因子构成(EF，89KDa)构成的AB型外毒素。A PA主要作用是与细胞表面特定的受体结合，并转运LF和EF进入细胞。LF是有776个氨基酸残基构成的锌离子依赖型的金属蛋白酶，能够特异性结合并且切割有丝分裂蛋白激激酶家族(MAPPK)的N端，如MEK1，MEK2，MKK3，MKK4，MKK6，和MKK7。MAPKK的切割进一步阻断了包括细胞外信号调节激酶(ERK)，p38和JNK等细胞信号转导途径，进而导致细胞裂解(Duesbery and Vande Woude 1999；Vitale，Blanset et al.2006)。EF是由767个氨基酸组成的一种依赖与钙离子的腺苷酸环化酶，能够催化细胞内的ATP转化为cAMP(Collier and Young 2003)，使得细胞内外水份失衡进而导致水肿。在致病时，炭疽毒素的单一成分不能发挥作用，水肿因子或致死因子必须与保护性抗原结合成水肿毒素(EF+PA，EdTx)或致死毒素(LF+PA，LeTx)才具有致病作用。炭疽毒素致病的过程为：保护性抗原与细胞表面的受体肿瘤内皮标志物8(TEM-8)或毛细管形态生成蛋白2(CMG-2)结合(Bradley，Mogridge et al.2001；Scobie，Rainey et al.2003)后，被细胞表面弗林类酶特异性地切割后释放出氨基酸20千道尔顿(PA20)的多肽片段，剩下的结合于受体的63千道尔顿(PA63)形成一个七聚体，该七聚体自发地结合LF或EF或同时结合LF和EF，形成一个多聚体复合物。该复合物在细胞表面辅助受体LPR6的协助下，内吞入胞内。内吞体在胞内酸性环境的诱导下，PA63发生构象重排，插入到内吞体膜中，形成一个通道。此时，结合于七聚体的EF或者LF在离子梯度和跨膜正电势差的作用下被拉入孔道，进入受体细胞，进而发挥致病作用(Young and Collier 2007)。

目前针对炭疽病治疗的药物主要是抗生素和保护性抗原特异性的抗血清。前者主要包括青霉素，四环素，链霉素，脱氧土霉素，乙酰红霉素，环丙沙星等，后者主要是来源于志愿者的血清。这些传统的药物和治疗手段存在诸多的缺陷：第一抗生素治疗只能杀掉体内感染的炭疽芽胞杆菌菌体，而对于存在巨大潜在危害的芽胞却无能力；第二，对于感染后期的人，因大量的外毒素已经分泌到血液中，抗生素并不能将其清除；第三，因为目前大量的抗生素的使用导致病原菌都出现了很强的耐药性；第四，对于治疗炭疽病，这些抗生素都需要很大的剂量，并不适用于那些对抗生素过敏的特殊人群。而抗血清治疗虽然能够清除分泌到血液中的炭疽外毒素，但也存在譬如血清来源有限，患者注射后出现过敏反应等诸多问题。因此开发新型高效安全的炭疽病治疗药物已成为全球面临的挑战和各个国家研究的热点(Baillie 2006)。

接种炭疽疫苗是预防炭疽芽胞杆菌感染的主要手段。目前人用的炭疽疫苗主要是以PA为主要成份的疫苗。其主要制备方法是从无荚膜的炭疽杆菌V2770NP1R菌株培养的上清液中提取，然后与Al(OH)3佐剂混合形成的制剂。该疫苗的主要免疫原是PA，但因其从炭疽杆菌的发酵液中提取，操作过程可能会残留一些未除尽的致死因子和水肿因子，这些大大的降低了传统疫苗的安全性。同时，这种疫苗因其主要成份是活性的PA，若给已感染炭疽杆菌的人接种这种疫苗，其中的PA同样可以参与LF或EF的运输，进而增强炭疽毒素的致病作用。此外，传统的PA疫苗主要产生抗PA抗体，而不产生中和LF或者EF的抗体。因此，我们亟待开发重组的，无活性的且能够刺激机体同时产生抗PA，抗LF或EF的新的炭疽疫苗。

发明内容

本发明的目的是构建一种新型的融合基因并利用此基因表达一种可用于炭疽病预防和抗毒素治疗的蛋白。发明的主要技术路线如图1所示，首先利用重叠延伸PCR技术将炭疽芽胞杆菌致死因子LF的结合功能域LFn编码区和具有显性抑制功能的保护性抗原的突变体DPA(PA含有427F→D点突变)的编码区融合后插入到表达载体pGEX-6p-1，形成重组载体pGEX-LFn-DPA。将该载体转入大肠杆菌E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL中，利用IPTG诱导后发现目标蛋白主要以可溶的形式表达。我们进一步纯化了融合蛋白LFn-DPA，并在体内和体外评估了该融合蛋白作为一种更安全的抗毒素和疫苗的潜力。体外抗毒素分析表明，LFn-DPA能够同时抑制LF和EF对细胞的毒性。体内小鼠保护分析表明，当该融合蛋白LFn-DPA与PA的比例为1∶8时，能够完全抵抗5倍的半致死量的LeTx对小鼠的攻击。表明该融合蛋白可作为一种新型抗炭疽毒素制剂。此外该无活性的融合蛋白免疫小鼠后能够刺激小鼠产生抗炭疽外毒素PA，LF，EF三种抗体，且与PA相比，LFn-DPA能够刺激机体产生更强的抗PA的免疫反应。综上，该融合蛋白可以作为一种抗毒素制剂和炭疽疫苗。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明制备融合蛋白的核苷酸序列；

图1：是本发明的技术路线示意图；

图2：是本发明所用的质粒图谱；其中图2-A：是质粒pGEX-6p-1的图谱；图2-B：是质粒pGEX-KG-PAF427D的图谱；图2-C：是质粒pGEX-6p-LF的图谱；

图3：是质粒pGEX-LFn-DPA的构建流程与图谱；

图4：是LFn-DPA蛋白示意图；

图5：是LFn-DPA蛋白的表达与纯化分析；

图6：是LFn-DPA蛋白的活性分析；

图7：是LFn-DPA蛋白体外抗致死毒素活性分析；

图8：是LFn-DPA蛋白体外抗水肿毒素活性分析；

图9：是抗体滴度检测；图中：A.抗PA抗体滴度；B.抗LF抗体滴度；C.抗EF抗体滴度；D.抗PA抗体亚型；E.抗LF抗体亚型；F.抗EF抗体亚型。

具体实施方式

实施例1融合体的构建与相关蛋白的制备

本发明中所用到的生化试剂或生物材料样品除作特殊说明外，均购自Sigma公司。

本发明所用到的质粒pGEX-6p-1(见图2-A)购自GEHealthcare公司；质粒pGEX-6p-LF(见图2-C)，pGEX-KG-PA_F427D(见图2-B，参考文献：Cao等.2008，Cao等，2009)。

本发明利用重叠延伸PCR技术构建融合体LFn-DPA(如图3所示)。

制备方法如下：

(1)采用PCR扩增LFn DNA片段。引物序列如下：

LF-5’，5’---GCGGATCCGCGGGCGGTCATGGTGATGT---3’(包含BamH I位点，下划线标示)；

LFn-3’，5’---

AGGAGAACC---3’(包含GTCGAC接头，下划线标示，重叠区用方框标示)；

上述引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。以质粒pGEX-6p-LF为模版，按照如下的反应体系和反应条件扩增LF的结合功能域LFn。

PCR体系如下：

10×PCR缓冲液(北京全式金公司)     10μL

dNTP(10mM)                        1μL

模板                              1μL

引物LF-5’(10μM)                 1μL

引物LFn-3’(10μM)                1μL

Pfu DNA聚合酶(北京全式金公司)     1μL

去离子水(ddH₂O)                   35μL

PCR条件：95℃预变性2min；95℃、20s，55℃、20s；72℃、30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃、5min。

(2)用PCR扩增DPA DNA片段。引物序列如下：

PA-5’，5’---

TTTCTTGTTC---3’(含GTCGAC接头，下划线标示，重叠区用方框标示)；

PA-3’，5’---ACCGCTCGAGTTATCCTATCTCATAGCC---3’(包含Xho I位点，用下划线标示)。

上述引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。以质粒pGEX-KG-DPA为模版，按照如下的反应体系和反应条件扩增DPA编码区。

PCR体系如下：

10×PCR缓冲液(北京全式金公司)        10μL

dNTP(10mM)                           1μL

模板                                 1μL

引物PA-5’(10μM)                    1μL

引物PA-3’(10μM)                    1μL

Pfu DNA聚合酶(北京全式金公司)        1μL

去离子水(ddH₂O)                      35μL

PCR条件：95℃预变性2min；95℃、20s，55℃、30s；72℃、1min，30个循环；72℃延伸10min，4℃、5min。

(3)将步骤(1)和(2)中扩增的片段用试剂盒(商品名称：QIAquick GEL ExtractionKit，购自德国Qiagen公司，按照该试剂盒的说明书操作)纯化。将纯化的LFn和DPA片段用重叠延伸PCR拼接。具体PCR体系和扩增条件为：

10×PCR缓冲液(北京全式金公司)         10μL

dNTP(10mM)                            1μL

LFn                                   2μL

PA                                    2μL

引物PA-5’(10μM)                     1μL

引物PA-3’(10μM)                     1μL

Pfu DNA聚合酶(北京全式金公司)         1μL

去离子水(ddH₂O)                       32μL

PCR条件：95℃预变性2min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、1.5min，30个循环；72℃延伸8min，4℃、5min。

(4)将步骤(3)中扩增的DNA片段纯化后克隆到载体pGEX-6p-1，形成pGEX-LFn-DPA。

具体操作为：纯化的LFn-DPA用限制性内切酶Bam HI-Xho I(购自TAKARA公司)酶切，酶切反应体系为：酶解缓冲液，5μL；BamHI，，2μL；Xho I，2μL；PCR产物，41μL。

混匀后置于37℃保温6小时。质粒载体pGEX-6p-1酶解体系和条件同上一致。利用试剂盒(商品名称：QIAquick GEL Extraction Kit，购自德国Qiagen公司)纯化酶切后的载体片段和基因片段，并将二者用连接酶连接。

连接体系：

10X连接酶缓冲液                1μL

双酶切的PCR产物                6μL

双酶切的载体                   2μL

T₄DNA连接酶(购自TAKARA公司)    1μL

混匀后，16℃保温过夜，然后将连接混合物与100L大肠杆菌感受态细胞E.coli DH5α混合，冰浴放置30分钟，42℃处理90秒，加800μL LB培养基(其中1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.5％酵母粉，pH7.0)，37℃保温45min，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素固体LB平皿，37℃保温14小时，挑取转化子并且抽提质粒，将又插入片段的质粒送交购自上海生工生物工程技术有限责任公司测序验证，将获得的含有融合基因LFn-DPA的质粒命名为pGEX-LFn-DPA。该质粒于2009年11月16日送交位于湖北省武汉大学内的中国典型培养物保藏中心，保藏名称为大肠杆DH5α/pGEX-LFn-DPA，其保藏号为CCTCC NO：M 209270。

(3)蛋白的表达、纯化与分析

(1)重组蛋白的表达

将重组质粒pGEX-LFn-DPA转化到表达宿主细胞E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(购自GE Healthcare公司，操作参照实施例1中的转化步骤)。将过夜活化的转化子以体积比为1％的接种量转接至1L含100μg/mL氨苄青霉素LB液体培养基中，37℃培养2-3hrs，使OD600达到0.8，加入异丙基-B-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.2mM，18℃200转/分钟培养6小时。离心收集菌体，然后用PBS缓冲液(pH 7.4，140.0mM氯化钠，2.7mM氯化钾，10.0mM磷酸氢二钠，1.8mM磷酸氢二钾)洗涤一次，再用50mL PBS悬浮，然后用高压细胞破碎仪破碎细胞(购自美国THERMO公司)。细胞破碎液于4℃、12000转/分钟离心30分钟，分离上清和沉淀并用SDS-PAGE检测目标蛋白的表达定位(见图5)。

(2)蛋白的纯化

利用亲和层析纯化重组LFn-DPA。具体操作步骤如下(所有操作均在4℃下进行)：首先用Gutathione(GSH)-Sepharose(购自GE Healthcare公司)亲和柱纯化蛋白，用缓冲液PBS平衡柱，样品1mL/min上样。用150mLPBS洗涤杂蛋白，然后用PreScission蛋白酶(购自GE Healthcare公司)4℃酶解16小时后，收集目的蛋白。含有LFn-DPA的洗脱液用Millipore50-kDa cut-off Ultra-4Centrifugal Filter Units(购自美国Millipore公司)浓缩并置换缓冲液，进一步用Mono Q Sepharose column(购自GE Healthcare公司)进行精纯。获得的PA蛋白分装后置-80℃保存备用，对纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析鉴定纯度(见图5)。

(3)所用的保护性抗原蛋白(PA)，致死因子蛋白(LF)参见考文献：Cao，S.，A.Guo，etal，Investigation of New Dominant Negative Inhibitors of Anthrax Protective AntigenMutants for use in Therapy and Vaccination，Infect Immun.和Cao，S.，Z.Liu，etal，Efficient production and characterization of Bacillus anthracis lethal factorand a novel inactive mutant rLFm-Y236F，Protein Expr Purif 59(1)：25-30。水肿因子蛋白(EF)的制备方法同上述致死因子蛋白(LF)的制备方法。

(4)纯化蛋白的检测和定量

蛋白的检测均使用12％的SDS-PAGE分析。配方如下：

浓缩胶浓度为5％：

H₂O                   1.4mL

30％Acr-Bis(29∶1)    0.33mL

1M Tris-HCL，pH8.8    0.25mL

10％SDS               0.02mL

10％过硫酸铵          0.02mL

TEMED                 0.002mL

分离胶浓度为          12％：

H₂O                   1.6mL

30％Acr-Bis(29∶1)    2mL

1M Tris-HCL，pH8.8    1.3mL

10％SDS               0.05mL

10％过硫酸铵          0.05mL

TEMED                 0.002mL

检测方法：取10μL纯化的蛋白样品，加等体积的蛋白上样缓冲液(2×)，沸水浴5-10min，然后上样10μL。LFn-DPA的纯化结果见图2.

(5)蛋白浓度的测定

蛋白质的定量均使用Bradford蛋白定量检测试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司，按照试剂盒的说明书操作)。具体步骤如下：

1)取4μL蛋白标准品(购自上海生工生物工程技术有限公司)加PBS稀释至100μL，使终浓度为200μg/mL；

2)取稀释后的标准品按0，1，2，4，6，8，10，15μL分别加到96孔板中，加PBS补足到20μL，每孔蛋白含量分别为0，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2和3μg，每个梯度重复3次；

3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS到20μL，重复3次；

4)各孔加入200μL Bradford Reagent，混匀，室温放置5min；

5)用预热的酶标仪(Thermo Scientific公司)测定A595读数；

6)绘制标准曲线，计算样品的蛋白浓度。

实施例2融合蛋白抗毒素活性分析

(1)细胞培养与细胞毒性检测

小鼠的单核细胞系RAW264.7(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)用含10％胎牛血清(购自杭州四季青公司)的无酚红DMEM高糖(美国Promega公司)培养液(含50U/mL青霉素和50μg/mL庆大霉素)在37℃，含5％CO2，95％空气的培养箱(日本SANYO公司)中培养。细胞传代用胰酶二乙胺四乙酸(EDTA)消化液消化细胞后接种于96孔培养板(购自CORNING公司)，待细胞长密度长至每孔1.5×10⁴个细胞时，吸弃培养液，再加入100μL含有待检测样品的新鲜培养液，继续培养三小时，然后每孔加入荧光染料ALamarBLue^TM(AbDSerotec)10μL，将培养板用铝箔包裹后置于培养箱中继续培养4h。采用酶标仪(BioTek，USA)在读取每孔的荧光值。读数参数为：激发光530nm，发射光590nm。细胞相对活性按照如下公式计算：

说明：对照孔为致死毒素(各1.0μg)处理孔；活细胞孔为不加毒素孔。

(2)融合蛋白的活性分析

浓度分别为1.25nM，2.5nM，5.0nM，10nM，20nM，40nM，80nM，160nM，320nM的LFn-DPA与含有50nM LF的DMEM培养基混匀后，作用于RAW264.7细胞，分析LFn-DPA活性，并设同样浓度的PA作为对照，按照实施例3所述检测细胞活性，结果见图6所示，融合蛋白完全丧失活性。

(3)体外抗致死毒素(LeTx)活性分析

PA与LF结合称为致死毒素(lethal toxin，LeTx)，在体外可导致敏感细胞(如小鼠巨噬细胞RAW264.7)的死亡。实验前16小时，将RAW264.7以3×10⁴个/孔接种于96孔培养板中，细胞长至80％满时，吸弃96孔板中培养基加入新鲜的含有固定浓度的LeTx(20nM PA和5nM LF)和不同浓度的LFn-DPA(0nM，0.125nM，0.25nM，0.5nM，1.0nM，2.0nM，4.0nM，8.0nM，16.0nM)，同时设不加LFn-DPA的细胞孔做对照。细胞活性按照实施例3所述检测，并利用软件GraphPad Prism 5中的非线性拟合计算半抑制量IC₅₀，结果如图7所示，LFn-DPA能够抑制致死毒素对细胞的毒性，保护细胞存活。

(4)体外抗致水肿毒素活性分析

中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1(购自中国科学院上海生命科学院细胞资源中心)培养用含有10％新生牛血清，50U/mL青霉素和50μg/mL庆大霉素的DMEM/F12(1∶1)细胞培养基(购自Hyclone公司)，在37℃，含5％CO2，95％空气的培养箱(日本SANYO公司)中培养。细胞传代用胰酶二乙胺四乙酸(EDTA)消化液消化细胞后接种于96孔培养板(CORNING公司)，待细胞长密度长至每孔80％满时，加入100μL含有固定浓度的EdTx(20nM PA和5nMEF)和梯度浓度LFn-DPA(浓度依次为：0.625nM，1.25nM，2.5nM，5.0nM，10.0nM，20.0nM)，37℃培养2h后，细胞内的环腺苷酸的浓度利用Cyclic AMP Assay Kit进行检测(购自R&D Systems公司)，单独用EdTx(20nM PA和5nM EF)和不处理的细胞分别用来做正对照和负对照，检测结果如图8，表明LFn-DPA能够抑制EdTx对敏感细胞的毒性作用。

(5)体内检测LFn-DPA抗毒素活性

取5-6周龄雌性BALB/c小鼠52只(购自湖北省疾病预防与控制中心)，平均分为7组，4只/组。其中分别将0.72nM，0.36nM，0.18nM，0.09nM，0.045nM的LFn-DPA与0.27nM LF+0.72nM PA混合后尾静脉注射五组小鼠。同时设两组对照：一组小鼠单独注射200μl PBS，另一组注射27nM LF+0.72nM PA。小鼠在48h内的症状以及存活率被观察并记录。如表格1，当LFn-DPA与PA的比例大于1/8时，小鼠完全被保护。

表1LFn-DPA体内抗毒素活性分析

实施例3动物免疫保护分析

(1)动物免疫

取6-8周龄雌性BALB/c鼠24只(购自湖北省疾病预防与控制中心)，平均分为3组，每组8只分为PA免疫组，LFn-DPA免疫组及1组PBS对照组。分别将50μL含20μg的重组蛋白PA，LFn-DPA与等体积的0.18mg的AL(OH)3混合后腹腔免疫小鼠。对照组是将50μL PBS与等体积的AL(OH)3混合后腹腔注射小鼠。分别于1，3，5周免疫小鼠，，第0，2，4，6周断尾采血。将收集的免疫小鼠血液分离血清后于-20℃冻存，用于抗体的检测。

(2)特异性IgG及IgG亚型滴度的检测

使用实施例1中纯化的PA，LF，EF蛋白各1μg/100μL于4℃过夜包被酶联板，加5％脱脂牛奶于37℃封闭1h，用洗涤液洗板3次后加入待检小鼠血清，待检血清用洗涤液倍比稀释，第一孔按1∶100稀释，加入100μL/孔。37℃反应30min。洗板3次后加入1∶5,000稀释的羊抗鼠IgG(H+L)-HRP(购自SouthernBiotech，USA)，37℃反应30min。洗板5次后加入100μL底物液(该底物液含1mg/mL 3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)和0.03％H₂O₂)，避光显色10min后，于630nm读数。取免疫后OD值/免疫前OD值＞2的血清最大稀释倍数作为血清抗体滴度，抗体滴度用以10为低的对数表示。

进一步检测IgG亚类IgG1和IgG2a抗体滴度的检测方法同IgG抗体滴度的检测，只是加入二抗时加入HRP-IgG1或HRP-IgG2a(结果如图9)。如图9所示，LFn-DPA免疫小鼠后能够刺激产生抗PA，LF，EF，的抗体，相对于PA免疫组，LFn-DPA能够诱导小鼠产生更高的抗PA的抗体滴度。此外，还发现LFn-DPA诱导小鼠产生的主要是IgG1和IgG2a亚型的抗体，且以IgG1为主。

(3)免疫小鼠攻毒实验

第三次免疫后一周对实施例3中三组免疫后的小鼠进行攻毒试验。具体方法是对每只小鼠通过尾静脉注射炭疽致死毒素(25μg LF+60μgPA，即本发明制备的PA)，观察PA和LFn-DPA对小鼠的免疫保护力。经LFn-DPA m免疫后的小鼠能够完全抵抗炭疽致死毒素的攻击，而对照即未免疫的小鼠全部死亡(结果见表2)。

表2LFn-DPA免疫保护能力分析；

参考文献

1、Baillie，L.W.Past，imminent and future human medical countermeasures for anthrax.J Appl Microbiol，2006，101(3)：594-606.

2、Bradley，K.A.，J.Mogridge，M.Mourez，R.J.Collier and J.A.Young Identificationof the cellular receptor for anthrax toxin.Nature，2001，414(6860)：225-9.

3、Collier，R.J.and J.A.Young Anthrax toxin.Annu Rev Cell Dev Biol，2003，19：45-70.

4、Cao，S.，A.Guo，et al.(2009).″Investigation of New Dominant Negative Inhibitorsof Anthrax Protective Antigen Mutants for use in Therapy and Vaccination.″InfectImmun.

5、Cao，S.，Z.Liu，et al.(2008).″Efficient production and characterization ofBacillus anthracis lethal factor and a novel inactive mutant rLFm-Y236F.″ProteinExpr Purif 59(1)：25-30.

6、Duesbery，N.S.and G.F.Vande Woude Anthrax toxins.Cell Mol Life Sci，1999，55(12)：1599-609.

7、Ho，S.N.，H.D.Hunt，et al.(1989).″Site-directed mutagenesis by overlap extensionusing the polymerase chain reaction.″Gene 77(1)：51-59.

8、Rainey，G.J.and J.A.Young Antitoxins：novel strategies to target agents ofbioterrorism.Nat Rev Microbiol，2004，2(9)：721-6.

9、Scobie，H.M.，G.J.Rainey，K.A.Bradley and J.A.Young Human capillarymorphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor.Proc Natl Acad SciUSA，2003，100(9)：5170-4.

10、Vitale，L.，D.Blanset，I.Lowy，T.O’Neill，J.Goldstein，S.F.Little，G.P.Andrews，G.Dorough，R.K.Taylor and T.Keler Prophylaxi s and therapy ofinhalational anthrax by a novel monoclonal antibody to protective antigen thatmimics vaccine-induced immunity.Infect Immun，2006，74(10)：5840-7.

11、Young，J.A.and R.J.Collier Anthrax toxin：receptor binding，internalization，pore formation，and translocation.Annu Rev Biochem，2007，76：243-65.

序列表

<110>华中农业大学

<120>一种适用于炭疽抗毒素和疫苗的融合蛋白

<130>

141>2009-11-18

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>2976

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(2976)

<223>

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(2976)

<223>

<400>1

gcg ggc ggt cat ggt gat gta ggt atg cac gta aaa gag aaa gag aaa     48

Ala Gly Gly His Gly Asp Val Gly Met His Val Lys Glu Lys Glu Lys

1               5                   10                  15

aat aaa gat gag aat aag aga aaa gat gaa gaa cga aat aaa aca cag     96

Asn Lys Asp Glu Asn Lys Arg Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys Thr Gln

            20                  25                  30

gaa gag cat tta aag gaa atc atg aaa cac att gta aaa ata gaa gta    144

Glu Glu His Leu Lys Glu Ile Met Lys His Ile Val Lys Ile Glu Val

        35                  40                  45

aaa ggg gag gaa gct gtt aaa aaa gag gca gca gaa aag cta ctt gag    192

Lys Gly Glu Glu Ala Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu Lys Leu Leu Glu

    50                  55                  60

aaa gta cca tct gat gtt tta gag atg tat aaa gca att gga gga aag    240

Lys Val Pro Ser Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys Ala Ile Gly Gly Lys

65                  70                  75                  80

ata tat att gtg gat ggt gat att aca aaa cat ata tct tta gaa gca    288

Ile Tyr Ile Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys His Ile Ser Leu Glu Ala

                85                  90                  95

tta tct gaa gat aag aaa aaa ata aaa gac att tat ggg aaa gat gct    336

Leu Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ile Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Ala

            100                 105                 110

tta tta cat gaa cat tat gta tat gca aaa gaa gga tat gaa ccc gta    384

Leu Leu His Glu His Tyr Val Tyr Ala Lys Glu Gly Tyr Glu Pro Val

        115                 120                 125

ctt gta atc caa tct tcg gaa gat tat gta gaa aat act gaa aag gca    432

Leu Val Ile Gln Ser Ser Glu Asp Tyr Val Glu Asn Thr Glu Lys Ala

    130                 135                 140

ctg aac gtt tat tat gaa ata ggt aag ata tta tca agg gat att tta    480

Leu Asn Val Tyr Tyr Glu Ile Gly Lys Ile Leu Ser Arg Asp Ile Leu

145                 150                 155                 160

agt aaa att aat caa cca tat cag aaa ttt tta gat gta tta aat acc    528

Ser Lys Ile Asn Gln Pro Tyr Gln Lys Phe Leu Asp Val Leu Asn Thr

                165                 170                 175

att aaa aat gca tct gat tca gat gga caa gat ctt tta ttt act aat    576

Ile Lys Asn Ala Ser Asp Ser Asp Gly Gln Asp Leu Leu Phe Thr Asn

            180                 185                 190

cag ctt aag gaa cat ccc aca gac ttt tct gta gaa ttc ttg gaa caa    624

Gln Leu Lys Glu His Pro Thr Asp Phe Ser Val Glu Phe Leu Glu Gln

        195                 200                 205

aat agc aat gag gta caa gaa gta ttt gcg aaa gct ttt gca tat tat    672

Asn Ser Asn Glu Val Gln Glu Val Phe Ala Lys Ala Phe Ala Tyr Tyr

    210                 215                 220

atc gag cca cag cat cgt gat gtt tta cag ctt tat gca ccg gaa gct    720

Ile Glu Pro Gln His Arg Asp Val Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Glu Ala

225                 230                 235                 240

ttt aat tac atg gat aaa ttt aac gaa caa gaa ata aat cta gtc gac    768

Phe Asn Tyr Met Asp Lys Phe Asn Glu Gln Glu Ile Asn Leu Val Asp

                245                 250                 255

gaa gtt aaa cag gag aac cgg tta tta aat gaa tca gaa tca agt tcc    816

Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser

            260                 265                 270

cag ggg tta cta gga tac tat ttt agt gat ttg aat ttt caa gca ccc    864

Gln Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro

        275                 280                 285

atg gtg gtt acc tct tct act aca ggg gat tta tct att cct agt tct     912

Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser

    290                 295                 300

gag tta gaa aat att cca tcg gaa aac caa tat ttt caa tct gct att     960

Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile

305                 310                 315                 320

tgg tca gga ttt atc aaa gtt aag aag agt gat gaa tat aca ttt gct    1008

Trp Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala

                325                 330                 335

act tcc gct gat aat cat gta aca atg tgg gta gat gac caa gaa gtg    1056

Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val

            340                 345                 350

att aat aaa gct tct aat tct aac aaa atc aga tta gaa aaa gga aga    1104

Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg

        355                 360                 365

tta tat caa ata aaa att caa tat caa cga gaa aat cct act gaa aaa    1152

Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys

    370                 375                 380

gga ttg gat ttc aag ttg tac tgg acc gat tct caa aat aaa aaa gaa    1200

Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu

385                 390                 395                 400

gtg att tct agt gat aac tta caa ttg cca gaa tta aaa caa aaa tct    1248

Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser

                405                 410                 415

tcg aac tca aga aaa aag cga agt aca agt gct gga cct acg gtt cca    1296

Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro

            420                 425                 430

gac cgt gac aat gat gga atc cct gat tca tta gag gta gaa gga tat    1344

Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr

        435                 440                 445

acg gtt gat gtc aaa aat aaa aga act ttt ctt tca cca tgg att tct    1392

Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser

    450                 455                 460

aat att cat gaa aag aaa gga tta acc aaa tat aaa tca tct cct gaa    1440

Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu

465                 470                 475                 480

aaa tgg agc acg gct tct gat ccg tac agt gat ttc gaa aag gtt aca    1488

Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr

                485                 490                 495

gga cgg att gat aag aat gta tca cca gag gca aga cac ccc ctt gtg    1536

Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val

            500                 505                 510

gca gct tat ccg att gta cat gta gat atg gag aat att att ctc tca    1584

Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser

        515                 520                 525

aaa aat gag gat caa tcc aca cag aat act gat agt caa acg aga aca    1632

Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr

    530                 535                 540

ata agt aaa aat act tct aca agt agg aca cat act agt gaa gta cat    1680

Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His

545                 550                 555                 560

gga aat gca gaa gtg cat gcg tcg ttc ttt gat att ggt ggg agt gta    1728

Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val

                565                 570                 575

tct gca gga ttt agt aat tcg aat tca agt acg gtc gca att gat cat    1776

Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His

            580                 585                 590

tca cta tct cta gca ggg gaa aga act tgg gct gaa aca atg ggt tta    1824

Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu

        595                 600                 605

aat acc gct gat aca gca aga tta aat gcc aat att aga tat gta aat    1872

Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn

    610                 615                 620

acc ggg acg gct cca atc tac aac gtg tta cca acg act tcg tta gtg    1920

Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val

625                 630                 635                 640

tta gga aaa aat caa aca ctc gcg aca att aaa gct aag gaa aac caa    1968

Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln

                645                 650                 655

tta agt caa ata ctt gca cct aat aat tat tat cct tct aaa aac ttg    2016

Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu

            660                 665                 670

gcg cca atc gca tta aat gca caa gac gat gac agt tct act cca att    2064

Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Asp Ser Ser Thr Pro Ile

        675                 680                 685

aca atg aat tac aat caa ttt ctt gag tta gaa aaa acg aaa caa tta    2112

Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu

    690                 695                 700

aga ttg gat acg gat caa gta tat ggg aat ata gca aca tac aat ttt    2160

Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe

705                 710                 715                 720

gaa aat gga aga gtg agg gtg gat aca ggc tcg aac tgg agt gaa gtg    2208

Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val

                725                 730                 735

gta ccg caa att caa gag aca act gca cgt atc att ttt aat gga aaa    2256

Val Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys

            740                 745                 750

gat tta aat ctg gta gaa agg cgg ata gcg gcg gtt aat cct agt gat    2304

Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp

        755                 760                 765

cca tta gaa acg act aaa ccg gat atg aca tta aaa gaa gcc ctt aaa    2352

Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys

    770                 775                 780

ata gca ttt gga ttt aac gaa ccg aat gga aac tta caa tat caa ggg    2400

Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly

785                 790                 795                 800

aaa gac ata acc gaa ttt gat ttt aat ttc gat caa caa aca tct caa    2448

Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln

                805                 810                 815

aat atc aag aat cag tta gcg gaa tta aac gca act aac ata tat act    2496

Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr

            820                 825                 830

gta tta gat aaa atc aaa tta aat gca aaa atg aat att tta ata aga    2544

Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg

        835                 840                 845

gat aaa cgt ttt cat tat gat aga aat aac ata gca gtt ggg gcg gat    2592

Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn IleAla Val Gly Ala Asp

    850                 855                 860

gag tca gta gtt aag gag gct cat aga gaa gta att aat tcg tca aca    2640

Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr

865                 870                 875                 880

gag gga tta ttg tta aat att gat aag gat ata aga aaa ata tta tca    2688

Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser

                885                 890                 895

ggt tat att gta gaa att gaa gat act gaa ggg ctt aaa gaa gtt ata    2736

Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile

            900                 905                 910

aat gac aga tat gat atg ttg aat att tct agt tta cgg caa gat gga    2784

Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly

        915                 920                 925

aaa aca ttt ata gat ttt aaa aaa tat aat gat aaa tta ccg tta tat    2832

Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr

    930                 935                 940

ata agt aat ccc aat tat aag gta aat gta tat gct gtt act aaa gaa    2880

Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu

945                 950                 955                 960

aac act att att aat cct agt gag aat ggg gat act agt acc aac ggg    2928

Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly

                965                 970                 975

atc aag aaa att tta atc ttt tct aaa aaa ggc tat gag ata gga taa    2976

Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

            980                 985                 990

<210>2

<211>991

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Ala Gly Gly His Gly Asp Val Gly Met His Val Lys Glu Lys Glu Lys

1               5                   10                  15

Asn Lys Asp Glu Asn Lys Arg Lys Asp Glu Glu Arg Asn Lys Thr Gln

            20                  25                  30

Glu Glu His Leu Lys Glu Ile Met Lys His Ile Val Lys Ile Glu Val

        35                  40                  45

Lys Gly Glu Glu Ala Val Lys Lys Glu Ala Ala Glu Lys Leu Leu Glu

    50                  55                  60

Lys Val Pro Ser Asp Val Leu Glu Met Tyr Lys Ala Ile Gly Gly Lys

65                  70                  75                  80

Ile Tyr Ile Val Asp Gly Asp Ile Thr Lys His Ile Ser Leu Glu Ala

                85                  90                  95

Leu Ser Glu Asp Lys Lys Lys Ile Lys Asp Ile Tyr Gly Lys Asp Ala

            100                 105                 110

Leu Leu His Glu His Tyr Val Tyr Ala Lys Glu Gly Tyr Glu Pro Val

        115                 120                 125

Leu Val Ile Gln Ser Ser Glu Asp Tyr Val Glu Asn Thr Glu Lys Ala

    130                 135                 140

Leu Asn Val Tyr Tyr Glu Ile Gly Lys Ile Leu Ser Arg Asp Ile Leu

145                 150                 155                 160

Ser Lys Ile Asn Gln Pro Tyr Gln Lys Phe Leu Asp Val Leu Asn Thr

                165                 170                 175

Ile Lys Asn Ala Ser Asp Ser Asp Gly Gln Asp Leu Leu Phe Thr Asn

            180                 185                 190

Gln Leu Lys Glu His Pro Thr Asp Phe Ser Val Glu Phe Leu Glu Gln

        195                 200                 205

Asn Ser Asn Glu Val Gln Glu Val Phe Ala Lys Ala Phe Ala Tyr Tyr

    210                 215                 220

Ile Glu Pro Gln His Arg Asp Val Leu Gln Leu Tyr Ala Pro Glu Ala

225                 230                 235                 240

Phe Asn Tyr Met Asp Lys Phe Asn Glu Gln Glu Ile Asn Leu Val Asp

                245                 250                 255

Glu Val Lys Gln Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser Ser Ser

            260                 265                 270

Gln Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn Phe Gln Ala Pro

        275                 280                 285

Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp Leu Ser Ile Pro Ser Ser

    290                 295                 300

Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu Asn Gln Tyr Phe Gln Ser Ala Ile

305                 310                 315                 320

Trp Ser Gly Phe Ile Lys Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala

                325                 330                 335

Thr Ser Ala Asp Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gln Glu Val

            340                 345                 350

Ile Asn Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg

        355                 360                 365

Leu Tyr Gln Ile Lys Ile Gln Tyr Gln Arg Glu Asn Pro Thr Glu Lys

    370                 375                 380

Gly Leu Asp Phe Lys Leu Tyr Trp Thr Asp Ser Gln Asn Lys Lys Glu

385                 390                 395                 400

Val Ile Ser Ser Asp Asn Leu Gln Leu Pro Glu Leu Lys Gln Lys Ser

                405                 410                 415

Ser Asn Ser Arg Lys Lys Arg Ser Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro

            420                 425                 430

Asp Arg Asp Asn Asp Gly Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr

        435                 440                 445

Thr Val Asp Val Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp Ile Ser

    450                 455                 460

Asn Ile His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys Ser Ser Pro Glu

465                 470                 475                 480

Lys Trp Ser Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser Asp Phe Glu Lys Val Thr

                485                 490                 495

Gly Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser Pro Glu Ala Arg His Pro Leu Val

            500                 505                 510

Ala Ala Tyr Pro Ile Val His Val Asp Met Glu Asn Ile Ile Leu Ser

        515                 520                 525

Lys Asn Glu Asp Gln Ser Thr Gln Asn Thr Asp Ser Gln Thr Arg Thr

    530                 535                 540

Ile Ser Lys Asn Thr Ser Thr Ser Arg Thr His Thr Ser Glu Val His

545                 550                 555                 560

Gly Asn Ala Glu Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val

                565                 570                 575

Ser Ala Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val Ala Ile Asp His

            580                 585                 590

Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp Ala Glu Thr Met Gly Leu

        595                 600                 605

Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn Ile Arg Tyr Val Asn

    610                 615                 620

Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu Pro Thr Thr Ser Leu Val

625                 630                 635                 640

Leu Gly Lys Asn Gln Thr Leu Ala Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gln

                645                 650                 655

Leu Ser Gln Ile Leu Ala Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu

            660                 665                 670

Ala Pro Ile Ala Leu Asn Ala Gln Asp Asp Asp Ser Ser Thr Pro Ile

        675                 680                 685

Thr Met Asn Tyr Asn Gln Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gln Leu

    690                 695                 700

Arg Leu Asp Thr Asp Gln Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr Asn Phe

705                 710                 715                 720

Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn Trp Ser Glu Val

                725                 730                 735

Val Pro Gln Ile Gln Glu Thr Thr Ala Arg Ile Ile Phe Asn Gly Lys

            740                 745                 750

Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp

        755                 760                 765

Pro Leu Glu Thr Thr Lys Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys

    770                 775                 780

Ile Ala Phe Gly Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gln Tyr Gln Gly

785                 790                 795                 800

Lys Asp Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gln Gln Thr Ser Gln

                805                 810                 815

Asn Ile Lys Asn Gln Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile Tyr Thr

            820                 825                 830

Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn Ile Leu Ile Arg

        835                 840                 845

Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn Ile Ala Val Gly Ala Asp

    850                 855                 860

Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr

865                 870                 875                 880

Glu Gly Leu Leu Leu Asn Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser

                885                 890                 895

Gly Tyr Ile Val Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile

            900                 905                 910

Asn Asp Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gln Asp Gly

        915                 920                 925

Lys Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp Lys Leu Pro Leu Tyr

    930                 935                 940

Ile Ser Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn Val Tyr Ala Val Thr Lys Glu

945                 950                 955                 960

Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser Glu Asn Gly Asp Thr Ser Thr Asn Gly

                965                 970                 975

Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly

            980                 985                 990

Claims (4)

1.一种融合蛋白的编码基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2.一种融合蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

3.权利要求1所述的融合蛋白的编码基因在制备炭疽抗毒素和炭疽疫苗中的应用。

4.权利要求2所述的融合蛋白在制备炭疽抗毒素和炭疽疫苗中的应用。

Images