CN112851775A - 一种白喉毒素无毒突变体crm197蛋白、生产方法以及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及蛋白纯化领域，具体公开了一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的生产方法，包括以下步骤：S1、粗纯S1.1离心；S1.2超滤；S1.3一段盐析；S1.4二段盐析；S1.5粗蛋白储存；S2、精纯S2.1粗蛋白复溶；S2.2超滤；S2.3过Q膜；S2.4超滤；S2.5柱层析；S2.6超滤；S3、储存CRM197蛋白S3.1原液配制；S3.2原液储存：储存于‑70℃以下。本申请生产方法所制得的CRM197蛋白可用于作为载体蛋白的结合疫苗或联合疫苗的制备。通过本申请的生产方法可制备出高质量、高收率、高稳定性的CRM197蛋白。
Description
技术领域
本申请涉及蛋白纯化的领域，更具体地说，它涉及一种白喉毒素无毒突变体CRM197 蛋白、生产方法以及应用。
背景技术
CRM197是白喉毒素的无毒变异体，与天然白喉毒素相比，CRM197蛋白在结构上仅是A片段上第52位的甘氨酸残基被谷氨酸残基取代，从而使得其酶催化活性丧失，因而不能对细胞产生毒性作用；但由于其B片段的蛋白序列及结构未发生任何变化，没有毒性的CRM197蛋白仍然可与敏感细胞的受体结合。即CRM197蛋白在丧失酶活性及毒性的同时仍保留白喉毒素的免疫原性，且其与其它多种白喉毒素及变异体相比，具有完全无毒，完整性最高、突变最少、结构最接近，受体阻断能力最强的优点。因此CRM197成为一种理想的多 糖结合疫苗载体蛋白。
目前，采用现有的纯化方法对CRM197发酵液进行纯化，所得的蛋白纯度不高，因此亟需一种新的CRM197蛋白的纯化方法。
发明内容
为了提升CRM197发酵液纯化的蛋白纯度，本申请提供一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白、生产方法以及应用。
本申请提供的一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的生产方法，采用如下的技术方 案：
第一方面，本申请提供一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的生产方法，包括以下步骤：
S1粗纯
S1.1离心：将CRM197发酵液离心后收集上清液；
S1.2超滤：将上清液使用缓冲液超滤10-15次，收集超滤液；
S1.3一段盐析：按超滤液体积20-25％(W/V)比例加入硫酸盐，充分搅拌后离心收集一段盐 析液；
S1.4二段盐析：一段盐析液按超滤液体积20-25％(W/V)比例加入硫酸盐，充分搅拌离心收 集沉淀即为粗蛋白；
S1.5粗蛋白储存：置-20℃或以下冻存即可；
S2精纯
S2.1粗蛋白复溶：粗蛋白用缓冲液充分溶解，得到粗蛋白溶液；
S2.2超滤：将粗蛋白溶液过滤后用缓冲液经5-50KD膜包超滤10-15次，收集超滤液一；
S2.3过Q膜：将超滤液一滤过赛多利斯Sartobind Q膜,收集滤过液；
S2.4超滤：将滤过液用缓冲液经5-50KD膜包等体积超滤10-15次，收集超滤液二；
S2.5柱层析：超滤液二经阴离子柱层析纯化，收集洗脱液；
S2.6超滤：将洗脱液用注射用水经5-50KD膜包超滤超滤10-15次，得到蛋白超滤液，并检 测蛋白浓度；
S3储存CRM197蛋白
S3.1原液配制：蛋白超滤液中加入蔗糖和注射用水使蔗糖终浓度为4～7％；
S3.2原液储存：置于-70℃以下冻存即可。
通过采用上述技术方案，首先通过粗纯中的离心和超滤和去除细菌菌体、代谢产物以 及培养成分等，进一步一段盐析可去除部分杂蛋白，二段盐析用于沉淀目标蛋白，通过两段 盐析可大大提升蛋白收率和蛋白纯度。
其次，精纯中的超滤可去除盐同时置换缓冲体系；进一步通过Q膜去除部分杂质蛋白 和色素等杂质，柱层析则进一步纯化获取目标蛋白。
另外，通过本申请纯化的CRM197蛋白配制成CRM197蛋白原液，可直接冻存，相对真空干燥的储存方法，缩短了工艺，降低了能耗和生产成本，易于储存及后期使用；不采取真空冷冻干燥工艺，避免了蛋白冻干的损耗，提高了蛋白收率。
因此采用本申请的生产方法可大大提升CRM197发酵液纯化的蛋白纯度，蛋白收率以 及蛋白储存的长期稳定性。
优选的，S1.1离心中，采用7500rpm、20～40min、2～8℃离心。
通过采用上述技术方案，可进一步提升CRM197蛋白纯度和CRM197蛋白收率。
优选的，S1.3一段盐析和S1.4二段盐析中均采用7500rpm、15～30min、2～8℃离心。
通过采用上述技术方案，可进一步提升CRM197蛋白纯度和CRM197蛋白收率。
优选的，所述缓冲液为10mM PB、10mM PBS中的一种。
优选的，所述硫酸盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁中的一种或多种的组合物。
优选的，S2.2超滤中，粗蛋白溶液使用0.45μm滤膜澄清过滤。
通过采用上述技术方案，可进一步提升CRM197蛋白纯度和CRM197蛋白收率。
优选的，S3.1原液配制中，蔗糖终浓度为5％。
通过采用上述技术方案，使蛋白原液可直接冻存，并进一步提升CRM197蛋白的长期 稳定性。
优选的，S2.5柱层析中，采用DEAE SFF柱Q柱。
通过采用上述技术方案，吸附效果较好，提升蛋白纯度。
第二方面，本申请提供一种采用上述生产方法制得的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋 白。
第三方面，本申请提供上述白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白作为载体蛋白制备结合 疫苗或联合疫苗的应用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、由于本申请采用粗纯中通过两次盐析和超滤，精纯中通过Q膜、超滤以及阴离子柱层析 纯化，通过本发明的CRM197蛋白精纯方法，可获得高收率和高质量的CRM197蛋白原液。
2、本申请中优选采用本发明的配制和储存方法，可获得稳定性较高的CRM197蛋白原 液。
3、本申请的方法，通过直接冻存，缩短了工艺，降低了能耗和生产成本，易于储存及 后期使用，避免了蛋白冻干的损耗，提高了蛋白收率。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
原料与来源
CRM197发酵液由艾美卫信生物药业(浙江)有限公司生产；
PB由艾美卫信生物药业(浙江)有限公司生产；
PBS由艾美卫信生物药业(浙江)有限公司生产；
蔗糖由国药集团化学试剂有限公司生产；
硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁由国药集团化学试剂有限公司生产；
DEAE SFF柱和Q柱由bersee博尔西生产；
注射用水由艾美卫信生物药业(浙江)有限公司生产。
实施例
实施例1
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的生产方法，包括以下步骤：
S1粗纯
S1.1离心：将CRM197发酵液分装至离心杯中，采用7500rpm、20min、2℃离心后收集上清 液；
S1.2超滤：澄清过滤上清液后，使用30KD膜包浓缩至1/10体积后，使用10mM PB溶液超 滤15次，收集超滤液；
S1.3一段盐析：按超滤液体积25％(W/V)比例加入硫酸铵，充分搅拌后分装至离心杯中，采 用7500rpm、15min、2℃离心收集一段盐析液。
S1.4二段盐析：一段盐析液按超滤液体积20％(W/V)比例加入硫酸铵，充分搅拌后分 装至离心杯中，采用7500rpm、15min、2℃离心收集沉淀即为粗蛋白；
S1.5粗蛋白储存：置-20℃或以下冻存即可；
S2精纯
S2.1粗蛋白复溶：粗蛋白用10mM PBS充分溶解，得到粗蛋白溶液；
S2.2超滤：粗蛋白溶液用0.45μm滤膜澄清过滤，用10mM PBS经30KD膜包等体积超滤15 次，收集超滤液一；
S2.3过Q膜：将超滤液一滤过赛多利斯Sartobind Q膜,收集滤过液；
S2.4超滤：将滤过液用10mM PB经30KD膜包等体积超滤15次，收集超滤液二；
S2.5柱层析：超滤液二经DEAE SFF阴离子柱层析纯化，收集洗脱液，具体先用0.5M氢氧 化钠溶液以40mL/min洗柱2个CV；再用生理盐水以40mL/min洗柱3个CV；最后用6个 CV的10mMPB平衡至基线平稳。
上样，流速40mL/min，上样后再用10mM PB平衡，再用预洗液洗至基线平稳，最后用洗脱液洗脱，在280nm吸光值大于20mAU时开始收集样品，吸光值小于20mAU停止收 集；
S2.6超滤：将洗脱液用注射用水经30KD膜包超滤超滤10次，得到蛋白超滤液，并检测蛋白 浓度。
S3、储存CRM197蛋白
S3.1原液配制：根据检测结果计算超滤液蛋白含量，按蛋白含量：蔗糖为1：9加入蔗糖，并 补加注射用水使蔗糖终浓度为4％，得到CRM197蛋白原液。
S3.2原液储存：置于-70℃以下冻存即可。
本申请实施例1还提供一种采用实施例1所述的生产方法制得的白喉毒素无毒突变体 CRM197蛋白。
本申请实施例1还提供实施例1所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白作为载体蛋 白制备结合疫苗或联合疫苗的应用。
实施例2
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的生产方法，包括以下步骤：
S1粗纯
S1.1离心：将CRM197发酵液分装至离心杯中，采用7500rpm、30min、5℃离心后收集上清 液；
S1.2超滤：澄清过滤上清液后，使用5KD膜包将上清液浓缩至1/10体积后，使用10mM PBS 溶液超滤12次，收集超滤液。
S1.3一段盐析：按超滤液体积22％(W/V)比例加入硫酸钠，充分搅拌40min后分装至 离心杯中，采用7500rpm、20min、5℃离心收集一段盐析液。
S1.4二段盐析：一段盐析液按超滤液体积22％(W/V)比例加入硫酸钠，充分搅拌40min 后分装至离心杯中，采用7500rpm、20min、5℃离心收集沉淀即为粗蛋白；
S1.5粗蛋白储存：置-20℃或以下冻存即可；
S2、精纯
S2.1粗蛋白复溶：粗蛋白用10mM PB充分溶解，得到粗蛋白溶液；
S2.2超滤：粗蛋白溶液用0.45μm滤膜澄清过滤，用10mM PBS经5KD膜包等体积超滤12 次，收集超滤液一；
S2.3过Q膜：将超滤液一滤过赛多利斯Sartobind Q膜,收集滤过液；
S2.4超滤：将滤过液用10mM PBS经5KD膜包等体积超滤12次，收集超滤液二；
S2.5柱层析：超滤液二经DEAE SFF阴离子柱层析纯化，收集洗脱液；
具体先用0.5M氢氧化钠溶液以40mL/min洗柱2个CV；再用生理盐水以40mL/min洗柱3 个CV；最后用6个CV的10mMPB平衡至基线平稳。
上样，流速40mL/min，上样后再用10mM PB平衡，再用预洗液洗至基线平稳，最后用洗脱液洗脱，在280nm吸光值大于20mAU时开始收集样品，吸光值小于20mAU停止收 集；
S2.6超滤：将洗脱液用注射用水经5KD膜包超滤超滤12次，得到蛋白超滤液；
S3、储存CRM197蛋白
S3.1原液配制：根据检测结果计算蛋白超滤液的蛋白含量，按蛋白含量：蔗糖为1：9加入蔗 糖，补加注射用水使蔗糖终浓度为5％，得到CRM197蛋白原液；
S3.2原液储存：置于-70℃以下冻存即可。
本申请实施例2还提供一种采用实施例2所述的生产方法制得的白喉毒素无毒突变体 CRM197蛋白。
本申请实施例2还提供实施例2所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白作为载体蛋 白制备结合疫苗或联合疫苗的应用。
实施例3
一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的生产方法，包括以下步骤：
S1粗纯
S1.1离心：将CRM197发酵液分装至离心杯中，采用7500rpm、40min、8℃离心后收集上清 液；
S1.2超滤：澄清过滤上清液后，使用50KD浓缩至1/10体积后，使用10mM PB溶液超滤15 次；
S1.3一段盐析：按超滤液体积25％(W/V)比例加入硫酸镁，充分搅拌30min后分装至离心杯 中，采用7500rpm、30min、8℃离心收集一段盐析液。
S1.4二段盐析：一段盐析液按超滤液体积25％(W/V)比例加入硫酸镁，充分搅拌40min 后分装至离心杯中，采用7500rpm、30min、8℃离心收集沉淀即为粗蛋白。离心收集沉淀即 为粗蛋白；
S1.5粗蛋白储存：置-20℃或以下冻存即可；
S2、精纯
S2.1粗蛋白复溶：粗蛋白用10mM PBS充分溶解，得到粗蛋白溶液；
S2.2超滤：粗蛋白溶液用0.45μm滤膜澄清过滤，用10mM PBS经50KD膜包等体积超滤10 次，收集超滤液一；
S2.3过Q膜：将超滤液一滤过赛多利斯Sartobind Q膜,收集滤过液；
S2.4超滤：将滤过液用10mM PB经50KD膜包等体积超滤10次，收集超滤液二；
S2.5柱层析：超滤液二经DEAE SFF阴离子柱层析纯化，收集洗脱液；
具体先用0.5M氢氧化钠溶液以40mL/min洗柱2个CV；再用生理盐水以40mL/min洗柱3 个CV；最后用6个CV的10mMPB平衡至基线平稳。
上样，流速40mL/min，上样后再用10mM PB平衡，再用预洗液洗至基线平稳，最后用洗脱液洗脱，在280nm吸光值大于20mAU时开始收集样品，吸光值小于20mAU停止收 集；
S2.6超滤：将洗脱液用注射用水经50KD膜包超滤超滤15次，得到蛋白超滤液。
S3、储存CRM197蛋白
S3.1原液配制：根据检测结果计算蛋白超滤液的蛋白含量，按蛋白含量：蔗糖为1：9加入蔗 糖，补加注射用水使蔗糖终浓度为7％，得到CRM197蛋白原液。
S3.2原液储存：置于-70℃以下冻存即可。
实施例4
与实施例1的区别在于，S2.5柱层析：超滤液二经Q阴离子柱层析纯化，收集洗脱液。
实施例5
与实施例1的区别在于，S3.1原液配制中，补加注射用水使蔗糖终浓度为10％。
实施例6
与实施例1的区别在于，S3.1原液配制中，补加注射用水使蔗糖终浓度为3％。
实施例7
与实施例1的区别在于，S1.1离心中，采用7500rpm、10min、1℃离心。
实施例8
与实施例1的区别在于，S1.1离心中，采用7500rpm、45min、9℃离心。
实施例9
与实施例1的区别在于，S1.3一段盐析和S1.4二段盐析中均采用7500rpm、10min、1℃离心。
实施例10
与实施例1的区别在于，S1.3一段盐析和S1.4二段盐析中均采用7500rpm、10min、1℃离心。
对比例
对比例1
与实施例1的区别在于去除步骤S2.3过Q膜。
对比例2
与实施例1的区别在于去除步骤S1.3一段盐析。
对比例3
与实施例1的区别在于CRM197蛋白原液采用冻干保存。
性能检测试验
一、产率检测
产率以最终纯化后收获的蛋白含量mg/粗纯发酵液体积L来进行评价，具体结果见表1；
其中，蛋白含量检测：按照《中国药典》三部，附录ⅥB第二法进行检测。
二、质量检测
1)鉴别试验：采用《中国药典》现行版通则3403方法进行；
检测标准为：应与白喉类毒素免疫血清形成明显的沉淀线；
2)蛋白纯度：使用液相色谱仪；
检测标准为：＞90％；
3)细菌内毒素：采用《中国药典》现行版通则1143方法进行；
检测标准为：蛋白含量≤5EU/μg；
4)无菌试验：采用《中国药典》现行版通则1101方法进行；
检测标准为：合格；
检测结果见表2。
三、稳定性检测
1)反复冻融试验：取储存于-70℃以下的原液，放置室温，缓慢自行溶解，直至全部溶化， 再将融化后的原液置于-70℃以下，重复冻融三次。
检测标准为：反复冻融后的蛋白纯度＞90％；
检测结果见表3-4
2)长期稳定性考察实验结果：经-70℃以下储存后的CRM197蛋白原液，经长期稳定性试验 考察，观察主要质量标准蛋白纯度的变化趋势。
检测结果见表5
检测结果分析
表1产率检测结果表
表2质量检测结果表
表3实施例1-4反复冻融试验结果试验表
表4实施例5-8反复冻融试验结果试验表
表5实施例9-10和对比例1-2反复冻融试验结果试验表
表6长期稳定性考察实验结果表
从以上数据可以看出，实施例1-10所得的蛋白原液蛋白纯度均高于92％，同时蛋白收率均高 于69％。对比例1-2所得的蛋白原液由于含有杂质蛋白，因此蛋白收率较高，但蛋白纯度大 大降低。
对比例3采用冻干的储存方法，所得的蛋白原液蛋白收率与实施例1-10所得的蛋白原 液接近，但是由于冻干工艺中的蛋白损耗，导致蛋白纯度较低。因此采用本申请的蛋白原液 的储存方法，可在保持较高蛋白收率以及提高蛋白纯度的同时大大节省工艺流程，降低能耗 和生产成本。
实施例1-10的蛋白原液进行24个月长期稳定性考察后，主要质量标准蛋白纯度虽略 有下降，但仍高于90％，符合质量标准(企业注册申请制定的标准)；在各长期考察时间点中， 实施例1-10的蛋白原液经反复冻溶3次后检测，其主要质量标准蛋白纯度虽略有下降，但亦 高于90％，符合质量标准(企业注册申请制定的标准)。因此，基本可以确定经本发明制备的 CRM197蛋白原液的有效期不少于24个月。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在 阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的 权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (10)
1.一种白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1粗纯
S1.1离心：将CRM197发酵液离心后收集上清液；
S1.2超滤：将上清液使用缓冲液超滤10-15次，收集超滤液；
S1.3一段盐析：按超滤液体积20-25%（W/V)比例加入硫酸盐，充分搅拌后离心收集一段盐析液；
S1.4二段盐析：一段盐析液按超滤液体积20-25%（W/V)比例加入硫酸盐，充分搅拌离心收集沉淀即为粗蛋白；
S1.5粗蛋白储存：置-20℃或以下冻存即可；
S2精纯
S2.1粗蛋白复溶：粗蛋白用缓冲液充分溶解，得到粗蛋白溶液；
S2.2超滤：将粗蛋白溶液过滤后用缓冲液经5-50KD膜包超滤10-15次，收集超滤液一；
S2.3过Q膜：将超滤液一滤过赛多利斯Sartobind Q膜,收集滤过液；
S2.4超滤：将滤过液用缓冲液经5-50KD膜包等体积超滤10-15次，收集超滤液二；
S2.5柱层析：超滤液二经阴离子柱层析纯化，收集洗脱液；
S2.6超滤：将洗脱液用注射用水经5-50KD膜包超滤超滤10-15次，得到蛋白超滤液，并检测蛋白浓度；
S3储存CRM197蛋白
S3.1原液配制：蛋白超滤液中加入蔗糖和注射用水使蔗糖终浓度为4～7%；
S3.2原液储存：置于-70℃以下冻存即可。
2.据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，S1.1离心中，采用7500rpm、20～40min、2～8℃离心。
3.权利要求1所述的生产方法，其特征在于，S1.3一段盐析和S1.4二段盐析中均采用7500rpm、15～30min、2～8℃离心。
4.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述缓冲液为10mM PB、10mM PBS中的一种。
5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述硫酸盐为硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁中的一种或多种的组合物。
6.据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，S2.2超滤中，粗蛋白溶液使用0.45μm滤膜澄清过滤。
7.据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，S3.1原液配制中，蔗糖终浓度为5%。
8.据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，S2.5柱层析中，采用DEAE SFF柱或Q柱。
9.一种采用如权利要求1-8任一项所述的生产方法制得的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白。
10.如权利要求9所述的白喉毒素无毒突变体CRM197蛋白作为载体蛋白制备结合疫苗或联合疫苗的应用。
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