CN102127165A - 一种从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-I的生产工艺 - Google Patents

一种从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-I的生产工艺 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从血浆组分四中纯化得到高纯ApoA-I的方法，包括下列步骤：血浆组分四沉淀溶解，离心除去硅藻土及杂质，收集上清液；上清液加入氯化钠使ApoA-I蛋白凝聚析出，离心获得ApoA-I沉淀；复溶ApoA-I沉淀并过滤；滤液先后经阴离子柱层析及疏水柱层析，分离获得高纯的ApoA-I溶液。本发明的方法工艺制备的ApoA-I具有很高的纯度，纯度可达95％以上，ApoA-I得率可达70％，且操作安全方便，容易实现工艺放大，非常适合工业化生产。

Description

一种从血浆组分四沉淀中制备高纯ApoA-I的生产工艺
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种从血浆组分四沉淀中制备高纯度载脂蛋白ApoA-I的生产工艺。
背景技术
载脂蛋白A-I(Apolipoprotein A-I，ApoA-I)是高密度脂蛋白(High DensityLipoprotein，HDL)的主要载脂蛋白，为单一多肽链，由243个氨基酸残基组成，分子量28.3kD。HDL主要功能是参与胆固醇逆向转运(Reverse Cholesterol Transport，RCT)，将外周组织细胞中的胆固醇移出并转运至肝脏转化清除，因而具有对抗动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)发生及发展的重要作用，而ApoA-I是HDL抗AS功能的主要承担者。同时，ApoA-I也具有抗炎抗内毒素的功能，因此是脂类代谢研究重点之一。另外，由于ApoA-I具有肝脏靶向作用的特点，在靶向药物研究中也有良好的应用前景。
目前ApoA-I的常用制备方法有超速离心法、有机溶剂沉淀法和高效液相色谱法等，虽能得到高纯度ApoA-I，但具有一些很明显的缺点：①制备量小，不适于工业生产；②蛋白得率低，经超离心、有机溶剂沉淀、柱层析等多步处理，在制备过程中损失了大部分ApoA-I；③成本高，需要超速离心机等贵重仪器；④安全性差，乙醇、丙酮、三氯乙酸，尿素等有机溶剂，不仅具有生理毒性，有的还易燃易爆，不利与安全生产。
另一方面，血浆组分四是人血浆经Cohn低温乙醇法处理后的剩余部分，因不能利用而被丢弃，其主要蛋白成分是白蛋白和β脂蛋白。目前尚无以血浆组分四为原料制备ApoA-I的相关报道。
发明内容
本发明的目的是以目前尚未被充分利用的人血浆组分四沉淀为原料，提供一种工序简单，操作方便，生产周期短，得率高，适用于工业化大规模生产的高纯载脂蛋白ApoA-I纯化工艺，使血浆资源得到更充分的利用。本发明制备的产品可用于治疗动脉粥状硬化等心脑血管疾病。
本发明根据ApoA-I的理化特性，通过调解悬浮液的酸度与离子强度获得合适的分离条件，离心获得富含ApoA-I的蛋白沉淀，然后复溶沉淀，先后经阴离子交换及疏水层析柱，选用合适的上样与洗脱条件，实现ApoA-I与杂蛋白的高效分离，达到了纯化目的。
本发明通过两步离心加两步柱层析法从血浆组分四沉淀中制备高纯度ApoA-I。本发明技术方案的关键点在于在合适的条件下分离并离心获得富含ApoA-I蛋白的沉淀并以两步柱层析纯化ApoA-I。在离心步骤中，获得富含ApoA-I的蛋白沉淀。在离子交换层析步骤中，选择合适的上柱条件，ApoA-I与杂蛋白被一起结合到层析柱上，然后以合适的缓冲液洗脱除去其中大部分杂蛋白，再用浓氯化钠溶液洗脱层析柱获得初步纯化的ApoA-I，然后上疏水柱，部分杂蛋白随流穿液除去，然后用合适的缓冲液进一步洗脱除去残留杂蛋白，最后用WFI或碱性溶液洗脱疏水柱，最终获得高纯ApoA-I蛋白溶液。
本发明提出的ApoA-I生产工艺流程参见附图1
本发明的从组分四中纯化得到高纯ApoA-I的方法，包括下列步骤：
(1)血浆组分四用pH8.00-10.00的缓冲液溶解，离心除去硅藻土及杂质，收集上清液；
(2)上清液加入氯化钠使ApoA-I蛋白凝聚析出，离心获得ApoA-I沉淀；
(3)复溶ApoA-I沉淀并过滤；
(4)步骤(3)的滤液先后经阴离子柱层析及疏水柱层析，分离获得纯化的ApoA-I溶液。所述纯化的ApoA-I溶液中，ApoA-I纯度达95％以上。
获得高纯的ApoA-I蛋白溶液后可采用常规方法经透析、浓缩、病毒灭活及灌装或冻干等步序后制成液体制剂或冻干为粉剂。
所述步骤(1)中，可将组分四低温(0～8℃)溶解于pHg.00-10.00的醋酸钠缓冲液，充分搅拌使之充分溶解。离心可除去硅藻土及不溶性杂质。
所述步骤(2)中，氯化钠在溶液中的浓度为1-3wt％，然后调解pH值至6.0-6.5，降温至-1-1℃，使ApoA-I蛋白凝聚析出。
所述步骤(3)可采用低温(0-10℃)的pH值为8.0-9.0的WFI(注射用水)或1-3wt％的氯化钠溶液复溶ApoA-I沉淀。然后用0.45μm的滤膜过滤。
所述步骤(4)中，所述阴离子柱层析采用DEAE阴离子层析柱，所述疏水柱层析采用butyl疏水柱。
进一步的，阴离子柱层析的步骤为：调整ApoA-I滤液的pH至5.3-5.7，离子强度为15-25mM后上DEAE阴离子层析柱，然后用低离子强度缓冲液洗脱DEAE层析柱后，再用高盐洗脱液洗脱层析柱，收集的高盐洗脱液获得初步纯化的ApoA-I洗脱液。所述低离子强度缓冲液优选pH5.00-5.10离子强度为15-25mM的Tris缓冲液。所述高盐洗脱液优选0.9-1.1M的氯化钠水溶液。
疏水柱层析的步骤为：调整初步纯化的ApoA-I洗脱液的pH至7.8-8.2后上butyl疏水柱，而后用低盐洗脱液进一步洗脱除去残留杂蛋白，最后用WFI或碱性溶液洗脱疏水柱得到ApoA-I蛋白溶液。所述低盐洗脱液优选0.01-0.05M的Tris缓冲液。所述碱性溶液优选pH10.30-11.30的NaOH水溶液。
本发明的特点：
(1)该工艺制备ApoA-I具有很高的纯度，纯度可达95％以上，ApoA-I得率可达70％。
(2)制备过程不涉及有机溶剂，操作安全方便
(3)中试结果表明，离心与柱层析结合纯化ApoA-I，很容易实现工艺放大，非常适合工业化生产。
附图说明
图1：人血浆载脂蛋白ApoA-I生产工艺流程框图
图2：DEAE阴离子柱层析的SDS-PAGE电泳结果图
图中：7为上样液蛋白条带，3为流穿液蛋白条带，2低分子量标准蛋白，1为杂蛋白洗脱液条带；4，5，6为目标蛋白洗脱液条带，箭头所指蛋白条带为ApoA-I
图3：Butyl柱层析的SDS-PAGE电泳结果图
图中：1为DEAE柱层析ApoA-I蛋白洗脱液，2低分子量标准蛋白；3，4，5，6，7，8为Butyl柱层析纯化得到的目标蛋白条带；箭头所指蛋白条带为ApoA-I
图4：western blot结果图
图中：0为白蛋白，1-6分别对应1.0ug(实施例1)，0.25ug(实施例1)，0.0625ug(实施例2)，1ug(实施例2)，0.25ug(实施例3)，0.0625ug(实施例3)纯化后的ApoA-I蛋白，7、8分别对应1.0ul和0.25ul的血浆组分四溶液
一抗：抗ApoA-I羊抗，calbiochem Cat#：178463，1∶2000
二抗：驴抗羊二抗，1∶5000
具体实施方式
以下列举具体实例以进一步阐述本发明，应理解，实例并非用于限制本发明的保护范围。
实施例1：ApoA-I样品制备
(1)血浆组分四沉淀溶解及预处理
称取组分四沉淀5千克(湿重)，溶于45千克醋酸钠缓冲液(控制温度为0～8℃)中，调pH值约9.00左右，充分搅拌使之溶解，然后用贝克曼离心机(7000rpm)除去硅藻土及不溶物，收集离心上清液。
(2)离心获得ApoA-I沉淀
在上清液中加入氯化钠使其浓度达到2wt％左右，然后调节pH值至6.0-6.5，降温至-1-1℃，使ApoA-I凝聚析出。高速离心，收集ApoA-I沉淀约500g，弃上清液。
(3)复溶ApoA-I沉淀
将ApoA-I沉淀500g充分溶解于5kg约5℃的2wt％的氯化钠溶液中，然后用0.45μm滤膜过滤。
(4)柱层析
用醋酸-醋酸钠溶液调整ApoA-I滤液的pH为5.3-5.7，离子强度为20mM，以120cm/h线流速上DEAE阴离子层析柱(DEAE阴离子层析柱体积3升，层析填料为DEAE SepharoseFF)，ApoA-I与杂蛋白结合到层析柱上，部分杂蛋白流穿。然后用pH5.10，离子强度为20mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱DEAE层析柱，大部分杂蛋白被洗脱下来；再用高浓度氯化钠溶液(1.0M左右)洗涤DEAE层析柱，收集得到初步纯化的ApoA-I蛋白溶液；将收集的高盐洗脱液用0.1NNaOH溶液调pH值约8.0后上butyl疏水柱，部分杂蛋白随流穿液除去，后用低盐洗脱液(0.02M的Tris缓冲液)进一步洗脱柱子，除去残留杂蛋白，最后用pH10.30的NaOH水溶液)洗脱疏水柱得到ApoA-I蛋白溶液。经SDS-PAGE电泳检测，获得了纯度为95％以上，分子量为28KD的ApoA-I。获得的蛋白经免疫浊度法测定及western blot测定(见附图4)，结合肝细胞试验验证具有ApoA-I的细胞结合活性，最终确认获得的蛋白即为ApoA-I蛋白。
(5)ApoA-I洗脱液后处理
洗脱下来的ApoA-I经millipore pilot system超滤浓缩，用缓冲液进行透析，然后浓缩至7％(7g/100ml)左右，加甘露醇至5wt％或蔗糖至10wt％，调蛋白浓度至5wt％并调pH值至7.00。
(6)巴氏病毒灭活
将以上溶液在60℃下保温10小时，完成病毒灭活处理。
(7)除菌过滤及灌装
经病毒灭活后的溶液进行除菌过滤，计算Apo A-I得率为70％(获得的ApoA-I与原料血浆组分四中ApoA-I的重量比)。按一定规格进行灌装，即制成ApoA-I液体针剂。
实施例2
ApoA-I样品制备
(1)血浆组分四沉淀溶解及预处理
称取组分四沉淀3千克(湿重)，溶于醋酸钠缓冲液(控制温度为0～8℃)中，调pH值为8.00，充分搅拌使之溶解，然后7000rpm离心除去硅藻土及不溶物，收集离心上清液。
(2)离心获得ApoA-I沉淀
在上清液中加入氯化钠使其浓度达到1wt％，然后调节pH值至6.0-6.5，降温至-1-1℃，使ApoA-I凝聚析出。高速离心，收集ApoA-I沉淀约300g，弃上清液。
(3)复溶ApoA-I沉淀
将ApoA-I沉淀300g充分溶解于0℃的1wt％的氯化钠溶液中，然后用0.45μm滤膜过滤。
(4)柱层析
用醋酸-醋酸钠溶液调整ApoA-I滤液的pH为5.3-5.7，离子强度为15mM，以120cm/h线流速上DEAE阴离子层析柱，ApoA-I与杂蛋白结合到层析柱上，部分杂蛋白流穿。然后用pH5.10左右，离子强度约为15mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱DEAE层析柱，大部分杂蛋白被洗脱下来；再用0.9M的氯化钠溶液洗涤DEAE层析柱，收集得到初步纯化的ApoA-I蛋白溶液；将收集的高盐洗脱液用0.1NNaOH溶液调pH值7.8后上butyl疏水柱，部分杂蛋白随流穿液除去，后用低盐洗脱液(0.01M的Tris缓冲液)进一步洗脱柱子，除去残留杂蛋白，最后用pH11.30的NaOH水溶液洗脱疏水柱得到ApoA-I蛋白溶液。经SDS-PAGE电泳检测，获得了纯度为95％以上，分子量为28KD的ApoA-I。获得的蛋白经免疫浊度法测定及westernblot测定(见附图4)，结合肝细胞试验验证具有ApoA-I的细胞结合活性，最终确认获得的蛋白即为ApoA-I蛋白。
(5)后处理同实施例1，最终获得ApoA-I得率为73％。
实施例3
ApoA-I样品制备
(1)血浆组分四沉淀溶解及预处理
称取组分四沉淀6千克(湿重)，溶于醋酸钠缓冲液(控制温度为0～8℃)中，调pH值为10.00，充分搅拌使之溶解，然后用7000rpm离心除去硅藻土及不溶物，收集离心上清液。
(2)离心获得ApoA-I沉淀
在上清液中加入氯化钠使其浓度达到3wt％，然后调节pH值至6.0-6.5，降温至-1-1℃，使ApoA-I凝聚析出。高速离心，收集ApoA-I沉淀约600g，弃上清液。
(3)复溶ApoA-I沉淀
将ApoA-I沉淀600g充分溶解于10℃左右的3wt％的氯化钠溶液中，然后用0.45μm滤膜过滤。
(4)柱层析
用醋酸-醋酸钠溶液调整ApoA-I滤液的pH为5.3-5.7，离子强度为25mM，以120cm/h线流速上DEAE阴离子层析柱(DEAE阴离子层析柱体积3升，层析填料为DEAE SepharoseFF)，ApoA-I与杂蛋白结合到层析柱上，部分杂蛋白流穿。然后用pH5.00，离子强度为25mM的醋酸-醋酸钠缓冲溶液洗脱DEAE层析柱，大部分杂蛋白被洗脱下来；再用高浓度氯化钠溶液(1.0M左右)洗涤DEAE层析柱，收集得到初步纯化的ApoA-I蛋白溶液；将收集的高盐洗脱液用0.1NNaOH溶液调pH值约8.0后上butyl疏水柱，部分杂蛋白随流穿液除去，后用低盐洗脱液(0.05M的Tris缓冲液)进一步洗脱柱子，除去残留杂蛋白，最后用WFI洗脱疏水柱得到ApoA-I蛋白溶液。经SDS-PAGE电泳检测，获得了纯度为95％以上，分子量为28KD的ApoA-I。获得的蛋白经免疫浊度法测定及western blot测定(见附图4)，结合肝细胞试验验证具有ApoA-I的细胞结合活性，最终确认获得的蛋白即为ApoA-I蛋白。
(5)后处理同实施例1，最终获得ApoA-I得率为71％。

Claims (9)

1.一种从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，包括下列步骤：
1)血浆组分四用pH8.00-10.00的缓冲液溶解，离心除去硅藻土及杂质，收集上清液；
2)上清液加入氯化钠使ApoA-I蛋白凝聚析出，离心获得ApoA-I沉淀；
3)复溶ApoA-I沉淀并过滤；
4)步骤3的滤液先后经阴离子柱层析及疏水柱层析，分离获得纯化的ApoA-I溶液。
2.如权利要求1所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，所述步骤1中，血浆组分四溶解的方法为将血浆组分四在0-8℃下溶解于pH8.00-10.00的醋酸钠缓冲液中。
3.如权利要求1所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，所述步骤2中，加入氯化钠使ApoA-I蛋白凝聚析出的方法为：加入氯化钠至氯化钠在溶液中的浓度为1-3wt％，调节pH值至6.0-6.5，降温至-1-1℃，使ApoA-I蛋白凝聚析出。
4.如权利要求3所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，步骤3中用于复溶ApoA-I的复溶液为注射用水或1-3wt％的氯化钠水溶液，复溶液的pH值为8.0-9.0，温度为0-10℃。
5.如权利要求4所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，所述步骤3复溶后的溶液采用0.45μm的滤膜过滤。
6.如权利要求1-5任一权利要求所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，步骤4中，所述阴离子柱层析采用DEAE阴离子层析柱，所述疏水柱层析采用butyl疏水柱。
7.如权利要求6所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，
所述阴离子柱层析的步骤为：调整ApoA-I滤液的pH至5.3-5.7，离子强度为15-25mM后上DEAE阴离子层析柱，然后用低离子强度缓冲液洗脱DEAE层析柱后，再用高盐洗脱液洗脱层析柱，获得初步纯化的ApoA-I洗脱液；
所述疏水柱层析的步骤为：调整初步纯化的ApoA-I洗脱液的pH至7.8-8.2后上butyl疏水柱，而后用低盐洗脱液进一步洗脱除去残留杂蛋白，最后用注射用水或碱性溶液洗脱疏水柱得到ApoA-I蛋白溶液。
8.如权利要求7所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，所述低离子强度缓冲液为pH5.00-5.10离子强度为15-25mM的Tris缓冲液；所述高盐洗脱液为0.9-1.1M的氯化钠水溶液；所述低盐洗脱液为0.01-0.05M的Tris缓冲液；所述碱性溶液为pH10.3-11.30的NaOH水溶液。
9.如权利要求1-8中任一权利要求所述从血浆组分四中纯化得到ApoA-I的方法，其特征在于，获得高纯的ApoA-I蛋白溶液后采用常规方法经透析、浓缩、病毒灭活及灌装或冻干步序后制成液体制剂或冻干为粉剂。
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