CN108977423A - 一种从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法 - Google Patents

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张凌晶
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    • C12Y304/17023—Angiotensin-converting enzyme 2 (3.4.17.23)

Abstract

本发明涉及物质分离提纯领域，公开了一种从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法，包括：(1)盐析：将猪肺溶于第一缓冲液中，组织均浆后加入促渗剂，搅拌、过滤、滤液离心，往所得上清液中加入盐至终浓度为0.2～0.5mol/L，混匀、离心，所得沉淀S1用含盐的第二缓冲液溶解，离心，所得沉淀S2用第三缓冲液溶解，离心，并将所得上清液用10kDa分子量截留的透析袋在第四缓冲液中进行透析以脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白，并用0.1wt％的硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀即表示透析完成，得到透析母液；(2)阴离子吸附分离。本发明采用特定的盐析技术结合阴离子交换柱层析两步即可获得高纯度(银染级别的电泳纯)的血管紧张素转化酶，分离效果好，工艺简单，耗时短，极具工业应用前景。

Description

一种从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法
技术领域
本发明属于物质分离提纯领域，具体涉及一种从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法。
背景技术
随着我国经济的快速发展和人们生活习惯的改变，慢性非传染性疾病已成为影响人民健康的公共卫生问题。高血压是患病率较高的慢性病之一，其致残、致死率高，且严重消耗医疗社会资源，其病理较为复杂，基础研究对于其防治开展至关重要。高血压病理基础中，血管紧张素及缓激肽在肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)对血压稳态调节具有重要作用，同时激肽释放酶-激肽系统(kallikrein kinin system，KKS)与之关系密切，协同调节血压。
在RAS系统中，血管紧张素转化酶(ACE)是最为重要的调控酶。ACE广泛存在于哺乳动物不同组织中，其中肺毛细血管内皮细胞ACE活性最高。ACE可将无活力的血管紧张素I(AngI)转化为能使血管收缩的血管紧张素II(AngII)，同时将缓激肽降解为无活性的片段，是高血压治疗药物筛选中的关键酶。
商品化ACE价格昂贵，不利于ACE抑制肽研究的顺利进行，且目前ACE的分离纯化主要采用硫酸铵分级沉淀，亲和层析，离子交换柱层析，羟基磷灰石柱层析，凝胶过滤层析相结合的方法进行，获得的ACE的纯度不够高，分离提纯过程繁琐，操作复杂，耗时长，且成本高。
发明内容
本发明的发明人经过深入研究之后发现，相比与采用硫酸铵盐析相比，采用金属氯化物盐析能够加快纯化速度，耗时短，盐的用量少，成本低且所得粗酶液中含有更少的杂蛋白及更高纯度的目的蛋白，进一步将该特定的盐析技术结合阴离子交换柱层析两步即可获得高纯度(银染级别的电泳纯)的血管紧张素转化酶，基于此，完成了本发明。
具体地，本发明提供的从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法包括：
(1)盐析：将猪肺溶于第一缓冲液中，组织均浆后加入促渗剂，并在0～10℃下搅拌0.5～2h，过滤、滤液离心，往所得上清液中加入盐至终浓度为0.2～0.5mol/L，混匀、离心，所得沉淀S1用含盐的第二缓冲液溶解，离心，所得沉淀S2用第三缓冲液溶解，离心，并将所得上清液用10kDa分子量截留的透析袋在第四缓冲液中进行透析以脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白，并用0.1wt％的硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀即表示透析完成，得到透析母液；所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液各自独立地为弱碱性缓冲液，所述促渗剂为能够促进猪肺组织中的蛋白渗透至第一缓冲液中的溶剂，加入上清液中的盐以及第二缓冲液中的盐各自独立地为金属氯化物；
(2)吸附分离：将所述透析母液泵入填装有功能团为二乙胺基乙基的阴离子交换树脂的吸附柱中进行树脂吸附，吸附完成后采用解吸液进行淋洗解吸，所述解吸液为能够将血管紧张素转化酶从所述阴离子交换树脂上洗脱下来且不能够将杂质从所述阴离子交换树脂上洗脱下来的溶剂，收集洗脱液。
所述猪肺一般为清洗干净，去除肺官及外层膜组织之后的猪肺。根据本发明的一种优选实施方式，所述从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法还包括盐析之前的原料预处理步骤：将猪肺清洗干净，去除肺官及外层膜组织，于-25℃～0℃下冷冻至猪肺组织充分冷却，此时，能够进一步提高血管紧张素转化酶的纯度和收率。
所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液可以相同，也可以不同，可以为现有的各种弱碱性缓冲剂，具体可以各自独立地为Tris-HCL缓冲液和/或磷酸盐缓冲液。此外，为了获得更高的纯度和收率，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液均优选为预冷后缓冲液，其温度优选各自独立地为0～10℃。所述猪肺与第一缓冲液的用量比优选为1:2～1:6m/v。所述沉淀S1与第二缓冲液的用量比优选为1:2～1:6m/v。所述沉淀S2与第三缓冲液的用量比优选为1:2～1:6m/v。需要说明的是，在本文中，除非有特别说明，否则涉及到猪肺与其他物质之间的用量之比时，所述猪肺的用量均指溶于第一缓冲液中猪肺的用量。
所述促渗剂可以为现有的各种能够促进猪肺组织中的蛋白渗透至第一缓冲液中的溶剂，优选选自聚乙二醇辛基苯基醚(Triton x-100)、乙基苯基聚乙二醇(Nonidet-P40)、n-正辛基-β-D-葡萄糖苷(1-O-n-octyl-β-D-glucopyranoside)中的至少一种，特别优选为Triton x-100。其中，聚乙二醇辛基苯基醚的数均分子量可以为500～800，所述乙基苯基聚乙二醇的数均分子量可以为500～1000，所述n-正辛基-β-D-葡萄糖苷的数均分子量可以为250～600。
所述猪肺与促渗剂的用量比优选为10:1～50:1v/v。
加入上清液中的盐以及第二缓冲液中的盐优选各自独立地为氯化钠和/或氯化钾。所述第二缓冲液中盐的浓度优选为0.1～0.5mol/L。
所述解吸液可以为现有的各种能够将血管紧张素转化酶从阴离子交换树脂上洗脱下来且不能够将杂质从阴离子交换树脂上洗脱下来的溶剂，例如可以为含盐的Tris-HCL缓冲液和/或含盐的磷酸盐缓冲液。所述解吸的方式优选为采用含不同盐浓度的Tris-HCL缓冲液进行梯度淋洗解吸，且在梯度淋洗解吸的过程中，所述Tris-HCL缓冲液中盐的浓度逐渐升高，此时能够利用阴离子交换树脂对ACE的结合强度在不同盐浓度中有明显变化的原理达到将ACE和杂蛋白有效分离的效果，获得高纯度的ACE。在具体操作过程中，可以采用由不含NaCl的Tris-HCL缓冲液和含0.2～0.5mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液混合组成的线性梯度解吸液进行梯度解吸，在梯度解吸过程中，不含NaCl的Tris-HCL缓冲液所占的比例逐渐减少，而含0.2～0.5mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液所占的比例逐渐增大，即，采用不含NaCl的Tris-HCL缓冲液和含0.2～0.5mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液的混合溶液进行洗脱，在梯度洗脱过程中，Tris-HCL缓冲液的NaCl浓度逐渐升高，最后过渡为采用含0.2～0.5mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液进行洗脱。
根据本发明的另一种优选实施方式，该方法还包括在所述吸附完成之后、解吸之前，采用碱性缓冲液冲洗吸附柱至280nm下的吸光度到基线，此时能够获得更高的ACE纯度。其中，所述碱性缓冲液可以为Tris-HCL缓冲液和/或磷酸盐缓冲液，特别优选为Tris-HCL缓冲液。
根据本发明的一种具体实施方式，从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法包括：
①预处理：将猪肺洗净并去除肺官及外层膜组织，之后冷冻至组织充分冷却；
②盐析：将经预处理后的猪肺按照1:2～1:6m/v的比例溶于已预冷的Tris-HCL缓冲液中，组织均浆后加入聚乙二醇辛基苯基醚，0～10℃条件下缓慢搅拌0.5～2h，四层纱布过滤、滤液离心，往所得上清液中加入固体NaCl至终浓度为0.2～0.5mol/L，混匀、离心，所得沉淀S1用已预冷的含NaCl的Tris-HCL缓冲液溶解，离心，所得沉淀S2溶解于已预冷的Tris-HCL缓冲液中，0～10℃条件下缓慢搅拌12～24h，离心，然后将所得上清液用10kDa分子量截留的透析袋在Tris-HCL缓冲液中进行透析以脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白，所述透析过程中更换4～6次透析液，并用0.1wt％硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀即表示透析完成，得到透析母液；
③吸附分离：将所述透析母液泵入填装有功能团为二乙胺基乙基的阴离子交换树脂吸附柱中，控制流速为0.5～2mL/min，吸附完成后采用0.01～0.05mol/L Tris-HCL缓冲液充分淋洗吸附柱至280nm下的吸光度到基线；
④解吸：吸附完成后的树脂采用由不含NaCl的0.01～0.05mol/L Tris-HCL缓冲液和含0.2～0.5mol/L NaCl的0.01～0.05mol/L Tris-HCL缓冲液混合组成的线性梯度解吸液淋洗解吸，收集洗脱液。
根据本发明的一种具体实施方式，从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法还包括树脂再生步骤：解吸后的阴离子交换树脂先用0.5～5mol/L的NaCl溶液淋洗1～5小时，再将阴离子交换树脂拆下，在0.05～0.2mol/L的NaOH溶液中浸泡0.1～2小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，这样能够使得阴离子交换树脂被重新利用，节约成本。
本发明的有益效果如下：
(1)本发明在制备ACE粗酶液时选用了金属氯化物(如氯化钠)盐析。与用量大、耗时长、成本高的传统硫酸铵盐析相比，金属氯化物盐析用量少，耗时短，成本低且粗酶液中含有更少量的杂蛋白及更高纯度的目的蛋白。
(2)本发明采用特定的方式进行盐析，透析除盐，获得纯度较高的ACE粗酶液，然后利用阴离子交换柱层析方法，快速有效地将ACE和杂质蛋白进行有效分离，所得ACE纯度即可达到银染级别的电泳纯，实现了ACE的快速有效分离纯化，具有工艺简单，分离效果好的优点，大大简化了原来需要进行多次柱层析的纯化步骤。
附图说明
图1是DEAE-Sepharose阴离子交换柱的层析图；
图2是纯化ACE的SDS-PAGE电泳图，其中，M为标准蛋白，泳道1为氯化钠盐析组分，泳道2为DEAE-Sepharose柱纯化ACE，电泳胶为银染色。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、原料预处理：取200g猪肺清洗干净后，去除肺官及外层膜组织，于-20℃条件下预冻至组织充分冷却。
2、盐析：将冷冻后的原料溶于600ml已预冷的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，组织均浆后加入20mL Triton x-100(数均分子量为646.86)，4℃条件下缓慢搅拌0.5h，四层纱布过滤，滤液离心(6000g，4℃，20min)，得到480mL上清液，向上清液中加入7.0g固体氯化钠至终浓度为0.25mol/L，混匀，离心(18000g，4℃，20min)，取沉淀S1溶于100ml含0.25mol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，离心(18000g，4℃，20min)后得到沉淀(S2)20.9g，将沉淀S2溶解于100mL已预冷的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，4℃下缓慢搅拌12h，离心后得到上清液(盐析液)，体积约118mL。利用10kDa分子量截留的透析袋在Tris-HCL缓冲液中透析以进行脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白。透析除盐过程中更换4～6次透析液，并用0.1wt％硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀，即透析完成，得到透析母液。
3、吸附分离：将脱盐后的透析母液泵入填装有DEAE-Sepharose阴离子交换树脂的吸附柱(2.5×5cm)中，控制流速为1mL/min，吸附完毕后，用0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(pH＝8.3)充分冲洗柱子至280nm下的吸光度到基线。
4、解吸：吸附完成后的树脂经由相同体积(总用量相同，下同)的0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(pH＝8.3，不含NaCl)和0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(含0.5mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液淋洗解吸，在梯度淋洗解吸的过程中，不含NaCl的缓冲液的比例逐渐减少，而含有NaCl的缓冲液的比例逐渐增加，收集洗脱液(5mL/管)，纯化ACE的DEAE-Sepharose阴离子交换柱的层析图，见图1。从图1可以看出，产物的蛋白质含量逐渐降低，ACE的酶活逐渐升高即杂蛋白逐渐较少。
将由本实施例分离提纯之后所得的ACE进行SDS-PAGE电泳银染分析，结果如图2所示，其中，M为标准蛋白，泳道1为氯化钠盐析组分，泳道2为DEAE-Sepharose柱纯化ACE，电泳胶为银染色。从图2可以看出，泳道1中含有很多杂带且180kDa所对应的条带(ACE)较不明显，泳道2中仅含有一条180kDa(ACE)所对应的条带且条带明显即经过DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析后杂蛋白得到有效去除，ACE得到了高度纯化。分子量约为180kDa处的蛋白条带是ACE条带，与报道的ACE分子量一致。
5、树脂再生：解吸后，树脂先用2mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在0.1mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。
实施例2
1、原料预处理：取500g猪肺清洗干净后，去除肺官及外层膜组织，于-20℃条件下预冻至组织充分冷却。
2、盐析：将冷冻后的原料溶于1500ml已预冷的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，组织均浆后加入60mL Nonidet-P40(数均分子量为680)，4℃条件下缓慢搅拌1h，四层纱布过滤，滤液离心(6000g，4℃，20min)，得到850mL上清液，向上清液中加入12.5g固体氯化钠至终浓度为0.25mol/L，混匀，离心(18000g，4℃，20min)，取沉淀S1溶于225ml含0.25mol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，离心(18000g，4℃，20min)后得到沉淀(S2)72g，将沉淀S2溶解于360mL已预冷的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，4℃下缓慢搅拌12h，离心后得到上清液(盐析液)，体积约352mL。利用10kDa分子量截留的透析袋在Tris-HCL缓冲液中透析以进行脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白。透析除盐过程中更换4～6次透析液，并用0.1wt％硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀，即透析完成，得到透析母液。
3、吸附分离：将脱盐后的透析母液泵入填装有DEAE-Sepharose阴离子交换树脂的吸附柱(2.5×8cm)中，控制流速为1mL/min，吸附完毕后，用0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(pH＝8.3)充分冲洗柱子至280nm下的吸光度到基线。
4、解吸：吸附完成后的树脂经由相同体积的0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(pH＝8.3，不含NaCl)和0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(含0.5mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液淋洗解吸，在梯度淋洗解吸的过程中，不含NaCl的缓冲液的比例逐渐减少，而含有NaCl的缓冲液的比例逐渐增加，收集洗脱液(5mL/管)，纯化后ACE的分子量特征与文献报道基本一致，并且将其进行SDS-PAGE电泳银染分析，结果表明，ACE得到了高度纯化。
5、树脂再生：解吸后，树脂先用2mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在0.1mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。
实施例3
1、原料预处理：取1000g猪肺清洗干净后，去除肺官及外层膜组织，于-20℃条件下预冻至组织充分冷却。
2、盐析：将冷冻后的原料溶于3000ml已预冷的Tris-HCL(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)缓冲液中，组织均浆后加入20mL n-正辛基-β-D-葡萄糖苷(数均分子量为292.37)，4℃条件下缓慢搅拌1h，四层纱布过滤，滤液离心(6000g，4℃，20min)，得到2500mL上清液，向上清液中加入36.5g固体氯化钠至终浓度为0.25mol/L，混匀，离心(18000g，4℃，20min)，取沉淀S1溶于880ml含0.25mol/L氯化钠的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，离心(18000g，4℃，20min)后得到沉淀(S2)105g，将沉淀S2溶解于525mL已预冷的Tris-HCL缓冲液(20mmoL/L，pH＝8.3，4℃)中，4℃下缓慢搅拌12h，离心后得到上清液(盐析液)，体积约620mL。利用10kDa分子量截留的透析袋在Tris-HCL缓冲液中透析以进行脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白。透析除盐过程中更换4～6次透析液，并用0.1wt％硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀，即透析完成，得到透析母液。
3、吸附分离：将脱盐后的透析母液泵入填装有DEAE-Sepharose阴离子交换树脂的吸附柱(2.5×12cm)中，控制流速为1mL/min，吸附完毕后，用0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(pH＝8.3)充分冲洗柱子至280nm下的吸光度到基线。
4、解吸：吸附完成后的树脂经由相同体积的0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(pH＝8.3，不含NaCl)和0.02mol/L Tris-HCL缓冲液(含0.5mol/L NaCl)混合组成的线性梯度洗脱液淋洗解吸，在梯度淋洗解吸的过程中，不含NaCl的缓冲液的比例逐渐减少，而含有NaCl的缓冲液的比例逐渐增加，收集洗脱液(5mL/管)，纯化后ACE的分子量特征与文献报道基本一致，并且将其进行SDS-PAGE电泳银染分析，结果表明，ACE得到了高度纯化。
5、树脂再生：解吸后，树脂先用2mol/L NaCl溶液淋洗4小时，再将树脂拆下，在0.1mol/L NaOH溶液中浸泡0.5小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性，树脂再生完毕，可循环使用。
实施例4
按照实施例1的方法从猪肺中分离提纯ACE，不同的是，将Tris-HCL缓冲液均采用磷酸盐缓冲液(pH值为8.3)替代，所得粗酶液中的ACE含量与由实施例1所得粗酶液中的ACE含量相当，将DEAE-Sepharose柱纯化ACE进行SDS-PAGE电泳银染分析，结果表明，ACE得到了高度纯化。
实施例5
按照实施例1的方法从猪肺中分离提纯ACE，不同的是，原料预处理步骤中不包括在-20℃条件下预冻至组织充分冷却的步骤，而是将去除肺官及外层膜组织之后的猪肺直接进行盐析，电泳图显示该实施例所得粗酶液中的分子量约为180kDa的条带很不明显，而实施例1所得粗酶液中的分子量约为180KDa的条带较明显，即该实施例所得粗酶液中的ACE含量少于由实施例1所得粗酶液中的ACE。
对比例1
按照实施例5的方法从猪肺中分离提纯ACE，不同的是，将盐析步骤中的氯化钠采用1.6～2.6mol/L的硫酸铵分级沉淀替代，所得粗酶液与盐析前相比比活力提高了2倍，而由实施例5所得的粗酶液中ACE的比活力较盐析前提高了5倍。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种从猪肺中分离提纯血管紧张素转化酶的方法，其特征在于，该方法包括：
(1)盐析：将猪肺溶于第一缓冲液中，组织均浆后加入促渗剂，并在0～10℃下搅拌0.5～2h，过滤、滤液离心，往所得上清液中加入盐至终浓度为0.2～0.5mol/L，混匀、离心，所得沉淀S1用含盐的第二缓冲液溶解，离心，所得沉淀S2用第三缓冲液溶解，离心，并将所得上清液用10kDa分子量截留的透析袋在第四缓冲液中进行透析以脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白，并用0.1wt％的硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀即表示透析完成，得到透析母液；所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液各自独立地为弱碱性缓冲液，所述促渗剂为能够促进猪肺组织中的蛋白渗透至第一缓冲液中的溶剂，加入上清液中的盐以及第二缓冲液中的盐各自独立地为金属氯化物；
(2)吸附分离：将所述透析母液泵入填装有功能团为二乙胺基乙基的阴离子交换树脂的吸附柱中进行树脂吸附，吸附完成后采用解吸液进行淋洗解吸，所述解吸液为能够将血管紧张素转化酶从所述阴离子交换树脂上洗脱下来且不能够将杂质从所述阴离子交换树脂上洗脱下来的溶剂，收集洗脱液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括盐析之前的原料预处理步骤：将猪肺清洗干净，去除肺官及外层膜组织，于-25℃～0℃下冷冻至猪肺组织充分冷却。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液各自独立地为Tris-HCL缓冲液和/或磷酸盐缓冲液；
所述第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液的温度各自独立地为0～10℃；
所述猪肺与第一缓冲液的用量比为1:2～1:6m/v；
所述沉淀S1与第二缓冲液的用量比为1:2～1:6m/v；
所述沉淀S2与第三缓冲液的用量比为1:2～1:6m/v。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述促渗剂选自聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇和n-正辛基-β-D-葡萄糖苷中的至少一种；优选地，所述猪肺与促渗剂的用量比为10:1～50:1v/v。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，加入上清液中的盐以及第二缓冲液中的盐各自独立地为氯化钠和/或氯化钾；所述第二缓冲液中盐的浓度为0.1～0.5mol/L。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解吸液为含盐的Tris-HCL缓冲液和/或含盐的磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述解吸的方式为采用含不同盐浓度的Tris-HCL缓冲液进行梯度淋洗解吸，且在梯度淋洗解吸的过程中，所述Tris-HCL缓冲液中盐的浓度逐渐升高；优选地，所述解吸的方式为采用由不含NaCl的Tris-HCL缓冲液和含0.2～0.5mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液混合组成的线性梯度解吸液进行梯度解吸，在梯度解吸过程中，不含NaCl的Tris-HCL缓冲液所占的比例逐渐减少，而含0.2～0.5mol/L NaCl的Tris-HCL缓冲液所占的比例逐渐增大。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括在所述吸附完成之后、解吸之前，采用碱性缓冲液冲洗吸附柱至280nm下的吸光度到基线；优选地，所述碱性缓冲液为Tris-HCL缓冲液和/或磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法，其特征在于，该方法包括：
①预处理：将猪肺洗净并去除肺官及外层膜组织，之后冷冻至组织充分冷却；
②盐析：将经预处理后的猪肺按照1:2～1:6m/v的比例溶于已预冷的Tris-HCL缓冲液中，组织均浆后加入聚乙二醇辛基苯基醚，0～10℃条件下缓慢搅拌0.5～2h，四层纱布过滤、滤液离心，往所得上清液中加入固体NaCl至终浓度为0.2～0.5mol/L，混匀、离心，所得沉淀S1用已预冷的含NaCl的Tris-HCL缓冲液溶解，离心，所得沉淀S2溶解于已预冷的Tris-HCL缓冲液中，0～10℃条件下缓慢搅拌12～24h，离心，然后将所得上清液用10kDa分子量截留的透析袋在Tris-HCL缓冲液中进行透析以脱盐并去除分子量小于10kDa的杂蛋白，所述透析过程中更换4～6次透析液，并用0.1wt％硝酸银水溶液检测至透析液无沉淀即表示透析完成，得到透析母液；
③吸附分离：将所述透析母液泵入填装有功能团为二乙胺基乙基的阴离子交换树脂吸附柱中，控制流速为0.5～2mL/min，吸附完成后采用0.01～0.05mol/L Tris-HCL缓冲液充分淋洗吸附柱至280nm下的吸光度到基线；
④解吸：吸附完成后的树脂采用由不含NaCl的0.01～0.05mol/L Tris-HCL缓冲液和含0.2～0.5mol/L NaCl的0.01～0.05mol/L Tris-HCL缓冲液混合组成的线性梯度解吸液淋洗解吸，收集洗脱液。
10.根据权利要求1-9中任意一项所述的方法，其特征在于，该方法还包括树脂再生步骤：解吸后的阴离子交换树脂先用0.5～5mol/L的NaCl溶液淋洗1～5小时，再将阴离子交换树脂拆下，在0.05～0.2mol/L的NaOH溶液中浸泡0.1～2小时，然后用大量蒸馏水清洗树脂至近中性。
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