ME01965B

ME01965B - Stabilizatori za vakcine osušene zamrzavanjem

Info

Publication number: ME01965B
Application number: MEP-2011-471A
Authority: ME
Inventors: Delphine Magali Belin-Poput; Noel Yves Henri Jean Genin
Original assignee: Merial Ltd
Priority date: 2005-09-16
Filing date: 2006-09-15
Publication date: 2012-04-30
Also published as: ES2373238T3; US8784843B2; JP2009508866A; RS51996B; WO2007035455A2; HRP20110803T1; SI1954308T1; CN101312742B; EP1954308A2; CY1112490T1; PT1954308E; US20100260796A1; PL1954308T3; DK1954308T3; EP1954308B1; JP5275803B2; WO2007035455A3; CN101312742A; ATE523207T1

Description

OBLAST PRONALASKA

Predstavljeni pronalazak se generalno odnosi na oblasti imunološke tehnologije i tehnologije vakcine. Specifičnije, predstavljeni pronalazak se odnosi na stabilizatore za osušene zamrzavanjem žive atenuirane imunogene kompozicije i/ili kompozicije vakcine koje mogu da sadrže, pored ostalog, paramiksovirus pasa. Pronalazak se dalje odnosi na stabilizovane, osušene zamrzavanjem žive atenuirane imunogene kompozicije i/ili kompozicije vakcine, na primer, paramiksovirusa pasa, koje mogu da sadrže ove stabilizatore. Drugi aspekti pronalaska su opisani u ili su očigledni iz sledećeg opisa, i unutar su opsega pronalaska.

OSNOVA PRONALASKA

Imunogene kompozicije i kompozicije vakcine koje sadrže biološke sastojke, kao što su virusi, bakterije, paraziti, gljive, proteini, polipeptidi, glikoproteini i naročito, atenuirani živi mikroorganizmi, primetno su osetljivi na uslove pripremanja, formulisanja i čuvanja.

Takvi biološki sastojci mogu biti modifikovani i razloženi hemijskim reakcijama (npr. hidroliza, deaminacija, Maillard-ova reakcija), od kojih su mnoge posredovane vodom. Tečna voda omogućava molekularne pokrete i može da ima za rezultat modifikaciju proteinskih konformacija u kompozicijama koje sadrže biološke sastojke. Ograničavanjem pristupa vodi ili uklanjanjem vode, smanjen je glavni faktor modifikacije i razgradnje. Raniji postupci za obezbeđivanje stabilnosti bioloških sastojaka primamo su obuhvatali zamrzavanje vode ili uklanjanje vode putem sušenja zamrzavanjem.

Liofilizacija ili postupak sušenja zamrzavanjem je uobičajeno korišćena tehnika za uklanjanje vode u pripremi dehidratisanih proizvoda. Generalno, „sušenje zamrzavanjem44 vodene kompozicije obuhvata tri koraka. Prvo, vodena kompozicija se zamrzava pod uslovima niske temperature. Drugo, zamrznuta voda se uklanja sublimacijom pod uslovima sniženog pritiska i niske temperature. Na ovom stadijumu, kompozicija obično sadrži oko 15% vode. Treće, preostala voda je dalje uklonjena desorpcijom pod uslovima sniženog pritiska i viših temperatura. Na kraju postupka liofilizacije, proizveden je proizvod koji je osušen zamrzavanjem, koji je takođe označen kao,, pastila“ ili,, kolač“. Proizvod koji je osušen zamrzavanjem sadrži veoma nisku količinu preostale vode (od oko 0. 5% do oko 5% tež. /tež. ) i suvi materijal u amorfnom obliku. Ovo specifično stanje je označeno kao „staklasto44.

Međutim, značajan gubitak aktivnosti bioloških sastojaka zabeležen je u toku stadijuma pripreme, kao što je pre i u toku liofilizacije, i takođe u toku čuvanja imunogenih kompozicija i kompozicija vakcine. Mora se očuvati celovitost bioloških sastojaka da bi se osiguralo održavanje imunizacione efikasnosti imunogenih kompozicija i kompozicija vakcine. Imunogena aktivnost bioloških sastojaka meri se preko sposobnosti da indukuju i stimulišu imunološki odgovor kada se primeni na domaćina ili subjekta.

Da bi se ograničila manipulacija subjekata i broj primena, postoji snažna potreba u tehnici da se obezbede multivalentne imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine. Po definiciji, multivalentna imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine sadrži više od jedne aktivne imunogene komponente koja potiče od, ili je poreklom od, najmanje dva različita patogena. Virusi iz različitih rodova mogu da variraju u stabilnosti u toku koraka sušenja zamrzavanjem i kasnijeg perioda čuvanja, što ima za rezultat gubitak vijabilnosti ili infektivnosti. U slučaju virusa kao što su paramiksovirusi pasa, aktivne imunogene komponente koje se obično primenjuju su živi atenuirani virusi. Da bi se efikasno stimulisao imuni sistem, živi atenuirani virusi moraju da se repliciraju u imunizovanom subjektu. Gubitak vijabilnosti ili infektivnosti može da se javi u toku postupka sušenja zamrzavanjem multivalentnih imunogenih kompozicija ili kompozicija vakcine, u toku čuvanja kompozicija, ili pre primene kompozicija posle rekonstitucije. Na taj način, stabilizatori se dodaju takvim kompozicijama koje su osušene zamrzavanjem. Međutim, da bi se dobile multivalentne imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine koje održavaju svoju infektivnost i/ili vijabilnost, naročito bi bio koristan uobičajeni stabilizator koji je sposoban da očuva vijabilnost i infektivnost različitih živih atenuiranih patogena.

Stabilizacija bioloških sastojaka u suvom obliku tipično obuhvata konzervisanje antitoksina, antigena i bakterija (Flosodort et al (1935) J. Immunol. 29, 389). Međutim, ograničenje u ovom postupku je obuhvatalo delimičnu denaturaciju proteina kada se suše iz vodenog stanja na temperaturama sredine. Sušenje od zamrznutog stanja pomoglo je u smanjenju denaturacije i dovelo je do bolje, iako nepotpune, konzervacije bioloških sastojaka uključujući bakterije i viruse (Stamp et al. (1947) J. Gen. Microbiol. 1, 251; Rightsel et al. (1967) Cryobiology 3, 423; Rowe et al. (1971) Cryobiology 8, 251).

Skorije, šećeri kao što su saharoza, rafinoza i trehaloza dodati su u različitim kombinacijama kao stabilizatori pre liofilizacije virusa. Veliki broj jedinjenja testiran je u odnosu na njihovu sposobnost da stabilizuju različite vakcine koje sadrže žive atenuirane biološke sastojke, naročito viruse. Takva jedinjenja obuhvataju SPGA (saharozu, fosfat, glutamat i albumin; Bovamick et al. (1950) J. Bacteriol. 59, 509-522; SAD Patent br. 4, 000, 256), goveđi ili humani serum albumin, soli alkalnih metala i glutaminske kiseline, soli aluminijuma, saharozu, želatin, škrob, laktozu, sorbitol, Tris-EDTA, kazein hidrolizat, natrijum i kalij um laktobionat, i monometalni ili dimetalni fosfat alkalnog metala. Druga jedinjenja obuhvataju, na primer, SPG-NZ amin (npr. SAD Patent br. 3, 783, 098) i smeše polivinilpirolidona (PVP) (npr. SAD Patent br. 3, 915, 794).

Vakcine i imunogene kompozicije imale su veliki uticaj na javno zdravlje smanjenjem morbiditeta i mortaliteta od različitih virulentnih patogena. Međutim, neželjeni sporedni efekti koji su rezultat aditiva u imunogenim kompozicijama i kompozicijama vakcine nastavljaju da predstavljaju potencijalni rizik koji može da prevaziđe sva zaštitna i terapeutska svojstva imunogenih kompozicija i kompozicija vakcine.

U obliku koji se često koristi u vakcinama u Sjedinjenim Američkim Državama, želatin može da izazove ozbiljne alergijske reakcije kod oko 1 od ukupno 2 miliona doza. Alergijske reakcije za koje je prethodno smatrano da su rezultat albumina (protein jaja) verovatnije su izazvane želatinom u istoj vakcini. U slučaju humanog serum albumina, iako nijedna bolest nikada nije bila povezana sa humanim serum albuminom u vakcinama, postoji šansa prenošenja virusa preko ovog proteina, koji je poreklom iz humane krvi.

Proizvodi poreklom od goveda, kao što su goveđi albumin i želatin, nose rizik od prenošenja CJD (Creutzfeld-Jakob-ove bolesti, koja je takođe poznata kao „bolest ludih krava“) preko proizvoda od krvi i vezivnog tkiva goveda koji se koriste u proizvodnji vakcina. Međutim, nije bilo zabeleženih slučajeva gde je CJD prenošena preko proizvoda od krvi ili vezivnih tkiva, prioni koji uzrokuju CJD nisu nađeni u krvi ili vezivnom tkivu, i zabranjena je upotreba proizvoda poreklom od goveda, od krava uvezenih iz zemalja gde ima poznatih slučajeva bolesti ludih krava. Ipak, u pogledu ovih rizika, učinjeni su napori da se eliminiše upotreba takvih proizvoda u imunogenim kompozicijama za koje je zabeleženo da izazivaju neželjene imune efekte.

De Rizzo (de Rizzo et al. (1989) Buli. Pan. Am. Health Organ. 23(3), 299-305) je objavio osušene zamrzavanjem preparate virusa malih boginja koji sadrže rastvore sorbitola-želatina ili glutaminske kiseline-laktoze. Ovi preparati su čuvani na 20°C i njihovi virusni titri su određivani tokom perioda čuvanja od 21 mesec. Dobijeni rezultati ukazuju na to da su virusi koji su osušeni zamrzavanjem bez stabilizatora stabilni kada se čuvaju na -20°C tokom perioda od 21 mesec. Pored toga, dobro je poznato da su virusi malih boginja koji su osušeni zamrzavanjem stabilni kada se čuvaju na -20°C i mogu da zadrže potenciju skoro bez gubitka tokom mnogo godina (Gray A., (1978) Dev. Biol. Štand. 41, 265-266). Međutim, ovi rezultati su dobijeni na -20°C gde su virusi malih boginja osušeni zamrzavanjem stabilni i ne pokazuju dodatni stabilizujući efekat. Ovi rezultati pokazuju samo da rastvori sorbitola-želatina i glutaminske kiseline-laktoze nemaju negativan efekat na stabilnost virusa malih boginja koji su čuvani u obliku osušenom zamrzavanjem na -20°C.

Precausta (Precausta et al (1980) J. Clin. Microbiol. 12(4), 483-489) je ispitivao efekte preostale vlage i hermetički zatvorene atmosfere na infektivnost, titar virusa štenećaka pasa (CDV) i virus infektivnog bronhitisa (IBV) posle sušenja zamrzavanjem. Rastvor laktoze je dodat u preparat CDV-a do krajnje koncentracije od 75 mg/ml, dok je IBV vakcina sadržala 40 mg manitola po ml. Kada je titar CDV-a pre sušenja zamrzavanjem upoređivan sa titrom posle sušenja zamrzavanjem i posle 12 meseci čuvanja na 6°C, titar CDV-a je smanjen od 101. 6 do 102. 0 CCID5o/ml, koji odslikava veoma značajno smanjenje u titru CDV-a.

Ovi stabilizatori često sadrže komponente koje nisu poželjne za primenu u subjekta, zbog problema sa bezbednošću i štetnih sporednih efekata. Kao posledica, postoji potreba za novim stabilizatorima i postupcima za očuvanje vijabilnosti i infektivnosti bioloških sastojaka u obliku osušenom zamrzavanjem, koji su bezbedni i pogodni za injekciju za subjekte i koji imaju dobar aspekt.

U stanje tehnike obuhvaćeni su EP872249 koji opisuje stabilizaciju virusa koji je osušen zamrzavanjem (MoMLV) sa na primer glukozom, askrobinskom kiselinom ili natrijum glutamatom i glukozom; W02005066333 koji opisuje stabilizaciju ALVAC (kanaripoks virus) sa kompozicijama koje obuhvataju asparaginsku kiselinu; i W00077043, koji opisuje vakcine na bazi DNK koje posebno sadrže imunogene protiv CDV i cPi2.

REZIME PRONALASKA

Predstavljeni pronalazak se odnosi na potrebu u tehnici za obezbeđivanjem, pored ostalog, novih stabilizatora za osušene zamrzavanjem žive atenuirane imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine, koje mogu da sadrže živi atenuirani virus štenećaka pasa (CDV) i virus parainfluence pasa tipa 2 (cPi2). Ovi stabilizatori mogu da očuvaju vijabilnost i infektivnost ovih paramiksovirusa pasa pored drugih virusa, patogena i aktivnih imunogenih komponenti, posebno u toku postupka sušenja zamrzavanjem i u toku dugog perioda čuvanja proizvoda osušenih zamrzavanjem bilo na temperaturama u frižideru ili na sobnoj temperaturi, naročito između od oko 4°C do oko 25°C. Značajno, stabilizatori za koje se ovde traži zaštita za osušene zamrzavanjem stabilizovane žive atenuirane imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine su bezbedni i pogodni za injekciju za subjekte posle rekonstitucije. Ove osušene zamrzavanjem stabilizovane imunogene kompozicije mogu da sadrže pastile ili kolače dobrog aspekta, tj., koje imaju pravilan oblik i ujednačenu boju.

Stabilizatori prema predstavljenom pronalasku su povoljno bez sastojaka životinjskog porekla, naročito bez serum albumina humanog ili goveđeg porekla, laktalbumina i želatina. Na ovaj način, minimizovani su ili eliminisani svi potencijalni biološki rizici od, na primer, alergijskih reakcija koje su rezultat alergije na želatin ili albumin, kao što je urtikarija i anafilaksa, i prenošenje bolesti spongiformnog encefalitisa, posebno Creutzfeldt-Jakob-ove bolesti (CJD) ili goveđeg spongiformnog encefalitisa (BSE; takođe poznat kao bolest ludih krava).

Prema tome, predstavljeni pronalazak daje sledeće:

1. Stabilizator za zamrzavanjem osušenu živu atenuiranu imunogenu kompoziciju virusa štenećaka pasa (CDV) i virusa parainfluenca pasa tipa 2 (cPi2) koji sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid i najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant, pri čemu najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant sadrži asparaginsku kiselinu; i pri čemu najmanje jedan redukcioni monosaharid sadrži glukozu, galaktozu, fruktozu, manozu, sorbozu ili njihove kombinacije; i pri čemu najmanje jedan redukcioni monosaharid je u koncentraciji od oko 20% do oko 50% tež. /tež. i najmanje jedan kiseli antioksidant je u koncentraciji od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež;

2. Stabilizator prema 1, koji dalje sadrži

(a) najmanje jedan punilac ili

(b) najmanje jedan punilac pri čemu najmanje jedan punilac sadrži dekstran, maltodekstrin, polivinilpirolidon, hidroksietil škrob ili njihove kombinacije ili

(c) najmanje jedan šećerni alkohol ili

(d) najmanje jedan šećerni alkohol pri čemu šećerni alkohol sadrži sorbitol, manitol, ksilitol, maltitol ili njihove kombinacije ili

(e) najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid ili

(f) najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid pri čemu najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid sadrži trehalozu, saharozu, rafmozu ili njihove kombinacije ili

(g) najmanje jedan šećerni alkohol i najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid ili

(h) najmanje jedan šećerni alkohol i najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid pri čemu najmanje jedan šećerni alkohol sadrži sorbitol, manitol ksilitol, maltitol ili njihove kombinacije, i pri čemu najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid sadrži trehalozu, saharozu, rafmozu ili njihove kombinacije;

3. Imunogena suspenzija ili rastvor koji sadrži živi atenuirani paramiksovirus koji sadrži CDV i cPi2, pomešan sa stabilizatorom prema 1 ili 2;

4. Imunogena suspenzija ili rastvor prema 3, gde je imunogena suspenzija ili rastvor multivalentna immunogena suspenzija ili rastvor koji dalje sadrže najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena koji se razlikuje od paramiksovirusa;

5. Imunogena suspenzija ili rastvor prema 4, u kome

(a) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta poreklom je od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxvirididae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije ili

(b) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži živi atenuirani adenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV) ili

(c) ) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena ili

(d) ) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena;

6. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od 3 do 5, pri čemu stabilizator sadrži

(a) najmanje jedan redukcioni monosaharid u krajnjoj koncentraciji od

oko 1% do oko 5% tež. /zapr. ili oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr. ili oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. ili oko 2. 5% do oko 3% tež. /zapr. ili oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. ili

(b) najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. ili

od oko 0. 2% tež. /zapr. ili

od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. ili

(c) najmanje jedan punilac u krajnjoj koncentraciji od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr. ili

(d) najmanje jedan šećerni alkohol u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov daje krajnja koncentracija najmanje jednog redukcionog monosaharida i najmanje jednog šećernog alkohola jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili

(e) najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. krajnje koncentracije i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov da je krajnja koncentracija redukcionog monosaharida i ne-redukcionog oligosaharida jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili

(f) najmanje jedan šećerni alkohol u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr., najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr., i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov da je krajnja koncentracija redukcionog monosaharida, šećernog alkohola i ne-redukcionog oligosaharida jednaka ili manja od oko 12. 5% tež. /zapr;

7. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od 3 do 5, pri čemu stabilizator sadrži:

(a) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. smeše dva redukciona monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca ili

(b) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili

(c) (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 5% tež. /zapr. ili

(d) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1 % do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili

(e) (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 3% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 5% tež. /zapr. ili

(f) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov daje krajnja koncentracija (i), (ii) i (iii) jednaka ili manja od oko 12. 5% tež. /zapr. ili

(g) (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov daje krajnja koncentracija (i), (ii) i (iii) jednaka ili manja od oko 10% tež. /zapr;

8. Zamrzavanjem osušena stabilizovana živa atenuirana CDV i cPi2 imunogena kompozicija koja sadrži (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije;

9. Imunogena kompozicija prema 8, naznačena time što je (ii) krajnja koncentracija najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije od oko 2% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije, i dalje sadrži (iii) krajnju koncentraciju od oko 15% do oko 70% tež. /tež. najmanje jednog punioca;

10. Imunogena kompozicija prema 8, naznačena time što dalje sadrži najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim paramiksovirusa;

11. Imunogena kompozicija prema 10, naznačena time što, najmanje jedna aktivna imunogena komponenta

(a) poreklom je od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije ili

(b) sadrži živi atenuirani adenovirus tipa 2 pasa (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV) ili

(c) sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena ili

(d) sadrži plazmiđni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena;

12. Zamrzavanjem osušena stabilizovana multivalentna imunogena kompozicija koja sadrži živi atenuirani CDV, živi atenuirani cPi2 i najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim paramiksovirusa, i koja sadrži:

(i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 2% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 15% do oko 70% tež. /tež. najmanje jednog punioca;

13. Multivalentna imunogena kompozicija prema 12, naznačena time što, najmanje jedna aktivna imunogena komponenta

(a) je poreklom od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije ili

(b) sadrži živi atenuirani adenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV) ili

14. Postupak za sušenje zamrzavanjem imunogene supsenzije ili rastvora živog atenuiranog CDV i cPi2, koji sadrži

(a) dovođenje u kontakt suspenzije ili rastvora živog atenuiranog CDV i cPi2 sa stabilizatorom prema 1 ili 2, čime se formira stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor;

(b) hlađenje, na atmosferskom pritisku, stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora do temperature manje od oko Tg vrednosti stabilizovane imunogene suspenzije; (c) sušenje stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora sublimacijom leda na niskom pritisku; i (d) uklanjanje viška preostale vode dodatnim snižavanjem pritiska i povećavanjem temperature stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora;

15. Komplet koji sadrži prvu bočicu koja sadrži zamrzavanjem osušenu stabilizovanu živu atenuiranu CDV i cPi2 imunogenu kompoziciju kao što je definisano u bilo kom od 8 do 11 ili zamrzavanjem osušenu multivalentnu imunogenu kompoziciju kao što je definisano u 12, i drugu bočicu koja sadrži rastvarač.

Predstavljeni pronalazak takođe daje zamrzavanjem osušenu stabilizovanu multivalentnu imunogenu kompoziciju koja sadrži živi atenuirani CDV, živi atenuirani cPi2, i najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim paramiksovirusa proizvedenu pomoću postupka prema pronalasku, i koja može da sadrži (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askrobinsku kiselinu ili njihove kombinacije.

U sledećem aspektu, pronalazak daje komplet, koji može da sadrži prvu bočicu koja sadrži zamrzavanjem osušenu stabilizovanu imunogenu kompoziciju prema pronalasku, i drugu bočicu koja sadrži rastvarač.

Rastvarač može biti izabran iz grupe koju čine demineralizovana voda, destilovana voda, voda za injekciju, pufer (tj., rastvor fosfatnog pufera) i adjuvant (tj., emulzije voda-u-ulju, aluminij um hidroksid, karbomeri).

KRATAK OPIS CRTEŽA

Sledeći Detaljan opis, koji je dat kao ilustracija, a bez namere da ograniči pronalazak na specifične varijante koje su opisane, može se razumeti u vezi sa priloženim Slikama, koje su ovde obuhvaćene, u kojima:

Slika 1A prikazuje fotografije pastila osušenih zamrzavanjem koje imaju pravilan oblik, penasti aspekt ili sunđerasti aspekt.

Slika 1B prikazuje fotografije prilepljenog aspekta, aspekta kalema i de-dupliciranog aspekta.

Slika 2 prikazuje grafikone koji pokazuju efekat procenta (A) ne-redukcionih oligosaharida, i (B) redukcionih monosaharida na titar CDV, izražen u loglO CCID5o/ml, na kraju koraka sušenja zamrzavanjem (na TO). Krajnja koncentracija ne-redukcionih oligosaharida i redukcionih monosaharida izražena je kao % tež. /zapr.

Slika 3 prikazuje grafikone koji pokazuju efekat jedinjenja antioksidanta na titar cPi2, izražen u loglO CCIDso/ml (A) na kraju koraka sušenja zamrzavanjem (na TO), i (B) posle perioda čuvanja od 3 meseca na +4°C (T + 3 meseca), pri čemu je krajnja koncentracija izražena u % tež. /zapr.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

U ovom opisu, „sadrži, " „koji sadrži, " „obuhvata" i „ima" i slično, mogu imati značenje koje im je dodeljeno u Zakonu o patentima SAD-a i može da označava „obuhvata, " „uključujući, " i slično; „koji se sastoji uglavnom od" ili „sastoji se uglavnom" slično ima značenje dodeljeno u Zakonu o patentima SAD-a i ovaj termin je otvoren, dozvoljavajući prisustvo više od onog koji je naveden sve dok osnovne ili nove karakteristike onog koji je naveden nisu promenjene prisustvom više od onoga koji je naveden, ali isključuje varijante iz stanja tehnike.

„Subjekat" u kontekstu predstavljenog pronalaska može biti kičmenjak, kao što je sisar, ptica, gmizavac, vodozemac ili riba; povoljnije čovek, prateća ili domaća životinja; životinja koja proizvodi hranu ili stočnu hranu; stoka, životinje za igre, trkaće ili sportske životinje kao što su, ali bez ograničenja na, goveda, psi, mačke, koze, ovce, svinje, konji i ptice. Poželjno, kičmenjak je pas.

Kao što je ovde korišćeno, „rekombinant" označava nukleinsku kiselinu koja je sintetisana ili na drugi način manipulisana in vitro (npr., „rekombinantna nukleinska kiselina"), postupke upotrebe rekombinantnih nukleinskih kiselina za proizvodnju genskih proizvoda u ćelijama, u subjektima ili u drugim biološkim sistemima, ili polipeptid („rekombinantni protein") koji je kodiran rekombinantnom nukleinskom kiselinom. „Rekombinantna sredstva" takođe obuhvataju isecanje ili ligaciju nukleinskih kiselina koje imaju različite kodirajuće regione, domene ili promotorske sekvence iz različitih izvora u

ekspresionoj kaseti ili vektoru za, npr., inducibilnu ili konstitutivnu ekspresiju nukleinsko kiselinskih kodirajućih sekvenci.

Kao što je ovde korošćen, termin „funkcionalno vezan" označava da su opisane komponente u vezi koja im omogućava da funkcionišu na njihov određeni način.

Termin „heterologan" kada se koristi u vezi sa nukleinskom kiselinom, označava daje nukleinska kiselina u ćeliji, virusu, subjektu ili bakteriji gde se ona normalno nalazi u prirodi; ili sadrži dve ili više nukleinsko kiselinske sekvence koje se ne nalaze u istom međusobnom odnosu kao što se normalno nalazi u prirodi, ili je rekombinantno konstruisana tako da se njen nivo ekspresije, ili fizički odnos sa drugim nukleinskim kiselinama ili drugim molekulima u ćeliji, subjektu ili strukturi, normalno ne nalazi u prirodi. Na primer, heterologna nukleinska kiselina može biti rekombinantno proizvedena tako da ima dve ili više sekvenci iz nesrodnih gena uređenih na način koji se ne nalazi u prirodi; npr., gen pasa funkcionalno vezan za promotorsku sekvencu inseriranu u, na primer, poksvirus ili adenovirus vektor. Na primer, heterologna nukleinska kiselina od interesa može da kodira imunogeni genski proizvod, pri čemu je heterologna nukleinska kiselina od interesa sadržana u vektoru primenjena terapeutski ili profilaktički kao imunogena kompozicija ili kompozicija vcakcine. Heterologne sekvence mogu da sadrže različite kombinacije promotora i sekvenci, čiji su brojni primeri ovde detaljno opisani.

Kao što je ovde korišćen, „vektor44 je alat koji omogućava ili olakšava prenos entiteta iz jedne sredine u drugu. Na primer, neki vektori korišćeni u tehnikama rekombinantne nukleinske kiseline daju entitete, kao što je segment nukleinske kiseline (kao što je segment heterologne nukleinske kiseline, kao što je segment heterologne cDNK), koji će biti preneti u ciljnu ćeliju. Ovde je takođe korišćen termin „ekspresioni vektor“. Predstavljeni pronalazak obuhvata rekombinantne vektore koji mogu da obuhvataju, bez ograničenja, virusne vektore, bakterijske vektore, gljivične vektore, protozojske vektore, plazmidne vektore ili njihove rekombinante.

U vezi sa heterolognim nukleinskim kiselinama za ekspresiju u vektoru (npr., koje kodiraju epitop od interesa i/ili antigen i/ili imunogen i/ili lek) i dokumentima koji daju takve heterologne nukleinske kiseline, kao i u vezi sa ekspresijom transkripcionih i/ili translacionih faktora za pojačanje ekspresije molekula nukleinske kiseline, kao i sa terminima kao što su „epitop od interesa“,,, lek“, „imuni odgovor44, „imunološki odgovor“, „zaštitni imuni odgovor44, „imunološka kompozicija44, „imunogena kompozicija44 i „kompozicija vakcine44, pored ostalog, date su sledeće reference SAD Patent br. 5, 990, 091 objavljen 23. 11. 1999., i WO 98/00166 i WO 99/60164, dokumenti koji su u njima citirani i dokumenti iz zapisnika u parnici tog patenta i tih PCT prijava; gde su svi oni ovde obuhvaćeni referencom. Na taj način, u praksi ovog pronalaska mogu se konsultovati SAD Patent br. 5, 990, 091 i WO 98/00166 i WO 99/60164, dokumenti koji su u njima citirani i dokumenti ili zapisnik iz parnice tog patenta i tih PCT prijava, i drugi dokumenti koji su ovde citirani ili na drugi način obuhvaćeni ovde referencom; i svi heterologni molekuli nukleinskh kiselina, promotori i vektori koji su ovde navedeni mogu se koristiti u praksi ovog pronalaska. U tom smislu, mogu se takođe navesti SAD Patenti br. 6, 706, 693; 6, 716, 823; 6, 348, 450; SAD Patentne prijave serijski br. 10/424, 409; 10/052, 323; 10/116, 963; 10/346, 021; i WO99/08713, objavljene 25. 02. 1999., iz PCT/US98/16739.

„Antigen44 je supstanca koju imuni sistem prepoznaje i indukuje imuni odgovor. Antigen može da sadrži ceo organizam, ubijen, atenuiran ili živ; podjedinicu ili deo organizma; rekombinantni vektor koji sadrži insert sa imunogenim osobinama; deo ili fragment nukleinske kiseline koji je sposoban da indukuje imuni odgovor posle predstavljanja životinji domaćinu; protein, polipeptid, peptid, glikoprotein, epitop, hapten, ugljeni hidrat, šećer ili bilo koju njihovu kombinaciju. Alternativno, antigen može da sadrži toksin ili antitoksin. Sličan termin koji se naizmenično koristi u ovom kontekstu je,, imunogen“. ,, patogen“ označava specifičan uzročni agens bolesti, kao što je bakterija, gljiva, protozoa, parazit ili virus.

Kao što su ovde korišeni, termini „imunogena kompozicija41 i „imunološka kompozicija44 i „imunogena ili imunološka kompozicija44 pokrivaju svaku kompoziciju koja izaziva imuni odgovor protiv antigena ili imunogena od interesa eksprimiranu iz vektora; na primer, posle primene na subjekta, izaziva imuni odgovor protiv ciljanog imunogena ili antigena od interesa. Termini „vakcinalna kompozicija44, „vakcina44 i „kompozicija vakcine44 pokrivaju svaku kompoziciju koja indukuje zaštitni imuni odgovor protiv antigena od interesa, ili koja efikasno štiti od antigena; na primer, posle primene ili injekcije u subjekta, izaziva zaštitni imuni odgovor protiv ciljanog antigena ili imunogena, ili obezbeđuje efikasnu zaštitu od antigena ili imunogena eksprimiranih iz vektora.

Kao što je ovde korišćen, termin „multivalentan44 označava imunogenu kompoziciju ili kompoziciju vakcine koja sadrži više od jednog antigena, bilo iz iste vrste, iz različitih vrsta ili imunogenu kompoziciju ili kompoziciju vakcine koja sadrži kombinaciju antigena iz različitih rodova.

„Aktivna imunogena komponenta44 u kontekstu predstavljenog pronalaska obuhvata žive atenuirane patogene, kao što su živi atenuirani virusi, žive atenuirane bakterije, gljive ili paraziti. Kada je aktivna imunogena komponenta deo multivalentne žive atenuirane CDV i cPi2 imunogene kompozicije, suspenzije ili rastvora prema pronalasku, aktivna imunogena komponenta može biti povoljno izvedena od patogena osim paramiksovirusa. Pronalazak takođe obuhvata rekombinantne heterologne imunogene ili antigene izvedene od ili poreklom od jednog ili više patogena koji su ovde opisani, koji mogu biti sadržani i eksprimirani u, pored ostalog, virusnim vektorima, bakterijskim vektorima, gljivičnim vektorima i plazmidnim vektorima. Pronalazak takođe sadrži epitope heterolognih imunogena ili antigena poreklom od jednog ili više patogena, imunomodulatore kao što su citokini, terapeutska sredstva, toksini, antitela, antigen-vezujući fragmenti antitela, adjuvanti ili druge vrste kao što su antisens RNK-e, katalitičke RNK-e, male interferišuće RNK, pored ostalih.

Termin „veterinarska kompozicija" označava svaku kompoziciju koja sadrži vektor za veterinarsku primenu koji eksprimira terapeutski protein kao što je, na primer, eritropoetin (EPO) ili imunomodulatomi protein, kao što je, na primer, interferon (IFN). Slično, termin „farmaceutska kompozicija" označava svaku kompoziciju koja sadrži vektor za ekspresiju terapeutskog proteina.

Kompozicije i postupci predstavljenog opisa mogu se odgovarajuće primenjivati u stabilizaciji imunmodulatora kao što su citokini, terapeutska sredstva, toksini, antitela, antigen-vezujući fragmenti antitela, adjuvanti, ili druge vrste kao što su antisens RNK-e, katalitičke RNK-e, male interferišuće RNK, pored ostalih. Posle rekonstitucije, ova jedinjenja se mogu koristiti za prevenciju bolesti kao profilaktička imunizacija ili da obezbede ublažavanje simptoma bolesti kao terapeutska imunizacija.

Predstavljeni opis obuhvata stabilizator za osušene zamrzavanjem žive atenuirane imunogene kompozicije koje sadrže najmanje jedan redukcioni monosaharid i najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant. Stabilizator može izborno da sadrži najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid i/ili najmanje jedan punilac i/ili najmanje jedan šećerni alkohol. Ovi stabilizatori mogu da očuvaju ili da zadrže imunogenost, infektivnost i vijabilnost bioloških sastojaka uključujući, ali bez ograničenja na, viruse, bakterije, gljive, parazite, proteine, polipeptide, pored ostalih. Stabilizatori koji su ovde opisani takođe imaju dobar aspekt, tj. ujednačeni oblik i boju, i bezbedni su za primenu u subjekta.

„Redukcioni monosaharid" je saharid koji je sposoban da donira elektrone, i na taj način je sposoban da redukuje drugo jedinjenje u toku reakcija oksidacije-redukcije. Uopšteno, redukcioni monosaharid ima aldehidne ili keton grupe u svojoj strukturi. Kolorimetrijski testovi su dostupni za identifikaciju redukcionih šećera, kao što je Fehling-ov reagens test, koji proizvodi promenu boje od tamno plave do crvene jer se reagens bakar jona redukuje do bakar metala u prisustvu redukcionog šećera. U predstavljenom pronalasku, redukcioni monosaharid poželjno sadrži glukozu, galaktozu, fruktozu, manozu, sorbozu ili njihove kombinacije. U jednoj varijanti pronalaska, data je kombinacija najmanje dva redukciona monosaharida. Redukcioni monosaharidi su značajni za zaštitu kompozicija, posebno proteina i živih atenuiranih patogena, u toku postupka sušenja zamrzavanjem, naročito u toku koraka sublimacije (tj., prvi i drugi korak desikacije), gde redukcioni monosaharidi uzimaju mesto sublimovane vode i održavaju koheziju biološke strukture.

Izborno, šećerni alkoholi i/ili ne-redukcioni oligosaharidi mogu se dodati u stabilizator prema predstavljenom pronalasku. Kombinacije redukcionih monosaharida i šećernih alkohola, kombinacije redukcionih monosaharida i ne-redukcionih oligosaharida, i kombinacije redukcionih monosaharida, šećernih alkohola i ne-redukcionih oligosaharida obuhvaćene su predstavljenim opisom.

Šećerni alkoholi su hemijski alkoholi, tačnije polioli, izvedeni od molekula šećera redukcijom aldehidne grupe šećera. U kontekstu predstavljenog opisa šećerni alkoholi su povoljno monosaharidni alkoholi ili disaharidni alkoholi. Šećerni alkohol može da sadrži sorbitol, manitol, ksilitol ili maltitol. Stabilizatori iz opisa mogu takođe da sadrže smešu najmanje dva šećerna alkohola.

,, Ne-redukcioni oligosaharidi" u kontekstu opisa su šećeri koji sadrže od dve do deset saharidnih jedinica i nisu sposobni da redukuju drugo jedinjenje u toku reakcija oksidacije-redukcije. U predstavljenom opisu, ne-redukcioni oligosaharid može biti ne-redukcioni disaharid ili ne-redukcioni trisaharid, koji povoljno sadrži trehalozu, saharozu ili rafinozu. Stabilizatori mogu da sadrže smešu najmanje dva ne-redukciona oligosaharida.

Jedinjenje kiseli antioksidant je defmisano kao hemijsko jedinjenje koje reaguje sa i neutrališe oksidante, slobodne radikale (tj., molekule sa nesparenim elektronima), ili hemikalije koje oslobađaju slobodne radikale. U kontekstu opisa, jedinjenje antioksidant je u kiselom obliku. Radi jasnoće, oni su ovde označeni kao „kiseli antioksidanti“. Kiseli antioksidanti mogu da sadrže askorbinsku kiselinu i/ili kisele aminokiseline, kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina. Antioksidant je povoljno asparaginska kiselina. Stabilizatori poželjno ne sadrže soli kiselih antioksidanata, npr. soli alkalnih metala kao što su soli natrijuma ili kalijuma, posebno natrijumova so asparaginske kiseline, kalijumova so asparaginske kiseline, natrijumova so glutaminske kiseline, kalijumova so glutaminske kiseline, natrijumova so askorbinske kiseline i kalijumova so askorbinske kiseline. Kombinacije više od jednog jedinjenja kiselog antioksidanta obuhvaćene su pronalaskom.

Punilac može biti farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi polimer kao što su, ali bez ograničenja na, dekstran, maltodekstrin, polivinilpirolidon (PVP), krospovidon i hidroksietil škrob. Drugi derivati škroba obuhvataju, ali bez ograničenja na, mikrokristalnu celulozu, metil celulozu, karboksi metil celulozu, hidroksipropil celulozu, hidroksietil metil celulozu i hidroksipropil metil celulozu. Povoljno, punilac može biti dekstran ili PVP, poželjno dekstran. Predstavljeni pronalazak takođe razmatra kombinacije najmanje dva punioca. Punilac povećava T'g vrednost imunogenih kompozicija i kompozicija vakcine, omogućavajući primenu viših temperatura u toku zamrzavanja. „T'g vrednost“ je definisana kao temperatura staklenog prelaza, koja odgovara temperaturi ispod koje zamrznuta kompozicija postaje staklasta. Punilac je primamo odgovoran za dobar aspekt zabeležen kod pastila i kolača osušenih zamrzavanjem prema predstavljenom pronalasku, posebno zadržavanjem čvrstog oblika pastila bez stvaranja vodoničnih veza.

Ako je dekstran korišćen kao punilac, njegova molekulama težina može biti od oko 5000 Da do oko 70000 Da, poželjno od oko 10, 000 Da do oko 40, 000 Da. Ako se PVP koristi kao punilac, njegova molekulama težina može biti od oko 8, 000 Da do oko 360, 000 Da, poželjno od oko 10, 000 Da do oko 60, 000 Da.

Ako se maltodekstrin koristi kao punilac, njegova ekvivalentna vrednost dekstroze (DE, koja je kvantitativna mera stepena hidrolize škrobnog polimera) može biti od oko 3 do oko 20, poželjno od oko 5 do oko 18, poželjnije od oko 10 do oko 15. Ako se hidroksietil škrob koristi kao punilac, njegova molekulama težina može biti od oko 70, 000 Da do oko 450, 000 Da, poželjno od oko 130, 000 Da do oko 200, 000 Da. Stepen supstitucije hidroksietil škroba može biti od oko 0. 4 do oko 0. 7, poželjno od oko 0. 4 do oko 0. 6. Stepen supstitucije je definisan kao broj hidroksietil grupa po jedinici glukoze.

Neke komponente u stabilizatoru ne moraju biti rastvorljive. Međutim, u okviru oblasti iskusnog tehničara je supstitucija pogodno analognih komponenti (npr. izborom rastvorljivije komponente) i/ili prilagođavanje količina nerastvorljive komponente prisutne u stabilizatoru za svrhe dobijanja rastvorljivog stabilizatora. Rastvorljivost komponente može se lako proveriti pomoću vizuelnog testa rastvorljivosti. Test rastvorljivosti sadrži korake dodavanja svih komponenti stabilizatora na temperaturi od oko 55°C, i mešanje od oko 30 minuta. Posle približno 24 časa na sobnoj temperaturi i bez bilo kakvog mešanja, stabilizator se može vizuelno proveravati prema izgledu taloga. Ako je stabilizator providan ili bistar, tada su sve komponente stabilizatora rastvorljive.

Specifične varijante stabilizatora prema predstavljenom pronalasku, pod nazivom F2, F2B, F6B, F33, F37, A, H, K i U, opisane su ovde u Primerima.

Stabilizatori prema predstavljenom pronalasku mogu se čuvati na temperaturama od oko 10°C do oko 40°C, i poželjno od oko 15°C do oko 25°C.

Pronalazak takođe daje stabilizovanu imunogenu suspenziju ili rastvor, koji sadrži imunogenu suspenziju ili rastvor koji sadrži živi atenuirani virus, kao što je, ali bez ograničenja na, paramiksovirus, pomešan sa stabilizatorom prema pronalasku. Paramiksovirus pasa sadrži, pored ostalog, virus štenećaka pasa (CDV) i virus parainfluence pasa tipa 2 (cPi2), oba u obliku živih atenuiranih virusa.

Korisna varijanta prema predstavljenom pronalasku obuhvata žive atenuirane paramiksoviruse, naročito, paramiksoviruse pasa. Paramiksovirus pasa je virus familije Paramyxoviridae, koja obuhvata virus štenećaka pasa (CDV) i virus parainfluence pasa tipa 2 (cPi2). Paramiksovirusi pasa su odgovorni za široki niz bolesti kod mnogih vrsta mesoždera, naročito domaćih životinja, kao što su psi, ili divljih životinja, kao što su lasice, lavovi, tigrovi i leopardi.

U stabilizovanim imunogenim suspenzijama ili rastvorima prema predstavljenom pronalasku, krajnja koncentracija redukcionog monosaharida je od oko 1% do oko 5% tež. /zapr, povoljno od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr, povoljnije od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr, i poželjno od oko 2. 5% do oko 3% tež. /zapr.

„Krajnja koncentracija" u kontekstu pronalaska označava koncentraciju jedinjenja u stabilizovanoj imunogenoj suspenziji ili rastvoru.

Stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvori prema pronalasku mogu da sadrže krajnju koncentraciju jedinjenja kiselog antioksidanta od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. konačno, naročito od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr, i naročito oko 0. 2% tež. /zapr.

Kada stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor sadrži najmanje jedan punilac, krajnja koncentracija punioca je od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr i korisno od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr.

Kada stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid i najmanje jedan šećerni alkohol, krajnja koncentracija redukcionog monosaharida je od oko 1% do oko 5% tež. /zapr, povoljno od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr, povoljnije od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. i poželjno od oko 2. 5% do oko 3% tež. /zapr, krajnja koncentracija šećernog alkohola je od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr i povoljno od oko 1. 5% do oko 3% tež. /zapr, uz uslov da je krajnja koncentracija smeše redukcionog monosaharida i šećernog alkohola jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr, i povoljno do oko 5% tež. /zapr.

Kada stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid i najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid, krajnja koncentracija redukcionog monosaharida je od oko 1% do oko 5% tež. /zapr, povoljno od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr, povoljnije od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. i poželjno od oko 2. 5% do oko 3% tež. /zapr, krajnja koncentracija ne-redukcionog oligosaharida je od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. i povoljno od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr, uz uslov da je krajnja koncentracija smeše redukcionog monosaharida i ne-redukcionog oligosaharida jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr, i povoljno do oko 5% tež. /zapr.

Kada stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid, najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid i najmanje jedan šećerni alkohol, krajnja koncentracija redukcionog monosaharida je od oko 1% do oko 5% tež. /zapr, povoljno od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr, povoljnije od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. i poželjno, od oko 2. 5% do oko 3% tež. /zapr; krajnja koncentracija ne-redukcionog oligosaharida je od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. i povoljno od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr, krajnja koncentracija šećernog alkohola je od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr, i povoljno od oko 1. 5% do oko 3% tež. /zapr, uz uslov daje krajnja koncentracija smeše redukcionog monosaharida, ne-redukcionog oligosaharida i šećernog alkohola jednaka ili manja od oko 12. 5% tež. /zapr, povoljno oko 10% tež. /zapr, i povoljnije oko 7. 5% tež. /zapr.

U nekim varijantama, stabilizatori F2, F2B, F6B, F33, F37, A, H, K ili U mešani su sa imunogenim suspenzijama ili rastvorima, ili sa multivalentnim imunogenim suspenzijama ili rastvorima koji sadrže žive atenuirane viruse. Poželjno, jedna zapremina F2, F2B, F6B, F33, F37, A, H, K ili U stabilizatora je pomešana sa jednom zapreminom imunogene suspenzije ili rastvora koji sadrži živi atenuirani virus, ili sa jednom zapreminom multivalentne imunogene suspenzije ili rastvora koji sadrži živi atenuirani virus. Njihove krajnje koncentracije u stabilizovanoj suspenziji ili rastvoru su poželjno oko polovine početne koncentracije.

Živa atenuirana vakcina ili imunogena kompozicija ima sledeće prednosti: može se primenjivati u niskim dozama, naročito ako je samo-replicirajuća; blisko imitira prirodni/divlji tip infekcije kod subjekta, i obezbeđuje subjektu sve moguće imunološki značajne antigene istovremeno, tj. u jednoj primeni.

Generalno je prihvaćeno da imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine na bazi živih atenuiranih mikroorganizama imaju sposobnost da indukuju visoko efikasni tip imunog odgovora. Takve imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine imaju tu prednost da, pošto je životinja domaćin imunizovana, ulazak patogena u domaćina indukuje ubrzano poništavanje ranijeg, ćelijski-posredovanog ili humoralnog imuniteta, koji je sposoban da kontroliše dalji razvoj organizma pre nego što infekcija zauzme klinički značajne proporcije. Imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine na bazi ubijenog patogena (ubijena vakcina) generalno su priznate u tehnici kao nesposobne ili manje verovatne da postignu ovaj tip odgovora. Međutim, imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine koje sadrže živi patogen, u zavisnosti od nivoa atenuacije, predstavljaju opasnost da imunizovani domaćin, posle imunizacije, može da dobije bolest protiv koje se traži zaštita. Prema tome, imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine koje poseduju imunizujuća svojstva živog patogena, ali koje ne izazivaju neželjene sporedne efekte posle primene na subjekta bile bi visoko poželjne.

Živi atenuirani patogeni mogu biti stvoreni ugradnjom širokog opsega mutacija, uključujući promene jednog nukleotida, mutacije specifične za mesto, insercije, supstitucije, delecije ili prerasporede. Ove mutacije mogu da utiču na mali segment genoma patogena, npr., 15 do 30 nukleotida, ili velike segmente genoma patogena, npr., 50 do 1000 nukleotida, u zavisnosti od prirode mutacije. Na primer, mutacije mogu biti uvedene ushodno ili nishodno od patogenovog ne-kodirajućeg regulatomog regiona ili elementa da bi se ukinula ili oslabila njegova aktivnost, što rezultira u atenuiranom fenotipu.

Mutacije ne-kodirajućih regulatomih regiona patogenovog genoma, koje mogu da imaju za rezultat nishodnu regulaciju replikacije patogenovog gena, i/ili nishodna regulacija transkripcije patogenovog gena može da ima za rezultat proizvodnju defektvnih patogena u svakom ciklusu replikacije; tj. patogeni koji sadrže manje od celog komplementa genomskih regiona ili segmenata potrebnih za potpuno infektivnog patogena. Prema tome, promenjeni patogen će pokazati atenuirane karakteristike po tome što će patogen dati defektnije patogene od patogena divljeg tipa u svakom ciklusu replikacije. Međutim, s obzirom na to da je količina proteina, antigena ili imunogena sintetisana u svakom ciklusu slična za divlji tip patogena i defektni patogen, takvi atenuirani patogeni su verovatno sposobni da indukuju dobar imuni odgovor kod subjekta.

Tamo gde patogenov gen kodira strukturni protein, npr., u slučaju patogena kao što su virusi, kapsidni, matriksni, površinski protein ili protein omotača, broj čestica proizvedenih u toku replikacije biće smanjen tako da mutirani patogen pokazuje atenuirane karakteristike; npr., titar koji ima za rezultat subkliničke nivoe infekcije. Na primer, smanjenje u ekspresiji virusnog kapsida smanjiće broj nukleokapsida pakovanih u toku replikacije, pri čemu smanjenje u ekspresiji proteina omotača može da smanji broj i/ili infektivnost viriona potomaka. Alternativno, smanjenje u ekspresiji virusnih enzima potrebnih za replikaciju, npr., polimeraze, replikaze, helikaze i slično, trebalo bi da smanji broj genoma potomaka stvorenih u toku replikacije. S obzirom na to daje broj infektivnih čestica proizveden u toku replikacije smanjen, promenjeni virusi pokazuju atenuirane karakteristike. Međutim, broj proizvedenih antigenih virusnih čestica generalno će biti dovoljan da indukuje snažan imuni odgovor kod subjekta.

Alternativan način za konstrukciju atenuiranih patogena obuhvata uvođenje mutacije, uključujući, ali bez ograničenja na, inserciju, deleciju ili supstituciju jednog ili više aminokiselinskih ostataka i/ili epitopa u jedan ili više proteina patogena. Ovo se lako može postići konstruisanjem odgovarajuće mutacije u odgovarajućoj genskoj sekvenci patogena. Svaka promena koja menja aktivnost proteina patogena tako daje replikacija modifikovana ili smanjena obuhvaćena je predstavljenim pronalaskom.

Na primer, u kontekstu atenuiranih virusa, mutacije koje ometaju, ali ne ukidaju potpuno vezivanje virusa za receptore ćelije domaćina i nastalu infekciju mogu biti konstruisane u virusnim površinskim antigenima ili virusnim proteazama uključenim u obradu za proizvodnju atenuiranog soja. Virusni površinski antigeni ili faktori virulencije mogu biti modifikovani tako da sadrže insercije, supstitucije ili delecije jedne ili više aminokiselina ili epitopa koje ometaju ili smanjuju afinitet vezivanja virusnog antigena za receptore ćelije domaćina. Ovaj pristup nudi dodatnu korist u tome što može biti proizveden himemi virus, koji eksprimira strani ili heterologni epitop, koji takođe pokazuje atenuirane karakteristike. Takvi virusi su idealni kandidati za primenu kao žive rekombinantne vakcine.

Mutacije konstruisane u bilo kom od virusnih enzima obuhvataju, ali bez ograničenja na, insercije, delecije i supstitucije u aminokiselinskoj sekvenci aktivnog mesta enzima. Na primer, vezujuće mesto enzima može biti promenjeno tako da je njegov vezujući afinitet za njegov supstrat smanjen, i kao rezultat toga, enzim je manje specifičan i/ili efikasan. Na primer, ciljno mesto izbora je kompleks virusne polimeraze, s obzirom na to da mutacije osetljive na temperaturu postoje u svim proteinima polimeraze. Prema tome, promene uvedene u aminokiselinske položaje povezane sa takvom osetljivošću na temperaturu mogu biti konstruisane u genu virusne polimeraze tako da se proizvodi atenuirani virusni soj.

CDV je virus sa omotačem i jednolančanom RNK od oko 100-300 nm u prečniku koji pripada rodu Morbillivirus. Jezgro CDV viri ona sadrži nukleoprotein (NP) peptid koji je blisko povezan sa virusnom RNK. Drugi peptid jezgra je fosfoprotein (P). Omotač CDV-a sadrži tri peptida, M protein (matriksni protein) i dva glikoproteina. Glikoproteini su hemaglutinin glikoproteini (H) i fuzioni (F) glikoprotein. Fuzioni glikoprotein je razložen u manje podjedinice, označene kao F1 i F2. H protein je primamo odgovoran za virusnu adsorpciju za ciljne ćelije i fuzioni glikoprotein je odgovoran za fuziju ćelije-za-ćeliju. Do danas, svi poznati izolati virusa štenećaka sadrže ove uobičajene virusne polipeptide. Put infekcije do psa je preko infektivnih kapljica aerosola, a prenošenje virusa je olakšano kašljanjem, kijanjem i bliskim smeštajem u toploj, vlažnoj, zatvorenoj sredini. Studije sugerišu da se virusna infekcija javlja prvo u respiratornom epitelijumu gornjeg oronazalnog trakta sa kasnijim širenjem do dubokog plućnog parenhima (Gorham "Canine Distemper", (1960) Advance Veterinary Science, Brandley and Jungher Editors, 6: 288-315).

Makrofage i monociti tkiva koji se nalaze u ili duž respiratornog epitelijuma u krajnicima izgleda da su prvi ćelijski tip koji prihvataju i repliciraju CDV. Virus se zatim prenosi u krvotok do udaljenih limforetikulamih tkiva. Ovo se postiže viremijom i javlja se negde od dva do četiri dana posle početne infekcije. Između osam i devet dana posle infekcije, virus se širi izvan limforetikulamih tkiva da bi obuhvatio epitelijalna i mezenhimalna tkiva (Appel, (1969) Am. J. Vet Res. 30, 1167-1182). U ovom stadijumu virusne infekcije specifični imuni odgovori domaćina na virusne antigene utiču na ishod bolesti. Akutni fatalni oblik bolesti je okarakterisan neograničenim širenjem virusa do skoro svakog tkiva u telu. Virus se može naći u u svakoj ekskreciji i sekreciji kod inficiranog subjekta, i primenom imunofluorescentnih postupaka ili tehnika traženja antigena, prisustvo antigena se može zabeležiti u skoro svakom ćelijskom tipu unutar psa. Za većinu ovih životinja, najverovatniji uzork smrti je brza fatalna bolest koja pogađa nervni sistem i/ili encefalitis.

Neki psi inficirani sa CDV ispoljavaju klinički odloženo napredovanje bolesti i umerene imune odgovore rekonvalescenta. Klinički znaci, ako su prisutni, suptilni su rano u bolesti i odraz su virusne izdržljivosti unutar centralnog nervnog sistema (CNS). Kasniji razvoj preko bolesti CNS-a je promenljiv. Većina pasa inficiranih sa CDV ne ispoljavaju očigledne kliničke znake bolesti i prepoznaju se kao rekonvalescenti, klinički normalni psi. Pokazano je da aktivno inficirani psi koji se konačno oporavljaju od infekcije CDV-om demonstriraju slobodna cirkulišuća anti-virusna antitela na ili oko dana 6 ili 7 posle infekcije (Krakowka, et al., (1975) J. Infect. Dis. 132, 384-392). Titri brzu rastu do visokih nivoa u ranoj rekonvalescenciji.

Psi pogođeni akutno sa CDV pokazuju promenljive nivoe depresije, anoreksije i groznice. Koža može biti različito dehidratisana, suva-hrapava i neelastična. Deo ovih životinja pokazuje fotofobiju i dokaz mukopurulentne okulame-nazalne sekrecije. Isprekidana dijareja je uobičajeni klinički znak. U toku ove akutne viremične faze bolesti, virus je sadržan u svakoj sekreciji i ekskreciji. Kako bolest napreduje, može da se razvije zapaljenje pluća, često kao posledica sekundarnih bakterijskuh infekcija. Psi u ovom stadijumu bolesti su umereno do teško limfopenični, u zavisnosti od stepena ili količine sekundarne infekcije. Iako akutno pogođeni psi mogu da pokažu skoro svaku kombinaciju neuoroloških znakova, najčešće psi imaju male epileptične napade ili velike epileptične napade. Ove konvulzivne epizode javljaju se vremenom i sa rastućom učestalošću.

Drugi neurološki oblik štenećaka pasa je onaj koji se javlja sa encefalitisom starog psa (ODE), ili koji se javlja posle sub-kliničke infekcije i očiglednog oporavka. Znaci CNS-a mogu ekstremno da variraju u prikazu i mogu biti zamenjeni za tumor mozga, traumu glave, bakterijski meningitis, hidrocefalus i bolest kičmenog diska. Glavna ne-neuronska manifestacija infekcije CDV-om kod pasa je imunosupresija povezana sa CDV-om (Krakowka, et al., (1980) Am. J. Vet. Res. 41, 284-292). Mnogi od znakova infekcije virusom štenećaka pasa mogu se pripisati istovremenim sekundarnim infektivnim procesima koji se javljaju kod ove oronule životinje.

Bolest kod pasa može takođe biti povezana sa bakterijskim patogenima, kao što su plućne bakterijske vrste uključujući, ali bez ograničenja na, Bordetella bronchiseptica, vrste Pasteurella, vrste Staphylococcus i Streptococcus. Ove bakterije su odgovorne za gnojni konjuktivitis, rinitis i bronhopneumoniju zabeleženu klinički kod pasa inficiranih sa CDV-om. Mešane virusne infekcije, uglavnom respiratornog tipa, takođe su uobičajene. Pored infekcije adenovirusom II pasa, reovirus, virus parainfluence pasa i verovatno drugi virusi kao što su herpes virus pasa, mogu biti uključeni u dvostruke ili višestruke mešane infekcije.

cPi2 je RNK virus koji indukuje respiratornu bolest koja je jedna od najčešćih virusnih bolesti pasa. Kada se kombinacija virusa parainfluence, adenovirusa-2 pasa i bakterija Bordetella bronchiseptica pojave zajedno, može da se javi „kašalj čopora“. cPi2 takođe izaziva traheobronhitis koji, kod nekih životinja, rezultira u eksudativnom zapaljenju pluća. Znakovi kašlja se razvijaju 7 do 9 dana posle izlaganja virusu. Klinički znaci su blagi i kratkotrajni, osim ukoliko se ne javi sekundama infekcija.

cPi2 je sferičan virus sa omotačem sa prosečnim prečnikom od 150-200 nm, sa spiralnim nukleokapsidom okruženim lipidnim dvoslojem pokrivenim sa glikoproteinskim bodljama. Svaka virusna čestica sadrži jednolančani, ne segmentirani, negativan-sens RNK genom sa nukleoproteinom (NP) i fosfoproteinom (P) i velikim (L) proteinima. cPi2 infekcija je stečena preko udisanja inficiranih respiratornih kapljica. Nos i nazofarinks su primarna mesta infekcije. Virus započinje infekciju primamo vezivanjem za epitelijalne ćelije sa cilijama ovih oblasti preko proteina hemaglutinina-neuraminidaze, koji se specifično kombinuju sa receptorima neuraminske kiseline u ćelijama domaćinima. Zatim, virusi ulaze u ćeliju preko fuzije sa ćelijskom membranom koja je posredovana preko F1 i F2 receptora. Virusi se umnožavaju i napadaju druge ćelije kako intracelulamo tako i ekstracelulamo. Umnožavanje virusa javlja se u traheobronhiolamim tkivima, što izaziva pojačanu proizvodnju sluzi.

Laringotraheitis je inflamacija larinksa i traheje koja, kada se javi kod pasa, poznata je obično kao „kašalj čopora44. Glavni simptom je kašalj koji se manifestuje kratkim, suvim „kašljucanjem44 ili serijom takvog kašlja. U najtežem obliku, kašalj može biti paroksizmalni, i infekcija obuhvata ceo respiratorni trakt, često proizvodeći upalu pluća. Kašalj je takođe okarakterisan kao dubok, uporan, ne-produktivan i generalno praćen suznim očima i curenjem nosa. Temperatura može biti normalna, iako je generalno povišena. Početak bolesti može biti iznenadan i može da se javi bez preliminarnih znakova. S obzirom na to daje bolest veoma zarazna, inficirani psi bi trebalo da budu izolovani da bi se sprečila infekcija celih populacija. Bolest proizvodi velike ekonomske gubitke vlasnicima čopora, i iako obično nije fatalna, takođe može da oslabi pse tako da se proizvedu ozbiljni efekti od drugih bolesti.

Živi cPi2 virus i drugi virusi, kao što je CDV, adenovirus pasa tip 2 (CAV2) i parvovirus pasa (CPV) mogu biti umnožavani u kulturama tkiva životinja sve dok oba virusa ne postanu ne-patogena, tj., virusi su postali neaktivni ili na drugi način atenuirani. cPi2 virus je sposoban za umnožavanje u širokom nizu različitih sistema kulture tkive, kao što su, na primer, embrion pileta, embrion patke, bubreg svinje, testisi svinje, embrionalni goveđi bubreg, bubreg mačke, bubreg psa i bubreg majmuna; i takođe u uspostavljenim ćelijskim linijama, kao što su, na primer, Madin Darby goveđi bubreg (MDBK), Madin Darby bubreg pasa (MDCK) i Serum Institute rožnjača zeca (SIRC).

Za razmnožavanje, na primer, adenovirusa pasa tipa 2 (CAV2), poželjne su kulture tkiva bubrega, naročito one poreklom od goveda i pasa, s obzirom na to da se CAV2 povoljno ne replicira u sistemu kulture tkiva drugih životinja kao što to čini cPi2 virus. Atenuacija svakog virusa može se postići pomoću standardnih serijskih pasaža, uključujući tehnike pasaža terminalnog razblaženja, pri čemu se dovoljan broj pasaža u podložnoj kulturi tkiva može koristiti sve dok virus ne postane ne-patogen bez gubitka imunogenosti. Imunogen, imunogena kompozicija ili imunogena suspenzija ili rastvor pripremljeni od njega mogu da stimulišu imuni odgovor kod pasa podložnih bolesti bez proizvodnje kliničkih simptoma koji su normalno posledica virulentnog sredstva do bilo kog značajnog stepena. Razmnožavanje se može izvesti u istim ili različitim tkivima kao što su oni navedeni u prethodnom tekstu.

Vremenski intervali pasaža trebalo bi dovoljno da omoguće repliciranje virusa između pasaža, i temperature inkubiranja se poželjno održavaju od oko 30°C do oko 38°C. Optimalan vremenski interval pasaža zavisi od određenog sistema kulture i temperature koja se koristi. U svakom slučaju, da li se dovoljna replikacija virusa javila ili ne lako se može odrediti pomoću standardnih tehnika kao što je tehnika hemadsorpcije koja je opisana u Shelokov, A. (1958) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 97, 802; koja je naročito korisna za cPi2 virus, ili pomoću citopatskih zapažanja, kao što je omogućavajući virusu da raste u toku određenog pasaža pre tačke gde se može zabeležiti veliki citopatski efekat uz kontinuiranu inkubaciju.

Koristan postupak razmnožavanja koristi ćelije bubrega pasa, naročito kontinuirane MDCK ćelijske linije. Na primer, za imunogene ili svrhe vakcine, oko najmanje 15 i poželjno od oko 20 do oko 45 pasaža iz izolacije preko psećih bubrežnih tkivnih kultura virusa, može biti napravljeno u intervalima od približno tri dana i na temperaturama inkubacije od oko 30 do oko 38°C. Poželjno je koristiti materijal za veći broj pasaža, s obzirom da će ovo biti korisno za proizvodnju povoljnih imunih odgovora kod subjekata kod kojih postoji potreba za tim.

U pripremi imunogenih kompozicija ili kompozicija vakcine, virulentni CDV može da raste u kultivisanim sisarskim ćelijama u uobičajenim uslovima za rast virusa. Ćelije domaćini mogu biti zasejane virusom u vreme zasađivanja ćelija, ili sa promenom podloge koja sadrži CDV kada je monosloj 90-100% konfluentan. Odnos multipliciteta infekcije (MOI) može biti od oko 0. 001 do oko 0. 05, poželjno oko 0. 01. Za proizvodnju virusa (jednog ili više) može se koristiti svaka odgovarajuća podloga za rast sisarske ćelije, kao što su, ali bez ograničenja na, Eagle-ova minimalna esencijalna podloga, Dulbecco-ova modifikovana Eagle-ova podloga, Iscove-ova modifikovana Dulbecco-ova podloga, Ham-ova F12 podloga, F15 podloga, RPMI 1640 podloga, koja sadrži životinjski serum, kao što je fetusni teleći serum, teleći serum, konjski serum, pseći serum i slično, od oko 0% do oko 10%, suplemenata kao što su L-glutamin i druge aminokiseline kako esencijalne tako i neesencijalne, Hank-ov ravnotežni slani rastvor (HBSS), Earle-ov rastvor soli, natrijum piruvat, natrijum bikarbonat, insulin, transferin i antibiotici i antimikotička sredstva, kao što su, ali bez ograničenja na, gentamicin, penicilin, streptomicin, polimiksin B, amfotericin i Fungizone®. Predstavljeni pronalazak takođe razmatra podloge za ćelijsku kulturu bez seruma.

Inficirane ćelijske kulture održavane u temperaturnom opsegu od oko 35°C do oko 40°C u trajanju od oko 2 do oko 7 dana posle zasejavanja, kada virus može biti sakupljen. Inficirane kulture mogu biti inokulisane sa podlogom za ćelijski rast, koja može biti sakupljena posle dodatnog inkubacionog perioda od 2 do 5 dana. Virusne tečnosti su sakupljene u sterilne kontejnere i mogu biti razbistrene filtracijom. Virusne tečnosti mogu biti dodatno koncentrovane primenom uobičajene ultrafiltracione tehnologije (npr., Millipore Pellicon systems) sa filterima koji imaju granice izuzimanja veličine čestica od 105 Daltona.

Drugi živi atenuirani virusi koji mogu biti mešani sa stabilizatorima prema predstavljenom pronalasku obuhvataju, bez ograničenja, viruse besnila, viruse gripa, viruse parainfluence, virus zauški, adenoviruse kao što je adenovirus pasa tipa 2 (CAV2), respiratorni sincicijalni virus, Epstein-Barr virus, rinoviruse, poksviruse kao što je vakcinija virus, virus boginja svinja, virus boginja rakuna, virusi boginja ptica kao što su virus boginja pernate živine, virus boginja kanarinca, virus boginja goluba, polioviruse, koksakiviruse, ehoviruse, koronaviruse, virus rubeole, virus varičela-zoster, herpes viruse (humani i životinjski), Herpes simplex virus, parvoviruse kao što je parvovirus pasa (CPV), citomegalovirus, virusi hepatitisa kao što je virus zaraznog hepatitisa pasa, humani papilomavirus, alfavirusi kao što je Semliki Forest virus, Sindbis virus, „Ross River“ virus, virus istočnog konjskog encefalitisa, virus zapadnog konjskog encefalitisa, virus Venecuelanskog konjskog encefalitisa, 0'nyong-nyong virus, flaviviruse kao što je virus denga groznice i virus zapadnog Nila, buniaviruse, arenaviruse, rotaviruse, hepadnaviruse kao što su ortohepadnavirusi i avihepadnavirusi, filoviruse, retroviruse kao što je svinjski endogeni retrovirus, HTLV-1, HTLV-2, FeLV, BLV, MLV, MMSV, Mason-Pfizer virus majmuna, lentiviruse kao što su HIV-1, HIV-2, FIV, SIV, BIV, mačji kalicivirus, virus mačje panleukopenije, virus mačjeg infektivnog peritonitisa, virus mačjeg rinotraheitisa, TGE virus (svinja) i vurus slinavke i šapa.

Imunogene kompozicije, suspenzije ili rastvori koji sadrže, na primer, paramiksoviruse pasa, pomešani su sa stabilizatorima prema pronalasku tako da formiraju stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvore. Poželjno, jedna zapremina suspenzije ili rastvora paramiksovirsa pasa pomešana je sa jednom zapreminom stabilizatora.

Stabilizatori prema pronalasku takođe se mogu koristiti za stabilizaciju multivalentnih imunogenih suspenzija ili rastvora, koji mogu da sadrže, na primer, imunogenu suspenziju ili rastvor paramiksovirusa pasa i najmanje aktivnu imunogenu komponentu koja je poreklom od ili je izvedena od patogena osim paramiksovirusa. Aktivna imunogena komponenta kao što je ovde defmisana može da sadrži žive atenuirane patogene, kao što su živi atenuirani virusi, bakterije, gljive ili paraziti. Međutim, aktivna imunogena komponenta takođe može da sadrži ubijene viruse, rekombinantne heterologne imunogene, antigene, imunogene podjedinice (npr. proteine, polipeptide, peptide, epitope, haptene) ili epitope imunogena ili antigena koji su izvedeni od ili su poreklom od jednog ili više patogena koji su ovde opisani, koji mogu biti eksprimirani iz virusnih vektora, bakterijskih vektora, plazmidnih vektora i slično.

Aktivna imunogena komponenta prema predstavljenom pronalasku može da sadrži jedan ili više imunogena izabranih od patogena pasa uključujući, ali bez ograničenja na, virus besnila, adenovirus pasa tipa 2 (CAV2), herpesvirus pasa (CHV), parvovirus pasa (CPV), koronavirus pasa, Leptospira canicola, Leptospira icterohaemorragiae, Leptospira grippotyphosa, Borrelia burgdorferi, Bordetella bronchiseptica i slično, uključujući njihove kombinacije. Aktivna imunogena komponenta može da obuhvata HA, F, NP gene iz CDV, gen za kapsid iz CPV, gene bodlji, M, N iz koronavirusa pasa, HN i F gene iz cPi2, gene iz Leptospira, gene iz Bordetella, gene iz Borrelia, i gB, gC i gD gene iz herpesvirusa pasa, pored ostalih. Ove komponente mogu biti korisne kao imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine za zaštitu pasa od bolesti uzrokovane ovim patogenima.

Adenovirus pasa tip 2 (CAV2) je veoma rasprostranjen i visoko zarazan za pse. On proizvodi simptome koji su slični prehladi. Generalno, prvi znaci zarazne bolesti su groznica, koja obično opada za jedan do dva dana. Pogođeni psi mogu imati zapaljenje krajnika, osetljivost abdomena, uvećanu jetru, povraćanje i proliv. Akutna bolest je normalno fatalna. CAV2 može biti inaktiviran ili atenuiran i kombinovan sa CDV (i/ili cPi2) da bi se proizvela multivalentna vakcina. Alternativno, mogu se koristiti imunogeni ili antigeni CAV2, ili epitopi CAV2 imunogena, kao što su proteini kapsida, matriksa ili heksona.

Parvovirus pasa (CPV) je uobičajeni intestinalni virus koji može da izazove povraćanje, proliv, gastroenteritis, miokarditis i hepatitis kod mladih pasa. Nađeno je da je veoma rasprostranjen kod pasa. CPV može biti prisutan u imunogenim kompozicijama, suspenzijama ili rastvorima prema pronalasku kao inaktivirani, živi atenuirani, ili CPV imunogeni, antigeni ili epitopi CPV imunogena, kao što su VP1, VP2 (kapsid) genski proizvodi.

Dve uobičajene bakterijske infekcije pasa takođe se mogu kombinovati u njihovom atenuiranom obliku u stabilizovanim imunogenim kompozicijama, suspenzijama ili rastvorima prema predstavljenom pronalasku; to su Leptospira canicola i Leptospira ichterohaemorrhagiae. Lepto infekcije su uobičajene kod pasa i naročito kod pasa inficiranih sa CDV, cPi2 ili kombinacijama virusa kao što se često može zabeležeiti kod pasa koji pate od štenećaka ili kašlja čopora, i na taj način, njihovo uključenje u stabilizovane imunogene kompozicije, suspenzije ili rastvore prema predstavljenom pronalasku je od značajne koristi.

Druga aktivna imunogena komponenta korisna u kompozicijama i postupcima prema predstavljenom pronalasku može da sadrži jedan ili više imunogena izabranih od patogena ptica uključujući, ali bez ograničenja na, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, virus infektivnog bronhitisa (IBV), virus Nevvcastle bolesti (NDV), virus sindroma pada nosivosti jaja (EDS), virus infektivne bolesti burze (IBDV), virus ćuraka, virus ptičjeg gripa, virus Marek-ove bolesti, Herpesvirusi kao što je virus infektivnog laringotraheitisa, virus ptičjeg infektivnog bronhitisa, ptičji reovirus, poksviruse uključujući virus boginja ptica, virus boginja pernate živine, virus boginja kanarinca, virus boginja goluba, virus boginja prepelice i virus boginja goluba, ptičji poliomavirus, ptičji pneumovirus, virus ptičjeg rinotraheitisa, virus ptičje retikuloendotelioze, ptičje retroviruse, ptičji endogeni virus, virus ptičje eritroblastoze, virus ptičjeg hepatitisa, virus ptičje anemije, virus ptičjeg enteritisa, virus Pacheco-ove bolesti, virus ptičje leukemije, ptičji parvovirus, ptičji rotavirus, virus ptičje leukoze, virus ptičjeg muskuloaponeurotičkog fibrosarkoma, virus ptičje mijeloblastoze, virus povezan sa ptičjom mijeloblastozom, virus ptičje mijelocitomatoze, virus ptičjeg sarkoma, virus ptičje nekroze slezine i njihove kombinacije.

Kao specifični imunogeni, aktivne imunogene komponente takođe mogu biti HN i F geni virusa Newcastle bolesti, poliprotein i VP2 geni iz infektivnog virusa bolesti burze, S i N geni iz virusa infektivnog bronhitisa i gB i gD geni iz virusa Marek-ove bolesti. Ove komponente mogu se koristiti kao imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine za zaštitu ptica od bolesti uzrokovane ovim patogenima.

Alternativno, aktivna imunogena komponenta sadrži jedan ili više imunogena iz patogena mačke kao što su, ali bez ograničenja na, mačji herpesvirus (FHV), mačji kalicivirus (FCV), virus mačje leukemije (FeLV), virus mačjeg infektivnog peritonitisa, virus mačje panleukopenije, virus mačje imunodeficijencije (FIV), virus besnila i slično, i njihove kombinacije.

Aktivna imunogena komponenta takođe može da obuhvata gB, gC i gD gene iz mačjeg herpesvirusa, env i gag/pro gene iz FeLV, env, gag/pol i tat gene iz FIV virusa, gen za kapsid iz mačjeg kalicivirusa, S modifikovani gen, M, i N gen iz virusa mačjeg infektivnog peritonitisa i VP2 gen iz mačjeg parvovirusa. Ove komponente mogu biti korisne kao imunogene ili kompozicije vakcine za zaštitu mačaka od bolesti uzrokovane ovim patogenima.

Aktivna imunogena komponenta može da sadrži jedan ili više imunogena iz patogena konja, kao što je konjski herpesvirus (tip 1 ili tip 4), virus konjskog gripa, virus konjskog encefalomijelitisa (EEV), tetanus, virus zapadnog Nila i slično ili njihove kombinacije.

Aktivna imunogena komponenta takođe može da obuhvata, gB, gC, gD i neposredne-rane gene iz konjskog herpesvirusa tipa 1, gB, gC, gD i neposredne-rane gene iz konjskog herpesvirusa tipa 4, HA, NA, M i NP gene iz virusa konjskog gripa, gene iz virusa istočnog konjskog encefalitisa, gene iz virusa zapadnog konjskog encefalitisa, gene iz virusa venecuelanskog konjskog encefalitisa, prM--M-E gene iz virusa zapadnog Nila i gene iz virusa konjskog arteritisa, ali nisu ograničeni na ove sekvence. Ove komponente mogu biti korisne kao imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine za zaštitu konja od bolesti uzrokovane ovim patogenima.

Aktivna imunogena komponenta može da sadrži jedan ili više imunogena iz goveđeg patogena, kao što je virus besnila, goveđi rotavirus, virus goveđe parainfluence tip 3 (bCPI2-3), goveđi koronavirus, virus goveđe virusne dijareje (BVDV), virusa slinavke i šapa (FMDV), goveđi respiratorni sincicijelni virus (BRSV), virus infektivnog goveđeg rinotraheitisa (IBR), Escherichia coli, Pasteurella multocida, Pasteurella haemolytica i slično i njihove kombinacije.

Aktivna imunogena komponenta takođe može biti izabrana od gB, gC, gD i neposrednih-ranih gena goveđeg herpesvirusa tipa 1, F i G gena BRSV, poliproteina, El, E2 gena iz BVDV, FIN i F gena iz PI3 virusa ili gena iz rotavirusa. Ove komponente mogu biti korisne kao imunogene ili kompozicije vakcine za zaštitu stoke od bolesti uzrokovane ovim patogenima.

Pored toga, aktivna imunogena komponenta može da sadrži jedan ili više imunogena iz patogena svinje kao što su, ali bez ograničenja na, virus svinjskog gripa (SIV), svinjski cirkovirus tipa 2 (PCV-2), virus svinjskog reproduktivnog respiratornog sindroma (PRRSV), virus lažnog besnila (PRV), svinjski parvovirus (PPV), virus svinjske kolere (HCV), FMDV, Mycoplasma hyopneumoniae, ErysipeIothrix rhusiopathiae, Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Escherichia coli i slično, i njihove kombinacije.

Aktivna imunogena komponenta takođe može da obuhvata gB, gC, gD i neposredne-rane gene iz PRV, HA, NA, M i NP gene iz virusa svinjskog gripa, poliprotein, El, E2 iz virusa svinjske kolere, ORF1 i ORF2 gene iz PCV2 virusa, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 ili ORF7 iz PRRSV virusa ili gene Mycoplasma hyopneumoniae. Ove komponente mogu biti korisne kao imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine za zaštitu svinja od bolesti uzrokovane ovim patogenima.

Aktivna imunogena komponenta može da sadrži sekvence koje kodiraju protein eksprimiran u patogenima kao što su RNK ili DNK virusi kao što su HIV, HCV, HBV, HPV, EBV, HSV, CMV, HTLV, Hanta virus, Ebola virus, Marburg virus, virus Rift Valley groznice, Lassa virus i virus gripa, virus hemoragičnog enteriditisa (HEV), virus infektivnog rinotraheitisa (IBRV), pored ostalih. Takvi imunogeni se povoljno mogu koristiti kao imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine za zaštitu subjekata, kao što su ljudi, protiv bolesti uzrokovane ovim patogenima.

Aktivna imunogena komponenta takođe može biti, na primer, iz bilo koje od sledećih patogenih bakterija i njihovih antigena: vrste Actinobacillus kao što je Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Bordetella bronchiseptica, Bordetella avium, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, vrste

Klebsiella kao što je Klebsiella pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium pseudotuberolosis, Mycobacterium pneumoniae, Streptococcus grupe A, Streptococcus equi, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus viridans, Neisseria gonorrhoeae, vrste Erysipelothrix, enterotoksigena Escherichia coli, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis, Haemophilus influenzae, Haemophilus somnus, Haemophilus parasuis, vrste Salmonella, Salmonella agona, Salmonella blockley, Salmonella enteriditis, Salmonella hadar, Salmonella Heidelberg, Salmonella montevideo, Salmonella senftenberg, Salmonella cholerasuis, vrste Rickettsia, Helicobacter pylori, Helicobacter felis, Shigella species, vrste Listeria, Legionella pneumoniae, vrste Pseudomonas, vrste Borrelia, Borellia burgdorferi, Neisseria meningitides, vrste Clostridium, Clostridium difficile, Ureaplasma urealyticum, vrste Staphylococcus, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Pasteurella pestis, vrste Campylobacter, Campylobacter jejuni, vrste Treponema, vrste Leptospira, Corynebacterium diphtheria, Hemophilus ducreyi, Hemophilus influenza, vrste Erlichhia, pored ostalih.

Aktivna imunogena komponenta takođe može biti poreklom od gljive ili budi kao što su Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatis, vrste Penicillium, vrste Fusarium, vrste Candida kao što su Candida trichophyton, Candida parapsilosis, Candida glabrata, Candida dubliniensis i Candida albicans, vrste Rhizopus, vrste Cryptococcus kao što su Cryptococcus neoformans, Cryptococcus grubii, Cryptococcus gattii, Paracoccidiodes brasiliensis, Histoplasma capsulatum, i druge gljive i buđ.

Aktivna imunogena komponenta takođe može biti izabrana od parazitiskih antigena poreklom od parazitskih vrsta uključujući, ali bez ograničenja na, vrste Plasmodium, vrste Trypanosome, vrste Giardia, vrste Boophilus, vrste Babesia, vrste Entamoeba, vrste Eimeria, vrste Leishmania, vrste Schistosoma, vrste Brugia, vrste Fascida, vrste Dirofilaria, vrste Wuchereria, vrste Onchocerea, vrste Treponema, vrste Toxoplasma, vrste Cryptococcus, vrste Coccidia, vrste Histomoniasis, vrste FIexamitiasis, vrste Giardia, pored ostalih; nematode uključujući vrste Ascaris, vrste Trichinella, i slično, crevne gliste kao što su metilji, pantljičare, pored ostalih; i druge slične patogene organizme. Postupci za pripremu imunogena poreklom od virusa, bakterija, gljiva, budi, protozoa, nematoda i crevnih glista poznati su u tehnici.

Drugi korisni imunogeni mogu biti, na primer, prečišćeni izlučeni antigeni virulentni faktori, kao što su toksini, citotoksini, i slično. Antigeni toksina koji su detoksifikovani modifikacijom (toksoidi), koji mogu biti primenjeni u kombinaciji sa adjuvantom kao što je aluminijum hidroksid, i mogu se koristiti za stimulaciju formiranja toksin-neutrališućih

antitela. Primeri toksina koji se mogu koristiti kao imunogen obuhvataju bakterijske endotoksine i egzotoksine kao što je lipopolisaharid, enterotoksine uključujući enterotoksine osetljive na toplotu (LT), enterotoksine stabilne na toploti (ST), verotoksin (VT), i slično. Bakterijski egzotoksin imunogeni se izlučuju u okolni medijum, i obuhvataju, na primer, toksin difterije (Corynebacterium diphtheriae), toksin tetanusa (Clostridium tetani), enterotoksine koje izlučuje Staphylococcus aureus, botulinum toksine (Clostridium botulinum); i toksine proizvedene od strane algi kao što su neurotoksini; i slično. Endotoksini stabilni na toploti, koji se oslobađaju autolizom bakterija, obuhvataju, na primer, toksine kolere koji se oslobađaju iz gram negativne Vibrio cholerae, količini koje proizvode crevne bakterije kao stoje E. coli (bakteriocin).

Imunogeni izvedeni od, ili poreklom od virusa, bakterija, gljiva i slično mogu biti proizvedeni pomoću postupaka in vitro kulture primenom odgovarajuće podloge za kuluturu ili ćelijskih linija domaćina i uobičajenih postupaka koji su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Na primer, PRRSV može biti kultivisan u odgovarajućoj ćelijskoj liniji, kao što je MA-104 ćelijska linija (videti SAD Patente br. 5, 587, 164; 5, 866, 401; 5, 840, 563; 6, 251, 404 pored ostalih). Na sličan način, PCV-2 može biti kultivisan primenom PK-15 ćelijske linije (videti SAD Patent br. 6, 391, 314); SIV može biti kultivisan na jajima (SAD Patent br. 6, 048, 537); i Mycoplasma hyopneumoniae može biti kultivisana u odgovarajućoj podlozi za kulturu (SAD Patenti br. 5, 968, 525; 5, 338, 543; Ross R F. et al., (1984) Am. J. Vet. Res. 45: 1899-1905). Povoljno, CDV može biti kultivisan u plućnim ćelijama lasice, kao što su one opisane u SAD Patentu br. 5, 178, 862. Druge tehnike za pripremu imunogena poreklom od virusa poznate su u tehnici, i opisane, na primer, u Ulmer et ah, Science 259: 1745 (1993); Male et ah, Advanced Immunology, pages 14. 1-14. 15, J. B. Lippincott Co., Philadelphia, Pa. (1989).

Takođe su korisni imunogeni sintetički peptidi koji imitiraju antigene peptidne sekvence. Takvi imunogeni mogu biti sintetisati primenom tehnike čvrste faze kao što je opisano, na primer, u R B. Merrifield, Science 85: 2149- 2154 (1963), prečišćeni i izborno spojeni za nosač protein kao što je muramil dipeptid (MDP), goveđi serum albumin (BSA), hemocijanin iz prilepka (KLH), i slično, primenom bifunkcionalnog kuplujućeg sredstva kao što je glutaraldehid, i slično.

Sintetički antigeni su takođe uključeni unutar definicije, na primer, poliepitopi, bočni epitopi i drugi rekombinantni ili sintetički izvedeni antigeni. Videti, npr., Bergmann et ah (1993) Eur. J. Immunol. 23, 2777-2781; Bergmann et ah (1996) J. Immunol. 157, 3242-3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol. Cell Biol. 75, 402-408; Gardner et ah (1998) 12th World AIDS

Conference, Geneva, Switzerland, Jun. 28-Jul. 3, 1998. Imunogeni fragmenti mogu obično da obuhvataju najmanje oko 3 aminokiseline, poželjno najmanje oko 5 aminokiselina, poželjnije najmanje oko 10-15 aminokiselina, i najpoželjnije 25 ili više aminokiselina, molekula. Ne postoji kritična gornja granica dužine fragmenta, koja bi mogla da sadrži skoro ćelu dužinu proteinske sekvence, ili čak fuzioni protein koji sadrži dva ili više, ili najmanje jedan epitop proteina.

Prema tome, minimalna struktura nukleinske kiseline koja eksprimira epitop može da sadrži nukleotide koji kodiraju epitop, imunogen ili antigen proteina ili poliproteina. Nukleinska kiselina koja kodira fragment celog proteina ili poliproteina, povoljnije, sadrži ili se uglavnom sastoji minimalno od oko 21 nukleotida, povoljno najmanje oko 42 nukleotida, i poželjno najmanje oko 57, oko 87 ili oko 150 uzatopnih ili kontinuiranih nukleotida sekvence koja kodira ceo protein ili poliprotein. Postupci određivanja epitopa, kao što su, stvaranje preklapajućih peptidnih biblioteka (Hemmer B. et ah, (1998) Immunology Today 19(4), 163-168), Pepscan (Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3998-4002; Geysen et ah, (1985) Proc. Nat Acad. Sci. USA 82, 178-182; Van der Zee R. et ah, (1989) Eur. J. Immunoh 19, 43-47; Geysen H. M., (1990) SoutheasfAsian J. Trop. Med. Public Health 21, 523-533; MultipinR Peptide Synthesis Kits de Chiron) i algoritmi (De Groot A. et ah, (1999) Nat. Biotechnol. 17, 533-561), i u PCT prijavi serijski br. PCT/US2004/022605. Drugi dokumenti koji su citirani i obuhvaćeni ovde mogu takođe biti konsultovani za postupke za određivanje epitopa imunogena ili antigena i na taj način molekula nukleinskih kiselina koji kodiraju takve epitope.

U predstavljenom opisu, aktivna imunogena komponenta takođe može da sadrži terapeutsko sredstvo, citokin, toksin, imunomodulator, protein, peptid, antitelo, antigen-vezujući fragment antitela, adjuvant, ili bilo koji drugi molekul koji može biti kodiran od strane DNK i poželjan za primenu na životinju, životinjsku ćeliju ili tkivo.

Takođe razmatrano u predstavljenom pronalasku je uključenost antisens, katalitičkih ili malih interferirajućih RNK vrsta u imunogenim kompozicijama i kompozicijama vakcine prema predstavljenom pronalasku, koje mogu ciljno da deluju na svaki molekul koji je prisutan unutar ćelije primaoca ili koji je verovatno prisutan unutar ćelije primaoca. One obuhvataju, ali bez ograničenja na, RNK vrste koje kodiraju ćelijske regulatome molekule, kao što je interleukin-6, agense uzročnike kancera kao što je humani papilomavirus, enzime, virusnu RNK i RNK izvedenu iz patogena, kao što je HIV-1 RNK. Na RNK-e takođe se može ciljno delovati na ne-transkribovanim DNK sekvencama, kao što su promotor ili pojačivački regioni, ili bilo koji drugi molekul prisutan u ćelijama primaocima, kao što su, ali bez ograničenja na, enzimi uključeni u sintezu DNK ili molekuli tRNK.

Pored toga, citokini i imunomodulatori takođe mogu biti ko-eksprimirani u imunogenim kompozicijama i kompozicijama vakcine prema predstavljenom pronalasku. Primeri obuhvataju, ali bez ograničenja na, IL-2, IL-4, TNF-α GM-CSF, IL-10, IL-12, IGF-1, IFN-α, IFN-β i IFN-γ.

Specifični motivi sekvence, kao što je RGD motiv, mogu biti inserirani u H-I petlju virusnog ili plazmiđnog vektora da bi se povećala njegova infektivnost. Pokazano je daje ova sekvenca esencijalna za interakciju određenog ekstracelulamog matriksa i adhezionih proteina sa superfamilijom receptora ćelijske površine pod nazivom integrini. Insercija RGD motiva može biti povoljno korisna kod subjekata sa oslabljenim imunim sistemom. Rekombinantni vektor može biti konstruisan kloniranjem specifičnog antigena, imunogena ili njihovih fragmenata u bilo koji od vektora kao što su oni opisani ovde. Rekombinantni vektor može biti korišćen za prenošenje ćelija kičmenjaka za primenu kao imunizujuće sredstvo (Videti, na primer, SAD Patentnu prijavu ser. br. 10/424, 409, koja je ovde obuhvaćena referencom).

Poželjno, kodoni koji kodiraju aktivne imunogene komponente, kao što su antigeni, imunogeni i epitopi, su,, optimizovani“ kodoni, tj., kodoni su oni koji se javljaju često u, tj., visoko ekrpmiranim genima pasa, umesto onih kodona koje često koriste, na primer, CDV ili cPi2. Takva upotreba kodona obezbeđuje efikasnu ekspresiju aktivne imunogene komponente u ćelijama. U drugim varijantama, na primer, kada je aktivna imunogena komponenta eksprimirana u bakterijama, gljivama ili drugom ekspresionom sistemu, obrazac upotrebe kodona je promenjen da bi predstavljao sklonost kodona ka visoko eksprimiranim genima u organizmu u kome je eksprimiran antigen ili imunogen. Obrasci upotrebe kodona su poznati u literaturi za visoko eksprimirane gene mnogih vrsta (npr., Nakamura et al., 1996; Wang et al, 1998; McEwan et al. 1998).

U nekim slučajevima može biti neophodno modifikovati kodirajuću sekvencu tako da ona može biti vezana za kontrolne sekvence sa odgovarajućom orijentacijom; tj., da bi se održao ispravan okvir čitanja. Takođe može biti poželjno proizvesti mutante ili analoge željenih aktivnih imunogenih komponenti. Mutanti ili analozi mogu biti pripremljeni delecijom dela sekvence koja kodira protein, insercijom sekvence, i/ili supstitucijom jednog ili više nukleotida unutar sekvence. Tehnike za modifikaciju nukleotidnih sekvenci, kao stoje mutageneza usmerena na mesto, opisani su u, npr., Sambrook et al., supra; DNA Cloning, supra; Nucleic Acid Hybridization, supra.

Imunogeni korisni kao aktivne imunogene komponente u predstavljenom pronalasku mogu biti sadržani u vektorima. Takvi vektori obuhvataju, ali bez ograničenja na, in vivo rekombinantne ekspresione vektore kao što su nukleinsko kiselinski vektor ili plazmid (EP prijava br. 1001025; Chaudhuri P, (2001) Res. Vet Sci. 70, 255-6), virusni vektori kao što su, ali bez ograničenja na, adenovirusni vektori, poksvirusni vektori kao što je virus boginja pernate živine (SAD Patent serijski br. 5, 174, 993; 5, 505, 941; i 5, 766, 599) vektori virusa boginja kanarinaca (SAD Patent serijski br. 5, 756, 103), retrovirusni vektori, herpes virusni vektori, vektori na bazi alfavirusa, gljivični vektori ili bakterijski vektori (Escherichia coli ili vrste Salmonella). Ovde su opisani specifični primeri vektora korisnih u pronalasku.

Vektor može biti virusni vektor, povoljno vektor virusa ptičjih boginja koji sadrži najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu, njen epitop, ili njen fragment. U posebno povoljnoj varijanti, vektor virusa ptičjih boginja je vektor virusa boginja kanarinaca, povoljno, atenuirani vektor virusa boginja kanarinaca kao što je ALVAC. Atenuirani virusi boginja kanarinaca opisani su u SAD Patentu br. 5, 756, 103 (ALVAC) i WO01/05934. Vektor boginja ptica može biti vektor boginja pernate živine, povoljno atenuirani vektor boginja pernate živine kao što je TROVAČ. Takođe se može navesti SAD Patent br. 5, 766, 599 koji se odnosi na atenuirani soj boginja pernate živine TROVAČ. S ovim u vezi, može se navesti virus boginja kanarinaca dostupan iz ATCC pod brojem VR-111. Brojni sojevi virusa boginja pernate živine za imunizaciju takođe su dostupni, npr. DIFTOSEC CT soj koji se prodaje u Merial i NOBILIS VARIOLE vakcina koja se prodaje u Intervet; i takođe se može navesti SAD Patent br. 5, 766, 599 koji se odnosi na atenuirani soj boginja pernate živine TROVAČ.

Virusni vektor koji je takođe koristan za primenu aktivnih imunogenih komponenti obuhvata poksvirus, npr. vakcinija virus ili atenuirani vakcinija virus, (na primer, MVA, modifikovani Ankara soj dobijen posle više od 570 pasaža Ankara soja vakcine na fibroblastima embriona pileta; videti Stickl & Hochstein-Mintzel, (1971) Munch. Med Wschr.

113, 1149-1153; Sutter et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 10847-10851; dostupan kao ATCC VR-1508; ili NYVAC, videti SAD Patent br. 5, 494, 807, na primer, Primeri 1 do 6 iz SAD Patenta br. 5, 494, 807 koji razmatra konstrukciju NYVAC, kao i varijaciju NYVAC sa dodatnim otvorenim okvirima čitanja deletiranim iz genoma Copenhagen soja vakcinija virusa, kao i inserciju heterolognih nukleinsko kiselinskih kodirajućih sekvenci u mesta ovog rekombinanta, i takođe, upotrebu podešenih promotora; videti takođe WO96/40241) avipoks virus ili atenuirani avipoksvirus (npr., kanaripoks, virus boginja pernate živine, virus boginja goluba, kravljih boginja, virus boginja prepelica, ALVAC ili TROVAČ; videti, npr., SAD

Patent br. 5, 505, 941, 5, 494, 807), virus boginja svinja, virus boginja rakuna, virus boginja kamila ili virus miksomatoze.

Za informacije o postupku za stvaranje njegovih rekombinanata i kako primenjivati njegove rekombinante, stručnjak iz date oblasti tehnike može da se posluži dokumentima koji su ovde citirani i sa WO90/12882, npr., kako je vakcinija virus naveden u SAD Patentima br. 4, 769, 330, 4, 722, 848, 4, 603, 112, 5, 110, 587, 5, 494, 807, i 5, 762, 938 pored ostalog; kako se virus boginja pernate živine navodi u SAD Patentima br. 5, 174, 993, 5, 505, 941 i US-5, 766, 599 pored ostalog; kako se virus boginja kanarinaca navodi u SAD Patentu br. 5, 756, 103 pored ostalog; kako se virus svinjskih boginja navodi u SAD Patentu br. 5, 382, 425 pored ostalog; i, kako se virus boginja rakuna, navodi u W000/03030, pored ostalog.

Kada je ekspresioni vektor vakcinija virus, inserciono mesto ili mesta za nukleinsku kiselinu ili nukleinske kiseline koje kodiraju aktivne imunogene komponente kao što su imunogeni, antigeni, epitopi i slično, koji će se eksprimirati povoljno su na genu za timidin kinazu (TK) ili insercionom mestu, genu za hemaglutinin (HA) ili insercionom mestu, regionu koji kodira inkuziono telo A tipa (ATI); videti takođe dokumenta koja su ovde citirana, naročito ona koja se odnose na vakcinija virus. U slučaju virusa boginja kanarinaca, povoljno inserciono mesto ili mesta su ORF(s) C3, C5 i/ili C6; videti takođe dokumenta koja su ovde citirana, naročito ona koja se odnose na virus boginja kanarinaca. U slučaju virusa boginja pernate živine, povoljno inserciono mesto ili mesta su ORF-i F7 i/ili F8; videti takođe dokumenta koja su ovde citirana, naročito ona koja se odnose na virus boginja pernate živine. Inserciono mesto ili mesta za MVA virus povoljno su kao u različitim publikacijama, uključujući Carroll M. W. et al. (1997) Vaccine 15(4), 387-394; Stittelaar K. J. et al. (2000) J. Virol., 2000, 74(9), 4236-4243; Sutter G. et al. (1994) Vaccine 12(11), 1032-1040; i, s ovim u vezi takođe je potrebno naglasiti daje ceo MVA genom opisan u Antoine G., (1998) Virology 244, 365-396, koji omogućava stručnjaku iz date oblasti tehnike da koristi druga inserciona mesta ili druge promotore.

Povoljno, nukleinska kiselina koja će biti eksprimirana može biti inserirana pod kontrolom specifičnog promotora poksvirusa, npr., vakcinija promotora 7. 5 kDa (Cochran et al., (1985) J. Virology 54, 30-35), vakcinija promotora I3L (Riviere et al., (1992) J. Virology 66, 3424-3434), vakcinija promotora HA (Shida, (1986) Virology 150, 451-457), vakcinija promotora 42K (Cooper J. A. et al, (1981) J. Virol. 37(1), 284-94), promotora virusa kravljih boginja ATI (Funahashi et al (1988) J. Gen. Virol. 69, 35-47), vakcinija 11K promotora (SAD Patent br. 5, 017, 487); vakcinija promotora H6 (Taylor J. et al., (1988) Vaccine 6, 504-508;

Guo P. et al. (1989) J. Virol. 63, 4189-4198; Perkus M. et al. (1989) J. Virol. 63, 3829-3836), ili sintetičkih vakcinija ili poksivursnih promotora, pored ostalog.

Povoljno, za imunizaciju sisara, ekspresioni vektor može biti vektor boginja kanarinaca ili boginja pernate živine. Na ovaj način, može postojati ekspresija heterolognih proteina sa ograničenom produktivnom replikacijom ili bez produktivne replikacije.

Drugi virusni vektor koristan za primenu i ekspresiju aktivnih imunogenih komponenti je adenovirus. Adenovirus je DNK virus bez omotača. Vektori izvedeni iz adenovirusa imaju određeni broj karakteristika koje ih čine naročito korisnim za genski transfer. Rekombinantni adenovirusni vektor je adenovirusni vektor koji nosi jednu ili više heterolognih nukleotidnih sekvenci (npr., dve, tri, četiri, pet ili više heterolognih nukleotidnih sekvenci). Na primer, biologija adenovirusa je detaljno okarakterisana, virus je ekstremno efikasan u uvođenju svoje DNK u ćeliju domaćina, virus može da inficira široki niz ćelija i ima širok opseg domaćina, virus može biti proizveden u velikim količinama sa relativnom lakoćom, i virus može postati takav da ima defektnu replikaciju putem delecija u ranom regionu 1 (,, E1“) virusnog genoma.

Za razliku od, na primer, retrovirusa, adenovirusi se ne integrišu u genom ćelije domaćina, sposobni su da inficiraju ćelije koje se ne dele, i sposobni su da efikasno prenose rekombinantne gene in vivo (Brody et al., 1994). Ove karakteristike čine adenoviruse privlačnim kandidatima za in vivo genski transfer, na primer, heterologne nukleinske kiseline od interesa u ćelije, tkiva ili subjekte kod kojih postoji potreba za tim.

Adenovirusni vektori koji sadrže višestruke delecije poželjni su kako za povećanje kapaciteta nosivosti vektora tako i za smanjenje verovatnoće da rekombinacija stvori replikaciono kompetentni adenovirus (RCA). U slučaju gde adenovirus sadrži višestruke delecije, nije neophodno da svaka od delecija, ako je prisutna pojedinačno, ima za rezultat adenovirus sa defektnom replikacijom. Sve dok delecije daju adenovirus sa defektnom replikacijom, dodatne delecije mogu biti uključene za druge svrhe, npr., za povećanje kapaciteta nosivosti adenovirusnog genoma za heterologne nukleotidne sekvence. Poželjno, više od jedne od delecija sprečava ekspresiju funkcionalnog proteina i daje adenovirus sa defektnom replikacijom. Poželjnije, sve delecije su delecije koje bi dale adenovirus sa defektnom replikacijom.

Adenovirusni rekombinanti mogu da obuhvataju El-defektne ili deletirane, E3-defektne ili deletirane, i/ili E4-defektne ili deletirane adenovirusne vektore, ili,, gutless“ adenovirusni vektor u kome su svi virusni geni deletirani. Adenovirusni vektori mogu da sadrže mutacije u El, E3 ili E4 genima, ili delecije u ovim ili svim adenovirusnim genima. E1 mutacija podiže granicu bezbednosti vektora zbog toga što je za El-defektne adenovirusne mutante poznato da su sa defektnom replikacijom u ne-dozvoljenim ćelijama, i da su, najmanje, visoko atenuirani. E3 mutacija pojačava imunogenost antigena prekidanjem mehanizma pomoću koga adenovirus nishodno reguliše MHC klasu I molekula. E4 mutacija smanjuje imunogenost adenovirusnog vektora supresijom kasne genske ekspresije, na taj način može da omogući ponovljenu re-imunizaciju korišćenjem istog vektora. Razmatrani su adenovirusni vektori bilo kog serotipa ili serogrupe koji su deletirani ili mutinari u El, E3, E4, E1 i E3, i E1 i E4.

,, Gutless“ adenovirusni vektor je najnovi model u familiji adenovirusnih vektora i izveden je od humanih adenovirusnih sekvenci. Njegova replikacija zahteva pomoćni virus i specijalnu humanu 293 ćelijsku liniju koja eksprimira Ela i Cre, stanje koje ne postoji u prirodnoj sredini; vektor je lišen svih virusnih gena, na taj način vektor kao nosač vakcine je ne-imunogen i može biti inokulisan više puta za reimunizaciju.,, Gutless“ adenovirusni vektor takođe sadrži prostor od 36 kb za obuhvatanje heterologne nukleinske kiseline (kiselina) od interesa, na taj način omogućavajući ko-primenu velikog broja antigena ili imunogena u ćelije.

Vektor može biti svaki rekombinantni virus ili virusni vektor, uključujući, bez ograničenja, poksvirus (npr., vakcinija virus, virus ptičjih boginja, virus boginja kanarinaca, virus boginja pernate živine, virus boginja rakuna, virus boginja svinja, itd. ), adenovirus (npr., adenovirus pasa), herpesvirus, baculovirus, retrovirus ili vektor može biti plazmid. Ovde citirana dokumenta, pored obezbeđenja primera vektora koji su korisni u praksi pronalaska, takođe mogu da obezbede izvore za druge aktivne imunogene komponente koje će eksprimirati vektor ili vektori u, ili koje su uključene u, stabilizovanim imunogenim kompozicijama, suspenzijama ili rastvorima prema pronalasku.

Elementi za ekspresiju aktivnih imunogenih komponenti mogu povoljno biti prisutni u plazmidnom vektoru. Termin plazmid pokriva svaku DNK transkripcionu jedinicu koja sadrži nukleinsku kiselinu prema pronalasku i elemente neophodne za njenu in vivo ekspresiju u ćeliji ili ćelijama željenog domaćina ili ciljnog mesta; i, s tim u vezi, zabeleženo je da je određeno tako da su super-namotan u obliku zavojnice ili ne-super zamotan u obliku navojnice, kružni plazmid, kao i linearni oblik, unutar obima pronalaska.

Na minimalan način, ekspresija aktivne imunogene komponente, kao što je antigen, imunogen i epitop, sadrži inicijacioni kodon (ATG), stop kodon i promotor i izborno takođe poliadenilacionu sekvencu za određene vektore kao što su plazmid i određeni virusni vektori, npr., virusni vektori osim poskvirusa. Kada nukleinska kiselina kodira poliproteinski fragment u vektoru, ATG se nalazi na 5' terminusu okvira čitanja i stop kodon se nalazi na 3' terminusu.

Mogu biti prisutni drugi elementi za kontrolu ekspresije, kao što su pojačivačke sekvence, stabilizujuće sekvence i signalne sekvence koje omogućavaju ekspresiju, modifikaciju i sekreciju proteina.

Nukleinska kiselina „kodirajuća sekvenca“ ili „nukleotidna sekvenca koja kodira" određeni protein je DNK sekvenca koja je transkribovana i translatirana u polipeptid in vitro ili in vivo kada je postavljena pod kontrolu odgovarajućih regulatomih elemenata. Granice kodiraj uće sekvence su određene preko start kodona na 5' terminusu i translacionog stop kodona na 3' terminusu. Kodirajuća sekvenca može da obuhvata, ali bez ograničenja na, prokariotske sekvence, cDNK iz eukariotske iRNK, genomske DNK sekvence iz eukariotske (npr., sisarske) DNK, i čak sintetičke DNK sekvence. Transkripciona terminacona sekvenca obično će se nalaziti 3' prema kodirajućoj sekvenci.

Nukleinsko kiselinski „kontrolni elementi" zajednički označavaju promotore, RNK splajs mesta, mesta vezivanja ribozoma, poliadenilacione signale (npr., poliadenilacioni signali poreklom od goveđeg hormona rasta, SV40 poliadenilacioni signal), transkripcione terminacione sekvence, ushodne regulatome domene, pojačivače, oridžine replikacije (koji mogu biti bakterijskog porekla, npr., izvedeni od bakterijskih vektora kao što je pBR322, ili eukariotskog porekla, npr., autonomno replicirajuće sekvence (ARS)), pakujuće signale, lider sekvence koje mogu ili ne moraju biti sadržane u kodirajućoj sekvenci aktivne imunogene komponente, kao što je imunogen, antigen ili epitop. Ako je signalna sekvenca uključena, ona može biti ili nativna, homologa sekvenca ili heterologna sekvenca. Lider sekvence mogu biti uklonjene od strane domaćina u post-translacionoj obradi. Videti, npr., SAD Patente br. 4, 431, 739; 4, 425, 437; 4, 338, 397, i slično, koji zajedno daju transkripciju i translaciju kodiraj uće sekvence u ćeliji domaćinu.

Ne moraju sve ove kontrolne sekvence da budu prisutne u rekombinantnom vektoru sve dok je željeni gen sposoban da bude transkribovan i translatiran. Kontrolni element, kao što je promotor „usmerava transkripciju" kodirajuće sekvence u ćeliji kada se RNK polimeraza vezuje za promotor i transkribuje kodirajuću sekvencu u iRNK. Rezultirajuća iRNK je zatim translatirana u polipeptid kodiran od strane kodirajuće sekvence.

Niz različitih promotor/pojačivač elemenata može se koristiti u zavisnosti od nivoa i željene tkivno-specifične ekspresije. Promotor može biti konstitutivan ili nducibilan (npr., metalotionein promotor, tetraciklin inducibilni promotor i egdizon inducibilni promotor, pored ostalih), u zavisnosti od željenog obrasca ekspresije. Promotor može biti nativan ili heterologan i može biti prirodna ili sintetička sekvenca. „Heterologan" u ovom kontekstu opisuje transkripcioni inicijacioni region koji se ne nalazi u domaćinu divljeg tipa u koji je uveden transkripcioni inicijacioni region. Promotor je izabran tako da će funkcionisati u ciljnoj ćeliji (ćelijama) ili tkivu (tkivima) od interesa. U predstavljenom pronalasku razmatrani su promotori specifični za mozak, specifični za jetru i specifični za mišiće (uključujući specifične za skeletne, srčani, glatke mišiće i/ili dijafragmu). Sisarski i ptičji promotori su takođe poželjni, naročito promotori pasa.

Promotor može povoljno biti,, rani“ promotor.,, Rani“ promotor je poznat u tehnici i defmisan je kao promotor koji pokreće ekspresiju gena koji je brzo i prolazno eksprimiran u odsustvu nove proteinske sinteze. Promotor takođe može biti,, snažan“ ili „slab" promotor. Termini „snažan promotor" i „slab promotor" poznati su u tehnici i mogu biti defmisani relativnom učestalošću inicijacije transkripcije (puta u minuti) na promotoru. „Snažan" ili „slab" promotor takođe može biti defmisan njegovim afinitetom za RNK polimerazu.

Heterologni gen može biti postavljen pod kontrolu promotora, mesta vezivanja ribozoma (za bakterijsku ekspresiju) i, izborno, pojačivača ili operatora, tako da se DNK sekvenca koja kodira željeni protein transkribuje u RNK u ćeliji domaćinu ili subjektu transformisanom vektorom koji sadrži aktivnu imunogenu komponentu.

Kontrolni elementi i druge regulatome sekvence mogu biti vezani za kodirajuću sekvencu pre insercije u vektor, kao što su klonirajući vektori opisani u prethodnom tekstu. Alternativno, kodirajuća sekvenca može biti klonirana direktno u ekspresioni vektor koji već sadrži kontrolne sekvence i odgovarajuće restrikciono mesto.

Poželjnije, antigeni ili imunogeni su funkcionalno povezani sa, na primer, glavnim neposrednim-ranim promotorom humanog citomegalovirusa (CMV), promotorom simian virusa 40 (SV40), promotorom P-aktina, promotorom albumina, promotorom elongacionog faktora 1-a (EFl-a), PγK promotorom, MFG promotorom ili promotorom Rous sarkoma virusa. Druge ekspresione kontrolne sekvence obuhvataju promotore izvedene od gena imunoglobulina, adenovirusa, goveđeg papiloma virusa, herpes virusa i tako dalje. Svaki sisarski virusni promotor takođe se može koristiti u praksi pronalaska, pored bilo kog psećeg virusnog promotora. Među psećim promotorima virusnog porekla, promotori neposrednih ranih gena infektivnog psećeg herpes virusa, rani (tj., timidin kinaza, DNK helikaza, ribonukleotidna reduktaza) ili kasni promotori, mogu se koristiti u postupcima i vektorima prema predstavljenom pronalasku. Drugi promotori obuhvataju E1 promotor psećeg adenovirusa, kao i promotor psećeg glavnog kompleksa histokompatibilnosti I. Pored toga, u okviru oblasti iskusnog stručnjaka je izbor pogodnog promotora koji eksprimira antigen ili imunogen od interesa u dovoljno visokim nivoima tako da se indukuje ili izazove imunogeni odgovor na antigen ili imunogen, bez nepotrebnog eksperimentisanja.

Spekulisano je da pokretanje transkripcije heterolognog nukleotida sa CMV promotorom može imati za rezultat nishodnu regulaciju ekspresije kod imunokompetentnih životinja (videti, npr., Guo et al., 1996). Prema tome, takođe je poželjno funkcionalno vezati sekvence antigena ili imunogena sa, na primer, modifikovanim CMV promotorom koji ne rezultira u ovoj nishodnoj regulaciji ekspresije antigena ili imunogena.

Vektori takođe mogu da sadrže polilinker ili višestruko klonirajuće mesto (,, MCS“), koje može povoljno da se nalazi nishodno od promotora. Polilinker obezbeđuje mesto za inserciju molekula antigena ili imunogena koji su,, u okviru“ sa promotorskom sekvencom, što ima za rezultat „funkcionalno vezivanje44 promotorske sekvence sa antigenom ili imunogenom od interesa. Višestruka klonirajuća mesta i polilinkeri su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike.

Vektori koji su ovde opisani takođe mogu da sadrže gene za otpornost na antibiotike. Primeri takvih gena za otpornost na antibiotike koji mogu biti ugrađeni u vektore prema pronalasku obuhvataju, ali bez ograničenja na, gene za otpornost na ampicilin, tetraciklin, neomicin, zeocin, kanamicin, bleomicin, higromicin, hloramfenikol, pored ostalih.

U varijantama gde postoji više od jednog antigena ili imunogena, sekvence antigena ili imunogena mogu biti funkcionalno vezane sa jednim ushodnim promotorom ijednom ili više sekvenci nishodnih unutrašnjih mesta za ulazak ribozoma (IRES) (npr., EMC IRES sekvenca pikomavirusa). IRES sekvenca omogućava multicistronsku translaciju dve ili više kodirajućih sekvenci iz jedne iRNK sekvence.

Vektori se mogu koristiti za transformaciju odgovarajuće ćelije domaćina ili subjekta. Određeni broj sisarskih ćelijskih linija poznat je u tehnici i obuhvata imortalizovane ćelijske linije dostupne iz American Type Culture Collection (ATCC), kao što su, ali bez ograničenja na, ćelije janika kineskog hrčka (CHO), HeLa ćelije, ćelije bubrega mladunčeta hrčka (BHK), ćelije bubrega majmuna (COS), ćelije humanog hepatoćelijskog karcinoma (npr., Hep G2), Madin-Darby ćelije bubrega goveda (,, MDBK“), Madin-Darby ćelije bubrega pasa (,, MDCK“), kao i druge. Slično, bakterijski domaćini kao što su E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella spp., Shigella spp. i Streptococcus spp., naći će primenu u predstavljenom pronalasku. Gljive domaćini korisni u predstavljenom pronalasku obuhvataju pored ostalih, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Candida maltosa, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces fragilis, Kluyveromyces lactis, Pichia guillerimondii, Pichia pastoris, Schizosaccharomyces pombe i Yarrowia lipolytica. Insekti domaćini korisni u predstavljenom pronalasku obuhvataju, ali bez ograničenja na, ćelije Spodoptera frugiperda.

Alternativno, vektori se mogu koristiti za inficiranje ćelije u kulturi da bi se eksprimirao željeni genski proizvod, npr., da bi se proizveo protein ili peptid od interesa. Poželjno, protein ili peptid je izlučen u medijum i može biti prečišćen iz njega primenom rutinskih tehnika poznatih u tehnici. Signalne peptidne sekvence koje usmeravaju ekstracelulamu sekreciju proteina poznate su u tehnici i nukleotidne sekvence koje kodiraju isti mogu biti funkcionalno vezane za nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid ili protein od interesa pomoću rutinskih tehnika poznatih u tehnici. Alternativno, ćelije mogu biti lizirane i eksprimiran rekombinantni protein može biti prečišćen iz ćelijskog lizata. Poželjno, ćelija je ćelija kičmenjaka, poželjnije sisarska ćelija.

Postupci za pripremu i/ili primenu vektora, rekombinanata ili plazmida za ekspresiju

genskih proizvoda gena bilo in vivo ili in vitro mogu biti bilo koji željeni postupak, npr., postupak koji je analogan postupcima opisanim u, ili je opisan u dokumentima citiranim u: SAD Patentima br. 4, 603, 112; 4, 769, 330; 4, 394, 448; 4, 722, 848; 4, 745, 051; 4, 769, 331; 4, 945, 050; 5, 494, 807; 5, 514, 375; 5, 744, 140; 5, 744, 141; 5, 756, 103; 5, 762, 938; 5, 766, 599;

5, 990, 091; 5, 174, 993; 5, 505, 941; 5, 338, 683; 5, 494, 807; 5, 591, 639; 5, 589, 466; 5, 677, 178;

5, 591, 439; 5, 552, 143; 5, 580, 859; 6, 130, 066; 6, 004, 777; 6, 130, 066; 6, 497, 883; 6, 464, 984;

6, 451, 770; 6, 391, 314; 6, 387, 376; 6, 376, 473; 6, 368, 603; 6, 348, 196; 6, 306, 400; 6, 228, 846;

6, 221, 362; 6, 217, 883; 6, 207, 166; 6, 207, 165; 6, 159, 477; 6, 153, 199; 6, 090, 393; 6, 074, 649;

6, 045, 803; 6, 033, 670; 6, 485, 729; 6, 103, 526; 6, 224, 882; 6, 312, 682; 6, 348, 450 i 6; 312, 683; SAD patentna prijava serijski br. 920, 197, koja je podneta 16. 10. 1986.; WO 90/01543; WO 91/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11313-11318; Ballay et al. (1993) EMBO J. 4, 3861-65; Felgner et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 2550-2561; Frolov et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11371-11377; Graham, F. L. (1990) Trends Biotechnol. 8, 85-87; Grunhaus et al. (1992) Sem. Virol. 3, 237-52; Ju et al. (1998) Diabetologia 41, 736-739; Kitson et al. (1991) J. Virol. 65, 3068-3075; McClements et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11414-11420; Moss, B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11341-11348; Paoletti, E. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11349-11353; Pennock et al. (1984) Mol. Cell. Biol: 4, 399-406; Richardson (Ed), (1995) Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols, " Humana Press Ine.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3, 2156-2165; Robertsonet al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11334-11340; Robinson et al. (1997) Sem. Immunol. 9, 271; i Roizman, B. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 11307-11312.

Ekspresija heterologne sekvence u subjektu može imati za rezultat imuni odgovor u subjektu na ekspresione proizvode antigena ili imunogena. Na taj način, aktivne imunogene komponente mogu se koristiti u imunogenoj kompoziciji ili kompoziciji vakcine da bi se obezbedila sredstva za indukovanje imunog odgovora, koja mogu, ali ne moraju, biti zaštitna. Tehnike molekularne biologije koje se koriste u kontekstu pronalaska opisali su Sambrook et al. (2001).

Čak dalje alternativno ili dodatno, u imunogenim ili kompozicijama vakcine, nukleotidna sekvenca koja kodira antigene ili imunogene može imati deletirani deo koji kodira transmembranski domen. Čak dalje alternativno ili dodatno, vektor ili imunogena kompozicija može dalje da sadrži i eksprimira u ćeliji domaćinu nukleotidnu sekvencu koja kodira heterolognu tPA signalnu sekvencu kao stoje sisarska tPA i/ili stabilizujući intron, kao što je intron II zečjeg P-globin gena.

Vektor može biti primenjen na subjekta u količini da bi se postigle količine navedene za kompozicije genskog proizvoda (npr., epitop, antigen, lek i/ili antitelo). Obuhvaćene su doze ispod i iznad onih koje su ovde ilustrovane, i za svaku kompoziciju koja će se primenjivati na subjekta, uključujući njene komponente, i za svaki određeni postupak primene, poželjno je odrediti toksičnost, kao što je putem određivanja srednje infektivne doze ćelijske kulture (CCID50), letalne doze (LD) i LD50 kod pogodnog subjekta; i doze kompozicije, koncentracije komponenti u njoj i vremena primene kompozicije, koja izaziva pogodan odgovor, kao što je putem titracija seruma i njegovom analizom, npr., pomoću ELISA i/ili seroneutralizacione analize. Takva određivanja ne zahtevaju nepotrebno eksprimentisanje stručnjaka iz date oblasti tehnike, ovog opisa i dokumenata koji su ovde citirani.

Multivalentne imunogene kompozicije i/ili kompozicije vakcine i/ili imunogene suspenzije ili rastvori koji sadrže živi atenuirani CAV2, živi atenuirani CDV, živi atenuirani cPi2 i živi atenuirani CPV, i koji sadrže stabilizator prema predstavljenom pronalasku testirane su u Primerima koji su ovde dati. Ove multivalentne vakcine pokazale su dobru stabilnost za CDV, cPi2, CAV2 i CPV. Ovo pokazuje da su stabilizatori prema predstavljenom pronalasku sposobni da očuvaju vijabilnost i infektivnost CDV, cPi2, CAV2 i CPV. Ovo takođe pokazuje da su stabilizatori prema predstavljenom pronalasku sposobni da očuvaju vijabilnost i infektivnost različitih virusa osim paramiksovirusa pasa, posebno parvovirusa pasa i adenovirusa pasa. Stabilizatori prema predstavljenom pronalasku takođe se mogu koristiti kao monovalentna imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine koja sadrži CAV, CPV, CDV ili cPi2.

Poželjno jedna zapremina multivalentne suspenzije ili rastvora (tj. paramiksovirusa pasa i najmanje jedna aktivna imunogena komponenta izvedena od patogena osim paramiksovirusa) pomešana je sa jednom zapreminom stabilizatora.

Pronalazak takođe daje postupak za proizvodnju zamrzavanjem osušene stabilizovane žive atenuirane imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine koja sadrži, na primer, paramiksoviruse pasa, koji sadrži korak liofilizacije stabilizovane suspenzije ili rastvora formiranog pomoću suspenzije ili rastvora živog atenuiranog paramiksovirusa pasa, pomešanog sa stabilizatorom prema pronalasku.

Sledeći aspekt predstavljenog pronalaska je postupak za proizvodnju zamrzavanjem osušene stabilizovane multivalentne imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine, koji sadrži korak liofilizacije stabilizovane multivalentne suspenzije ili rastvora koji sadrži, na primer, suspenziju ili rastvor živog atenuiranog paramiksovirusa pasa i najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu izvedenu od patogena osim paramiksovirusa, pomešanu sa stabilizatorom prema pronalasku.

„Sušenje zamrzavanjem" obuhvata liofilizaciju i odnosi se na postupak pomoću koga je suspenzija zamrznuta, nakon čega se voda uklanja sublimacijom na niskom pritisku. Kao što je ovde korišćen, termin „sublimacija" odnosi se na pramenu u fizičkim osobinama kompozicije, pri čemu se kompozicija menja direktno iz čvrstog stanja u gasovito stanje bez prelaska u tečnost. Kao što je ovde korišćena,,, T'g vrednost" je definisana kao temperatura staklenog prelaza, koja odgovara temperaturi ispod koje zamrznuta kompozicija postaje staklasta.

Postupak za sušenje zamrzavanjem imunogene suspenzije ili rastvora prema pronalasku može da sadrži korake (a) dovođenja u kontakt imunogene suspenzije ili rastvora sa stabilizatorom prema pronalasku, čime se formira stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor; (b) hlađenja, na atmosferskom pritisku, stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora do temperature manje od oko T'g vrednosti stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora; (c) sušenja stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora (tj., korak primame desikacije ili sublimacije) sublimacijom leda na niskom pritisku; i (d) uklanjanja viška preostale vode (tj., sekundarni korak sušenja ili desorpcije) dodatnim snižavanjem pritiska i povećanjem temperature stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora.

Korak hlađenja (b) može da se javi na temperaturama nižim od oko -40°C (korak zamrzavanja vode). Sušenje stabilizovanih imunogenih suspenzija ili rastvora sublimacijom leda na niskom pritisku (c) može da se javi na, na primer, pritisku nižem od ili jednakom oko 200 Pbar, pri čemu se dodatno snižavanje pritiska može javiti na pritiscima nižim od ili jednakim oko 100 Pbar. Konačno, temperatura stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora u toku uklanjanja viška preostale vode (d) javlja se, na primer, na temperaturama između oko 20°C i oko 30°C.

Postupak sušenja zamrzavanjem takođe se može izvesti sa imunogenom suspenzijom ili rastvorom koji sadrži živi atenuirani paramiksovirus pasa i najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu izvedenu od patogena osim paramiksovirusa, koja je pomešana sa stabilizatorom prema pronalasku da bi se dobila osušena zamrzavanjem stabilizovana multivalentna imunogena ili kompozicija vakcine.

Sadržaj vlage materijala osušenog zamrzavanjem može biti u opsegu od oko 0. 5% do oko 5% tež. /tež., poželjno od oko 0. 5% do oko 3% tež. /tež., i poželjnije od oko 1. 0% do oko 2. 6% tež. /tež.

Povoljno, stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor koji sadrži najmanje jedan pinilac ima visoku T'g vrednost od između oko -36°C do oko -30°C. Visoka T'g vrednost omogućava više temperature u toku koraka zamrzavanja vode postupka zamrzavanja i/ili postupka sušenja zamrzavanjem, čime se smanjuje izloženost živog atenuiranog virusa i aktivne imunogene komponente stresu, izbegavajući značajan gubitak aktivnosti.

Svaki korak, uključujući zamrzavanje vode, i njeno uklanjanje u toku primame i sekundarne desikacije, podvrgava biološke sastojke, kao što su patogeni, u imunogenim suspenzijama ili rastvorima prema pronalasku mehaničkom, fizičkom i biohemijskom šoku, koji imaju potencijalno štetne efekte na strukturu, izgled, stabilnost, imunogenost, infektivnost i vijabilnost patogena ili bioloških sastojaka.

Stabilizatori prema pronalasku obezbeđuju dobru stabilnost živih atenuiranih patogena kao što je paramiksovirus pasa, i održavaju infektivnost, naročito, CDV-a i cPi2 u toku postupka sušenja zamrzavanjem i u toku čuvanja. Stabilnost može biti izračunata preko razlike između titra infektivnosti pre koraka sušenja zamrzavanjem, i titra infektivnosti posle 12 meseci čuvanja osušene zamrzavanjem stabilizovane imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine na 4°C. Dobra stabilnost može povoljno da sadrži razliku od samo 1. 2 loglO i poželjno od samo 1. 0 loglO. Postupci za određivanje titra infektivnosti su dobro poznati stručnjacima iz date oblasti tehnike. Neki postupci za određivanje titra infektivnosti su opisani u Primerima koji su ovde dati. Takođe, stabilnost može biti procenjena,, fitovanjem“ loglO titra i vremenskih tačaka titracije u toku perioda čuvanja primenom izračunavanja i/ili algoritama linearne regresije.

Pored toga, stabilizatori prema pronalasku obezbeđuju osušene zamrzavanjem pastile koje imaju dobar aspekt, drugim rečima, koje imaju pravilan oblik i ujednačenu boju.

Nepravilan oblik može biti okarakterisan prisustvom ćele ili dela pastile zalepljene za dno recipijenta i koja ostaje nepokretna posle obrtanja i bočnog pomeranja (prilepljeni aspekt). Takođe, pastila koja ima oblik kalema (aspekt kalema), ili podela pastile u dva dela, prema horizontalnoj ravni (de-duplicirani aspekt), ili pastila koja ima aspekt musa sa nepravilnim rupama (sunđerasti aspekt), ili pastila koja ima aspekt pene u primaocu (aspekt pene) imaju nepravilan oblik i nisu prihvaćene (Slike 1A i 1B).

Zamrzavanjem osušene imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine koje su stabilizovane primenom stabilizatora prema predstavljenom pronalasku i dobijene pomoću postupka sušenja zamrzavanjem koji je opisan u prethodnom tekstu obuhvaćene su predstavljenim pronalaskom.

U predstavljenom opisu, zamrzavanjem osušena stabilizovana živa atenuirana imunogena ili kompozicija vakcine ili zamrzavanjem osušena stabilizovana multivalentna imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, i (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta.

Zamrzavanjem osušena stabilizovana živa atenuirana imunogena ili kompozicija vakcine ili zamrzavanjem osušena stabilizovana multivalentna imunogena ili kompozicija vakcine može da sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 15% do oko 70% tež. /tež. najmanje jednog punioca.

Stabilizovane zamrzavanjem osušene imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine prema predstavljenom pronalasku mogu da se čuvaju u suvoj atmosferi na temperaturama frižidera i na sobnoj temperaturi, naročito na temperaturama od oko 2°C do oko 35°C, i naročito od oko 4°C do oko 25°C.

Sledeći aspekt predstavljenog pronalaska daje komplet koji sadrži prvu bočicu koja sadrži zamrzavanjem osušenu stabilizovanu živu atenuiranu imunogenu kompoziciju ili kompoziciju vakcine ili zamrzavanjem osušenu stabilizovanu multivalentnu imunogenu kompozicju ili kompoziciju vakcine prema pronalasku, i drugu bočicu koja sadrži rastvarač.

Za njenu upotrebu i primenu na subjekta, zamrzavanjem osušena stabilizovana imunogena kompozicija ili kompozicija vakcine može biti rekonstituisana rehidratacijom sa rastvaračem. Rastvarač je tipično voda, kao što je demineralizovana ili destilovana voda, voda za injekciju, ali takođe može da sadrži fiziološke rastvore ili pufere, kao što je na primer fosfatno puferisani rastvor (PBS) ili adjuvanti uključujući, ali bez ograničenja na, emulzije voda u ulju, Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, aluminij um hidroksid, glukan, dekstran sulfat, gvožđe oksid, natrijum alginat, Bacto-Adjuvant, određeni sintetički polimeri kao što su poli aminokiseline i ko-polimeri aminokiselina, saponin, "REGRESSIN" (Vetrepharm, Athens, Ga. ), "AVRIDINE" (N, N-dioktadecil-N', N'-bis(2-hidroksietil)-propandiamin), parafmsko ulje, muramil dipeptid i slično. Ovde su detaljno opisani drugi specifični primeri adjuvanata i kompozicije adjuvanata.

Pogodni adjuvanti obuhvataju fMLP (N-formil-metionil-leucil-fenilalanin; SAD Patent br. 6, 017, 537) i/ili polimer akrilne kiseline ili metakrilne kiseline i/ili kopolimer anhidrida maleinske kiseline i alkenil derivata. Polimeri akrilne kiseline i metakrilne kiseline mogu biti unakrsno vezani, npr., sa polialkenil etrima šećera ili polialkohola. Ova jedinjenja su poznata pod terminom,, karbomer“ (Pharmeuropa, Vol. 8, No. 2, June 1996). Stručnjak iz date oblasti tehnike takođe može da konsultuje SAD Patent br. 2, 909, 462 (obuhvaćen referencom), koji razmatra takve akrilne polimere unakrsno vezane sa polihidroksilovanim jedinjenjem koje sadrži najmanje 3 hidroksil grupe; polihidroksilovano jedinjenje sadrži ne više od 8 hidroksil grupa; kao sledeći primer, atomi vodonika od najmanje 3 hidroksila su zamenjeni sa nezasićenim alifatičnim radikalima koji sadrže najmanje 2 atoma ugljenika. Radikali mogu da sadrže od oko 2 do oko 4 atoma ugljenika, npr., vinili, alili i druge etilenski nezasićene grupe. Nezasićeni radikali mogu sami po sebi da sadrže druge supstituente, kao što je metil. Proizvodi koji se prodaju pod nazivom Carbopol® (Noveon Ine., Ohio, USA) naročito su pogodni za primenu kao adjuvanti. Oni su unakrsno vezani sa alil saharozom ili sa alilpentaeritritolom, odnosno, mogu se navesti proizvodi Carbopol® 974P, 934P i 97IP.

Kao kopolimeri anhidrida maleinske kiseline i alkenil derivata, mogu se navesti EMA® proizvodi (Monsanto), koji su kopolimeri anhidrida maleinske kiseline i etilena, koji može biti linearan ili unakrsno vezan, na primer, unakrsno vezan sa divinil etrom. Takođe, mogu se navesti SAD Patent br. 6, 713, 068 i Regelson, W. et al., 1960; (obuhvaćeni referencom).

Katjonski lipidi koji sadrže kvatemamu amonijum so opisani su u SAD Patentu br. 6, 713, 068, čiji sadržaj je obuhvaćen ovde referencom, takođe se mogu koristiti u postupcima i kompozicijama prema predstavljenom pronalasku. Među ovim katjonskim lipidima, prednost se daje DMRIE (N-(2-hidroksietil)-N, N-dimetil-2, 3-bis(tetradeciloksi)-l-propan amonijumu; WO96/34109), povoljno vezanom sa neutralnim lipidom, povoljno DOPE (dioleoilfosfatidiletanolamin; Behr J. P. et al, 1994), da bi se formirao DMRIE-DOPE.

Ukupni sadržaj komponenti u rekonstituisanim imunogenim kompozicijama ili kompozicijama vakcine spreminim za injektiranje prema pronalasku može se koristiti da bi se

obezbedila injekcija u izotoničnoj koncentraciji, npr., unutar opsega od oko 100-600 mOsm, generalno unutar oko 250-450 mOsm i poželjno oko 330 mOsm.

Doze živih atenuiranih patogena, posebno CDV i cPi2, u zamrzavanjem osušenim stabilizovanim imunogenim kompozicijama ili kompozicijama vakcine, ili u rekonstituisanim spremnim za injektiranje imunogenim kompozicijama ili kompozicijama vakcine, mogu biti u opsegu od oko IO2 do oko 107 CCIDso/dozi. Za proteine, polipeptide ili glikoproteine u zamrzavanjem osušenoj stabilizovanoj multivalentnoj imunogenoj kompoziciji ili kompoziciji vakcine, ili u rekonstituisanim spremnim za upotrebu multivalentnim imunogenim kompozicijama ili kompozicijama vakcine, može biti u opsegu u ekvivalentnom titru pre inaktivacije od oko 105 do oko IO9 CCID5o po dozi, poželjno od oko 106 do oko 108 CCID50 po dozi.

Rekonstituisane spremne za upotrebu imunogene kompozicije ili kompozicije vakcine mogu se primenjivati na životinju injekcijom preko parenteralnog ili mukozalnog puta, poželjno intramuskulamo ili subkutano. Međutim, primena takvih rekonstituisanih spremnih za upotrebu imunogenih kompozicija ili kompozicija vakcine takođe može da sadrži intranazalnu, epikutanu, topikalnu ili oralnu primenu. Zapremina doze za injekciju može biti od oko 0. 1 ml do oko 2. 0 ml, i poželjno oko 1. 0 ml.

Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću sledećih neograničavajućih Primera, koji su dati kao ilustracija različitih varijanti pronalaska i nisu određeni tako da ograničavaju predstavljeni pronalazak ni na koji način.

PRIMIRI

Primer 1: Priprema stabilizatora

Sastav i količine komponenti u stabilizatorima prikazani su u Tabeli 1.,, Dekstran“ sadrži dekstran-40, 000 koji ima molekularnu težinu od 40, 000 Da. Tabela 1: Sastav stabilizatora

Za svaki stabilizator, jedan litar destilovane vode zagrevan je do temperature od oko 55°C uz mešanje. Jedinjenja su zatim lagano dodavana u vrelu vodu uz održavanje mešanja magnetnom polugom, da bi se olakšalo njihovo rastvaranje. Mešanje je održavano oko 30 minuta posle poslednjeg dodavanja, čime se dobija homogeni rastvor.

Rastvor je zatim hlađen do sobne temperature. Posle hlađenja rastvora, stabilizator je sterilisan sterilnom filtracijom kroz filter koji ima graničnu veličinu pora od 0. 22 pm (Optiscale Durapore). Sterilni rastvori stabilizatora F2, F2B, F6B, F33, F37, A, H, K i U zatim su čuvani na sobnoj temperaturi.

Svaki od stabilizatora dobijenih u Primeru 1 korišćeni su za stabilizaciju virusne suspenzije. Dodato je četiri zapremine stabilizatora na sobnoj temperaturi i uz mešanje u 6 zapremina smeše četiri živa atenuirana virusa pasa. Živi atenuirani virusi pasa bili su virus parainfluence pasa tip 2 (cPi2), virus štenećaka pasa (CDV), adenovirus pasa tip 2 (CAV2) i parvovirus pasa (CPV).

T'g vrednosti ovih stabilizovanih suspenzija merene su sa diferencijalnim skenirajućim kalorimetrom (Mettler Toledo; Viroflay, France) i prikazane su u Tabeli 2.

Tabela 2. T'g vrednost stabilizovanih suspenzija

Stabilizovane suspenzije formulisane sa stabilizatorom dalje su sušene zamrzavanjem. Ciklus sušenja zamrzavanjem sadržao je 3 stadijuma:

(1) Stadijum zamrzavanja: stabilizovane suspenzije, sakupljene u malim bočicama, postavljene su u uređaj za sušenje zamrzavanjem i hlađene preko kontakta sa policama na atmosferskom pritisku sve dok nisu bile potpuno zamrznute. Temperatura polica bila je niža od ili jednaka oko -50°C.

(2) Stadijum sublimacije (ili primame desikacije): Pritisak u uređaju za sušenje zamrzavanjem podešen je do dovoljno niskog pritiska da bi se dobila sublimacija leda (pritisak niži od ili jednak 120 Pbar). Temperatura je regulisana tako da se u toku sublimacije nije javilo otapanje, na temperaturi proizvoda koja je bila niža od ili jednaka -22°C). Para koja nastaje kao rezultat sublimacije je zamrznuta u kondenzatoru leda postavljenom pre vakuumskih pumpi.

(3) Stadijum desorpcije (ili sekundarne desikacije): Na kraju sublimacije, kada je sav led nestao iz proizvoda koji će se sušiti zamrzavanjem, višak slobodne i/ili vezane

rezidualne vode eliminisan je dodatnim snižavanjem pritiska ponovo do manje od ili jednako 30 Pbar u uređaju za sušenje zamrzavanjem i povećanjem temperature do oko 30°C.

Posle sušenja zamrzavanjem, vakuum je narušen primenom sterilnog azota. Boce su zatim zatvorene, i uređaj za sušenje zamrzavanjem je ispražnjen. Meren je sadržaj vlage svake stabilizovane vakcine koja je osušena zamrzavanjem i prikazanje u Tabeli 3.

Tabela 3. Sadržaj vlage stabilizovanih vakcina osušenih zamrzavanjem

Primer 3: Studije stabilnosti posle sušenja zamrzavanjem

Kod zamrzavanjem osušenih pastila dobijenih posle sušenja zamrzavanjem stabilizovanih suspenzija kao što je opisano u Primeru 2 zabeleženo je da postoji razlika između abnormalnih pastila i onih koje imaju pravilan oblik. Pastile osušene zamrzavanjem koje sadrže stabilizator prema predstavljenom pronalasku i koje dalje sadrže punilac (tj. F2, F2B, F33, A, H, K i U) imaju dobar aspekt; sa samo 5 pastila sa F2 stabilizatorom koje imaju prilepljeni aspekt od ukupno 110 (4. 5%). Zamrzavanjem osušene stabilizovane vakcine zatim su čuvane na +4°C.

Određivanje titra virusa vakcina osušenih zamrzavanjem izvedeno je izračunavanjem srednjeg titra tri titracije ponovljene na istoj vakcini. Vakcine osušene zamrzavanjem dobijene posle sušenja zamrzavanjem kao što je opisano u Primeru 2 su rehidratisane u 1 ml vode za injekciju. Svaka vakcina je zatim razblažena da bi se dobila razblaženja od -3. 8 log 10 do -6. 8 log 10.

Za titraciju cPi2, svako razblaženje je postavljeno 6 puta na titracionu ploču u količini od 50 µl po komorici, sa 50 µl rastvora anti-hepatitis antitela i 150 μl ćelijske suspenzije Madin-Darby ćelija bubrega pasa (MDCK ćelija) u 100, 000 ćelija/ml. MDCK ćelije su kultivisane u F15 podlozi za kulturu dopunjenoj sa 2% fetusnog goveđeg seruma. Kao kontrola, 100 μl razblaženja u 150 μl MDCK ćelija postavljeno je u istu komoricu. Svi titracioni plakovi su održavani na 37°C u trajanju od 7 dana. Posle inkubacije, supematanti su uklonjeni iz svake komorice titracionih ploča i postavljeni u nove titracione ploče sa kupastim ćelijama. Eritrociti zamorčeta (Alsever sp. ) dodati su u svaku komoricu koja sadrži supematant. Razblaženje rastvora eritrocita bilo je isto u svim komoricama. Posle 3-4 časa na +4°C, rezultati su dobijeni postavljanjem ploča na beli papir. Virusni napadi zatim su detektovani preko prisustva taloga koji se lako može identifikovati.

Za titraciju CDV, svako razblaženje je postavljeno 6 puta na titracionu ploču, u količini od 50 µl po komorici, sa 50 gl rastvora anti-cPi2 antitela i 150 µl ćelijske suspenzije VERO ćelija (ćelije bubrega majmuna) u 120, 000 ćelija/ml. Vero ćelije su kultivisane u Eagle-ovoj minimalnoj esencijalnoj podlozi (MEM podloga za kulturu) dopunjenoj sa 2% fetusnim goveđim serumom. Kao kontrola, jedna stotina µl razblaženja i 150 µl VERO ćelija je postavljeno u istu komoricu. Sve titracione ploče su održavane na 37°C u trajanju od 7 dana. Posle inkubacije, titracione ploče su postavljen pod mikroskop. Virusni napadi su detektovani preko razgradnje VERO ćelija. Virusni titri su izraženi u loglO infektivne doze za 50% ćelijske kulture po mililitru (CCID50/ml).

Tabela 4 prikazuje smanjenje titara cPi2 i CDV, izraženih u log10 CCID50/ml, posle koraka sušenja zamrzavanjem i perioda čuvanja od 12 meseci na 4°C.

Tabela 4: Smanjenje titara cPi2 i CDV posle sušenja zamrzavanjem i 12-mesečnog čuvanja na

4°C.

Rezultati pokazuju veoma dobru stabilnost kako CDV tako i cPi2 virusa za duge periode čuvanja na 4°C. Za neke od ovih zamrzavanjem osušenih stabilizovanih vakcina, titracije CAV2 i CPV izvedene su u tri kopije. Rezultati ovih titracija dati su u Tabeli 5 kao

smanjenje srednje vrednosti dobijene iz tri titracije, izraženi u loglO CCIDso/ml, neposredno posle koraka sušenja zamrzavanjem i posle perioda čuvanja od 3 meseca (TO+3) na 4°C.

Tabela 5: Smanjenje titara CAV2 i CPV posle sušenja zamrzavanjem i 3-mesečnog čuvanja

na 4°C

Ispitivani su efekti različitih jedinjenja stabilizatora na stabilnost CDV i cPi2 u toku i posle koraka sušenja zamrzavanjem. Naročito, proveravan je efekat ne-redukcionog oligosaharida na stabilnost CDV. Rezultati su dati preko statističke analize na Slici 2A i u Tabeli 6.

Tabela 6: Prosečan titar i standardna devijacija na kraju koraka sušenja zamrzavanjem (na TO)

CDV-a stabilizovanog sa stabilizatorom koji sadrži ne-redukcioni oligosaharid (n=72).

Prisustvo ne-redukcionog oligosaharida u stabilizatoru nema nikakav efekat na titar CDV (ANOVA p-vrednost = 0. 5142).

Proveravan je efekat redukcionog monosaharida na stabilnost CDV. Rezultati su podvrgnuti statističkoj analizi i prikazani su na Slici 2B i u Tabeli 7.

CDV-a stabilizovanog sa stabilizatorom koji sadrži redukcioni monosaharid (n-72).

Kao stoje prikazano u Tabeli 7 i na Slici 2B, prisustvo redukcionog monosaharida u stabilizatoru ima pozitivan efekat na titar CDV (ANOVA p = 0. 0000).

Takođe je ispitivan efekat jedinjenja anti-oksidanta na stabilnost cPi2. Rezultati su podvrgnuti statističkoj analizi na Slikama 3A i 3B, i u Tabelama 8 i 9.

Tabela 8: Prosečan titar i standardna devijacija cPi2 stabilizovanog sa stabilizatorom sa ili bez

asparaginske kiseline (n=T5), na kraju koraka sušenja zamrzavanjem (na TO)

Tabela 9: Prosečan titar i standardna devijacija cPi2 stabilizovanog sa stabilizatorom sa ili bez asparaginske kiseline (n=15), posle koraka sušenja zamrzavanjem i 3-mesečnog perioda

čuvanja na 4°C (na T0+3 meseci).

Nađeno je da prisustvo jedi nj enj a anti-oksidanta u stabilizatoru ima pozitivan efekat na titar cPi2 (ANOVA p= 0. 0000) u toku koraka sušenja zamrzavanjem i u toku perioda čuvanja.

Primer 4: Uporedne studije komponenti stabilizatora

F2 stabilizator (Primer 1) korišćen je kao referenca za merenje smanjenja titra vakcina osušenih zamrzavanjem u poređenju sa drugim stabilizovanim formulacijama osušenim zamrzavanjem. Ove formulacije su dobijene modifikacijom svake komponente kao što je prikazano u Tabeli 10.

Stabilizator F63 je identičan sa F2, ali nema jedinjenje antioksidant.

Stabilizator F62 je identičan sa F2, ali obuhvata fenilalanin umesto asparaginske kiseline.

Stabilizator F42 je identičan sa F2, ali obuhvata mononatrijum so asparaginske kiseline umesto asparaginske kiseline.

Stabilizator F32 je identičan sa F2, ali obuhvata betain umesto redukcionog monosaharida.

Tabela 10: Sastav formulacija

Prve formulacije su korišćene za stabilizaciju vakcina iz Primera 2 i osušene su zamrzavanjem prema postupku koji je ovde opisan. Vakcine koje su osušene zamrzavanjem su rehidratisane u 1 ml vode za injekciju. Određivanje titra cPi2 i titra CDV vakcina izvedeno je izračunavanjem srednjeg titra tri titracije ponovljene na istoj vakcini kao što je izvedeno u Primeru 3. Titri su mereni posle postupka sušenja zamrzavanjem za svaku formulaciju. Ovi titri, izraženi u loglO CCID50/ml, dati su u Tabeli 11.

Tabela 11: Smanjenje titara u toku koraka sušenja zamrzavanjem osušenih zamrzavanjem/rehidratisanih vakcina stabilizovanih sa različitim formulacijama

Ovi rezultati pokazuju da odsustvo jedinjenja antioksidanta proizvodi značajan gubitak u titru za cPi2. Obuhvatanje aminokiseline fenilalanina, kojoj nedostaje antioksiđativni efekat, takođe ima za rezultat gubitak u titru za oba cPi2 i CDV. Slično, obuhvatanje mononatrijum soli antioksidativne asparaginske kiseline proizvodi gubitak u titru za oba cPi2 i CDV. Ovi rezultati takođe pokazuju da odsustvo redukcionog monosaharida ima za rezultat visok gubitak u titru za cPi2 kao i za CDV.

Primer 5: Procena bezbednosti stabilizovanih vakcina kod pasa

Neke od osušenih zamrzavanjem vakcina opisanih u Primeru 2 primenjene su na pse posle rehidratacije u sterilnoj injektabilnoj vodi. Vakcine su sadržale A, H, K i F2B stabilizatore opisane u Primeru 1.

Četiri psa bez specifičnog patogena (SPF) starosti 3 do 5 meseci i 4 obična psa starosti 3 do 5 meseci, po slučajnom izboru su dodeljeni u 4 grupe od po dve životinje, pri čemu je svaka grupa imala jednog SPF psa i jednog običnog psa. Za svaku grupu, dva psa su imunizovana subkutano na dan 0 sa dvostrukom dozom (2 ml) njihove odgovarajuće stabilizovane vakcine. Na dan 14, psi su imunizovani subkutano sa jednom dozom (1 ml) iste stabilizovane vakcine.

Beležene su trenutne lokalne reakcije i trenutne opšte reakcije, rektalne temperature, lokalne reakcije, opšte reakcije i klinički simptomi. Nisu zabeležene nikakve lokalne ili opšte reakcije posle primene. Prema tome, izgleda daje bezbednost stabilizovanih vakcina visoka. [0200] Pronalazak koji je ovde dat biće dalje opisan sledećim numerisanim pasusima:

1. Stabilizator za zamrzavanjem osušenu živu atenuiranu imunogenu kompoziciju štenećaka pasa (CDV) i paramiksovirusa pasa tipa 2 (cPi2) koja sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid i najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant, pri čemu najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije.

2. Stabilizator prema pasusu 1, pri čemu najmanje jedan redukcioni monosaharid sadrži glukozu, galaktozu, fruktozu, manozu, sorbozu ili njihove kombinacije.

3. Stabilizator prema pasusu 1 ili 2, koji dalje sadrži najmanje jedan punilac.

4. Stabilizator prema pasusu 3, pri čemu najmanje jedan punilac sadrži dekstran, maltodekstrin, polivinilpirolidon, hidroksietil škrob ili njihove kombinacije.

5. Stabilizator prema bilo kom od pasusa 1 do 4, koji dalje sadrži najmanje jedan šećerni alkohol.

6. Stabilizator prema pasusu 5, pri čemu najmanje jedan šećerni alkohol sadrži sorbitol, manitol ksilitol, maltitol ili njihove kombinacije.

7. Stabilizator prema bilo kom od pasusa 1 do 6, koji dalje sadrži najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid.

8. Stabilizator prema pasusu 7, pri čemu najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid sadrži trehalozu, saharozu, rafmozu ili njihove kombinacije.

9. Stabilizator prema bilo kom od pasusa 1 do 8, koji dalje sadrži najmanje jedan šećerni alkohol i najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid.

10. Stabilizator prema pasusu 9, pri čemu najmanje jedan šećerni alkohol sadrži sorbitol, manitol ksilitol, maltitol ili njihove kombinacije, i pri čemu najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid sadrži trehalozu, saharozu, rafmozu ili njihove kombinacije.

11. Imunogena suspenzija ili rastvor koji sadrži živi atenuirani paramiksovirus koji sadrži CDV i cPi2, pomešan sa stabilizatorom prema bilo kom od pasusa 1 do 10.

12. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu je imunogena suspenzija ili rastvor multivalentna imunogena suspenzija ili rastvor koji dalje sadrži najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim paramiksovirusa.

13. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 12, pri čemu je najmanje jedna aktivna imunogena komponenta poreklom od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxvirididae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije.

14. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusima 12 ili 13, pri čemu najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži živi atenuirani adenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV).

15. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 12 do 14, pri čemu najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

16. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 12 do 15, pri čemu najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

17. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 16, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 1% do oko 5% tež. /zapr.

18. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 16, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr.

19. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 16, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr.

20. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 16, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 2. 5% do oko 3% tež. /zapr.

21. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 20, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr.

22. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 20, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr.

23. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 20, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 2% tež. /zapr.

24. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 23, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan punilac u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr.

25. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od pasusa 11 do 24, stabilizator sadrži najmanje jedan punilac u krajnjoj koncentraciji od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr.

26. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan šećerni alkohol u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov daje krajnja koncentracija najmanje jednog redukcionog monosaharida i najmanje jednog šećernog alkohola jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr.

27. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. krajnje koncentracije i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov da je krajnja koncentracija redukcionog monosaharida i ne-redukcionog oligosaharida jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr.

28. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži najmanje jedan šećerni alkohol u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr, najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov da je krajnja koncentracija redukcionog monosaharida, šećernog alkohola i ne-redukcionog oligosaharida jednaka ili manja od oko 12. 5% tež. /zapr.

29. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. smeše dva redukciona monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca.

30. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju odo oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr.

31. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1 % do oko

0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 5% tež. /zapr.

32. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1 % do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov daje krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr.

33. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jedan redukcioni monosaharid, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 3% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov daje krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 5% tež. /zapr.

34. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov da je krajnja koncentracija (i), (ii) i (iii) jednaka ili manja od oko 12. 5% tež. /zapr.

35. Imunogena suspenzija ili rastvor prema pasusu 11, pri čemu stabilizator sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov daje krajnja koncentracija (i), (ii) i (iii) jednaka ili manja od oko 10% tež. /zapr.

36. Postupak za sušenje zamrzavanjem imunogene suspenzije ili rastvora živog atenuiranog CDV i cPi2 prema bilo kom od pasusa 11 do 35, koji sadrži (a) dovođenje u kontakt suspenzije ili rastvora sa stabilizatorom, čime se formira stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor; (b) hlađenje, na atmosferskom pritisku, stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora do temperature od manje od oko T'g vrednosti stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora; (c) sušenje stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora sublimacijom leda na niskom pritisku; i (d) uklanjanje viška preostale vode dodatnim snižavanjem pritiska i povećanjem temperature stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora.

37. Postupak prema pasusu 36, pri čemu je temperatura u koraku (b) manja od oko -40°C.

38. Postupak prema pasusu 36 ili 37, pri čemu je pritisak u koraku (c) manji od oko ili jednak oko 200 Pbar.

39. Postupak prema pasusu 36 ili 37, pri čemu je pritisak u koraku (d) manji od ili jednak oko 100 Pbar.

40. Postupak prema bilo kom od pasusa 36 do 39, pri čemu je temperatura u koraku (d) između oko 20°C i oko 30°C.

41. Postupak prema bilo kom od pasusa 36 do 40, koji dalje sadrži najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim paramiksovirusa.

42. Postupak prema pasusu 41, pri čemu je najmanje jedna aktivna imunogena komponenta poreklom od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije.

43. Postupak prema pasusu 41 ili 42, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži živi atenuirani ađenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV).

44. Postupak prema bilo kom od pasusa 41 do 43, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

45. Postupak prema bilo kom od pasusa 41 do 44, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

46. Zamrzavanjem osušena stabilizovana živa atenuirana CDV i cPi2 imunogena kompozicija proizvedena pomoću postupka prema bilo kom od pasusa 36 do 45.

47. Zamrzavanjem osušena stabilizovana živa atenuirana CDV i cPi2 imunogena kompozicija, koja sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije.

48. Zamrzavanjem osušena stabilizovana živa atenuirana CDV i cPi2 imunogena kompozicija, koja sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 2% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 15% do oko 70% tež. /tež. najmanje jednog punioca.

49. Zamrzavanjem osušena stabilizovana multivalentna imunogena kompozicija koja sadrži živi atenuirani CDV, živi atenuirani cPi2, i najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patenogena osim paramiksovirusa, i koja sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije.

50. Multivalentna imunogena kompozicija prema pasusu 49 ili 50, pri čemu je najmanje jedna aktivna imunogena komponenta poreklom od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije.

51. Multivalentna imunogena kompozicija prema pasusu 49, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži živi atenuirani adenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV).

52. Multivalentna imunogena kompozicija prema bilo kom od pasusa 49 do 51, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

53. Multivalentna imunogena kompozicija prema bilo kom od pasusa 41 do 52, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

54. Zamrzavanjem osušena stabilizovana multivalentna imunogena kompozicija koja sadrži živi atenuirani CDV, živi atenuirani cPi2 i najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim paramiksovirusa, i koja sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 2% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 15% do oko 70% tež. /tež. najmanje jednog punioca.

55. Multivalentna imunogena kompozicija prema pasusu 54, pri čemu je najmanje jedna aktivna imunogena komponenta poreklom od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije.

56. Multivalentna imunogena kompozicija prema pasusu 54 ili 55, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži živi atenuirani adenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV).

57. Multivalentna imunogena kompozicija prema bilo kom od pasusa 54 do 56, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

58. Multivalentna imunogena kompozicija prema bilo kom od pasusa 54 do 57, pri čemu najmanje jedna imunogena komponenta sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

59. Komplet koji sadrži prvu bočicu koja sadrži zamrzavanjem osušenu stabilizovanu imunogenu kompoziciju prema bilo kom od pasusa 46 do 58, i drugu bočicu koja sadrži rastvarač.

60. Komplet prema pasusu 49, pri čemu je rastvarač izabran iz grupe koju čine demineralizovana voda, destilovana voda, voda za injekciju, pufer i adjuvant.

Claims

1. Stabilizator za zamrzavanjem osušenu živu atenuiranu imunogenu kompoziciju virusa štenećaka pasa (CDV) i virusa parainfluenca pasa tipa 2 (cPi2) koji sadrži najmanje jedan redukcioni monosaharid i najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant, pri čemu najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant sadrži asparaginsku kiselinu; i pri čemu najmanje jedan redukcioni monosaharid sadrži glukozu, galaktozu, fruktozu, manozu, sorbozu ili njihove kombinacije; i pri čemu najmanje jedan redukcioni monosaharid je u koncentraciji od oko 20% do oko 50% tež. /tež. i najmanje jedan kiseli antioksidant je u koncentraciji od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež.

2. Stabilizator prema patentnom zahtevu 1, koji dalje sadrži (a) najmanje jedan punilac ili (b) najmanje jedan punilac pri čemu najmanje jedan punilac sadrži dekstran, maltodekstrin, polivinilpirolidon, hidroksietil škrob ili njihove kombinacije ili (c) najmanje jedan šećerni alkohol ili (d) najmanje jedan šećerni alkohol pri čemu šećerni alkohol sadrži sorbitol, manitol, ksilitol, maltitol ili njihove kombinacije ili (e) najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid ili (f) najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid pri čemu najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid sadrži trehalozu, saharozu, rafmozu ili njihove kombinacije ili (g) najmanje jedan šećerni alkohol i najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid ili (h) najmanje jedan šećerni alkohol i najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid pri čemu najmanje jedan šećerni alkohol sadrži sorbitol, manitol ksilitol, maltitol ili njihove kombinacije, i pri čemu najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid sadrži trehalozu, saharozu, rafmozu ili njihove kombinacije.

3. Imunogena suspenzija ili rastvor koji sadrži živi atenuirani paramiksovirus koji sadrži CDV i cPi2, pomešan sa stabilizatorom prema patentnom zahtevu 1 ili 2.

4. Imunogena suspenzija ili rastvor prema patentnom zahtevu 3, gde je imunogena suspenzija ili rastvor multivalentna immunogena suspenzija ili rastvor koji dalje sadrže najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena koji se razlikuje od paramiksovirusa.

5. Imunogena suspenzija ili rastvor prema patentnom zahtevu 4, u kome (a) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta poreklom je od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxvirididae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije ili (b) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži živi atenuirani adenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV) ili (c) ) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena ili (d) ) najmanje jedna aktivna imunogena komponenta sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

6. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 5, pri čemu stabilizator sadrži (a) najmanje jedan redukcioni monosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 1 % do oko 5% tež. /zapr. ili oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr. ili oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. ili oko 2. 5% do oko 3% tež. /zapr. ili oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. ili (b) najmanje jedno jedinjenje kiseli antioksidant u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. ili od oko 0. 2% tež. /zapr. ili od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. ili (c) najmanje jedan punilac u krajnjoj koncentraciji od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr. ili (d) najmanje jedan šećerni alkohol u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov daje krajnja koncentracija najmanje jednog redukcionog monosaharida i najmanje jednog šećernog alkohola jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili (e) najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. krajnje koncentracije i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov da je krajnja koncentracija redukcionog monosaharida i ne-redukcionog oligosaharida jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili (f) najmanje jedan šećerni alkohol u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr., najmanje jedan ne-redukcioni oligosaharid u krajnjoj koncentraciji od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr., i najmanje jedan redukcioni monosaharid, uz uslov da je krajnja koncentracija redukcionog monosaharida, šećernog alkohola i ne-redukcionog oligosaharida jednaka ili manja od oko 12. 5% tež. /zapr.

7. Imunogena suspenzija ili rastvor prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 5, pri čemu stabilizator sadrži: (a) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. smeše dva redukciona monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca ili (b) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 7. 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili (c) (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog punioca, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 5% tež. /zapr. ili (d) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1 % do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 7. 5% tež. /zapr. ili (e) (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 3% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov da je krajnja koncentracija (i) i (ii) jednaka ili manja od oko 5% tež. /zapr. ili (f) (i) krajnju koncentraciju od oko 1% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 3% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov daje krajnja koncentracija (i), (ii) i (iii) jednaka ili manja od oko 12. 5% tež. /zapr. ili (g) (i) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 4% tež. /zapr. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 5% tež. /zapr. najmanje jednog šećernog alkohola, (iii) krajnju koncentraciju od oko 0. 5% do oko 2. 5% tež. /zapr. najmanje jednog ne-redukcionog oligosaharida, i (iv) krajnju koncentraciju od oko 0. 1% do oko 0. 25% tež. /zapr. najmanje jednog kiselog antioksidanta, uz uslov daje krajnja koncentracija (i), (ii) i (iii) jednaka ili manja od oko 10% tež. /zapr.

8. Zamrzavanjem osušena stabilizovana živa atenuirana CDV i cPi2 imunogena kompozicija koja sadrži (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 1. 5% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije.

9. Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što je (ii) krajnja koncentracija najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije od oko 2% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije, i dalje sadrži (iii) krajnju koncentraciju od oko 15% do oko 70% tež. /tež. najmanje jednog punioca.

10. Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 8, naznačena time što dalje sadrži najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim par amikso virusa.

11. Imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 10, naznačena time što, najmanje jedna aktivna imunogena komponenta (a) poreklom je od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviriđae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije ili (b) sadrži živi atenuirani adenovirus tipa 2 pasa (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV) ili (c) sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena ili (d) sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

12. Zamrzavanjem osušena stabilizovana multivalentna imunogena kompozicija koja sadrži živi atenuirani CDV, živi atenuirani cPi2 i najmanje jednu aktivnu imunogenu komponentu poreklom od patogena osim paramiksovirusa, i koja sadrži: (i) krajnju koncentraciju od oko 20% do oko 50% tež. /tež. najmanje jednog redukcionog monosaharida, (ii) krajnju koncentraciju od oko 2% do oko 6% tež. /tež. najmanje jednog kiselog antioksidanta koji sadrži asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu, askorbinsku kiselinu ili njihove kombinacije, i (iii) krajnju koncentraciju od oko 15% do oko 70% tež. /tež. najmanje jednog punioca.

13. Multivalentna imunogena kompozicija prema patentnom zahtevu 12, naznačena time što, najmanje jedna aktivna imunogena komponenta (a) poreklom je od patogena koji sadrži Adenoviridae, Parvoviridae, Coronaviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Rhabdoviridae ili njihove kombinacije ili (b) sadrži živi atenuirani adenovirus pasa tipa 2 (CAV2) i živi atenuirani parvovirus pasa (CPV) ili (c) sadrži virusni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena ili (d) sadrži plazmidni vektor koji sadrži jedan ili više heterolognih imunogena.

14. Postupak za sušenje zamrzavanjem imunogene supsenzije ili rastvora živog atenuiranog CDV i cPi2, koji sadrži (a) dovođenje u kontakt suspenzije ili rastvora živog atenuiranog CDV i cPi2 sa stabilizatorom prema patentnom zahtevu 1 ili 2, čime se formira stabilizovana imunogena suspenzija ili rastvor; (b) hlađenje, na atmosferskom pritisku, stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora do temperature manje od oko Tg vrednosti stabilizovane imunogene suspenzije; (c) sušenje stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora sublimacijom leda na niskom pritisku; i (d) uklanjanje viška preostale vode dodatnim snižavanjem pritiska i povećavanjem temperature stabilizovane imunogene suspenzije ili rastvora.

15. Komplet koji sadrži prvu bočicu koja sadrži zamrzavanjem osušenu stabilizovanu živu atenuiranu CDV i cPi2 imunogenu kompoziciju kao što je defmisano u bilo kom od patentnih zahteva 8 do 11 ili zamrzavanjem osušenu multivalentnu imunogenu kompoziciju kao što je defmisano u patentnom zahtevu 12, i drugu bočicu koja sadrži rastvarač.