KR101799983B1 - 생물학적 활성 미생물 및/또는 생활성 물질을 포함하는 안정한 건식분말 조성물 및 제조 방법 - Google Patents

생물학적 활성 미생물 및/또는 생활성 물질을 포함하는 안정한 건식분말 조성물 및 제조 방법 Download PDF

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로저 드루이스
브라이언 카펜터
엘레나 아티모비치
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Abstract

본 발명은 보호 건식 제형 메트릭스 내에 살아있거나 죽은 미생물 및/또는 생활성 물질을 임베딩 (embedding)하는 것과 관련이 있는데, 상기 제형은 생활성 미생물이나 물질, 안정제 및 보호제를 포함한다. 상기 제형은 진공 하에서 또는 진공을 가하지 않고, 용액 내에서 모든 고형 성분을 분산하고, 상기 용액을 그것의 동결 온도 이상의 온도로 냉각함으로써 제조된다. 상기 방법은, 상기 건식 물질의 바람직한 최종 수분 활성도를 달성하기 위하여, 바람직한 온도 및 시간 동안 상기 제형을 제1 건조하는 단계, 최대의 진공 및 상승된 온도하에서 가속화된 제2 건조하는 단계를 포함한다.

Description

생물학적 활성 미생물 및/또는 생활성 물질을 포함하는 안정한 건식분말 조성물 및 제조 방법 {STABLE DRY POWDER COMPOSITION COMPRISING BIOLOGICALLY ACTIVE MICROORGANISMS AND/OR BIOACTIVE MATERIALS AND METHODS OF MAKING}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국 특허청에 2009년 5월 26일과 2009년 6월 6일에 각각 출원된 미국 가출원 제 61/181,248호와 제 61/223,295호의 이익을 주장하며, 상기 가출원들의 내용은 참조로서 본 명세서에 통합된다.
기술분야
본 발명은 고온 및 습한 조건에서 생활성 미생물 및/또는 물질의 보호분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 보호 건조 제형 메트릭스에 임베딩 (embedding)되어있는 살아있는 미생물 및/또는 생활성 물질에 관한 것이다.
살아있거나 죽은 박테리아와 바이러스 등의 생활성 미생물이나, 단백질, 비타민, 무기질, 호르몬, 세포 등의 생활성 물질은 고온 및 습한 조건하에서 저장시 일반적으로 불안정하다. 예컨대, 락토바실러스 람노서스 (lactobacillus rhamnosus)등의 상업적으로 이용가능한 프로바이오틱 박테리아 (probiotic bacteria)는 실온 (대략 25℃)의 환경에서 저장시 2주 이내에 생존능력을 잃게 된다. 배양용기 (예컨대, 발효기)로부터 수확 후에 이들 생활성 미생물을 건조하고 보호하는 일반적인 방법은, 추후 동결 건조시키거나 다른 위치로의 운반을 하여 살아있는 세포의 농축액을 액체질소로 떨어뜨린 후 냉동된 비즈 (beads)를 -80℃에서 저장하는 것이다. 동결건조는 민감한 생활성 물질을 건조하기 위한 주된 방법이다. 분무건조, 초임계 건조 및 데시케이션 (desiccation) 등의 다른 방법은, 이들 방법에서 사용되는 높은 온도가 미생물 자체에 심각한 손상을 야기하기 때문에 살아있거나 약독화된 박테리아와 바이러스 등의 민감한 생활성 물질은 일반적으로 적합하지 않다. 게다가 생성물의 안정성을 위한 특정한 잔여습기요구량까지 물질을 충분히 건조하지 못할 수 있어서 다른 수단에 의한 추가적인 건조단계가 필요할 수 있다.
동결건조에서, 생활성 미생물이나 물질은 일반적으로 용액이나 보호제의 현탁액에 혼합되어 냉각되며 이어서 진공하에서 승화되어 탈수된다. 동결건조 공정의 낮은 온도는 생활성의 분해반응을 감소시키고, 최종 건조형태 중의 활성감소를 최소화한다. 그러나 영하의 온도는 에너지 집중을 요구하고, 동결물질의 부피비에 비해 낮은 표면 면적은 긴 건조 시간을 필요로 한다 (회분주기당 수일까지). 또한, 동결 건조 과정의 느린 건조는 민감한 생물활성을 손상시키거나 변성시킬 있는 얼음결정의 형성을 용이하게 한다. 이러한 이유로, 생활성 미생물이나 바이러스, 박테리아, 세표벽이나 지질막을 가진 세포 등의 물질은 동결건조과정에 상당한 문제가 있다.
얼음 결정구조의 형성을 감소시키기 위한 한 가지 방안은 생활성 솔루션에 동결방지제를 첨가하는 것이다. 그러한 보호제는 수용성 화학물질로서, 동결시 세포막과 세포 내 단백질을 보호하고 저장시 안정성을 향상시키기 위하여 제형에 첨가된다. 살아있는 박테리아와 바이러스에 사용되는 일반적인 안정제는 높은 농도의 세포물질이나 생활성 물질에서 수크로스 (sucrose), 글리세롤 (glycerol) 또는 소비톨 (sorbitol) 등의 당 (sugar)을 포함한다 (Morgan et al., 2006; Capela et al., 2006). 그러나 이러한 보호제는 용적내에서 활성 성분들을 보호하도록 세포내로 적절히 침투되지 않을 수 있다. 그러므로 건조물질의 적절한 저장안정도를 달성하면서 건조손실을 최소화하는 최적의 건조과정 및 제형을 개발하는 중대한 도전이 남는다.
동결 건조와 관련된 문제 중 일부는 특정 제형과 액체상태에서 진공 건조의 조합을 사용하여 해결되었다. 애니어 (Annear 1962)는 당과 아미노산의 용액 내에 박테리아를 포함하는 제형과 끓음과 거품형성을 포함하는 진공건조과정을 개발하였다. 로저 (Roser) 등 (미국 특허 제 6,964,771호)은 진공에서 끓는 것과 거품발생 후, 액체 농축단계를 포함하는 거품 형성에 의한 건조와 비슷한 개념을 개시하였다. 끓는 단계에서 발생할 수 있는 산화와 변성 손상을 완화하기 위하여, 브론쉬테인 (Bronshtein) (미국특허 제5,766,520호, 제7,153,472호)은 탄수화물과 계면활성제를 함유하는 향상된 보호 공식을 도입하였다. 상기 보호솔루션의 건조는 또한, 거품이 떠있는 남겨진 물이 끓어서 건조된 안정한 거품을 형성하도록 강한 진공을 적용하기 전에 중간 진공하에서 단계적으로 농축하는 단계를 포함한다. 끓는 단계를 제거하기 위한 시도로, 뷔쏭 (Busson)과 슈뢰더 (Schroeder) (미국 특허 제 6,534,087호)는 30 토르 (Torr) 이상의 매우 약한 진공압력을 적용하여, 끓지 않는 진공건조기를 사용하여 인센시티브 바이오액티브 (insensitive bioactive)를 위한 액체 상태 제형의 건조과정을 제안했다. 물질을 끓이지 않고 건조하는 일정한 수준을 달성한 후에, 20℃ 이상의 열을 가하고, 몇 시간 뒤에 건조된 물질을 수확하였다.
전체 건조공정 동안에 상기 생활성 용액이 액체상태로 유지되는 이러한 타입의 건조공정은 끓는 동안에는 액체의 대류 때문에 빠르게 건조되고, 거품 표면에 의해 표면적이 증가된다는 이점이 있다. 그러나 끓는 것과 거품은 필요한 용액의 분출을 제공하기 위하여 상당한 양의 열을 투입해야 한다. 그러한 건조과정은 생물학적 물질의 활동성이나 생존력을 파괴할 수 있는 효소 프로세스 (예컨대, 단백질 가수분해 반응), 화학 프로세스 (예컨대, 산화와 자유라디칼 공격)를 가속화하기 때문에 바이러스, 세포나 박테리아 등의 민감한 생체의 건조에는 적합하지 않다.
상기 기술한 건조과정은 대량 산업공정에 확장하기에는 제한이 따른다. 동결의 방지는 동결건조나 분무동결건조과정사이클보다 더 낮은 진공레벨 (>7 토르(Torr))에서 공정이 될 것을 요구한다. 위의 공정의 중대한 단점은 용기나 트레이 또는 유리병 내에서 거품의 팽창을 조절하거나 제한할 수 없다는 것이다. 불가항력의 분출과 과도한 거품 형성은 산업 규모 공정에서의 실행을 불가능하게 한다. 끓는 단계에서 발생하는 분출과 거품형성은 용기의 벽과 건조 챔버로 물질의 일부가 튀게 된다. 끓는 과정에서 분출을 완화하기 위하여 브뢴쉬테인 (Bronshtein) (미국 특허 제6,884,866호, 제6,306,345호)은 특별한 챔버와 허용 가능한 수준으로 과열을 감소시키는 제어 온도/압력 응용 프로토콜을 제시하였다. 미국 특허 제2008/0229609호에서 기술된, 분출과 과도한 거품형성을 포함하는 또 다른 접근은 상기 생물활성 용액을 통기성 막으로 덮인 컨테이너나 백에 동봉하는 것이다. 이러한 프로토콜은 산업수준에서 시행되기 어렵고, 다른 제형으로 확실하게 반복하기 어렵다.
액체 상태에서 건조가능한 적절한 보호 제형과 살아있거나 죽은 바이러스나 박테리아 세포 등의 생활성 미생물을 특히 영상 온도에서 건조하기 위한 산업적으로 팽창가능한 방법을 위한 필요가 있다. 특히, 식품이나 농업산업등의 제약산업 이외의 곳에도 적용가능한 비용효율이 높은 건조공정에 대한 필요가 있다. 보호 제형과 온화한 건조 공정은 고온에 노출됨이 없이도 충분한 건조를 제공해야한다. 고온과 습한 조건에서 이러한 생물을 보호할 수 있는 조성물이 필요하다. 아래에서 기술되는 본 발명은 이러한 모든 문제에 대한 해결책을 제시한다.
발명의 요약
본 발명은 펩티드, 단백질, 호르몬, 비타민, 미네랄, 약, 살균제, 살진균제, 제초제, 살충제, 살정자제, 핵산, 항체, 백신 등의 생활성 물질 및/또는 박테리아 (프로바이오틱이나 다른 것) 바이러스 등의 생활성 미생물 및/또는 세포 현탁액을 저장조에서 보존하기 위한 조성물과 방법을 포함한다. 건조방법은 생활성 미생물이나 물질, 안정제 및 보호제를 포함하는 제형의 제어 가능한 팽창 과정을 제공한다. 상기 제형은 진공상태 혹은 진공없이 용액 내에서 모든 고형 성분를 분산시킴으로써 제조된다. 상기 용액은 동결온도 이상의 온도로 냉각되고, 진공하에서 건조되어 예측하지 못한 높은 안정성를 나타내는 건조 조성물이 된다. 상기 방법은 건조물질이 최종적으로 바람직한 수분활성을 갖도록, 목적 온도와 시간에서의 제1건조단계, 최대의 진공 및 고온하에서의 가속화된 제2건조단계를 포함한다.
하나의 실시예에서, 상기 미생물이 내장되는 상기 제형은 충분한 양의 안정제를 포함한다. 적당한 안정제의 예는 이에 제한되지 않지만, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (cellulose acetate phthalate), 카복시 메틸 셀룰로오스 ( caboxy-methyl-cellulose), 펙틴, 알긴산나트륨 (sodium alginate), 알지닉산염, 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로오스 (hydroxyl propyl methyl cellulose), 메틸 셀룰로오스, 캐라지난 (carrageenan), 구아검 (guar gum), 아라비아 고무, 잔탄검 (xanthan gum), 로커스트빈검 (locust bean gum), 키토산, 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 녹말, 화공 녹말, 사이클로덱스트린 및 올리고당 (예컨대, 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란 등), 그리고 이들의 혼합물을 포함한다.
하나의 특정 실시예에서, 바람직한 안정제 제형은 알긴산나트륨이다. 상기 제형은 총건조물 중량%로 0.1-10%의 안정제 제형, 좋기로는 1-6%, 더 좋기로는 2-4%로 포함한다. 추가 실시예에서, 상기 안정제 제형은 알긴산나트륨과 올리고당의 무게비율이 1:1-10, 더 좋기로는 1:1-5의 혼합물을 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 상기 안정제 제형은 단단한 하이드로겔을 형성하기 위하여 2가 금속이온과 가교된다.
또다른 실시예에서 상기 미생물이 내장되는 상기 제형은 상당한 양의 보호제를 포함한다. 적절한 보호제의 예는, 이에 제한되지 않지만, 인간과 소혈청알부민, 흰자위, 젤라틴, 면역글로불린, 분리 대두 단백질 (isolated soya protein), 밀단백질, 탈지분유, 카세인염, 훼이 단백질 (whey protein), 임의의 단백질 가수분해물 등의 단백질; 단당류 (예컨대, 갈락토오스, D-만노스, 소르보스 등), 이당류 (예컨대, 락토스, 트레할로오스, 수크로스 등) 등의 탄소화물, 라이신, 글루탐산나트륨, 글라이신, 알라닌, 알지닌, 히스티딘 등의 아미노산뿐 아니라 소수성 아미노산 (트립토판, 티로신, 류신, 페닐알라닌 등); 베타인 등의 메틸아민; 황산 마그네슘 등의 부형제 염, 3가 이상의 당(sugar) 알코올 등의 폴리올 (polyol) (예컨대, 글리세린, 에리스톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소비톨, 만니톨); 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플로닉 (pluronics); 계면활성제; 그리고 이들의 혼합물을 포함한다.
하나의 바람직한 실시예에서, 상기 보호제는 이당류, 단백질 및 단백질 가수분해물의 혼합물을 포함한다. 특정 실시예에서, 상기 바람직한 보호제는 트레할로스, 분리 대두 단백 또는 훼이 단백질 (whey protein), 그리고 그들의 가수분해물의 혼합물이다. 좋기로는 상기 제형은 총건조물의 중량%로 10-90%의 트레할로스, 0.1-30%의 분리 대두 단백질 또는 훼이 단백질 (whey protein), 0.1-30%의 대두 단백질 또는 훼이 단백질 (whey protein)의 가수분해물을 포함한다. 좋기로는 20-80%의 트레할로스, 0.1-20%의 분리 대두 단백질 또는 훼이 단백질 (whey protein), 1-20%의 대두 단백질 또는 훼이 단백질 (whey protein)의 가수분해물, 더 좋기로는 40-80%의 트레할로스, 0.1-20%의 분리 대두 단백질 또는 훼이 단백질 (whey protein), 1-20%의 대두단백질 또는 훼이 단백질 (whey protein)의 가수분해물이다.
상기 발명의 방법은 전형적으로 진공상태 혹은 진공없이 혼합, 생활성 미생물의 농축용액 또는 건식분말(예컨대, 살아있거나 죽은 백신, 박테리아, 미세조류 (algae) 바이러스 및/또는 세포현택액) 또는 생활성 물질 (예컨대, 펩티드, 단백질, 호르몬, 비타민, 미네랄, 약물, 살미생물제, 살진균제, 제초제, 살충제, 살정자제, 핵산, 항체, 백신), 안정제 및 보호제를 균질의 제형으로 혼합하는 단계, 상기 제형을 동결온도 이상의 온도로 냉각하는 단계, 20℃ 이상의 선반 온도에서 진공하에서 건조하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따르면 상기 건조 단계는 20℃ 이상의 선반온도에서 초기 진공 건조에 이어서, 건조 제형의 수분활성도를 Aw 0.3 이하로 줄이기 위하여 충분한 시간동안 최대의 진공과 고온 하에서 가속화된 제2건조를 포함할 수 있다.
혼합 방법의 실시예에서, 상기 미생물이나 물질은 건조된 안정한 형태이고, 추가로 건조안정제와 보호제가 함께 혼합 건조된다. 이러한 건조 혼합물에 물을 첨가하고, 적당한 진공상태하에서 혼합하고 교반하여 균질한 목적 밀도의 슬러리로 제공한다.
혼합방법의 또 다른 실시예에서, 상기 생활성 미생물이나 물질은 농축용액이나 페이스트된 형태이다. 상기 용액은 물을 첨가하기 전에 기타 모든 제형성분과 혼합된다.
혼합방법의 또 다른 실시예에서, 상기 생활성 미생물과 물질은 건식분말 형태이다. 건식분말는 물을 첨가하기 전에 다른 모든 제형성분과 혼합된다.
혼합방법의 또 다른 실시예에서, 상기 건조 생활성미생물이나 물질은 제형성분의 일부와 혼합되고, 이 혼합물은 다른 제형성분들을 물에 첨가하여 얻어진, 미리 형성된 슬러리에 첨가된다.
상기 건조방법의 바람직한 실시예에서, 상기 생활성 미생물은 진공하에서 안정제와 보호제 제형을 포함하는 용액에서 혼합된다. 하나의 특정 실시예에서, 상기 생활성 미생물은 살아있는 박테리아 (예컨대, 프로바이오틱 박테리아)를 포함한다. 적절한 미생물의 예로는 이에 제한되는 것은 아니지만, 사카로미세스 (Saccharomyces), 디바로미세스 (Debaromyces), 칸디다 (Candida), 피치아 (Pichia), 토룰롭시스 (Torulopsis) 등의 효모, 아스페르길루스 (Aspergillus). 리조푸스 (Rhizopus), 무코르 (Mucor), 페니실륨 (Penicillium), 토룰롭시스 (Torulopsis) 등의 곰팡이, 비피더스균, 클로스트리듐 (Clostridium), 푸소박테륨 (Fusobacterium), 멜리소쿠스 (Melissococcus), 류코노스토크 (Leuconostoc), 바이젤라 (Weiss ella), 에어로코커스(Aerococcus), 오에노코커스(Oenococcus), 락토바실러스 (Lactobacillus) 등의 박테리아를 포함한다. 적절한 프로바이오틱 미생물의 특정 예로 아래의 종들이 있고, 그러한 종 안에 모든 배양 생물형이 포함된다. : 아스퍼질러스 니가 (Aspergillus niger), A.오리재 (A. oryzae), 바실러스 코아귤런스 (Bacillus coagulans), B.렌터스 (B. lentus), B.리케니포미스 (B. licheniformis), B.메센테리커스 (B. mesentericus), B.푸밀루스 (B. pumilus), B.섭틸러스 (B. subtilis), B. 낫토 (B. natto), 박테로이데스 아밀로필러스 (Bacteroides amylophilus), Bac. 카필로서스 (Bac. capillosus), Bac. 루미노콜라 (Bac. ruminocola), Bac.쉬이 (Bac. suis), 비피도박테리움 아돌레샌티스 ( Bifidobacterium adolescentis), B.아니말리스 (B. animalis), B.브레베 (B. breve), B.비피덤 (B. bifidum), B. 인판티스 (B. infantis), B.락티스 (B. lactis), B.롱검 ( B. longum), B.퓨도롱검 (B. pseudolongum), B.써모필럼 (B. thermophilum), 칸디다 핀토레페실 (Candida pintolepesii), 클로스트리듐 뷰티리쿰 (Clostridium butyricum), 엔테로코커스 크레모리스 (Enterococcus cremoris), E.디아세티 락티스 (E. diacety lactis), E. 패시움 (E. faecium), E. 인테르메디우스 (E. intermedius), E.락티스 (E. lactis), E.문트디 (E. muntdi), E. 써모필러스 (E. thermophilus), 대장균 (Escherichia coli), 클루이베르마이세스 프라길리스 (Kluyveromyces fragilis), 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilus), L.알리멘타리어스 (L. alimentarius), L.아밀로보러스 (L. amylovorus), L.크리스파투스 (L. crispatus), L.브레비스 (L. brevis), L.케이스4 (L. case 4), L. 쿨바투스 (L. curvatus), L.셀로바이오서스 (L. cellobiosus), L. 델브릭키이 ss.불가리쿠스 (L. delbrueckii ss. bulgaricus), L.파르시미니스 (L. farciminis), L.페르멘텀 (L. fermentum), L.가세리 (L. gasseri), L.헬베티쿠스 (L. helveticus), L. 락티스 (L. lactis), L.플랜타룸 (L. plantarum), L.존스니 (L. johnsonii), L.루테리 (L. reuteri), L.람노서스 (L. rhamnosus), L.사케이 (L. sakei), L.살리바리우스 (L. salivarius), 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides), P. 세레비새(담노수스) (P. cereviseae (damnosus )), 페디오코쿠스 아시디락티시 (Pediococcus acidilactici), P.펜토사수스 (P. pentosaceus), 프로피오니박테리움 프루덴레이치 (Propionibacterium freudenreichii), Prop. 셰르트나니 (Prop. shertnanii), 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cereviseae), 스타필로코쿠스 카르노서스 (Staphylococcus carnosus), Staph. 자일로서스 (Staph. xylosus), 스트렙토코쿠스 인판타리우스 (Streptococcus infantarius), Strep. 살리바리우스 ss. 써모필러스 (Strep. salivarius ss. thermophilus), Strep.써모필루스 (Strep. Thermophilus) 및 Strep. 락티스 (Strep, lactis).
바람직한 방법에서, 상기 제형은 실온 (예컨대, 20℃ 내지 30℃) 및 진공하에서 혼합된다. 균질하게 혼합된 후에, 상기 제형은 그것의 동결온도 이상의 온도로 냉각시킨다. 전형적으로 상기 제형은 -10℃에서 +10℃사이로, 더 바람직하게는 -5℃와 +5℃사이로 냉각시킨다. 바람직한 실시예에서, 초기 진공압력을 원래의 예비 냉각온도 수준으로 유지하기 위하여 조절하면서, 상기 냉각된 제형은 열이 가해지는 (20℃이상) 건조 챔버로 옮긴다. 일반적으로 상기 바람직한 진공압력은 7토르 (Torr) 미만이지만 3 토르 (Torr)보다 낮지 않다. 이러한 바람직한 조건하에서, 상기 제형의 조절된 팽창과 더욱 빠른 상기 제형의 제1건조가 달성된다. 제2건조를 가속화하기 위하여, 최대의 진공압력을 가하고, 열공급 온도는 30℃에서 60℃까지 추가적으로 높일 수 있다. 최종 생성물의 안정성을 극대화시키기 위하여, 바람직하게는 상기 제형의 수분활성을 Aw= 0.3 이하까지 감소시키기에 충분한 시간동안 상기 제형을 건조시킨다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 제2건조는 1토르 (Torr) 미만의 압력, 특히 바람직한 실시예에서는 0.2토르 (Torr)이하의 압력에서의 물의 제거를 포함한다.
습식 제형은 점성 슬러리나 0.05 nm 내지 10 nm 범위의 하이드로겔 입자의 형태 일 수 있다. 건조 제형은 조각으로서 직접 사용되거나 평균 입자크기가 약 10 μm 내지 약 1000 μm인 파우더로써 들어간다. 상기 제형은 농축파우더 또는 환원용액 (예컨대, 음료)의 형태로 인간을 포함한 동물에 직접 투여될 수도 있고, 플레이크 (flake)나 파우더 형태로 음식이나 사료 내에 포함될 수 있다.
도 1은 40 ℃와 33% 상대습도에서 저장되는 프로바이오틱 박테리아, L. 람노서스(L. rhamnosus)의 안정성 경향을 보여준다.
도 2는 제2건조단계가 Aw 0.28 로 끝날때, 제형 공정을 위한 공정 온도와 누적 생존능력의 손실량을 보여준다.
도 3은 서로 다른 안정제 제형이 저장안정도에 미치는 효과를 보여준다.
도 4는 진공하에서 알지네이트(alginate) 점성의 제형 팽창에 대한 효과를 보여준다.
도 5는 안정제의 서로 다른 조합물이 박테리아 생존률에 미치는 효과에 대해 보여준다.
도 6은 진공하에서 제형 밀도가 팽창속도에 미치는 효과를 보여준다.
도 7은 제형의 예비 냉각 온도가 진공하에서 팽창에 미치는 효과를 보여준다.
도 8은 제1건조단계 동안 진공압력이 제형 온도에 미치는 효과를 보여준다.
도 9는 진공압력이 제형의 건조속도에 미치는 효과를 보여준다.
도 10은 본 발명의 제형과 방법으로 건조된 프로바이오틱 박테리아, L. 아시도필러스(L. acidophilus)의 37℃ 및 33% 상대습도에서의 저장하에서의 안정성을 보여준다.
도 11은 상기 발명에 따른 하이드로겔 제형에서 안정한 건조제형을 생성하는 방법의 흐름도를 보여준다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 실시예를 기술하기 위한 목적으로만 이해되어야 하며, 발명을 제한하기 위함이 아니다. 이 명세서와 추가되는 청구항에 사용되는 단수형태 "하나 (a)" , "하나 (an)" 및 "그 (the)"는 상기 내용이 명백하게 다른 것을 지시하는 것이 않는한 복수형을 포함한다. 따라서 예컨대, "단백질 (a protein)"은 하나의 단백질이나 2 이상의 단백질 조합을 포함한다. "효소", "비타민", "박테리아" 등도 단수나 그 이상의 혼합물을 포함한다.
본 발명에서 기술되고 청구되는 아래 용어는 아래의 정의에 따라 사용된다.
"주위" 실온의 온도나 조건은 임의의 주어진 시간, 주어진 환경이다. 일반적으로 주위 실온은 22-25℃, 주위 대기 압력 그리고 주위 대기 습도는 일년 중 시간, 날씨, 극한의 조건, 고도 등에 따라 다양할 것이다.
"탈기 (Degassing)"는 기체의 부분압력이 적용되는 압력보다 클 때 액체내의 용액으로부터 가스가 배출되는 것을 의미한다. 이는 끓는 것 (boiling)이 아니며, 종종 용액이 끓는 압력 이상에서 발생할 수 있다. 예를 들면, 탄산음료병은 높은 이산화탄소 부분압력을 포함한다. 병 뚜껑을 제거하면 상기 부분압력은 낮아지고, 상기 용액에는 거품이 일어난다 (탈기이며, 끓는 것이 아님).
"끓는 것 (boiling)"은 액체에서 기체로의 빠른 상 (相)이동을 의미하며, 액체가 끓는점 이상의 온도가 되었을 때 일어난다. 끓는 온도는 액체의 증기압이 외부의 압력과 같아지는 온도이다. 끓는 것은 이미 끓는점에 도달한 액체에 열이 가해질 때 특히 활발해질 수 있다.
상기 건조 제형 조성물의 맥락에서 "수분 활성도" 또는 "Aw"는 물의 유용성을 의미하며, 계 (systen) 내에서 물의 에너지 상태를 나타낸다. 이는, 샘플의 수증기압에 대하여 그 온도에서 순수한 물의 수증기압으로 나눈 것으로 정의된다. 순수 증류수는 수분활성도가 정확히 1 또는 Aw=1.0 이다.
저장안정도에서의 "상대습도" 또는 "RH"는 주어진 온도에서 대기 중의 수증기압을 의미한다. 상대습도는 일반적으로 대기를 포화시키는데 필요한 것보다 적고, 포화수증기압에 대한 백분율로 표시된다.
본 명세서에서 기술되는 설명하는 "제1건조"는 처음의 진공이 적용되는 시간부터 제2건조가 시작되는 지점까지 일어나는 건조를 의미한다. 일반적으로, 제1건조의 대부분은 광범위한 증발에 의해 일어나는 반면에 생성물의 온도는 열원의 온도보다 훨씬 낮게 유지된다.
본 명세서에서 기술된 과정과 관련하여 "제2건조"는, 제형의 동결온도 이상의 온도와 열원과 비슷한 온도에서 일어나는 건조단계를 의미한다. 전형적인 제형의 건조과정에서, 제2건조단계는 제형의 수분활성도를 Aw 0.3 이하까지 낮춘다.
"생활성 미생물" 또는 "생물학적 활성 미생물 또는 제형"은 미생물의 생물학적 활성을 명백히 효과적으로 허용하는 형태인 살아있거나 죽은 미생물 제재를 의미한다. "건식분말로써 살아있는 미생물"은 살아있는 박테리아가 적어도 10% W/W가 되는 박테리아 바이오매스를 의미한다. "건식분말로써 죽은 미생물"은 적어도 죽은 박테리아가 99.999%인 박테리아 바이오매스를 의미한다.
"생활성 물질", "생활성 조성물", "생물학적 활성 물질" 또는 "생활성 제형"은 생활성 성분들의 생물학적 활성이 명백히 효과적으로 구현되는 제재의 형태를 나타낸다. 그러한 생활성 물질은 이에 제한되지 않지만, 펩티드, 단백질, 호르몬, 비타민, 미네랄, 약물, 살미생물제, 살진균제, 제초제, 살충제, 살정자제, 핵산, 항체 및 백신을 포함한다.
"안정제"는 습식 제형의 점성을 증가시키거나 하이드로겔을 형성하기 위하여 제형에 첨가되는 화합물이나 물질을 나타낸다. 적당한 안정제의 예로는, 이에 제한되지 않지만, 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 (cellulose acetate phthalate), 카복시 메틸 셀룰로오스 (caboxy-methyl-cellulose), 펙틴, 알긴산나트륨 (sodium alginate), 알지닉산염, 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로오스 ( hydroxyl propyl methyl cellulose), 메틸 셀룰로오스, 캐라지난 (carrageenan), 구아검 (guar gum),아라비아 고무, 잔탄검 (xanthan gum), 로커스트빈검 (locust bean gum), 키토산, 키토산 유도체, 콜라겐, 폴리글리콜산, 녹말, 화공 녹말, 사이클로덱스트린 및 올리고당 (예컨대, 이눌린, 말토덱스트린, 덱스트란 등), 그리고 이들의 혼합물을 포함한다.
"보호제"는 건조과정이나 그 이후동안 생활성 물질의 안정성을 증가시키거나, 생성된 건식분말의 장기간 저장안정도를 위하여 첨가되는 화합물이나 물질을 의미한다. 적절한 보호제는 일반적으로 용액에 쉽게 용해되며, 걸쭉해지거나 물과의 접촉에 따라 중합되지 않는다. 적절한 보호제로는 이에 제한되지 않지만, 인간과 소혈청알부민, 흰자위, 젤라틴, 면역글로불린, 훼이 단백질 (whey protein), 대두단백질, 카제네이트 (caseinate), 젤라틴, 면역글로불린 등의 단백질, 단당류 (갈락토오스, D-만노스, 소르보스 등), 이당류 (락토스, 트레할로오스, 수크로스 등) 등의 탄수화물, 글루탐산모노나트륨 (monosodium glutamate), 라이신, 글라이신, 알라닌, 알지닌, 히스티딘 등의 아미노산뿐 아니라 소수성 아미노산 (트립토판, 티로신, 류신, 페닐알라닌 등); 베타인 등의 메틸아민; 황산 마그네슘 등의 부형제 염; 3가나 그 이상의 당 (sugar) 알코올 등의 폴리올 (polyol)(예컨대, 글리세린, 에리스톨, 글리세롤, 아라비톨, 자일리톨, 소비톨, 만니톨); 프로필렌글리콜; 폴리에틸렌 글리콜; 플로닉 (pluronics); 계면활성제; 그리고 이들의 혼합물을 포함한다.
"안정한" 제형 또는 조성물은 생활성 미생물 또는 물질을 저장시에 생존능력 및/또는 생활성을 유지시키는 것이다. 안정도는 선택한 시간 동안에 선택한 온도 및 습한 조건하에서 측정할 수 있다. 경향 분석은 물질을 보관하기 이전에, 그 예상 유통 기한을 추정하기 위하여 사용할 수 있다. 살아있는 박테리아의 경우, 예를 들면 안정도는 예정된 온도, 습도 및 시간 조건하에서, 1 g의 건식 제형당 1 log CFU 을 손실하는데 걸리는 시간으로 정의된다.
박테리아의 경우, "생존능력"은 박테리아의 성장에 적절한 영양 배지에서 콜로니 (CFU 또는 콜로니형성단위)을 형성하는 능력을 의미한다. 바이러스의 경우 생존능력은 적절한 숙주세포 내에 감염되고 재생산되어 숙주세포의 론(lawn)에서 플라크(plaque) 형성하는 능력을 의미한다.
본 발명의 조성물과 방법은, 건조상태에서 연장된 수명을 갖는 살아있거나 죽은 백신, 박테리아, 미세조류(algae) 바이러스 및/또는 세포현탁액, 펩티드, 단백질, 호르몬, 비타민, 미네랄, 약물, 살미생물제, 살진균제, 제초제, 살충제, 살정자제, 핵산, 항체, 백신 등의 생활성 미생물이나 물질을 생산하기 위한 비용절감과 산업규모의 건조 공정을 제공하고자 하는 문제를 해결한다. 본 발명은 용액에서 안정제, 보호제와 함께 생활성 미생물 또는 물질을 포함하는 제형을 제공하는데, 상기 제형은 동결온도 이상의 온도에서 냉각시키고, 조성물에 열을 충분히 가하면서 압력을 낮춘 상태에서 습기를 제거함으로써 제형을 안정화시킨다.
건조공정 동안 미생물의 생존능력 감소 대부분은, 낮은 건조압력과 고온에서 용액의 "끓는 것"과 관련된 버블 케비테이션(bubble cavitation)동안 동결융해 스트레스와 얼음 결정 형성, 높은 삼투압과 산화 스트레스, 전단력과 에너지 방출의 조합에 의해 초래될 수 있다. 본 발명은 건조과정의 손실을 최소화하고 그 이후의 혹한 저장 조건하에서 생활성 미생물을 보호하는 제형과 산업규모의 건조과정을 제공한다.
발명의 구성
본 발명은 점성 용액에 생활성 미생물 또는 물질, 안정제 및 보호제의 제형 조성물을 포함한다. 본 발명의 제형은 예비 냉각없이 건조된 비점성 또는 농축제형과는 물리적 구조나 기능이 본질적으로 상이한 것이 발견되었다. 예를 들면, 선행기술의 제형은 효과적인 건조를 촉진하기 위해 처음에 "발포"(foamed)된다. 상기 발포단계는 일반적으로 용액 상태에서 진공건조의 피할수 없는 결과로 용액의 광범위한 끓는 것과 분출을 초래하고, 그 결과 병이나 용기의 적재하중이 매우 낮다(예컨대, 미국 특허 제 6,534.087호에서 최종 거품 생성물의 두께가 2 mm 보다 얇다). 본 발명의 조성물 및 건조방법은 상기 제형의 제한적이고 조절된 팽창을 가능하게 하여, 건조면적당 높은 적재를 가능하게 하고, 그 결과 물질의 대량생산을 쉽게 달성할 수 있다.
단세포 미생물은 본 발명의 제형과 건조 방법에 의할 때 특히 유용한 것으로 밝혀졌다. 하나의 실시예에서, 본 발명의 생활성미생물은 프로바이오틱 박테리아다. 상기 제형은 상기 조성과, 농축 솔루션, 페이스트, 냉동된 비즈 (beads)나 건식분말형태에서 살아있는 박테리아를 얻는 것을 포함하는 본 발명의 방법에 따라 제조된다. 진공하에서 프로바이오틱 박테리아를 안정제 및 보호제와 혼합하고, 동결온도 이상의 온도에서 상기 점성의 제형을 냉각하고, 예비 냉각온도를 유지하기 위하여 충분한 진공압력을 가하여, 수분제거가 용이하도록 20℃ 이상의 열원을 공급한다. 상기 제형의 예비 냉각온도를 유지하는 것은, 상기 제형으로부터의 열의 전도 및/또는 수분증발에 의한 잠열의 손실에 의할 수 있다. 건조 과정을 더 가속화 하기 위해서, 진공을 0.1 토르 (Torr) 까지 높이고, 온도를 70℃까지 올려서, 수분활성도가 Aw 0.3 이하인 최종 조성물을 제공하기 위한 제2건조 단계를 적용한다. 그러한 조성물은 40℃ 와 33% RH의 조건의 저장조건에서 60일 이상 동안 안정하게 유지될수 있다 (도 1 참조). 본 발명에 명시된 공정은 기존의 건조공정을 능가하는 생존능력을 갖는 세포의 예기치 못한 능력을 야기한다는 것을 보여준다. 본 발명에 따른 건조과정에서 초기 생존능력의 손실은 단지 0.3 로그 (logs) 였다 (도 2 참조).
안정한 건식분말 조성물의 제조를 위한 제형
본 발명에 따르는 건식분말 제조를 위하여, 성분은 바람직한 미생물 또는 물질을 안정제와 보호제를 포함하는 구성성분들과 혼합한다. 그러한 구성 성분들은 , 상기 바람직한 생활성 미생물 또는 물질과 혼합될 시, 상기 미생물의 저장과 관리를 위한 대량의 안정한 건식 조성물을 제공하기 위하여 본 발명의 방법에 따라 가공할 수 있다. 상기 제형 안정제는 다당류와 올리고당의 혼합물을 포함할 수 있다. 특히 살아있는 미생물을 안정화시키기 위하여 바람직한 다당류는 알지네이트 (alginate)이다. 알지네이트 (alginate)는 펙틴과 아라비아검 (gum acacia) 등의 기타 다당류보다 프로바이오틱 등의 민감한 생물체의 건조손실의 감소에 매우 우수하다고 발견된 바 있기 때문이다(도 3). 또한, 온화한 온도에서 무독성 금속과 하이드로겔을 형성하는 특성 때문에 더욱 선호된다. 또한 알지네이트 (Alginate)는 제형에 적절한 점성을 제공하고, 특정 점도에서 제형의 조절된 팽창을 가능하게 하여, 진공하에서 상기 제형을 효과적으로 안정화한다고 알려졌다 (도 4).
또한 올리고당과 알지네이트 (alginate)를 혼합하는 것은 제형의 전체적인 안정도에 기여한다는 것이 알려졌다. 도 5는 알지네이트 (alginate)와 올리고당의 다른 조합물의 저장안정도에 미치는 효과를 나타낸다. 알지네이트 (alginate)와 이뉼린 (inulin)의 조합물은 프로바이오틱 박테리아의 장기간 저장 효과면에서 선호된다. 본 발명의 하나의 실시예에서, 상기 제형 안정제 중 적어도 하나는 바람직하게는 금속이온과 가교되어 단단한 하이드로겔을 형성할 수 있는 고무이다.
본 발명의 보호제는, 다양한 단백질, 펩티드, 당(sugar), 당(sugar) 알코올과 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 보호제는 동결온도(예컨대, -20℃)에서 상기 제형 내의 생물학적 활성을 결정화 및/또는 불안정하게 하지 않는 것이 선호된다. 2개 이상의 서로 다른 보호제를 포함하는 것이, 장기간 저장 조건에서 결정의 형성을 억제하고, 상기 건조된 생활성 물질 제형을 안정화시키는데 있어서 유리할 수 있다.
습식 제형은 상당한 양의 총 고형물을 포함할 수 있다 (물 등의 용매를 뺀 성분). 총 고형물의 주요 부분은 생활성 물질, 안정제 및 보호제로 구성될 수 있다. 예를 들면, 상기 생활성 물질은 상기 제형 중 약 2-50 중량%의 농도 범위로 존재할 수 있고, 안정제는 약 1-20 중량%, 보호제는 20-80 중량%로 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 제형 중 상기 안정제는 0.5-10 중량%, 보호제는 10-40 중량%의 농도범위로 존재할 수 있다. 바람직하게는, 상기 습식제형은 약 5% 내지 80%, 더 바람직하게는, 30% 내지 60% 의 고형분을 가져야 한다. 본 발명의 제형 점도는 전형적으로 1000 cP(centipoises) 보다 높고, 더 바람직하게는 10,000cP 보다 높고, 450,000 cP 보다 낮고, 가장 바람직하게는 30,000 cP보다 높고, 100,000 cP보다 낮은 것이다.
본 발명의 제형 점도는 보호제가 용액에 완전히 용해 되도록 450,000 cP 까지 높아질 수 있다. 상당한 양의 총 고형도를 포함하는 높은 점성과 균질의 슬러리는 생활성 물질의 열과 삼투감수성에 따라 고온에서 달성될 수 있다. 예를 들면, 30-60%의 총고형물을 포함하는 살아있는 세포 제형은 약 35-40℃의 높은 온도에서 혼합될 수있고, 상기 혼합은 모든 보호제가 완전히 용해될 때까지 수행된다.
안정한 건식 제형 제조 방법
생활성 미생물을 보존하기 위한 안정한 건식제형을 제조하는 방법은, 농축용액, 페이스트, 냉동된 비즈 또는 건식분말 형태 (안정화된 것 또는 기타)내에서 특정 미생물의 살아있는 배양물을 얻는 것을 포함한다. 상기 제형은 진공하에서 상기 생활성 미생물이나 물질을 용액 내에서 안정제 및 보호제와 혼합하고, 상기 제형을 그것의 동결온도에 비하여 10℃를 넘지 않는 온도까지 냉각하고, 상기 제형에 열을 공급하는 동안 감압하에서 수분을 증발시켜서 상기 제형을 건조시킴으로써 제조한다.
예를 들면, 한가지 실시 상태에 있어서, 생활성 미생물 또는 물질, 안정제 및 보호제를 포함하는 제형을 약 10-50 토르 (Torr)의 일정 수준의 온화한 진공하에서는 균질하게 혼합된다. 도 6은 진공하에서 제형의 상이한 밀도가 그것의 팽창에 미치는 효과를 보여준다. 용액에서 제형 성분의 혼합시 공기의 주입은 상대적으로 높은 진공압력에서도 제어불가능하고 과한 거품을 초래한다. 본 발명에 따라 진공단계에서 혼합함으로써, 제형 용액에 공기나 가스 주입을 생략함으로써 용액의 과도하고 통제불가능한 거품을 제거하여, 이 문제를 해결한다.
상기 용액은 그것의 동결온도 이상의 온도로 (보통 -5°C 내지 +5°C)로 냉각된다. 도 7은 진공압력하에서 제형 용액의 예비 냉각이 그것의 팽창에 미치는 효과를 보여준다. 상대적으로 높은 진공 압력하에서도 끓음이 효과적으로 제거될 수 있고, 용액온도가 그것의 동결온도보다 10℃ 이상 높지 않은 온도로 줄어들 때 제형의 평창이 더 잘 제어된다는 놀랍고 예기치 못한 발견을 하였다. 도 7에서 볼 수 있듯이, 상기 제형은 +5 ℃, 더 바람직하게는 -3℃로 냉각되고, 과도한 거품 형성 없이, 3 토르(Torr)의 진공 압력이 가해질 수 있다.
일단 냉각되면 상기 제형은 제1건조 단계에서 예비 냉각온도를 유지하기 위하여 충분한 진공(예컨대, 약 3 토르(Torr))하에서 건조된다. 도 8은 진공 압력을 가했을때 상기 제형 용액의 온도에 미치는 효과를 보여준다. 8 토르(Torr) 이상의 상대적으로 높은 진공압력에서, 상기 제형 온도는 6℃ 이상으로 증가하고 선반 또는 챔버 온도까지 계속 가파르게 상승한다. 동시에, 상기 용액은 거품이 계속 나고, 더 팽창한다. 이 실시예는 위에서 기술한 상기 제형의 팽창을 조절하면서 강한 압력 (<3 토르(Torr))이 가해지는 선행기술 (예컨대, 3-7 토르 (Torr) 이상의 진공 압력을 가한 미국특허 제 6,534,087호 참조)과 구분된다. 이 공정은 상당히 빠른 건조 속도 (도 9 참조)를 나타내고, 상기 제형의 높은 용량이 가능하다. 이 실시예에서, 상기 발명의 방법이 a) 진공하에서 조절된 팽창을 가진 특정 구성 b) 혼합시 상기 제형으로 공기의 주입을 제거하는 방법 c) 상기 제형의 예비 냉각을 제공하기 때문에, 매우 낮은 진공압력 하에서 과도한 거품과 끓음이 제거된다.
선행기술의 일반적인 방법은 과도한 거품 및/또는 격렬한 끓음이 민감한 생물체에 손상을 가할 수 있고, 산업 규모에 어려움을 초래한다. 게다가 점성 슬러리로부터 완전하고 효과적인 탈기는 어렵고, 장시간을 요구한다. 이러한 장애는 본 발명에서 첫째로, 온화한 진공하에서 혼합함으로써, 제형으로 가스의 도입을 제거하는 것을 수행함으로써 해결된다. 제형에 남아 있는 작은 양의 수용성 가스도 제형이 낮은 진공하에서 서서히 팽창되면서 제거된다. 상기 제형의 동결온도 이상의 추가적인 예비 냉각 단계도 팽창속도의 추가적인 조절을 제공하고 그럼으로써 선행기술보다 건조면적당 더 높은 용량을 허용한다. 제1건조단계가 끝난 후, 짧은 시간안에 상기 제형의 건조를 달성하기 위해서, 안정한 건조 제형은 상승한 제2건조 온도 (70℃까지) 및 진공압력은 0.2 토르 (Torr) 미만에서 유지될 수 있다.
발명의 또 다른 실시예에서, 본 발명은 생활성 미생물이나 물질의 보존을 위하여 하이드로겔 제형 조성물을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 예를 들면, 건식분말 형태에서 프로바이오틱 박테리아를 포함하는 제형, 안정제 및 보호제와 함께 용액내에서 혼합되고, 금속이온 또는 2가 양이온이 첨가됨으로써 하이드로겔에 가교되며, 위에서 기술한 낮은 진공 및 온도하에서 건조된다. 상기 제형의 예비 냉각온도를 유지하는 것은, 상기 제형으로부터 열의 전도 및/또는 수분 증발에 의한 잠열을 손실에 의할 수 있다.
예를 들면 본 발명의 하나의 특정 실시 상태에 있어서, 상기 제형은 1 내지 2.5%의 알긴산 나트륨 (바람직하게는 1.5%의 알긴산 나트륨), 1% 내지 약 5%의 이뉼린 (바람직하게는 2.5%의 이뉼린), 20% 내지 60%의 트레할로스 (바람직하게는 40%의 트레할로스) 및 3% 내지 15%의 카제인 가수분해물 (바람직하게는 8%의 카제인 가수분해물) 용액의 살아있는 프로바이오틱 박테리아의 프레쉬 (fresh), 동결 또는 건조 배양물을 포함한다. 상기 제형은 모든 성분이 완전히 용해될 때까지 진공하에서 실온보다 약간 높은 온도 (일반적으로 25°C 내지 37°C)에서 혼합했다.
본 발명의 또 다른 실시 상태에서, 모든 성분들이 상승한 온도에서 용액에 용해되며, 슬러리가 0℃ 내지 -5℃의 온도로 냉각되고, 살아있는 미생물의 건식분말이 모든 성분들이 완전히 용해될 때까지 혼합된다. 생체 건식 분말의 혼합을 원활히 하고, 응집을 막기 위해서, 소량의 트레할로스 (trehalose)가 건식분말에 첨가될 수 있다 (일반적으로 건식분말과 트레할로스를 같은 비율로 포함하고 있는 혼합물은 충분하다).
상기 제형 슬러리는 약 200 g/sq ft 용량의 트레이에 퍼지고, 트레이는 동결 건조기의 선반에 놓인다. 선반 온도는 0 내지 -5℃ (바람직하게는 -2℃)로 맞춰지고, 슬러리는 그 온도까지 냉각된다. 진공 압력은 1 내지 5 토르 (Torr)(바람직하게는 3 토르 (Torr))가 가해지고, 선반온도는 열 전도 이동을 위하여 20℃ 내지 45℃ (바람직하게는 30℃)까지 오른다. 상기 제형 온도는 초기 증발 단계 동안에 상기 샘플의 동결을 막기 위하여 약 0 내지 -5℃ 온도로 유지된다. 생성물 온도가 약 10℃에 달했을 때, 0.1 토르 (Torr)의 최대 진공과 40℃의 선반 온도에서 제2건조 단계가 시작된다. 전체 건조 공정은 약 4시간 동안 진행되어 생성물은 수확되고, 수분활성도는 -0.3 Aw 이하이다.
발명의 또 다른 실시상태에서, 적재된 트레이는 냉장실에서 -2℃까지 예비 냉각되고, 즉시 복사열 전이를 위하여 진공 오븐 건조기에 적재했다. 제1과 제2건조 단계는 열 전도 전이를 위하여 상기에서 기술한 대로 적용된다.
제형의 제조
본 발명의 제형은 프레쉬 (fresh), 동결, 건식 살아있는 미생물을 안정제 및 보호제를 포함하는 용액이나 현탁액에 넣는 것을 포함할 수 있다. 안정제 및/또는 고농도의 보호제는 냉각과 혼합전에 과열 수용액에 상기 생활성 미생물과 교반하여 용해될수 있다. 배양 바이러스 또는 박테리아 등의 상기 미생물은 영양 배지로부터 원심분리와 여과에 의해 농축, 분리될 수 있고, 바로 본 발명의 상기 제형에 혼합되거나, 기존의 동해방지제와 함께 액체 질소로 떨어뜨리고, 소량의 냉동 비즈는 상기 제형에 혼합되기 전까지 -8℃에서 저장된다. 그 대신, 냉동 비즈는 동결 건조될 수 있고, 미세한 분말로 가공되어, 밀폐주머니에 포장되고 발명의 상기 제형에 혼합되기 전에 냉동저장된다. 본 발명에 따르는 하나의 실시상태에서, 상기 제형 내에서 물의 총량은 농축 생체의 용액 및 생체 현탁액 내에서 얻어지고, 실온보다 약간 높은 온도에서 유지된다. 안정제 및 보호제의 건조 성분는 함께 섞어져, 따뜻한 생체 현탁액에 서서히 첨가된다. 상기 제형 현탁액은 온화한 진공하에서 플래너터리 믹서기 (planetary mixer)에서 모든 성분이 완전히 분산되고, 균일한 슬러리를 얻을때까지 서서히 저어진다.
본 발명의 또 다른 실시상태에서, 실온보다 살짝 높은 온도에서 물에 건조혼합생성물이 첨가되기 전에, 상기 생활성 미생물은 건식분말 형태로 있고, 제형 성분과 예비 혼합 건조된다.
상기 생활성 미생물 또는 물질은 효소활동, 면역반응 유도, 세포 증식, 감염, 세포성장 억제, 세포 성장 자극, 치료효과, 약리효과, 향균효과 및/또는 그러한 것 등의 생활성을 제공할 수 있다. 상기 생활성 미생물 또는 물질은 미생물세포 또는 백신으로 유용한 리포솜 (liposomes)이나, 치료를 위한 운반체가 될 수 있다. 본 발명의 생활성 미생물은 살아있는 바이러스, 살아있는 약독화 바이러스 및/또는 그러한 것이 될 수 있다.
제형 안정제는 제형에 구조적 안정성 및/또는 생활성 미생물에 물리적 및 화학적 보호 이점을 제공한다. 상기 안정제는 상기 제형에 점성을 제공하고, 진공하에서 팽창 성질을 더 잘 조절하고, 발명의 건식 제형에 구조적인 강도를 높인다.
상기 보호제는 다양한 단백질, 단백질 가수분해물, 당(sugar), 당 (sugar) 알코올 및 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들면, 수크로스나 트레할로스 등의 당 (sugar)은 상기 생활성 물질을 물리적으로 둘러싸, 건조 과정 전반에 분자 구조의 유지를 촉진하고, 건조상태에서 무정형 매트릭스에 구조적인 강도를 준다. 상기 보호제는 건조과정 동안에, 세포막의 손상과 효소의 변성을 막기 위하여 수화수 (water of hydration) 손실을 대체할 수 있다. 상기 보호제의 다른 기능은 위협이 되는 빛, 산소, 산화제 및 습기의 노출로부터 생활성 물질을 보호하는 것을 포함할 수 있다. 대부분의 보호제는 약 0.1 중량% 내지 약 60 중량% 범위의 용액에 즉시 용해될 수 있다.
제형의 예비냉각
본 발명의 제형은 건조과정에서 진공압력을 가하기 전에, 상기 제형 슬러리의 추가적인 농밀화, 낮은 진공압력에서 제형의 팽창을 더 잘 조절, 생활성 미생물이나 물질의 안정 및/ 또는 세포막을 통해 제형 구성성분의 침투를 향상하는 것 등의 추가적인 이점을 제공하기 위하여 예비 냉각 할 수 있다. 냉각은 선행기술에서 알려진 임의의 적절한 기술을 적용할 수 있다. 예를 들면, 냉각은 찬 표면과의 접촉과 전도, 잠열의 상실 및/또는 그러한 것들로 할 수 있다. 일반적으로, 제형은 관에서 유지되거나 금속 트레이에 퍼지고, 조절된 온도와 평형이 되는 조절된 온도 표면 또는 챔버와 접촉하여 놓인다. 일반적으로, 발명의 상기 제형은 그것의 동결온도 이상의 온도에서 예비 냉각될 수 있다 (예컨대, -5°C 내지 +5°C사이).
제형의 제1건조
살아있거나 약화된 생체 등의 생활성 미생물의 보호하기 위한 일반적인 과정은, 막 손상과 세포구성성분의 변성을 초래할 수 있는 냉각과 진공상태의 조합을 포함한다. 선행기술은 높은 압력 (예컨대, 100토르(Torr)미만), 특정 동결방지제 첨가, 탁한 용액 (시럽)을 얻기 위한 농축 단계 및/또는 냉각을 막기 위한 높은 초기온도의 사용을 알려준다. 본 발명의 제형과 파라미터 공정의 사용은 이러한 제한을 극복하고, 산업생산량을 상당히 향상시키는 건조 면적당 높은 용량을 가능하게 한다.
본 발명의 상기 제형은 증발에 의해 건조된다. 제형 주위의 가스 환경으로부터 용매 (습기)의 제거는 응결 또는 건조에 의해 초래될 수 있다. 상기 제형으로부터 용매의 증발은 낮은 진공압력하에서 가속화된 제형의 제1건조를 제공할 수 있다. 제형의 조절된 팽창은 제형 밖으로 용매가 빠른 전이를 함으로써 상기 제형의 제1건조를 가속화한다. 상기 제형의 조절된 팽창은 건조 진공이 가해질 때, 남아있는 용해된 가스의 탈기 (끓는 것이 아닌)에 의해 달성된다. 제형이 끓지 않거나 과도한 거품이 발생하지 않는 것이 바람직하다. 끓는 중에 버블 형성과 관련된 케비테이션 (cavitation)과 전단력 및/ 또는 제형이 용기로부터 튀거나 생활성 미생물에 부정적인 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
제1건조가 진행됨에 따라, 상기 제형 구조는 안정화된다. 건조 챔버 내에 열이 공급되면서 용매의 증발에 의한 잠열의 감소를 보상하고, 상기 제형 온도는 그것의 동결온도보다 10℃ 이내에서 유지된다. 제1건조과정 중 어떤 지점에서, 용매의 증발 속도가 느려지고, 건조 챔버내에서 열의 불필요한 공급으로 인해 제형 온도가 오르기 시작한다. 이는 본 발명에서 제1건조단계가 끝나는 지점을 알려준다. 상기 제형으로부터 용매가 빠지면서, 용액 내 상기 보호제는 액체처럼 흐르는 것을 멈출 때까지 점점 농축되고, 걸쭉해진다. 비결정질 및/또는 유리 제형은 안정한 제형 구조로 보존된다.
제2건조
구조적으로 안정한 상기 제형의 제2건조는 잔류되어 붙잡힌 습기를 제거하고, 주위 온도에서 장기간 저장시 안정한 조성을 제공한다. 제2건조는 몇 시간에서 수일까지 고온 및 강한 진공의 적용을 포함한다. 바람직한 실시예에서, 제2건조 단계를 완성하기 위하여 필요한 주기는 제1건조단계의 2배이다. 바람직하게, 제2건조단계의 종결에서 상기 제형의 수분활성도는 Aw 0.3 미만이다. 건조 온도는 실온 내지 약 70℃의 범위 내에 있을 수 있다. 많은 생활성 미생물을 위한 일반적인 제2건조 과정은, Aw가 0.3 미만인 안정한 건식 제형조성을 제공하기 위해서, 약 30℃ 에서 약 40℃까지 온도가 오르는 것과 약 30분 내지 약 24시간 (바람직하게는 약 30분 내지 약 4시간) 유지하는 것을 포함할 수 있다. 제2건조 중 하나의 특정 실시상태에서, 건조온도는 제1건조 조건으로부터 살아있는 미생물 등의 생물체의 활성을 추가적으로 보존할 수 있는 속도까지 서서히 오른다. 제2건조 과정에서 수분 제거 속도를 가속화해서 잔여 수분 레벨을 낮추기 위하여 강한 진공이 제공될 수 있다. 제2건조과정에서 진공은 1 토르 (Torr) 미만, 바람직하게는 약 0.2 토르 (Torr) 미만이다.
발명의 상기 건조 방법에 의해 비정질 유리 매트릭스 내에 싸인 생활성 미생물 또는 생활성 물질은, 비정질 유리 조성물 내의 화합물과 다른 분자의 상당히 감소된 유동성 때문에, 단백질의 언폴딩 (unfolding)과 상당히 더딘 분자 상호작용 또는 교차 반응을 막는다. 비정형 고체가 유리 전이 온도보다 낮게 됨에 따라, 잔여 습기는 상대적으로 낮게 유지되고 (예컨대, Aw 0.3 이하), 불안정한 생활성 미생물은 상대적으로 안정하게 유지될 수 있다. 생활성 미생물 또는 물질이 결정 상태에서 더 잘 있게 됨에 따라, 장기간의 안정성를 위하여 유리 상태로 성취하는 것이 필수적이지 않다고 나타난다.
건식분말의 준비
상기 건조 제형은, 원하는 모양과 사이즈로 절단되거나, 습기처럼 쉽게 흐르는 유동 분말 (free flowing powder)로 분쇄 및 연마, 건조 응집, 과립, 타블레팅 (tabletting), 압축, 펠렛화 (pelletization) 또는 임의의 다른 종류의 운반 과정을 통틀어 사용될 수 있다. 으깨거나, 분쇄, 제분 또는 가루로 만드는 공정은 선행 기술에서 잘 알려져 있다. 예를 들면, 해머 밀 (hammer mill), 임팩트 밀 (impact mill), 제트 밀 (jet mill), 핀 밀 (pin mill), 윌리 밀 (wiley mill) 또는 비슷한 밀링 기기가 사용될 수 있다. 바람직한 입자 크기는 약 1000 μm 미만이고, 더 바람직하게는 500 μm 미만이다.
명세서에서 기술한 상기 조성물과 방법들은 상기 생활성 미생물 또는 생활성 물질이 가진 생물학적 활성을 보존한다. 예를 들면, 높은 온도 (예컨대, 40℃) 및 높은 습도 (예컨대, 33% RH)의 조건하에서, 제형의 생활성을 측정하면서 조성의 안정성를 시험했다. 살아있는 프로바이오틱 박테리아의 경우, 최소한 60일은 이러한 제형내에서 박테리아 제형이 안정하다는 연구 결과가 나타난다(도 1 참조). 안정도는 시간에 따른 포텐시(potency)손실 g 당 1 log CFU 로 정의된다. 그러한 제형은 높은 농도의 생활성 미생물이 사용되어 질 때에도 안정하다. 따라서 이러한 제형은 장기간 실온 이상의 온도에서 운반되고 저장되어 질 때 이점이 있다.
실시예
하기의 실시예는 이해를 돕기 위하여 제공되며, 청구된 발명을 제한하지 않는다.
[실시예 1]
예비 혼합된 건식 제형의 제조
몇 가지 제형의 예비혼합물은 표 1 에 따라 제조하였다. 트레할로스는 Cargill Minneapolis, MN 사로부터 구입하였다. 대두 분리 단백질은 Fearn Natural Foods, Mequon, WI 사로부터 구입하였다. 훼이 단백질 농축은 Agri- Mark Inc., Middlebury, VT.사로부터 구입하였다. 카제인 가수분해물은 Marcor, Carlstadt, NJ 사로부터, 알긴산나트륨은 ISP Corp., Wayne, NJ.사로부터 구매하였다. 모든 성분은 함께 혼합되어 균일하게 섞인다 (표 1).
예비 혼합 조성물의 제형 (중량%)
성분 예비혼합 대두 예비혼합 훼이 예비혼합 단백질가수분해물
알긴산나트륨 3.0 3.0 3.0
이뉼린 5.0 5.0 5.0
트레할로스 75.3 75.3 75.3
대두분리단백질 14 ---- ----
농축 훼이 단백질(whey protein) ---- 14 ----
카제인 가수분해물 2.7 2.7 16.7
[실시예 2]
프로바이오틱 박테리아를 포함하는 안정한 건식분말
락토바실러스 아시도필루스 (Lactobacillus Acidophilus ) (실험실 발효 수확물로부터 100g 냉동 농축) 37℃에서 해동시켰다. 예비혼합된 단백질 가수분해산물 (100g, 표 1)은 이중 외피 플래터너리 믹서기 ((DPM, lqt, 로스 엔지니어링주식회사 (Ross Engineering, Inc. 사바나(Savannah) GA,)내의 해동된 프로바이오틱 박테리아의 슬러리에 서서히 첨가시켰다. 혼합은 40RPM의 온화한 진공 (25토르 (Torr)) 및 37℃에서 10분간 수행하였다. 균일한 슬러리는 200 g/sq ft 용량의 트레이에 고르게 분포시키고, 상기 트레이는 냉동 건조기 (모델명 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)의 선반에 두었다. 선반 온도는 냉동되지 않고 냉각시키기 위하여 슬러리의 동결온도를 -5℃ 위로 맞추었다. 상기 제형온도가 약 -1℃에 도달할 때 진공압력(3 토르 (Torr))을 가하였다. 슬러리는 진공이 약 7 토르(Torr)에 도달할 때, 서서히 탈기하기 시작한다. 진공이 3토르 (Torr)에 도달할 때, 선반 온도는 50℃까지 증가하였다. 제형 온도는 제1건조단계의 50분 동안, 약 -1℃에서 약 +5℃ 사이에서 유지되었다. 제형 온도가 +10℃까지 상승하면, 제2건조 단계를 개시하였다. 선반 온도가 50℃에서 계속 유지하면서 최대 0.1 토르 (Torr)의 진공을 가하였다. 제2건조 단계는, 건조과정이 종결되고 건조 제형이 냉각 건조기에서 제거되는 시점까지 추가적으로 100분 동안 계속 되었다. 이 시점의 상기 건조 제형의 수분 활성도는 하이그로팜 올 기기 (Hygropalm Awl instrument) (로토닉 기기 주식회사,헌팅턴, 뉴욕(Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.)에 의해 Aw=0.23로 측정되었다.
제형화, 준비, 건조 공정 동안의 생존능력의 손실은 도 9 에 제시하였다. 제형을 제조하는 동안에 생존능력의 손실은 0.26 로그 (logs)이고, 건조 과정 동안에는 0.34 로그 (logs)이며, 총 누적손실량은 0.6 로그 (logs)이다.
도 10은 37℃와 33% RH의 가속화된 저장 조건하에서 상기 건조제형내의 저장안정도를 나타낸다. 이 저장 조건에서 4주가 지난후, 본 발명의 제형내의 안정화된 프로바이오틱 박테리아의 생존능력손실은 겨우 0.8 로그 (logs)였다.
[실시예 3]
하이드로겔 제형의 제조
농축 프로바이오틱 슬러리는 실시예2에 따라 준비되나, 표1의 예비혼합 훼이 단백질(whey protein)을 사용한다. 상기 슬러리에 0.5 g의 이염기성 인산칼슘이 첨가했고, 이어서 0.5 g의 글루코노락톤을 첨가했다. 상기 슬러리는 고형 하이드로겔을 형성하기 위하여 추후 2시간동안 실온에서 단단해졌다. 단단한 겔은 상업적 이용가능한 슬라이서/분쇄기를 사용하여, 얇고 긴 줄로 잘라졌다. 상기 얇은 줄은 200 g/sq ft 용량의 트레이에 적재됐고, 건조를 위하여 실시예2에서 설명한 냉각 건조기에 두었다. 0.1토르 (Torr)의 최대 진공을 달성하고 4 시간 후에, 냉각 건조기에서 상기 건조 생성물을 빼내었다. 상기 제형의 수분활성도(Aw)는 0.05 로 측정되었다 (하이그로팜 올, 로토닉 헌팅턴, 뉴욕)(HygroPalm Awl, Rotonic Huntington, NY로 측정). 상기 건조 제형은 스탠다드 해머 밀링기(standard hammer milling)를 이용하여 고운 가루로 갈리었고, 50-250 마이크론(micron) 막으로 체 쳐졌다. 도 11은 본 발명에 따라 하이드로겔 제형으로부터 안정한 건식 제형 생성방법의 플로우차트를 제시한다.
[실시예 4]
프로바이오틱 사료의 제조
상업적으로 이용가능한 개를 위한 제형 사료는 컨벡션오븐(convection oven)에서 수분활성도 0.1 로 건조시켰고, 실시예3에서 설명한 프로바이오틱 건조제형으로 감싸졌다. 건조 펠렛은 약 5 %의 팻-베이스드 모이스쳐 베리어 (fat-based moisture barrier)(40 %의 닭고기 지방, 40%의 코코아 버터 및 20%의 비즈왁스 혼합물)와 드럼 텀블러에서 건조 제형 (보통 10. sup.8 CFU/g의 정량을 제공하는 0.1-0.5%의 총사료)과 함께 혼합되었고, 마지막으로 펫-베이스드 모이스쳐 베리어 (fat-based moisture barrier)로 분사되었다. 코팅의 총 양은 15%이다 (사료에서). 코팅 시간은 약 30분이다.
[실시예 5]
몇 가지의 프로바이오틱 미생물과 물고기 사료의 제조
본 발명에 따르는 물고기를 위한 제형 먹이는 몇 가지의 프로바이오틱의 혼합물을 포함하여 제조하였다. 비피더스균 락티스 (Bifidobacterium lactis)을 포함하는 안정한 건식 프로바이오틱 제형은 상기 실시예2에서 기술한 대로 제조되었다.상업적으로 이용가능한 연어 (Zeigler Bros., Gardners, PA)를 위한 개시 먹이는 컨벡션 오븐(convection oven)에서 0.1의 수분활성도로 건조되었고, 드럼 텀블러 (drum tumbler)에서 프로바이오틱 제형으로 감싸졌다. 펠렛 (100 g)은 펫-베이스드 모이스쳐 베리어 (40 %의 피쉬오일, 40%의 코코아버터 및 20 %의 비즈왁스 혼합물)의 약 5 %로 분사되고, 1g의 안정한 건식 프로바이오틱 제형과 혼합되었고 (107 cfu/g 정량을 얻기 위하여), 마지막으로 펫-베이스드 모이스쳐 베리어로 추가적으로 분사되었다. 코팅의 총량은 물고기 먹이의 약 10 %였다.
[실시예 6]
본발명의 건조 제형을 포함하는 영아용 조제식
락토바실러스 GG(lactobacillus GG)(발리오사, 핀란드 Valio Corp, Finland)를 포함하는 안정한 건조 제형은 상기 실시예2 에 따라 두 개의 입자 크기 그룹으로 체쳐져(50 μm 이상 및 150 μm이하) 제조되었다.영아용 조제식은 99 g 의 뉴트라미젠 (Nutramigen)(Mead Johnson; Evansville, IL)과 0.1 g의 작은 사이즈 입자 (50 μm 이하)를 혼합함으로써 제조되었다. 최종 생성물은 100 g의 영아용 조제식 당 약 108 cfu의 락토바실러스 GG (Lactobacillus GG)를 포함한다.
[실시예 7]
효소를 포함하는 안정한 건식분말
40 중량 %의 사비네이즈 (Savinase)(노보자임,덴마크 Novozymes, Denmark) 를 포함하는 하이드로겔 제형은 온화한 진공하에서, 60g의 예비혼합 단백질 가수분해물 제형 (표1)과 100g의 수용액 중 40g의 사비네이즈 (savinase)와 함께 혼합되어 준비되었다. 상기 습식 제형은 진공오븐 속에서 50℃의 건조온도로 건조되었다. 건조제형의 로딩과 저장안정도를 결정하기 위하여: 건조 샘플은 정확하게 마이크로원심분리 튜브로 계량된다(<100 mg). 200 μl의 다이메틸설폭시화물 (DMSO)가 첨가되었다. 제형은 볼텍싱 (vortexing)에 의해 DMSO 버퍼 (buffer)에 용해되었다. 상기 샘플에 0.8 ml의 NaOH 0.05 N 포함하는 용액, 0.5 %의 SDS, 0.075 M의 시트르산 (trisodium salt)이 첨가되었다. 튜브는 45°C에서 10분간 초음파로 분해된 후, 이어서 5,000 rpm에서 10분간 원심분리를 하였다. 맑은 DMSO/NaOH/SDS/시트르산 용액의 표본은 마이크로플레이트로 옮겨져, 브래드포드 어세이 방법 (Bradford assay method)을 사용하여 단백질 함량을 분석하였다. 안정한 효소 제형의 저장안정도는 본 발명의 상기 제형이 없는 건조 효소보다 상당히 높다.
[실시예 8]
비타민 A를 포함하는 안정한 건식분말
50 중량%의 비타민 A 를 포함하는 하이드로겔 제형 (BASF Corp., Florham Park, NJ)은 25토르 (Torr)진공하에서, 50g의 예비 혼합된 대두 단백질 제형(표1), 100g의 수용액 중 50g의 비타민 A 파우더와 함께 혼합되어 제조되었다. 상기 습식 제형은 -5℃까지 예비 냉각되고, 200g/sq ft 용량의 트레이에 분포되고, 3토르 (Torr)의 초기 진공 압력 및 70℃의 진공 오븐에서 건조되고, 제형 온도가 5℃까지 이르면, 이어서 70℃에서 0.2 토르 (Torr)의 최대 진공 단계가 뒤따른다.
[실시예 9]
침입 (invasive) 종 미끼 (bait)의 제조
본 발명에 따른 특별히 타겟화 된 침입 (invasive) 종의 펠렛화 된 미끼 (Pelleted bait) 는 살충제를 포함하여 제조하였다. 표1의 예비 혼합 훼이 단백질(whey protein)을 200 gm의 물에 첨가하였다. 이 용액에 90 gm의 로테논, 0.5 gm의 이염기성 인산 칼슘을 첨가하였고, 이어서 0.5 gm의 글루코노락톤을 첨가하였다. 상기 슬러리는 실온에서 2시간 동안 단단해졌다. 단단한 겔은 슬라이서/분쇄기를 통해 얇고 긴 줄로 잘라졌다. 얇은 줄은 트레이에 적재되었고, 진공오븐 건조기에 두었다. 건조는 0.1의 수분활성도를 달성한 후에 멈추었다. 상기 건조 제형은 특정 타겟 종을 위한 특정 미끼(bait) 사이즈로 적절한 사이즈 분포로 갈아졌다.
[실시예 10]
수용성 제형내에서 보호 살충제의 제조
살충제의 보호 용해 입상 제형은 본 발명의 과정에 따라 준비되는 저장 과정에서 제형 내의 다른 성분에 의해 분해의 대상이 된다. 표 1의 예비혼합 대두 단백질은 200g의 물에 첨가되었다. 이 용액에 80g의 민감한 살충제의 건조 제형이 첨가되었다. 상기 슬러리는 진공 오븐 건조기에 옮겨졌고, 0.1의 수분활성도로 건조되었다. 상기 건조 제형은 원하는 크기로 연마되어 포장되었다.
[실시예 11]
불용성 제형내에서 보호 살충제의 제조
살충제의 보호 불용성 입상 제형은 저장과정에서 본 발명의 제형과 방법에 의해 준비되는 다른 성분에 의해 분해의 대상이 된다. 표 1의 예비혼합 대두 단백질이 200 g의 물에 첨가되었다. 상기 용액에 90 g의 민감한 살충제의 건조 제형과 0.5g의이염기성 인산 칼슘이 첨가되었고, 이어서 0.55g의 글루코노락톤이 첨가되었다. 상기 슬러리는 실온에서 2시간동안 단단해져, 슬라이서/분쇄기를 통해 얇고 긴실로 잘렸다. 상기 얇은 줄은 트레이에 올려져, 진공 오븐 건조기에서 0.1의 수분활성도에 이를 때까지 건조되었다. 상기 건조 제형은 추후 원하는 크기 분포로 연마되어, 포장되었다.
[실시예 12]
10 g의 건조 락토바실러스 람노서스 GG(Lactobacillus Rhamnosus GG)은 상기 실시예1의 100 g의 예비혼합 단백질 가수분해물과 혼합되었다. 상기 건조 혼합물은 이중 외피 플래너터리 믹서(jacketed dual planetary mixer)로 35℃에서 100 gm의 탈이온수에 서서히 첨가되었고, 40 rpm에서 10분간 혼합되었다. 상기 균일한 슬러리는 결국 100 gm/ sq ft의 용량 트레이에 분포시키고, 트레이는 냉각 건조 선반 위에 두었다(모델명 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 선반 온도는 슬러리를 냉각하기 위하여 5℃에 맞추었다. 선반 온도가 30℃까지 오른 때, 압력을 3 토르(Torr)로 낮추기 위하여 진공을 가하였다. 2시간 후, 압력은 150 milli토르(Torr)까지 감소하였고, 선반 온도는 여전히 30℃에 머무른다. 건조는 생성물 온도가 선반온도에서 2℃ 오르는 지점까지 추가적으로 3시간 동안 계속되었다. 상기 건조 생성물은 냉각 건조기에서 제거되었고, 이 지점에서 상기 건조 제형의 수분활성도는 하이그로팜 올 기기 (Hygropalm Awl instrument)에 의해 측정되었다. 제형화, 준비 및 건조 과정 동안에 생존능력 감소는 측정되고 기록되었다. 상기 건조 제형의 저장안정도 검사는 32℃ 및 20 % RH의 가속화된 저장 조건하에서 이루어졌다.
30℃에서 시행 결과 및 40℃에서 반복은 아래에서 제시된다.
Figure 112011103372732-pct00001
[실시예 13]
20g의 건조 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus Rhamnosus GG )는 상기 실시예1의 100g의 예비혼합 훼이 단백질(whey protein)과 혼합되었다. 상기 건조 혼합물은 35℃에서 이중 외피 플래너터리 믹서(jacketed dual planetary mixer)에서 100 gm 의 탈이온수에 서서히 첨가되었고, 40 rpm에서 10분간 혼합되었다. 상기 균일한 슬러리는 100gm/ sq ft의 용량 트레이에 고르게 분포되었고, 트레이는 냉각 건조기의 선반 위에 두었다 (모델명 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 상기 선반 온도는 슬러리를 냉각시키기 위하여 5℃로 맞춰진다. 선반 온도가 30℃까지 오른 때 압력을 3 토르(Torr)까지 감소시키기 위하여 진공을 가하였다. 2시간 후 압력은 150 밀리토르(milliTorr)까지 추가적으로 감소되었고, 선반온도는 여전히 30℃로 유지된다. 건조는 추가적으로 3시간 동안 계속되고, 생성물 온도는 선반 온도에서 2℃까지 오른다. 상기 건조 생성물은 냉각 건조기에서 제거되었고, 이 지점에서 건조 제형의 수분활성도는 하이그로팜 올 기기 (Hygropalm Awl instrument)에 의해 측정되었다. 제형화, 준비 및 건조 과정에서 생존 능력의 감소는 측정되고 기록되었다.
건조 제형의 저장안정도 검사는 32℃ 및 20 % RH 의 가속화된 저장 조건하에서 수행되었다.
30℃에서 시행 결과와 40℃에서의 반복이 아래에서 제시된다.
Figure 112011103372732-pct00002
[실시예 14]
65.3 gm 의 트레할로스, 3 gm의 알긴산 나트륨, 5 gm의 이뉼린 및 16.7 gm 의 훼이 가수분해물을 건조 파우더로서 함께 혼합하였고, 이중 외피 플래너터리 믹서 (jacketed dual planetary mixer)에서 35℃의 100 gm의 탈이온수에 서서히 첨가하였고, 40 rpm에서 5분간 혼합할 동안에, 10g 의 건조 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilis)는 10gms의 트레할로스와 혼합하였다가 잠시 한쪽에 놓아두었다. 상기 슬러리에 예비 혼합 건조 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilis)와 트레할로스가 첨가하였고, 35℃에서 추가적으로 5분 동안 혼합하였다. 상기 균일한 슬러리는 100 gm/ sq ft의 용량 트레이에 고르게 분포되었고, 트레이는 냉각 건조기의 선반 위에 두었다 (모델명 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 상기 선반 온도는 슬러리를 냉각하기 위하여 5℃로 맞추었다. 상기 선반 온도가 30℃까지 오른 때, 압력을 3 토르 (Torr)까지 낮추기 위하여 진공을 가하였다. 2시간후 압력은 150 밀리토르 (milliTorr)까지 감소되었고, 선반 온도는 여전히 30℃로 유지된다. 생성물 온도는 선반 온도의 2℃의 이내로 오르는 시점까지 건조를 추가적으로 3시간 동안 계속하였다. 상기 건조 생성물은 냉각 건조기에서 제거되었고, 이 지점의 상기 건조 제형의 수분활성도는 하이그로팜 올 기기 (Hygropalm Awl instrument)를 이용하여 측정되었다. 제형화, 준비 및 건조과정에서 생존능력의 손실은 측정되고 기록되었다. 상기 건조제형의 저장안정도 검사는 32℃ 및 20% RH의 가속화된 저장 조건하에서 수행하였다. 건조기가 30℃에서 유지될 때의 시행결과와 건조기가 50℃에서 유지될 때를 비교하여 아래 표에 제시하였다.
Figure 112011103372732-pct00003
[실시예 15]
65.3 gm의 트레할로스, 3gm의 알긴산나트륨, 5 gm의 이뉼린 및 16.7 gm의 훼이 가수분해물을 건식 분말로서 함께 혼합하고, 이중 외피 플래너터리 믹서(jacketed dual planetary mixer)내에서 50℃, 100 g의 탈이온수에 서서히 첨가하고, 40 rpm에서 5분간 혼합하는 동안, 10g의 건조 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilis)는 10 gms의 트레할로스와 혼합하고 잠시 한쪽에 놓아두었다. 상기 슬러리는 4℃까지 냉각하였다. 상기 냉각 슬러리에 락토바실러스 아시도필러스 (Lactobacillus acidophilis )와 트레할로스 예비 혼합물이 첨가되었고, 혼합은 4℃에서 추가적으로 5분 동안 계속하였다. 상기 균일한 슬러리는 100 gm/ sq ft의 용량 트레이에 고르게 분포되었고, 트레이는 냉각 건조기의 선반 위에 두었다 (모델명 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 상기 선반 온도는 냉각 슬러리의 온도를 유지하기 위하여 5℃로 맞추었다. 선반 온도가 30℃까지 오르면, 압력을 3 토르 (Torr)로 감소시키기 위하여 진공을 가하였다. 2시간 후 압력은 추가로 150 밀리토르 (milliTorr)까지 감소하였고, 선반 온도는 여전히 30℃로 유지되었다. 생성물 온도는 선반 온도의 2℃ 이내의 범위까지 오르는 시점까지, 건조를 추가적으로 3시간 동안 계속하였다. 상기 건조 생성물은 냉각 건조기에서 제거되었다. 하이그로팜 올 기기 (Hygropalm Awl instrument)에 의해 측정된 이 지점에서의 건조 제형의 수분활성도는 Aw=0.23 이다. 제형화, 준비 및 건조 과정에서 생존능력의 감소는 총 0.6 로그 (logs) 이다.
[실시예 16]
100 g의 대두 예비 혼합물은 이중 외피 플래너터리 믹서 (jacketed dual planetary mixer)내에서 35℃의 100gm의 탈이온수에 서서히 첨가되었고, 40rpm에서 10분간 혼합되었다. 10g의 건조 비피더스균 락티스 (Bifidobacterium lactis) Bb-12은 20 rpm에서 서서히 첨가되어 혼합되었고, 상기 슬러리는 추가적으로 5분동안 혼합되었다. 상기 균일한 슬러리는 100 gm/ sq ft의 용량 트레이에 고르게 분포되고, 트레이는 냉각 건조기의 선반 위에 두었다 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 선반 온도는 슬러리를 냉각하기 위하여 5℃로 맞췄다. 선반 온도가 30℃까지 오른때, 압력을 3토르(Torr)로 낮추기 위하여 진공을 가하였다. 2시간 후 압력이 150 밀리토르(milliTorr) 로 감소되었고, 선반 온도는 여전히 30℃로 유지된다. 건조는 추가적으로 3시간 동안 계속되며, 생성물 온도는 선반 온도의 2℃ 이내 범위로 오른다. 상기 건조 생성물은 냉각 건조기에서 제거되었고, 이 지점에서 하이그로팜 올 기기(Hygropalm Awl instrument)로 측정된 건조 제형의 수분활성도는 Aw=0.26 이다. 제형화, 준비 및 건조 과정에서 생존 능력의 감소는 총 0.7 로그(logs) 였다.
32℃ 및 20% RH의 가속화된 저장 조건하에서 건조 제형의 저장안정도 검사는 본 발명의 제형화에서 안정화된 프로바이오틱 박테리아의 생존능력감소가 4주 후에 겨우 0.7 로그 (logs)라는 것을 보여준다.
[실시예 17]
실시예 1에 따른 동일한 파라미터로서, 로스 믹서(Ross mixer)내에서 행하여진 혼합을 제외하고, 1.2gm/cc 의 슬러리 밀도로 하기 위하여 진공 25인치 하에서 된다. 이 지점에서 하이그로팜 올 기기 (Hygropalm Awl instrument)로 측정된 건조 제형의 수분활성도는 Aw=0.26 이다. 제형화, 준비 및 건조 과정에서 생존 능력의 감소는 총 0.5 로그(logs) 였다.
32℃ 및 20% RH의 가속화된 저장 조건 하에서 건조 제형의 저장안정도 검사는, 본 발명의 제형화에서 안정화된 프로바이오틱 박테리아의 생존능력 감소가 사주 후에 겨우 0.7 로그 (logs) 라는 것을 보여준다.
[실시예 18]
100g 의 LGG 박테리아의 신선한 액체 농축 (10% 고체 및 나머지 물을 포함하는)은 이중 외피 플래너터리 믹서(jacketed dual planetary mixer)내에 첨가되었고, 35℃ 까지 오른다. 여기에 100g의 훼이 예비혼합물을 서서히 첨가하였다 (표1). 상기 결과 슬러리는 40 rpm에서 10분간 혼합되었다. 상기 균일한 슬러리는 100 gm/ sq ft 의 용량 트레이에 고르게 분포되었고, 트레이는 냉각 건조기의 선반 위에 두었다 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 선반 온도가 30℃까지 오른 때, 압력을 3토르(Torr)로 낮추기 위하여 진공을 가하였다. 2시간 후에 압력은 150 밀리토르(milliTorr)로 감소되었고, 선반 온도는 여전히 30℃로 유지된다. 건조는 추가적으로 3시간 동안 계속되었고, 생성물 온도는 선반 온도의 2℃이내 범위로 오른다. 상기 건조 생성물은 냉각건조기에서 제거되었다.이 지점에서 하이그로팜 올 기기 (Hygropalm Awl instrument)로 측정된 건조 제형의 수분활성도는 Aw=0.25 였다. 제형화, 준비 및 건조 과정에서 생존능력의 감소는 총 0.5로그 (logs)였다. 32℃ 및 20% RH의 가속화된 저장 조건에서 건조 제형의 저장안정도 검사는 본 발명의 제형화에서 안정화된 프로바이오틱 박테리아의 생존능력감소가 4주 후에 겨우 0.4로그 (logs) 에 불과하단 것을 보여준다.
[실시예 19]
100g의 냉각 농축된 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus Rhamnosus GG (LGG)), 냉각 농축물 및 100g의 예비혼합 단백질 가순분해물은 이중 외피 플래너터리 믹서(jacketed dual planetary mixer)(DPM, lpt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA)로 첨가되었다.이 과정은 냉각 농축물을 먼저 얼리면서도 할 수 있다. 혼합은 40 RPM 및 37℃에서 10분간 수행되었다. 상기 균일한 슬러리는 점성도를 측정하였고 (Brookfield viscometer, Model # LVDVEl 15, Brookfield Engineering Laboratories, Inc.), 100g/sq ft의 용량 트레이에 고르게 분포되었다. 높은 점성 범위를 위한 점성도 파라미터는 400 mL의 파이렉스 비커 속 300g 의 샘플, 33-37℃, Spindle #64, 1.0 RPM 속도로, 가드-레그 (guard-leg) 없이 작동되었다. 상기 트레이는 30분 동안 냉각을 위하여 4℃ 냉장고에 넣어졌다. 냉각 후에, 선반 온도를 30℃로 맞추고, 2800m토르(Torr) 압력에서 최소 2.5시간 동안 냉각 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)를 사용하여 건조를 시작하였다. 적어도 2.5 시간이 지난 후에, 압력은 다른 2.5 시간 동안 lOOm토르(Torr)까지 감소되었다. 실험은 두 가지 다른 LGG 발효 집단으로 반복되었고, 한 집단은 3% DMV로 워싱되고, 예비혼합 가수분해물에 첨가하기 전에 탈이온수로 복원하는 것을 포함한다.
Figure 112011103372732-pct00004
중간 점성 범위를 위한 점성도 파라미터는 400 ml의 파이렉스 비커에 300g 의 샘플, 33-37℃, Spindle #64, 5.0 RPM 속도로, guard-leg 없이 작동된다.
Figure 112011103372732-pct00005
[실시예 20]
100g의 냉각 농축 락토바실러스 람노서스 GG (Lactobacillus Rhamnosus GG (LGG) )은 37℃에서 해동되었고, 이중 외피 플래너터리 믹서(jacketed dual planetary mixer)(DPM, lpt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA)에 첨가되었다. 그것에 100 g의 예비혼합 단백질 가수분해물이 첨가되었다. 냉각 농축을 얼린 것도 사용될 수 있다. 혼합은 40 RPM 및 37℃에서 10분 동안 수행되었고, 상기 슬러리는 100 g/sq ft의 용량 트레이에 고르게 분포되었다. 상기 트레이는 냉각을 위하여 30분동안 4℃ 냉장고에 넣어졌다. 냉각 후에, 선반 온도 30℃ 및 압력 2800 mTorr에서 냉각 건조기 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY)를 사용해 적어도 2.5시간동안 건조를 시작한다. 적어도 2.5 시간 후에, 압력은 다른 2.5 시간 동안 100 Torr까지 감소한다. 이 동일한 과정은, 100g의 단백질 가수분해물에 혼합된 10g의 건식 (분말) LGG 물질에도 적용된다. 이 건조 혼합물은 이중 외피 플래너터리 믹서 (jacketed dual planetary mixer)내에서 90g의 탈이온수에 서서히 첨가하였다.
Figure 112011103372732-pct00006
[실시예 21]
효소를 포함하는 안정한 건식분말
40g의 건식분말 형태의 프로바이오틱 효소(Novozymes, Denmark)는 60g의 대두 예비혼합물과 혼합되었다 (표1). 상기 건조 혼합물은 이중 외피 플래너터리 믹서(jacketed dual planetary mixer)내에서 35℃에서 100 g의 탈이온수에 서서히 첨가되었고, 40 rpm에서 10분간 혼합되었다. 상기 균일한 슬러리는 용량 100 gm/ sq ft의 트레이에 고르게 분포되었고, 트레이는 냉각 건조기의 선반 위에 두었다 (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). 선반 온도는 슬러리 냉각을 위하여 5℃로 맞췄다. 선반 온도가 60℃까지 오른 때, 압력을 3 토르(Torr)로 낮추기 위하여 진공을 가하였다. 1 시간 후에, 압력은 150 milli토르(Torr)까지 감소되었고, 선반 온도는 여전히 60℃로 유지된다. 건조는 한시간 동안 더 진행되었고, 생성물의 온도는 선반온도의 2℃이내 범위에서 오른다. 상기 건조 생성물은 냉각 건조기에서 제거되었다. 건식 제형의 수용과 저장안정도를 결정하기 위하여 건조 샘플은 정확히 마이크로원심분리 튜브 (microcentrifuge tube)에서 계량되며 (<100 mg), 200μg 의 다이메틸 설폭시화물 (DMSO)이 첨가되었다. 상기 제형은 DMSO 버퍼에서 볼텍싱 (vortexing)에 의해 용해되었다. 이 샘플에 0.8 ml의 0.05N NaOH 를 포함하는 용액, 0.5%의 SDS 및 0.075M 시트르산 (trisodium salt)가 첨가되었다. 상기 튜브는 45℃에서 10분간 초음파 처리되고, 10분간 1000rpm 원심분리가 뒤따른다. 깨끗한 DMSO/NaOH/SDS/시트르산 용액의 표본은 마이크로플레이트로 옮겨져, 브래드포드 어세이 방법 (Bradford assay method) 를 사용하여 단백질 함량을 분석하였다. 안정한 효소 제형의 저장안정도는 본 발명의 제형이 없는 건조 효소보다 상당히 높다.
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본 명세서에서 언급된 참고문헌들의 내용은 본 명세서에 참고로 통합된다.
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Claims (40)

  1. (i) 프로바이오틱인 생활성 미생물이나 물질, (ii) 알긴산나트륨(sodium alginate) 다당류 및 이뉼린(inulin) 올리고당인 안정제 및 (iii) 이당류 및 단백질 가수분해물인 보호제를 포함하고, 상기 생활성 미생물이나 물질은 비정질 유리 매트릭스로 싸여 있는 것을 특징으로 하는 안정한 건식 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제1항에 있어서, 상기 안정제는 1 중량% 내지 20 중량%로 존재하는 것인 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 보호제는 용액 내에서 손쉽게 용해되고, 물과의 접촉에 따라 걸쭉해지거나 중합되지 않는 것인 조성물.
  9. 제1항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물은 인간혈청알부민, 소혈청알부민, 흰자위, 젤라틴, 면역글로불린, 분리 대두 단백질(isolated soya protein), 밀단백질, 탈지분유, 카세인염, 훼이 단백질(whey protein) 및 완두콩 단백질로 구성된 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 보호제는 1 중량% 내지 80 중량%로 존재하는 것인 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 보호제의 총량은 20 중량% 내지 70 중량%인 것인 조성물.
  12. (i) 수용성 용매 내에서 프로바이오틱인 생활성 미생물이나 물질, 알긴산나트륨(sodium alginate) 다당류 및 이뉼린(inulin) 올리고당인 안정제 및 이당류 및 단백질 가수분해물인 보호제를 진공 하에서 혼합하는 단계,
    (ii) 단계(i)의 혼합물을 그것의 동결 온도 초과의 온도로 냉각하는 단계,
    (iii) 진공 하에서, 그것의 동결 온도 초과의 온도에서, 상기 냉각된 혼합물을 증발에 의하여 제1건조하는 단계,
    (iv) 상기 혼합물의 수분 활성도를 Aw -0.3 이하로 줄이기 위하여 충분한 시간 동안 20℃ 이상의 온도에서 상기 혼합물을 제2건조하는 단계를 포함하는,
    상기 생활성 미생물이나 물질은 비정질 유리 매트릭스로 싸여 있는 것을 특징으로 하는 제1항의 안정한 건식 조성물을 제조하는 방법.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서, 상기 혼합물의 제1건조 및 제2건조는 증발에 의해 수행되는 것인 방법.
  15. 삭제
  16. 제12항에 있어서, 상기 제2건조 단계는 혼합물의 온도가 제1건조 온도보다 최소한 10℃이상 증가 되었을 때 시작되는 것인 방법.
  17. 제12항에 있어서, 상기 제2건조 단계 동안 남겨진 용매의 증발 속도는 온도, 진공 압력 또는 온도 및 진공 압력의 증가에 따라 가속화되는 것인 방법.
  18. 삭제
  19. 제12항에 있어서, 상기 건조된 혼합물을 절단, 분쇄, 연마 또는 개별 분쇄하여 유동 분말 (free flowing powder)로 제조되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 건조 혼합물의 입자 크기는 1000 μm 미만인 것인 방법.
  21. 제12항에 있어서, 상기 조성물을 재구성 (reconstituted) 액체, 분쇄된 분말 (ground powder), 식품 또는 사료로 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  22. 수용액 내에서 (i) 프로바이오틱인 생활성 미생물이나 물질, (ii) 알긴산나트륨(sodium alginate) 다당류 및 이뉼린(inulin) 올리고당인 안정제, 및 (iii) 이당류 및 단백질 가수분해물인 보호제를 포함하는 조성물로서, 상기 보호제는 상기 용액 내에서 용해되고, 상기 조성물은 10,000 cP 내지 450,000 cP의 점성도를 가지는, 제1항의 안정한 건식 조성물을 제조하기 위한 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 총 고형분은 수용액 내에서 30중량% 내지 70중량% 범위인 것인 조성물.
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제 22항에 있어서, 상기 보호제는 물과의 접촉에 따라 걸축해지거나 중합되지 않는 것인 조성물.
  29. 제22항에 있어서, 상기 단백질 가수분해물은 인간혈청알부민, 소혈청알부민, 흰자위, 젤라틴, 면역글로불린, 분리 대두 단백질(isolated soya protein), 밀단백질, 탈지분유, 카세인염, 훼이 단백질(whey protein) 및 완두콩 단백질로 구성되는 군에서 1종 이상 선택되는 것인 조성물.
  30. 제12항에 있어서, 상기 보호제는 수용매 내에서 용해되고, 용액의 점성도는 10,000 cP 내지 450,000 cP이고, 1 Torr 내지 5 Torr 범위의 진공 하에서 제1건조하며, 0.2 Torr 이하의 진공 압력에서 제2건조하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 건조된 혼합물은 절단, 분쇄, 연마 또는 개별 분쇄하여 유동 분말 (free flowing powder)로 제조되는 것인 방법.
  32. 제30항에 있어서, 상기 건조된 혼합물의 입자 크기는 1000 μm 미만인 것인 방법.
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 제30항에 있어서, 상기 보호제는 물과의 접촉에 따라 걸쭉해지거나 중합되지 않는 것인 방법.
  38. 삭제
  39. 제30항에 있어서, 상기 생활성 미생물 또는 물질은 보호제가 용해된 후에 수용액에 첨가되는 것인 방법.
  40. 제22항, 제23항, 제28항 및 제29항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 생활성 미생물 또는 물질을 인간을 제외한 동물에 급여(feeding)하는 방법.
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