CN108277160B - 一种微生物冻干保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微生物冻干保护剂，属于生物化学助剂技术领域。本发明研制的产品主要包括甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙、改性海泡石、还原氧化石墨烯和水，在配置过程中，先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水搅拌混合，再加入改性海泡石和还原氧化石墨烯，恒温超声处理后，减压浓缩，真空冷冻干燥，研磨，即得微生物冻干保护剂。本发明在生物化学助剂技术行业的发展中具有广阔的前景。

Description

一种微生物冻干保护剂

技术领域

本发明公开了一种微生物冻干保护剂，属于生物化学助剂技术领域。

背景技术

微生物保藏就是对活体微生物群体进行有效的保藏，微生物保藏的基本目的是保持其纯度、活性并尽可能减少变异，最终目的是为科技创新和生物经济发展提供有效的支撑。目前用于微生物的保藏技术可以分为四类: 传代法、干燥法、冷冻法和冷冻干燥法，其原理主要是运用干燥、低温和隔绝空气的手段，抑制微生物的新陈代谢，使其生命活动处于半永久性休眠状态，从而达到保藏的目的。现在简易的保藏方法，例如定期移植法、液体石蜡法，在很多实验室和保藏机构还在使用，而砂土保藏法、硅胶干燥法等简易的保藏方法，已经很少见到。当今公认的最安全、最可靠的长期保存微生物的方法是冷冻法和冷冻干燥法，它们适用于大多数微生物的保藏。冷冻干燥保藏技术适用范围广泛，除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用外，其它微生物如细菌、病毒等均可采用此方法。其基本原理是微生物和冻干保护剂在低温下先行冻结至共晶点以下，然后在适当的真空环境下进行冰晶升华干燥，随后进行解吸干燥，除去部分结合水，从而获得干燥的微生物产品，最后进行真空熔封，在低温、避光环境下保藏。冻干保护剂可分为小分子保护剂( 如低聚糖类、醇类和缓冲盐类) 和大分子保护剂( 如蛋白质、多肽类和多糖类) 。小分子保护剂，一般具有很强的亲水性，分子结构中含有氢键，在冷冻或干燥过程中，可与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。而大分子保护剂通过“包裹”形式保护菌体，同时，促进低分子保护剂发挥作用。保护剂类型的选择主要取决于菌株的生物学特性，脱脂牛乳、血清、蔗糖等既是有效的冻干保护剂又是很好的低温保护剂。传统的微生物冻干保护剂冻干后保存时间短、生物存活率低、稳定性不足。

因此，如何改善传统的微生物冻干保护剂冻干后生物存活率低、稳定性不足不具有具有好的保护效果的缺点，以获取更高综合性能的提高，是其推广与应用，满足工业生产需求亟待解决的问题。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是：针对传统微生物冻干保护剂冻干后生物存活率低、稳定性不足不具有具有好的保护效果的问题，提供了一种微生物冻干保护剂。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种微生物冻干保护剂，其特征在于，是由以下重量份数的原料组成：

甜菊糖苷 10～20份

明胶 2～4份

卡波姆 6～8份

阳离子表面活性剂 1～3份

硫酸钙 0.1～0.2份

改性海泡石 14～18份

还原氧化石墨烯 4～6份

水 80～100份

所述微生物冻干保护剂配置过程为：

（1）按原料组成称量各组分；

（2）先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水搅拌混合，再加入改性海泡石和还原氧化石墨烯，恒温超声处理后，减压浓缩，真空冷冻干燥，研磨，即得微生物冻干保护剂。

所述明胶为等电点为5.0～6.0的明胶。

所述卡波姆为卡波姆910NF，卡波姆934NF或卡波姆941NF中的任意一种。

所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺或十二烷基三甲基溴化铵中的任意一种。

所述改性海泡石改性过程为：将海泡石和水按质量比为1：5～1：8倒入水热釜中，于温度为150～180℃，压力为3～5MPa条件下，保温保压2～4h后，出料，过滤，干燥，得改性海泡石。

所述还原氧化石墨烯制备过程为：将氧化石墨烯和乙醇按质量比为1：1～1：3混合后，于温度为900～920℃条件下，密闭反应3～5h，得还原氧化石墨烯。

本发明的有益效果是：

（1）本发明通过添加分子量较小的甜菊糖苷作为产品有效成分之一，在使用过程中，和微生物菌体混合过程中，小分子的甜菊糖苷较易渗透通过菌体细胞壁，从而与菌体细胞膜表面的蛋白质接触，其亲水端和细胞膜表面亲水端结合，使细胞膜表面蛋白质自身的疏水基团暴露，且小分子甜菊糖苷在界面出的迁移能力较强，其在菌体细胞膜表面的有效吸附可使整个细胞膜转变为疏水结构，从而降低了菌体冻干后的吸湿性，有利于菌体冻干后的长期保存，避免长时间保存后菌体存活率下降，另外，待菌体活性复苏后，小分子的甜菊糖苷可作为具体营养物质被菌体吸收利用，从而使菌体细胞膜结构恢复，不会对菌体复苏后的新城代谢造成不良影响；

（2）本发明通过添加卡波姆和改性海泡石，在使用过程中，两者结构中的极性基团可与菌体胞内酶和大分子中极性基团形成氢键，代替极性基团周围失去的水分子，从而维持细菌细胞内活性大分子、酶及细胞器的稳定，从而使细菌存活率得到有效提高，另外，改性海泡石层间结构中的金属离子可与卡波姆溶解后电离出的氢离子发生部分离子交换，产生的金属离子可为体系内部大分子有机质发生配位交联提供条件，从而有效保障冻干后菌体内部生物大分子的活性和稳定性，且该配位交联为物理交联，过程可逆，可恢复，不会对菌体中的大分子有机质活性造成影响。

具体实施方式

按质量比为1：5～1：8将海泡石和水混合倒入水热釜中，于温度为150～180℃，压力为3～5MPa条件下，保温保压反应2～4h后，打开水热釜，泄至常压，出料，过滤，得滤饼，并将所得滤饼转入烘箱中，于温度为105～110℃条件下干燥至恒重，得干燥滤饼，并将所得干燥滤饼用研钵研磨10～20min，得改性海泡石；将氧化石墨烯和无水乙醇按质量比为1：1～1：3混合倒入聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，再将反应釜密封，加热升温至900～920℃，保温密闭反应3～5h后，开启反应釜，出料，并干燥至恒重，得还原氧化石墨烯；按重量份数计，依次取10～20份甜菊糖苷，2～4份明胶，6～8份卡波姆，1～3份阳离子表面活性剂，0.1～0.2份硫酸钙，14～18份改性海泡石，4～6份还原氧化石墨烯，80～100份水，先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水倒入烧杯中，并将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器，于温度为55～65℃，转速为400～600r/min条件下，恒温搅拌混合2～4h后，再加入改性海泡石和还原 氧化石墨烯，并将烧杯转入超声分散仪中，于温度为55～65℃，超声频率为40～60kHz条件下，恒温超声分散3～5h，得分散液，再将所得分散液转入旋转蒸发仪，于温度为75～85℃，压力为550～600kPa条件下，减压浓缩45～60min，得浓缩液，随后将浓缩液真空冷冻干燥，得干燥料，再将所得干燥料倒入研钵中，研磨10～15min，出料，即得微生物冻干保护剂。所述明胶为等电点为5.0～6.0的明胶。所述卡波姆为卡波姆910NF，卡波姆934NF或卡波姆941NF中的任意一种。所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺或十二烷基三甲基溴化铵中的任意一种。

按质量比为1：8将海泡石和水混合倒入水热釜中，于温度为180℃，压力为5MPa条件下，保温保压反应4h后，打开水热釜，泄至常压，出料，过滤，得滤饼，并将所得滤饼转入烘箱中，于温度为110℃条件下干燥至恒重，得干燥滤饼，并将所得干燥滤饼用研钵研磨20min，得改性海泡石；将氧化石墨烯和无水乙醇按质量比为1：3混合倒入聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，再将反应釜密封，加热升温至920℃，保温密闭反应5h后，开启反应釜，出料，并干燥至恒重，得还原氧化石墨烯；按重量份数计，依次取20份甜菊糖苷，4份明胶，8份卡波姆，3份阳离子表面活性剂，0.2份硫酸钙，18份改性海泡石，6份还原氧化石墨烯，100份水，先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水倒入烧杯中，并将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器，于温度为65℃，转速为600r/min条件下，恒温搅拌混合4h后，再加入改性海泡石和还原氧化石墨烯，并将烧杯转入超声分散仪中，于温度为65℃，超声频率为60kHz条件下，恒温超声分散5h，得分散液，再将所得分散液转入旋转蒸发仪，于温度为85℃，压力为600kPa条件下，减压浓缩60min，得浓缩液，随后将浓缩液真空冷冻干燥，得干燥料，再将所得干燥料倒入研钵中，研磨15min，出料，即得微生物冻干保护剂。所述明胶为等电点为6.0的明胶。所述卡波姆为卡波姆910NF。所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺。

按质量比为1：8将海泡石和水混合倒入水热釜中，于温度为180℃，压力为5MPa条件下，保温保压反应4h后，打开水热釜，泄至常压，出料，过滤，得滤饼，并将所得滤饼转入烘箱中，于温度为110℃条件下干燥至恒重，得干燥滤饼，并将所得干燥滤饼用研钵研磨20min，得改性海泡石；将氧化石墨烯和无水乙醇按质量比为1：3混合倒入聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，再将反应釜密封，加热升温至920℃，保温密闭反应5h后，开启反应釜，出料，并干燥至恒重，得还原氧化石墨烯；按重量份数计，依次取20份葡萄糖，4份明胶，8份卡波姆，3份阳离子表面活性剂，0.2份硫酸钙，18份改性海泡石，6份还原氧化石墨烯，100份水，先将葡萄糖、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水倒入烧杯中，并将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器，于温度为65℃，转速为600r/min条件下，恒温搅拌混合4h后，再加入改性海泡石和还原氧化石墨烯，并将烧杯转入超声分散仪中，于温度为65℃，超声频率为60kHz条件下，恒温超声分散5h，得分散液，再将所得分散液转入旋转蒸发仪，于温度为85℃，压力为600kPa条件下，减压浓缩60min，得浓缩液，随后将浓缩液真空冷冻干燥，得干燥料，再将所得干燥料倒入研钵中，研磨15min，出料，即得微生物冻干保护剂。所述明胶为等电点为6.0的明胶。所述卡波姆为卡波姆910NF。所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺。

按质量比为1：8将海泡石和水混合倒入水热釜中，于温度为180℃，压力为5MPa条件下，保温保压反应4h后，打开水热釜，泄至常压，出料，过滤，得滤饼，并将所得滤饼转入烘箱中，于温度为110℃条件下干燥至恒重，得干燥滤饼，并将所得干燥滤饼用研钵研磨20min，得改性海泡石；将氧化石墨烯和无水乙醇按质量比为1：3混合倒入聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，再将反应釜密封，加热升温至920℃，保温密闭反应5h后，开启反应釜，出料，并干燥至恒重，得还原氧化石墨烯；按重量份数计，依次取20份甜菊糖苷，4份明胶，3份阳离子表面活性剂，0.2份硫酸钙，18份改性海泡石，6份还原氧化石墨烯，100份水，先将甜菊糖苷、明胶、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水倒入烧杯中，并将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器，于温度为65℃，转速为600r/min条件下，恒温搅拌混合4h后，再加入改性海泡石和还原氧化石墨烯，并将烧杯转入超声分散仪中，于温度为65℃，超声频率为60kHz条件下，恒温超声分散5h，得分散液，再将所得分散液转入旋转蒸发仪，于温度为85℃，压力为600kPa条件下，减压浓缩60min，得浓缩液，随后将浓缩液真空冷冻干燥，得干燥料，再将所得干燥料倒入研钵中，研磨15min，出料，即得微生物冻干保护剂。所述明胶为等电点为6.0的明胶。

将氧化石墨烯和无水乙醇按质量比为1：3混合倒入聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，再将反应釜密封，加热升温至920℃，保温密闭反应5h后，开启反应釜，出料，并干燥至恒重，得还原氧化石墨烯；按重量份数计，依次取20份甜菊糖苷，4份明胶，8份卡波姆，3份阳离子表面活性剂，0.2份硫酸钙，6份还原氧化石墨烯，100份水，先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水倒入烧杯中，并将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器，于温度为65℃，转速为600r/min条件下，恒温搅拌混合4h后，再加入还原氧化石墨烯，并将烧杯转入超声分散仪中，于温度为65℃，超声频率为60kHz条件下，恒温超声分散5h，得分散液，再将所得分散液转入旋转蒸发仪，于温度为85℃，压力为600kPa条件下，减压浓缩60min，得浓缩液，随后将浓缩液真空冷冻干燥，得干燥料，再将所得干燥料倒入研钵中，研磨15min，出料，即得微生物冻干保护剂。所述明胶为等电点为6.0的明胶。所述卡波姆为卡波姆910NF。所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺。

按质量比为1：8将海泡石和水混合倒入水热釜中，于温度为180℃，压力为5MPa条件下，保温保压反应4h后，打开水热釜，泄至常压，出料，过滤，得滤饼，并将所得滤饼转入烘箱中，于温度为110℃条件下干燥至恒重，得干燥滤饼，并将所得干燥滤饼用研钵研磨20min，得改性海泡石；按重量份数计，依次取20份甜菊糖苷，4份明胶，8份卡波姆，3份阳离子表面活性剂，0.2份硫酸钙，18份改性海泡石，100份水，先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水倒入烧杯中，并将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器，于温度为65℃，转速为600r/min条件下，恒温搅拌混合4h后，再加入改性海泡石，并将烧杯转入超声分散仪中，于温度为65℃，超声频率为60kHz条件下，恒温超声分散5h，得分散液，再将所得分散液转入旋转蒸发仪，于温度为85℃，压力为600kPa条件下，减压浓缩60min，得浓缩液，随后将浓缩液真空冷冻干燥，得干燥料，再将所得干燥料倒入研钵中，研磨15min，出料，即得微生物冻干保护剂。所述明胶为等电点为6.0的明胶。所述卡波姆为卡波姆910NF。所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺。

按质量比为1：8将海泡石和水混合倒入水热釜中，于温度为180℃，压力为5MPa条件下，保温保压反应4h后，打开水热釜，泄至常压，出料，过滤，得滤饼，并将所得滤饼转入烘箱中，于温度为110℃条件下干燥至恒重，得干燥滤饼，并将所得干燥滤饼用研钵研磨20min，得改性海泡石；将氧化石墨烯和无水乙醇按质量比为1：3混合倒入聚四氟乙烯内衬不锈钢反应釜中，再将反应釜密封，加热升温至920℃，保温密闭反应5h后，开启反应釜，出料，并干燥至恒重，得还原氧化石墨烯；按重量份数计，依次取20份甜菊糖苷，4份明胶，8份卡波姆，0.2份硫酸钙，18份改性海泡石，6份还原氧化石墨烯，100份水，先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、硫酸钙和水倒入烧杯中，并将烧杯移入数显测速恒温磁力搅拌器，于温度为65℃，转速为600r/min条件下，恒温搅拌混合4h后，再加入改性海泡石和还原 氧化石墨烯，并将烧杯转入超声分散仪中，于温度为65℃，超声频率为60kHz条件下，恒温超声分散5h，得分散液，再将所得分散液转入旋转蒸发仪，于温度为85℃，压力为600kPa条件下，减压浓缩60min，得浓缩液，随后将浓缩液真空冷冻干燥，得干燥料，再将所得干燥料倒入研钵中，研磨15min，出料，即得微生物冻干保护剂。所述明胶为等电点为6.0的明胶。所述卡波姆为卡波姆910NF。

对比例：上海某生物科技有限公司生产的冻干保护剂。

将实例1至实例6所得的微生物冻干保护剂及对比例产品进行性能检测，具体检测方法如下：

菌体的活化与培养：将实验室保存的植物乳杆菌Lp1接入到MRS液体培养基中，在37℃下培养，每24h传代一次，均按照体积分数为1.5%的接种量接种，活化两次。随后将活化后的菌液以体积分数为3%的接种量接种到100mL的MRS液体培养基中，在37℃下培养至稳定期初期（14h）后收集菌体。

浓缩发酵剂的制备和真空冷冻干燥：将植物乳杆菌Lp1的发酵液在4℃下，以6000g，离心20min，在无菌操作台中弃掉上清液，用灭菌生理盐水洗涤菌泥2次，随后用1/10原发酵液体积的灭菌生理盐水充分悬浮混合菌体，接着4℃离心收集菌体，弃去上清液，然后加入等体积的不同浓度的冻干保护剂后充分震荡，混匀菌悬液。将菌悬液样品放置在-80℃预冻12h后，放入真空冷冻干燥机中进行冻干，利用冻干后菌体细胞的存活率来比较上述冻干保护剂的效果。

菌体细胞存活率计算：采用梯度稀释平板活菌计数法，分别对冻干前的菌悬液样品和冻干后的样品进行活菌计数，其中冻干后的菌粉计数时，先向冻干菌粉中加入与冻干前等体积的灭菌生理盐水进行复水，随后将平板在37℃下培养48h后计活菌数，测定菌体细胞冻干存活率。

菌体细胞存活率=1mL冻干后样品中的活菌数/1mL冻干前样品中的活菌数×100%。

具体检测结果如表1所示：

表1：微生物冻干保护剂性能具体检测结果

检测项目	实例1	实例2	实例3	实例4	实例5	实例6	对比例
								细胞存活率/%	93.67	85.17	82.57	82.54	81.46	80.62	75.23

由表1检测结果可知，本发明技术方案制备的微生物冻干保护剂具有生物存活率高具有优异的保护效果特点，在生物化学助剂技术行业的发展中具有广阔的前景。

Claims (4)

1.一种微生物冻干保护剂，其特征在于，是由以下重量份数的原料组成：

甜菊糖苷 10～20份

明胶 2～4份

卡波姆 6～8份

阳离子表面活性剂 1～3份

硫酸钙 0.1～0.2份

改性海泡石 14～18份

还原氧化石墨烯 4～6份

水 80～100份

所述微生物冻干保护剂配置过程为：

（1）按原料组成称量各组分；

（2）先将甜菊糖苷、明胶、卡波姆、阳离子表面活性剂、硫酸钙和水搅拌混合，再加入改性海泡石和还原氧化石墨烯，恒温超声处理后，减压浓缩，真空冷冻干燥，研磨，即得微生物冻干保护剂；所述改性海泡石改性过程为：将海泡石和水按质量比为1：5～1：8倒入水热釜中，于温度为150～180℃，压力为3～ 5MPa条件下，保温保压2～4h后，出料，过滤，干燥，得改性海泡石；所述还原氧化石墨烯制备过程为：将氧化石墨烯和乙醇按质量比为1：1～1：3混合后，于温度为900～920℃条件下，密闭反应3～5h，得还原氧化石墨烯。

2.根据权利要求1所述的一种微生物冻干保护剂，其特征在于，所述明胶为等电点为5.0～6.0的明胶。

3.根据权利要求1所述的一种微生物冻干保护剂，其特征在于，所述卡波姆为卡波姆910NF，卡波姆934NF或卡波姆941NF中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的一种微生物冻干保护剂，其特征在于，所述阳离子表面活性剂为阳离子聚丙烯酰胺或十二烷基三甲基溴化铵中的任意一种。