CN104611256A - 一种微生物冻干保护剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种微生物冻干保护剂及其制备方法和应用。该制备方法包括以下步骤：(1)将菌种接种于番茄汁蔗糖培养基中，20-35℃，100-300rpm振荡培养24-72小时，获得发酵液；(2)将步骤(1)所得发酵液稀释到原体积的2-10倍，调节该发酵液稀释液的pH至6.5-7.5，灭菌，冷却即得。该制备方法工艺简便，所得冻干保护剂中菌株存活率高、该冻干保护剂保存稳定性极佳。

Description

一种微生物冻干保护剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种微生物冻干保护剂及其制备方法和应用。
背景技术
乳酸菌是人类肠道中的重要菌群，研究表明，乳酸菌可以使肠道菌群的构成发生有益变化，抑制腐败菌的繁殖，恢复人体肠道内菌群平衡，形成抗菌生物屏障，并消解腐败菌产生的毒素，清除肠道垃圾，维护人体健康。其次，乳酸菌的发酵代谢产物能减轻胃酸分泌，并且对肠壁神经有良好的刺激作用,能促进人体消化酶的分泌和肠道的蠕动,从而促进对蛋白质、单糖及钙、镁等营养物质的吸收利用,并预防便泌。另外，乳酸菌在改善乳糖不耐、降血脂、降血压、增强人体免疫力和抵抗力、抗衰老、抗肿瘤等方面都起着积极作用。
真空冷冻干燥技术是将湿物料或溶液在较低的温度(一般为－10℃～－50℃)下冻结成固态，然后在真空条件下使其中的水分不经液态直接升华成气态，最终使物料脱水的干燥技术，乳酸菌可通过这种干燥技术保持较高的生理特性，并可直接投入食品生产中。为了增强菌株在冻干过程中的存活性能，除了对冻干工艺的优化外，微生物冻干保护剂的选择也是影响乳酸菌干燥过程中细胞稳定性的重要外部因素。目前，常用的微生物冻干保护剂有海藻糖、乳糖、蔗糖、D-山梨醇、脱脂奶粉、糊精等，并且，现有乳酸菌冻干制剂的制备所涉及的配方相当复杂，一个配方往往会涉及多种微生物冻干保护剂，复杂的配方对微生物冻干保护剂原料的安全性提出了更高的要求，同时大大增加了在制备过程中污染的风险，进而对消费者构成了潜在的威胁。此外，随着生活质量的不断提高，与我们每个人日常生活息息相关的乳酸菌制剂所采用的微生物冻干保护剂(糊精等)的食品安全问题越来越受到消费者的重视，而目前市场上非常匮乏天然、安全、健康的植物乳杆菌冻干制剂。因此，寻找的新型乳酸菌冻干制剂的制备方法和产品将是未来乳酸菌冻干制剂制备的重要研究方向之一。
发明内容
因此，本发明为了解决目前缺乏来源天然、制备方法操作简便、益生菌存活率高、保存稳定性佳的微生物冻干保护剂的问题，提供了一种微生物冻干保护剂及其制备方法和应用。
本发明人发现，由于现有微生物冻干保护剂的制备所涉及的配方相当复杂，正如背景部分所述，微生物冻干保护剂的成分包括海藻糖、乳糖、蔗糖、D-山梨醇、脱脂奶粉、糊精等等，由于微生物冻干保护剂的配方复杂，对微生物冻干保护剂原料的安全性提出了更高的要求，同时大大增加了在制备过程中产生污染的风险，进而对消费者构成了潜在的威胁，这种现状与当前消费者日益增强的食品安全意识构成了极大的矛盾和冲突，为了解决这一矛盾，发明人对微生物冻干保护剂的制备方法，特别是菌种的培养方式，培养基的选择，发酵培养的温度、时间等一系列技术参数进行了认真的分析和筛选，最终得到了本发明所述的技术方案以及所得微生物冻干保护剂。制备该微生物冻干保护剂的原料来源天然，其制备方法工艺简便，所得微生物冻干保护剂的保存稳定性极佳，能够获得使被保护的菌株存活率高的技术效果。
因此，为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种微生物冻干保护剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)菌种接种于番茄汁蔗糖培养基中，所述番茄汁蔗糖培养基的pH值为6.5-7.5，蔗糖的质量百分比浓度为5-20％，其余为番茄汁，20-35℃，100-300rpm振荡培养24-72小时，获得发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液稀释到原体积的2-10倍，调节该发酵液稀释液的pH至6.5-7.5，灭菌，冷却即得。
其中步骤(1)为将肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)菌种接种于番茄汁蔗糖培养基中，所述番茄汁蔗糖培养基的pH值为6.5-7.5，蔗糖的质量百分比浓度为5-20％，其余为番茄汁，20-35℃，100-300rpm振荡培养24-72小时，获得发酵液。其中所述的肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)较佳地为肠膜明串珠菌BD1710，该菌株为现有技术。所述菌株的菌种接种量较佳地为0.5-5％，所述百分比为体积百分比。其中所述番茄汁蔗糖培养基为本领域常规的番茄汁蔗糖培养基，该番茄汁蔗糖培养基较佳地由包括以下步骤的方法制备：清洗成熟番茄，去皮榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。其中所述过滤的方法较佳地为利用100目纱布过滤取汁，所述煮沸的时间较佳地为1-10分钟，所述离心的速度较佳地为4,000-12,000g，离心的时间较佳地为8-12分钟，蔗糖的加入量较佳地为5-20％，所述灭菌的温度较佳地为110-135℃，灭菌时间较佳地为10-30分钟，pH值较佳地为6.5-7.5。所述培养的温度较佳地为25-30℃，更佳地为28℃，所述震荡的速度较佳地为150-200rpm，更佳地为180rpm，所述培养的时间较佳地为26-50小时，更佳地为50小时。
其中(2)为：将步骤(1)所得发酵液稀释到原体积的2-10倍，调节该发酵液稀释液的pH至6.5-7.5，灭菌，冷却即得。该所得发酵液稀释的倍数较佳地为原体积的2倍，所述pH值较佳地为7.0。
较佳地，本发明所述微生物冻干保护剂的制备方法还包括步骤(3)：将步骤(2)所得发酵液冷冻干燥，即得。
本发明所述的冻干为本领域常规的冻干方法，所述冻干方法较佳地为真空冷冻干燥，其中所述真空冷冻干燥条件较佳地为：板层极限温度≤-60℃，冷阱极限温度-70℃，板层装料厚度0.5～2.0mm，真空度10～30Pa。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：一种如上所述的微生物冻干保护剂制备方法制得的微生物冻干保护剂。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之三是：一种微生物冻干制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌(L.plantarum)以接种量0.5-5％接种于培养基，35-40℃培养6-12小时获得发酵液，将其6,000-10,000g离心8-12分钟，获得菌体沉淀，所述百分比为体积百分比；
(2)将本发明所述微生物冻干保护剂与步骤(1)所得菌体沉淀按照体积比为1:1-1:9混匀，重悬，冷冻干燥后即得。
其中步骤(1)为将植物乳杆菌(L.plantarum)以接种量0.5-5％接种于培养基，35-40℃培养6-12小时获得发酵液，将其6,000-10,000g离心8-12分钟，获得菌体沉淀，所述百分比为体积百分比。所述植物乳杆菌更佳地为植物乳杆菌ST-Ⅲ，植物乳杆菌ATCC14917，植物乳杆菌WCFS1或植物乳杆菌P8。所述植物乳杆菌菌株的制备方法为本领域常规制备方法，或者通过购买获得。其中所述培养的温度较佳地为37℃，培养的时间较佳地为10小时，离心的时间较佳地为10分钟。
其中步骤(2)为：将本发明所述微生物冻干保护剂与步骤(1)所得菌体沉淀A按照体积比为1:1-1:9混匀，重悬，冷冻干燥后即得。其中所述体积比较佳地为1:2。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之四是：如上所述微生物冻干保护剂制备方法制备所得微生物冻干制剂。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
1、本发明所述微生物冻干保护剂的制备方法采用的原料来源天然，与现有的微生物冻干保护剂所用的复合配方相比，本发明制备获得的微生物冻干保护剂具有更高的食品安全性；
2、本发明所述微生物冻干保护剂的制备方法工艺简便，其创新性的使用肠膜明串珠菌番茄汁蔗糖发酵液来制备，极大地简化了工艺流程，仅需培养基发酵、菌体收集与重悬、冷冻干燥三步即可完成制备；
3、采用本发明的制备方法获得的微生物冻干保护剂使被保护的菌株存活率高、保存稳定性佳，其可作为一种新型的制备方法应用微生物冻干保护剂的制剂工业化生产及相关领域中，应用前景十分广阔。
附图说明
图1为菌株的不同浓度对微生物冻干保护剂中菌株存活率及活菌数的影响结果图。
图2为微生物冻干保护剂浓度对菌株存活率及活菌数的影响结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为15-25℃。
实施例1植物乳杆菌冻干制剂的制备与存活率、活菌数的测定
1、材料与方法
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，加入15％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至7.0，121℃灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
种子(发酵菌种)的制备：
(1)将植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ(所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.084，该菌株的来源请参见公开号为CN 102604833A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mLMRS液体(Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(2)将肠膜明串珠菌L.mesenteroides BD1710(所述肠膜明串珠菌的保藏编号为CGMCC No.6432，该菌株的来源请参见公开号为CN 103013891 A的中国专利)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含2％(w/v)蔗糖的M17琼脂培养基(Merck Co.德国)上，28℃好氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入20mL含2％(w/v)蔗糖的M17液体培养基(Merck Co.德国)，28℃180rpm摇床培养24h取出，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
2、植物乳杆菌冻干制剂的制备
(1)将所得植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ的种子以常规条件发酵，即以接种量2％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，37℃培养8小时获得发酵液A，将其8,000g离心10min获得ST-Ⅲ菌体沉淀A。
(2)将所得肠膜明串珠菌L.mesenteroides BD1710的种子按接种量2％(v/v)无菌接种于pH7.0、蔗糖浓度为15％(w/v)的番茄汁蔗糖培养基中，28℃、180rpm振荡培养48小时，获得发酵液B。
(3)以无菌水稀释发酵液B，使最终体积为原发酵液B体积的2倍，再用食用级碱调节该发酵液B稀释液的pH至7.0，118℃灭菌20分钟，冷却至室温，即得微生物冻干保护剂B。
(4)将1倍体积的微生物冻干保护剂B分别与1、4、9倍体积的ST-Ⅲ发酵液离心获得的沉淀A混匀，重悬，经冷冻干燥后即得ST-Ⅲ的冻干制剂S1、S2、S3。
3、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
向上述方法制备的冻干制剂S1、S2、S3中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)，植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100。
不同菌浓对冻干制剂中菌株存活率及活菌数的影响如图1所示，ST-Ⅲ冻干制剂S1的菌株存活率为91％，活菌数对数值为10.43(即2.68×1010cfu/g)；S2的菌株存活率为82％，活菌数对数值为10.95(即8.9×1010cfu/g)；S3的菌株存活率为71％，活菌数对数值为11.26(即1.81×1011cfu/g)。
实施例2植物乳杆菌冻干制剂的制备与存活率、活菌数的测定
1、材料与方法
番茄汁蔗糖培养基的制备：同实施例1；种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
2、植物乳杆菌冻干制剂的制备
(1)将所得植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ的种子以常规条件发酵，即以接种量2％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，37℃培养8小时获得发酵液A，将其8000g离心10min获得ST-Ⅲ菌体沉淀A。
(2)将所得肠膜明串珠菌L.mesenteroides BD1710的种子按接种量2％(v/v)无菌接种于pH7.0、蔗糖浓度为15％(w/v)的番茄汁蔗糖培养基中，28℃、180rpm振荡培养48小时，获得发酵液B。
(3)以无菌水稀释发酵液B，使最终体积为原发酵液B体积的2、5和10倍，再用食用级碱调节该发酵液B稀释液的pH至7.0，118℃灭菌20分钟，冷却至室温，即得微生物冻干保护剂B。
(4)将1倍体积的微生物冻干保护剂B与1倍体积的ST-Ⅲ发酵液离心获得的沉淀A混匀，重悬，经冷冻干燥后即得ST-Ⅲ的冻干制剂S4、S5、S6。
3、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
向上述方法制备的冻干制剂S4、S5、S6中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)，植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100。
微生物冻干保护剂浓度对冻干制剂中菌株存活率及活菌数的影响如图2所示，ST-Ⅲ冻干制剂S4的菌株存活率为91％，活菌数对数值为10.43(即2.68×1010cfu/g)；S5的菌株存活率为74％，活菌数对数值为10.76(即5.8×1010cfu/g)；S6的菌株存活率为56％，活菌数对数值为10.91(即8.05×1010cfu/g)。
实施例3植物乳杆菌冻干制剂的制备与存活率、活菌数的测定
1、材料与方法
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸1min，12,000g离心10min，取上清，加入20％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至6.5，110℃灭菌30min，
冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
2、植物乳杆菌冻干制剂的制备
(1)将所得植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ的种子以常规条件发酵，即以接种量5％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，40℃培养6小时，获得发酵液A。
(2)将所得肠膜明串珠菌L.mesenteroides BD1710的种子按接种量0.5％(v/v)无菌接种于pH6.5、蔗糖浓度为20％(w/v)的番茄汁蔗糖培养基中，35℃、100rpm振荡培养72小时，获得发酵液B。
(3)以无菌水稀释发酵液B，使最终体积为原发酵液B体积的2倍，再用食用级碱调节该发酵液B稀释液的pH至6.5，110℃灭菌30分钟，冷却至室温，即得微生物冻干保护剂B。
(4)将1倍体积的微生物冻干保护剂B与1倍体积的植物乳杆菌ST-Ⅲ发酵液离心获得的沉淀A混匀，重悬，经冷冻干燥后即得ST-Ⅲ的冻干制剂S7。
3、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
向上述方法制备的冻干制剂S7中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)，植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100。
经测定，植物乳杆菌ST-Ⅲ冻干制剂S7中的菌株存活率为91％，活菌数的对数值为10(即1.01×1010cfu/g)。
实施例4植物乳杆菌冻干制剂的制备与存活率、活菌数测定
1、材料与方法
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸10min，4,000g离心10min取上清，加入5％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至7.5，135℃灭菌10min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。种子(发酵菌种)的制备：同实施例1。
2、植物乳杆菌冻干制剂的制备
(1)将所得植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ的种子以常规条件发酵，即以接种量0.5％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，35℃培养12小时，获得发酵液A。
(2)将所得肠膜明串珠菌L.mesenteroides BD1710的种子按接种量5％(v/v)无菌接种于pH7.5、蔗糖浓度为5％(w/v)的番茄汁蔗糖培养基中，25℃、300rpm振荡培养24小时，获得发酵液B。
(3)以无菌水稀释发酵液B，使最终体积为原发酵液B体积的2倍，再用食用级碱调节该发酵液B稀释液的pH至7.5，135℃灭菌10分钟，冷却至室温，即得微生物冻干保护剂B。
(4)将1倍体积的微生物冻干保护剂B与1倍体积的ST-Ⅲ发酵液离心获得的沉淀A混匀，重悬，经冷冻干燥后即得ST-Ⅲ的冻干制剂S8。
3、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
向上述方法制备的冻干制剂S8中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)，植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100。
经测定，ST-Ⅲ冻干制剂S8中的菌株存活率为62％，活菌数对数值为10.74(即5.52×1010cfu/g)。
实施例5植物乳杆菌冻干制剂的制备与存活率、活菌数的测定
1、材料与方法
番茄汁蔗糖培养基的制备：成熟番茄清洗，去皮，榨汁机压榨，100目纱布过滤取汁，煮沸5min，8000g离心10min取上清，加入15％(w/v)蔗糖加热溶解后冷却至室温，以食用级碱调节pH至7.0，121℃灭菌20min，冷却至室温，即得无菌的番茄汁蔗糖培养基。
种子(发酵菌种)的制备：
(1)将植物乳杆菌L.plantarum ATCC14917(从ATCC购买)、植物乳杆菌L.plantarum WCFS1(从TI Food and Nutrition,Wageningen,The Netherlands购买)、植物乳杆菌L.plantarum P8(由内蒙古农大提供)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于MRS固体培养基(Merck Co.德国)上，37℃厌氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入1mL MRS液体(Merck Co.德国)，运用涡旋震荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，37℃厌氧培养24h取出，以2％(v/v)接种量接种于50mL MRS液体，37℃培养24h后，培养物9，000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
(2)将L.mesenteroides LM57(由丹尼斯克公司提供)的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含2％(w/v)蔗糖的M17琼脂培养基(Merck Co.德国)上，28℃好氧培养24h取出，用接种环挑取单菌落放入20mL含2％(w/v)蔗糖的M17液体培养基(Merck Co.德国)，28℃180rpm摇床培养24h取出，培养物9,000rpm离心10分钟，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤2次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子。
2、植物乳杆菌冻干制剂的制备
(1)将所得L.plantarum ATCC14917、L.plantarum WCFS1、L.plantarumP8的种子分别以接种量2％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，37℃培养8小时，发酵液经8,000g离心10min后获得对应的植物乳杆菌菌体沉淀。
(2)将L.mesenteroides LM57按接种量2％(v/v)无菌接种于pH7.0、蔗糖浓度为15％(w/v)的番茄汁培养基中，28℃、180rpm振荡培养48小时，获得发酵液B。
(3)以无菌水稀释发酵液B，使最终体积为原发酵液B体积的2倍，再用食用级碱调节该发酵液B稀释液的pH至7.0，118℃灭菌20分钟，冷却至室温，即得微生物冻干保护剂B。
(4)将1倍体积的微生物冻干保护剂B与1倍体积的植物乳杆菌发酵液离心获得的沉淀混匀，重悬，经冷冻干燥后即得对应的冻干制剂。
4、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
向上述方法制备的不同植物乳杆菌冻干制剂中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)，植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100。
不同植物乳杆菌冻干制剂的菌株存活率、活菌数如表1所示。
表1不同植物乳杆菌冻干制剂的菌株存活率、活菌数
由表1可知，运用本发明所制备的不同植物乳杆菌冻干制剂具有普遍的高存活率和高活菌数特性。
效果实施例1检测植物乳杆菌冻干制剂的稳定性
将实施例1-4制备的植物乳杆菌冻干制剂S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8，分装入无菌的铝箔袋，常温(25℃)保存6个月和12个月后，取出菌粉，采用MRS平板计数法测定活菌数，结果如表2所示。
表2植物乳杆菌ST-Ⅲ冻干制剂常温保存的稳定性测定
由表2可知，所有测试的植物乳杆菌ST-Ⅲ冻干制剂在常温保存12个月后，活菌数可稳定保持在108以上。
对比例1检测传统冻干制剂中植物乳杆菌的存活率和活菌数
其中涉及的MRS液体培养基以及微生物种子的制备方法与实施例1相同。
1、利用传统方法制备冻干制剂：
(1)传统微生物冻干保护剂的制备：将7.06％脱脂乳、6.46％麦芽糖和6.70％谷氨酸钠溶解于蒸馏水中，115℃灭菌15分钟即得(王世宽,洪玉程,袁先铃.响应面法优化植物乳杆菌和凝结芽孢杆菌微生物冻干保护剂的研究[J].四川理工学院学报(自然科学版),2013,5:23-26.)。
(2)将植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ常规条件发酵，即以接种量2％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，37℃培养8小时获得发酵液A，将其8,000g离心10min获得ST-Ⅲ菌体沉淀A。
(3)将1倍体积的传统微生物冻干保护剂与1倍体积的ST-Ⅲ发酵液离心获得的沉淀A混匀，重悬，经冷冻干燥后即得ST-Ⅲ的冻干制剂P2。
2、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
取实施例1制备所得冻干制剂S1，将其命名为P1，作为对照。向上述方法制备的冻干制剂P1、P2中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)。植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100。
本发明冻干制剂和传统冻干制剂中植物乳杆菌的存活率和活菌数如表3所示。
表3本发明冻干制剂和传统冻干制剂中植物乳杆菌的存活率和活菌数
由表3可知，本发明方法所制备冻干制剂的存活率与现有传统方法相当，但活菌数有显著提高。
对比例2检测常规发酵液制备的冻干制剂中菌株的存活率和活菌数
其中涉及的MRS液体培养基以及微生物种子的制备方法与实施例1相同。
1、利用常规发酵液制备冻干制剂：
(1)将植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ常规条件发酵，即以接种量2％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，37℃培养8小时获得发酵液。
(2)将发酵液以无菌的食用级碱液调节pH至7.0，冷冻干燥后即得ST-Ⅲ的冻干制剂P3。
2、常规发酵液制备的冻干制剂中菌株存活率、活菌数的测定
以对比例1所述的冻干制剂P1和P2作为对照。向上述方法制备的冻干制剂P1、P2和P3中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)，存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌悬液单位体积内的理论活菌数×100。
本发明冻干制剂、传统冻干制剂及常规发酵液制备的冻干制剂中植物乳杆菌的存活率、活菌数如表4所示。
表4本发明冻干制剂、传统冻干制剂及常规发酵液制备的冻干制剂中植物乳杆菌的存活率、活菌数
从表4的结果中可以得出，常规发酵液制备的冻干制剂比本发明所述制备方法所得膳食补充剂的菌株存活率和活菌数显著降低。
对比例3检测植物乳杆菌冻干制剂中菌株的存活率和活菌数
1、对比例中涉及的MRS液体培养基，含有蔗糖的番茄汁培养基以及微生物种子的制备方法与实施例1相同。
2、制备植物乳杆菌冻干制剂
(1)将所得植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ的种子常规条件发酵，即以接种量0.4％(v/v)无菌接种于MRS液体培养基，30℃培养15小时获得发酵液A，将其12000g离心10min获得ST-Ⅲ菌体沉淀A。
(2)将所得肠膜明串珠菌L.mesenteroides BD1710的种子按接种量6％(v/v)无菌接种于pH8.0、蔗糖浓度为3％(w/v)的番茄汁蔗糖培养基中，39℃、50rpm振荡培养18小时，获得发酵液B。
(3)以无菌水稀释发酵液B，使最终体积为原发酵液B体积的1.5倍，再用食用级碱调节该发酵液B稀释液的pH至8.0，140℃灭菌5分钟，冷却至室温，即得微生物冻干保护剂B。
(4)将1倍体积的微生物冻干保护剂B分别与0.5倍体积的ST-Ⅲ发酵液离心获得的沉淀A混匀，重悬，经冷冻干燥后即得ST-Ⅲ的冻干制剂P4。
3、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
向上述方法制备的冻干制剂P4中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)。
植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100
经测定，ST-Ⅲ冻干制剂P4中的菌株存活率为25.5％，活菌数对数值为9.80(即6.37×109cfu/g)。
从对比例3的结果中可以得出，将所述植物乳杆菌冻干制剂制备方法中的接种量，培养温度，培养时间，勾兑液pH以及勾兑比例调整到本发明之外的时候，所得冻干剂中微生物的存活率和活菌数产生了显著降低。
对比例4检测植物乳杆菌冻干制剂中菌株的存活率和活菌数
1、其中涉及MRS液体培养基，含有蔗糖的番茄汁培养基以及微生物种子的制备方法与实施例1相同。
2、制备植物乳杆菌冻干制剂
将实施例中植物乳杆菌L.plantarum ST-Ⅲ的接种量，培养温度，培养时间，肠膜明串珠菌的菌株接种量，培养温度，培养时间，震荡速度，番茄汁蔗糖培养基的pH值，培养温度，培养时间以及所得发酵液的稀释倍数和pH值等主要技术参数逐一进行调整，获得了以下一组不同方法制备的植物乳杆菌冻干制剂，
3、植物乳杆菌冻干制剂存活率、活菌数的测定
向上述方法制备的冻干制剂P5中加入无菌蒸馏水，使体积还原为冻干前的体积，采用MRS平板计数方法测定单位体积(通常为每毫升)内的植物乳杆菌活菌数。冻干粉活菌数(cfu/g)＝单位体积发酵液活菌数(cfu/mL)÷单位体积发酵液冻干后的质量(g/mL)，植物乳杆菌存活率(％)＝冻干制剂还原体积后单位体积内的活菌数÷冻干前菌体重悬液单位体积内的理论活菌数×100。检测所得结果如表5所示：
表5不同方法制备所得冻干制剂中植物乳杆菌的存活率和活菌数
从对表5所示的结果中可以得出，将所述微生物冻干制剂的制备方法中菌种的接种量，培养温度，培养时间以及发酵液的pH调整到本发明之外的时候，所得冻干剂中微生物的存活率和活菌数产生了显著降低。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种微生物冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)菌种接种于番茄汁蔗糖培养基中，所述番茄汁蔗糖培养基的pH值为6.5-7.5，蔗糖的质量百分比浓度为5-20％，其余为番茄汁，20-35℃，100-300rpm振荡培养24-72小时，获得发酵液；
(2)将步骤(1)所得发酵液稀释到原体积的2-10倍，调节该发酵液稀释液的pH至6.5-7.5，灭菌，冷却即得。
2.如权利要求1所述的微生物冻干保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述菌种为肠膜明串珠菌(L.mesenteroides)BD1710，所述菌种的接种量为0.5-5％，所述百分比为体积百分比。
3.如权利要求1所述的微生物冻干保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述番茄汁蔗糖培养基由包括以下步骤的方法制备而得：清洗成熟番茄，去皮榨汁，将所得榨汁过滤后煮沸，离心取上清，加入蔗糖加热溶解后冷却，调节pH值，灭菌后冷却即得。
4.如权利要求2所述的微生物冻干保护剂的制备方法，其特征在于，所述过滤的方法为利用100目纱布过滤取汁，所述煮沸的时间为1-10分钟，所述离心的速度为4,000-12,000g，离心的时间为8-12分钟，蔗糖的加入量为5-20％，所述灭菌的温度为110-135℃，灭菌时间为10-30分钟，调节pH值到6.5-7.5。
5.如权利要求1所述的微生物冻干保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述培养的温度为28℃，震荡的速度为180rpm，培养的时间为48小时。
6.如权利要求1所述的微生物冻干保护剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述节pH值为7.0，所述发酵液稀释到原体积的2倍。
7.一种如权利要求1-8任一项所述的微生物冻干保护剂的制备方法制得的微生物冻干保护剂。
8.一种微生物冻干制剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将植物乳杆菌(L.plantarum)以接种量0.5-5％接种于培养基，35-40℃培养6-12小时获得发酵液，将其6,000-10,000g离心8-12分钟，获得菌体沉淀，所述百分比为体积百分比；
(2)将权利要求7所述微生物冻干保护剂与步骤(1)所得菌体沉淀按照体积比为1:1-1:9混匀，重悬，冷冻干燥后即得。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述的植物乳杆菌是植物乳杆菌(L.plantarum)ST-Ⅲ，植物乳杆菌ATCC14917，植物乳杆菌WCFS1或植物乳杆菌P8。
10.一种由权利要求8或9所述的制备方法制备而得的微生物冻干制剂。
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