CN106119152A - 一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用 - Google Patents

一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106119152A
CN106119152A CN201610465805.2A CN201610465805A CN106119152A CN 106119152 A CN106119152 A CN 106119152A CN 201610465805 A CN201610465805 A CN 201610465805A CN 106119152 A CN106119152 A CN 106119152A
Authority
CN
China
Prior art keywords
bacillus acidophilus
acidophilus
strain
bacillus
cgmcc
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610465805.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郭子好
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
JIANGSU YANCHENG YUANYAO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
JIANGSU YANCHENG YUANYAO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by JIANGSU YANCHENG YUANYAO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd filed Critical JIANGSU YANCHENG YUANYAO BIO-TECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201610465805.2A priority Critical patent/CN106119152A/zh
Publication of CN106119152A publication Critical patent/CN106119152A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/225—Lactobacillus
    • C12R2001/23—Lactobacillus acidophilus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
    • A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
    • A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
    • A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用。本发明的一种嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明的一种嗜酸乳杆菌菌株，该菌株为嗜酸乳杆菌株；保藏名称为嗜酸乳杆菌YY13002；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年8月16日；保藏编号:CGMCC NO.8043。本发明乳酸菌素含量高，该菌株生产的乳酸菌素可以抑制多种条件致病菌株，包括G+菌株和G‑菌株，对单核细胞增生李斯特菌有强烈的抑制性。

Description

一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用。
背景技术
我国在饲料中添加抗生素已有近70年的时间，饲料中抗生素的添加对集约化畜牧业的生产和发展做出了巨大的贡献。随着社会生活水平的提高，人们对健康的重视程度越来越高，近年来人们逐渐发现抗生素饲料添加剂在带来巨大经济效益的背后隐藏着日益突出的负面效应，比如抗生素引起的内源性感染和二重感染，致病性细菌耐药性的产生，肠道正常菌群的破坏，畜产品及环境中的大量的抗生素残留等问题，这些将对养殖业、饲料工业和动物带来了严重威胁，抗生素通过食物链直接危及人类的健康。1986年，瑞典全面禁止在畜禽饲料中使用抗生素，成为第一个不准使用抗生素作为饲料添加剂的国家，随后20年，全面禁用抗生素作为饲料添加剂。近年来我国禁止抗生素添加剂在畜牧业中使用的呼声越来越高，2015年我国开始禁用部分抗生素。为此，研究和开发新的抗生素替代品的工作迫在眉睫。
近年来，抗生素类替代品酸化剂、植物提取物、益生菌制剂、酶制剂、功能性多糖等的研究与开发成为近年来绿色饲料添加剂的热点，其中益生菌制剂的研究成为当前畜禽养殖的热点。益生菌是动物肠道内的正常菌群，对动物体没有毒副作用。其附着在动物肠道内，一方面产生一些抑制病原菌生长的物 质，另外在生长代谢过程中，可以分泌多种酶类，促进动物对饲料的消化吸收，提高料肉比，促进动物健康生长。因此益生菌制剂成为国内外业界研究的热点。
乳酸菌素bacteriocins of lactic acid bacteria是指乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抗菌活性的多肽或蛋白类物质。它们通常可以抑制一些常见的腐败菌和致病菌，如金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，大肠杆菌Escherichia coli，沙门氏菌salmonella，单核细胞增生李斯特菌Listeria monocytogenes等。而且大部分乳酸菌乳酸菌素稳定性较好，具有耐热性，而且易于被动物体内的蛋白酶降解，不会在体内积聚引起不良反应，能够完全代替抗生素的使用，被认为是具有广阔前景的天然食品防腐剂和饲料添加剂。然而一般天然存在的乳酸菌其中乳酸菌素的含量都较低，其中嗜酸乳杆菌也是其中的一种，为此，迫切需要获得能够高产乳酸菌素的乳酸菌株。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用。
为达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：本发明的一种嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明的一种嗜酸乳杆菌菌株，该菌株为嗜酸乳杆菌株；保藏名称为嗜酸乳杆菌YY13002；分类名称为：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年8月16日；保藏编号:CGMCC NO.8043。
进一步地，所述嗜酸乳杆菌菌株的单菌落接种到MRS培养基上37℃厌氧生长良好,菌落成圆形，直径大小0.8-2.0mm，较光滑，乳白色或灰白色，革兰氏染 色、镜检，菌体较平直或稍长者稍弯，两端钝圆，成单或双存在、无芽孢、革兰氏染色呈阳性的杆状。
本发明所述的嗜酸乳杆菌菌株制备的嗜酸乳杆菌菌剂。
进一步地，所述的嗜酸乳杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的嗜酸乳杆菌的发酵培养物；
(b)所得嗜酸乳杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)所得嗜酸乳杆菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的嗜酸乳杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将嗜酸乳杆菌甘油管接种于120mL新鲜液体MRS培养基中，使用150mL三角烧瓶于37℃静置培养24小时，培养结束后菌浓为2*109-6*109cfu/mL之间，
(2)发酵菌剂制备：将上述活化菌株嗜酸乳杆菌接种于液体培养基中，接种至溶液浓度中菌浓为105-106cfu/mL，静置培养，温度为37℃，培养24小时，收集含菌体的培养液，制得嗜酸乳杆菌菌剂。
本发明所述的嗜酸乳杆菌在生产用于乳酸菌素中的应用。
本发明所述的嗜酸乳杆菌菌剂在生产用于乳酸菌素中的应用。
有益效果：本发明乳酸菌素含量高，该菌株生产的乳酸菌素可以抑制多种条件致病菌株，包括G+菌株和G-菌株，对单核细胞增生李斯特菌有强烈的抑制性，并对金黄色葡萄菌、沙门氏菌和大肠杆菌具有较强的抑制性。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：(1)嗜酸乳杆菌是以一些最常见的腐败菌和病原菌为指示菌，筛选出产对单核细胞增生李斯特菌有强烈抑制性的嗜酸乳杆菌菌株，并且通过诱变手段提高其发酵液中的乳酸菌素活力。
(2)本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)可以产生对多种致病菌有抑制作用的乳酸菌素，并且对李斯特菌有强烈的抑制性。本发明嗜酸乳杆菌CGMCC No8043在抑制李斯特氏菌，尤其是单核细胞增生李斯特菌中的应用，以及嗜酸乳杆菌CGMCCNo 8043在抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌的应用，并且对嗜酸乳杆菌CGMCC No8043产生的乳酸菌素进行了测序。
(3)该乳酸菌素对胃蛋白酶不敏感，对胰蛋白酶敏感，具有很好的热稳定性，在121℃作用30min，仍然保持较高的活性。该细菌素在pH2.0-8.0范围处理30min，均保持很强的抑制指示菌单核细胞增生李斯特菌CICC 21633的能力。可以应用为具有广阔前景的天然食品防腐剂及饲料添加剂。
附图说明
图1是本发明嗜酸乳杆菌的菌落图；
图2是本发明嗜酸乳杆菌同源性的系统发育树图；
图3是本发明不同NTG浓度对嗜酸乳杆菌致死曲线图；
图4是本发明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长曲线图；
图5是本发明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长中pH变化图；
图6是嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043不同生长时间上清液对单核细胞增生李斯特菌抑菌活力变化图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
本发明的一种嗜酸乳杆菌，所述嗜酸乳杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
本发明的一种嗜酸乳杆菌菌株，该菌株为嗜酸乳杆菌株；保藏名称为嗜酸乳杆菌YY13002；分类名称为：嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年8月16日；保藏编号:CGMCC NO.8043。
图1是本发明嗜酸乳杆菌的菌落图；所述嗜酸乳杆菌菌株的单菌落接种到MRS培养基上37℃厌氧生长良好,菌落成圆形，直径大小0.8-2.0mm，较光滑，乳白色或灰白色，革兰氏染色、镜检，菌体较平直或稍长者稍弯，两端钝圆，成单或双存在、无芽孢、革兰氏染色呈阳性的杆状。
图2是本发明嗜酸乳杆菌同源性的系统发育树图；由此图可以看出，嗜酸乳杆菌独树一支，确定为嗜酸乳杆菌。
本发明所述的嗜酸乳杆菌菌株制备的嗜酸乳杆菌菌剂。
所述的嗜酸乳杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)所述的嗜酸乳杆菌的发酵培养物；
(b)所得嗜酸乳杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)所得嗜酸乳杆菌细胞的超声裂解沉淀。
本发明所述的嗜酸乳杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)菌株活化：将嗜酸乳杆菌甘油管接种于120mL新鲜液体MRS培养基中，使用150mL三角烧瓶于37℃静置培养24小时，培养结束后菌浓为2*109-6*109cfu/mL之间，
(2)发酵菌剂制备：将上述活化菌株嗜酸乳杆菌接种于液体培养基中，接种至溶液浓度中菌浓为105-106cfu/mL，静置培养，温度为37℃，培养24小时，收集含菌体的培养液，制得嗜酸乳杆菌菌剂。
本发明所述的嗜酸乳杆菌在生产用于乳酸菌素中的应用。
本发明所述的嗜酸乳杆菌菌剂在生产用于乳酸菌素中的应用。
实施例1
嗜酸乳杆菌野生菌的获得
1.粪样采集
采集上海市航头镇某猪场断奶仔猪新鲜粪样，放入冷藏盒中，带回分离筛选备用。
2.菌株的分离纯化
称取粪样5g加入45mL灭菌生理盐水中，充分混匀，取1mL混悬液加入9mL的无菌生理盐水中，十倍稀释至10-5、10-6、10-7，取0.1mL涂布于MRS固体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，无水乙酸钠5g，磷酸二氢钾2g，柠檬酸二铵2g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.19g，吐温80 1mL，琼脂15g，蒸馏水1000mL，pH为6.5)，每个稀释度三个重复，37℃厌氧培养48h，挑取单个菌落划线厌氧纯化培养。48h后，将纯化后的菌落进行过氧化氢试验和革兰氏染色镜检，其中过氧化氢试验阴性、革兰氏染色阳性的菌株，可以初步判定为乳酸菌，此时将对应的单个菌落接入灭菌的MRS液体培养基，37℃，培养24h，取菌液加入离心管，按照1：1的比例加入30％的甘油，混匀，-70℃冷冻保存备用。
将保存的乳酸菌用接种环接种在MRS液体培养基中，37℃静置培养48h后，利用点种法，点种5ul，对各种G-，G+病原菌做抑菌试验，并选取抑菌圈比较明显的乳酸菌株进行复筛试验。
初筛后具有抑菌效果的菌株培养于MRS液体培养基中，24h后离心取上清，将上清用过氧化氢酶处理后调节PH为6.0，过滤除菌。利用牛津杯双层琼 脂扩散法，对指示菌进行抑菌试验。含1.5％琼脂的LB培养基(蛋白陈10g，酵母提取物5g，氯化纳10g，蒸馏水1.0L，pH7.0)按每平皿10mL倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却，然后用无菌摄子将牛津杯轻轻放置于培养基上；制备含0.8％琼脂的LB培养基，冷却至50℃，按1％的接种量加入单核细胞增生李斯特菌菌悬液作为上层培养基，倾倒20mL上层培养基于放置好牛津杯的的平板中冷却，冷却后将牛津杯取出，将上清液加入小孔中于4℃冰箱中扩散30min，然后取出37℃过夜培养。用游标卡尺比较抑菌圈大小。获得一种对单核细胞增生李斯特菌有强烈抑制的乳酸菌，命名为YY12-7。
实施例2
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)YY12-7的鉴定
1.YY12-7菌株形态学特性
YY12-7菌株接种到MRS培养基上37℃厌氧生长良好,菌落成圆形，直径大小0.8～2.0mm，较光滑，乳白色或灰白色。革兰氏染色、镜检发现，菌体较平直或稍长者稍弯，两端钝圆，成单或双存在、无芽孢、革兰氏染色呈阳性的杆状。
2.分离菌株YY12-7的种、属鉴定
参照《伯杰细菌鉴定手册》和《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》，并对菌株YY12-7进行16sRNA测序。其中菌株生理生化实验结果如表1所示，碳源选择发酵试验结果如表2所示，结合生理生化和碳源选择发酵实验结果，并将16S信息进行比对，菌株YY12-7应为嗜酸乳杆菌。
根据细胞显微形态、生理生化数据和16S rRNA基因序列数据，将菌株鉴定为嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。菌株YY12-7的理化试验结果如表1所示。菌株YY12-7碳源选择发酵试验结果如表2所示。 表1
生化项目 YY12-7试验结果
过氧化氢酶 -
氧化酶 -
吲哚 -
硫化氢试验 -
明胶液化 -
硝酸盐还原 -
七叶苷 +
苦杏仁苷 -
葡萄糖盐 -
Arg水解酶 -
Arg脱羧酶 +
表2
注：“-”代表不发酵，“+”代表发酵
设计特异性引物，用PCR扩增后对该菌的16SrRNA基因序列测定序，与基因库的标准菌比对，结果显示该株菌为嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)。
实施例3
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)YY12-7诱变筛选获得高产菌株
1.嗜酸乳杆菌菌悬液的制备
挑取嗜酸乳杆菌单个菌落接种于120ml/瓶的液体培养基中，37℃厌氧培养24h。然后以5％的接种量，接种于120ml/瓶的液体培养基中，培养8h至对数 生长期，计数。
2.亚硝基胍(nitroso-guanidin，NTG)诱变适宜菌液浓度的选择
将处于对数生长期的嗜酸乳杆菌YY12-7悬液进行10倍梯度稀释，分别制成108，107，106，105cfu/ml的菌悬液；各浓度的20ml菌液中加入NTG溶液，使NTG的终浓度分别为300ug/mL，600ug/mL，900ug/mL，1200ug/mL，1500ug/mL；37℃水浴处理45min，间歇振荡。到达预定时间后，用生理盐水稀释至100ml，6000min/rpm离心10min，去上清液后再加入100ml生理盐水离心10min，再重复一次。然后用生理盐水进行10倍梯度稀释，稀释梯至104，105，106，然后各取100ul涂布MRS培养基平皿上，每个梯度平行3个，37℃培养36h，计算个浓度的菌落数及适宜菌液浓度的致死率。致死曲线如图1所示，结果表明，以107cfu/ml的菌悬液，加入900ug/mL的NTG诱变效果为佳。图1为不同NTG浓度致死曲线。图3是为了说明在不同NTG浓度下对嗜酸乳杆菌的致死情况，本发明要求NTG对嗜酸乳杆菌的致死率在60％-70％，所以选择900ug/mL的NTG作为诱导条件。
3.紫外(ultraviolet，UV)诱变处理
离心30min(6000min/rpm)，用等体积的生理盐水制作菌悬液，并稀释至107cfu/ml作为诱变菌悬液。采用功率20W的紫外灯，照射距离调整为30cm，预热30min，取20ml菌悬液置于平皿内并搅拌，使用紫外照射50sec，使致死率控制在50％～60％，将处理的样品作为亚硝基胍(NTG)诱变处理的材料。
4.亚硝基胍(nitroso-guanidin，NTG)诱变处理
取上述经过UV诱变的20ml细菌悬液加入2.5ml 900ug/mL的NTG母液，使致死率控制在60％～80％，置于灭菌的三角瓶中培养40min，分别装入100ml的离心管内5ml，在用生理盐水补满100ml，离心20min，去上清夜在加入100 ml生理盐水离心20min，再重复一次。进行10倍梯度稀释，取105稀释梯度涂布100ul于MRS培养基的平皿上，共涂平皿60个。37℃培养48小时。
将诱变后的植物乳杆菌用接种环接于液体MRS中，37℃培养24h。以单核细胞增生李斯特菌为指示菌，菌浓度为107cfu/ml接于琼脂含量为0.8％的LB培养基中，分别以点种法初筛，牛津杯法复筛。获得一种抑菌圈明显增大的诱变菌株，将此菌株每隔三天传代一次，共传十代，分别比较每代菌株的上清液的抑菌活性，确定所获得菌株的稳定性，将此菌株命名为YY13002。并于2013年08月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No 8043。
实施例4
嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长状况的确定
1.嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长曲线的测定。
接1％嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043的24h培养物于新鲜MRS培养基中，37℃静置培养，每小时测量OD600值变化。生长曲线如图2所示，嗜酸乳杆菌CGMCCNo 8043于第3h开始进入对数期，第18小时起进入平稳期。图4为嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长曲线图。图4为嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043在新鲜MRS培养基中的24h实时生长曲线，该图说明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043于第3h开始进入对数期，第18小时起进入平稳期。
2.嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长中pH变化的确定。
接1％嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043的24h培养物于新鲜MRS培养基中，37℃静置培养，每小时测量pH值变化。如图3所示为本发明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长中pH变化图。图5为嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043在新鲜MRS 培养基中的24h实时生长pH变化曲线。由此图可以看出，随着培养时间的延长，培养基中pH逐步下降，在18h后稳定，稳定pH为3.6。
随着培养时间的延长，培养基中pH逐步下降，在18h后稳定，稳定pH为3.6。如图5所示，为本发明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长中pH变化图。
3.嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043生长中抑菌活力变化的确定。
接1％嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043的24h培养物于新鲜MRS培养基中，37℃静置培养，每小时取样测量OD600值，离心取上清，将上清调pH至6.0后各点100ul于含1％单核细胞增生李斯特菌的效价检测平板，于37℃过夜培养。用游标卡尺测量抑菌圈大小的变化。如图6所示，为本发明嗜酸乳杆菌CGMCC No8043不同生长时间上清液对单核细胞增生李斯特菌抑菌活力变化图。此图为嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043不同时间发酵上清调pH至6.0后对单核细胞增生李斯特菌的效价检测，用游标卡尺测量抑菌圈大小的变化。由图可以看出嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043抑菌活性随OD600的变化曲线，从OD600为0.67起有抑菌圈，为10.1mm，其中牛津杯的外径为8.0mm，至OD6005.98后趋于稳定，最大为27mm。
实施例5
嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043抑菌效果及抑菌物质鉴定
1.嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043发酵液抑菌物质的抑菌能力
接1％嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043的24h培养物于新鲜MRS培养基中，37℃静置培养20h，培养后经6000rpm/min离心5min后，取上清用过氧化氢酶处理后调节PH为6.0，过滤除菌。利用牛津杯双层琼脂扩散法，对指示菌进行抑菌试验。含1.5％琼脂的LB培养基按每平皿10mL倾倒在无菌培养皿中，超净工作台中冷却，然后用无菌摄子将牛津杯轻轻放置于培养基上；制备含0.8％ 琼脂的LB培养基，冷却至50℃，按1％的接种量加入单核细胞增生李斯特菌(CICC21633)菌悬液、大肠杆菌(ATCC25922)菌悬液、沙门氏菌(ATCC14028)菌悬液和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)作为上层培养基，倾倒20mL上层培养基于放置好牛津杯的的平板中冷却，冷却后将牛津杯取出，将上清液加入小孔中于4℃冰箱中扩散30min，然后取出37℃过夜培养，观察抑菌圈。结果表明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043发酵液除对单核细胞增生李斯特菌(CICC 21633)有较强的抑制作用外，对大肠杆菌(ATCC25922)、沙门氏菌(ATCC14028)和金黄色葡萄球菌(ATCC6538)均有不同程度的抑制。抑菌结果见下表3。嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043发酵液对不同菌株的抑菌能力如表3所示，
表3
2.嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043发酵液抑菌物质的鉴定
本发明的嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043对单核细胞增生李斯特菌有强烈的抑制作用，对其它菌株也有相应的抑菌能力。推测该菌株可以分泌乳酸菌素，在本发明中进行了酸、过氧化氢酶和蛋白酶处理等试验，结果表明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043对单核细胞增生李斯特菌CICC 21633的抑制作用不受pH和过 氧化氢酶的影响；且发酵液中存在一种抑菌物质，该物质对胃蛋白酶不敏感，对胰蛋白酶敏感，推测该抑菌物质是一种蛋白或多肽物质。
嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043发酵液经离心后使用离子色谱柱进行分离，根据不同的出峰进行收集后进行抑菌实验，取具有抑菌能力的物质经葡聚糖凝胶G50进行初分，最后经制备液相色谱进行细分，分离后的物质经SDS-PAGE电泳确认后送至测序公司进行测序，测序后获得该抑菌物质的序列，结果如下：
HQKTLTDKELALISGGKTYYGTNGVHCTKKSLWGKVRLKNVIPGTLCRKQSLPIK
为鉴定此序列的正确性，经多肽合成公司合成了该肽，然后经稀释后进行抑菌实验，结果抑菌圈为22mm，表明此序列测定正确。
实施例6
嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043分泌的乳酸菌素的生物学特性研究。
1.乳酸菌素对热的稳定性。
挑取活化的嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养24h，发酵液以6000rpm/min离心5min，收集上清液，过滤除去菌体及其它杂质。将上清液分别放置在60℃、80℃、100℃和121℃处理30min，调节pH至6.0。按照步骤一所述的牛津杯双层平板法，在37℃条件下做抑菌试验，确定不同温度处理后对乳酸菌素抑制单核细胞增生李斯特菌CICC21633活性的影响。温度对嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043乳酸菌素活性的影响如表4所示，
表4
结果如表4所示，结果表明嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043对121℃以下的温度较为稳定。
2.嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043分泌的乳酸菌素对酸的稳定性
将嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043发酵上清液(按照步骤1的方法获得)分别用lmo l/LHCL和lmo l/L NaOH调其pH为2.0-10.0，37℃下培养2h，调pH为6.0，然后按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做抑菌试验，测定抑菌物质对单核细胞增生李斯特菌CICC 21633的抑菌活性。同等条件下，分别用lmo l/LHCL和lmol/L NaOH调整灭菌后的液体MRS培养基pH为2.0-10.0，37℃下培养3h，调整pH值为6.0，同样按照步骤一所述的牛津杯双层平板法做对照。嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043乳酸菌素对酸的稳定性如表5所示，
表5
结果如表5可见，嗜酸乳杆菌CGMCC No 8043分泌的乳酸菌素在pH 2.0-10.0范围内较为稳定。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书.说明书及其等效物界定。

Claims (8)

1.一种嗜酸乳杆菌，其特征在于：所述嗜酸乳杆菌的16S rDNA基因序列为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
2.一种嗜酸乳杆菌菌株，其特征在于：该菌株为嗜酸乳杆菌株；保藏名称为嗜酸乳杆菌YY13002；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2013年8月16日；保藏编号:CGMCC NO.8043。
3.根据权利要求2所述的嗜酸乳杆菌菌株，其特征在于：所述嗜酸乳杆菌菌株的单菌落接种到MRS培养基上37℃厌氧生长良好,菌落成圆形，直径大小0.8-2.0mm，较光滑，乳白色或灰白色，革兰氏染色、镜检，菌体较平直或稍长者稍弯，两端钝圆，成单或双存在、无芽孢、革兰氏染色呈阳性的杆状。
4.权利要求2或3所述的嗜酸乳杆菌菌株制备的嗜酸乳杆菌菌剂。
5.根据权利要求4所述的嗜酸乳杆菌菌剂，其活性成分为如下(a)(b)(c)中的至少一种：
(a)权利要求1所述的嗜酸乳杆菌的发酵培养物；
(b)权利要求1所得嗜酸乳杆菌细胞的超声裂解上清；
(c)权利要求1所得嗜酸乳杆菌细胞的超声裂解沉淀。
6.权利要求5所述的嗜酸乳杆菌菌剂的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)菌株活化：将嗜酸乳杆菌甘油管接种于120mL新鲜液体MRS培养基中，使用150mL三角烧瓶于37℃静置培养24小时，培养结束后菌浓为2*109-6*109cfu/mL之间，
(2)发酵菌剂制备：将上述活化菌株嗜酸乳杆菌接种于液体培养基中，接种至溶液浓度中菌浓为105-106cfu/mL，静置培养，温度为37℃，培养24小时，收集含菌体的培养液，制得嗜酸乳杆菌菌剂。
7.权利要求1所述的嗜酸乳杆菌在生产用于抗病原菌的产品中的应用。
8.权利要求4或5所述的嗜酸乳杆菌菌剂在生产用于抗病原菌的产品中的应用。
CN201610465805.2A 2016-06-23 2016-06-23 一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用 Pending CN106119152A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610465805.2A CN106119152A (zh) 2016-06-23 2016-06-23 一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610465805.2A CN106119152A (zh) 2016-06-23 2016-06-23 一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106119152A true CN106119152A (zh) 2016-11-16

Family

ID=57269444

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610465805.2A Pending CN106119152A (zh) 2016-06-23 2016-06-23 一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106119152A (zh)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109170268A (zh) * 2018-09-26 2019-01-11 江苏傲农生物科技有限公司 一种乳酸菌素plnE的应用
CN111118092A (zh) * 2019-12-30 2020-05-08 江苏盐城源耀生物科技有限公司 一种固态发酵生产乳酸菌素的方法
CN113025539A (zh) * 2021-05-12 2021-06-25 郑州大学 一株抑制病原菌的耐盐耐低温弯曲乳杆菌及其在食品冷链反复冻融保藏中的应用
CN114736838A (zh) * 2022-06-14 2022-07-12 广东容大生物股份有限公司 一种肠源性益生菌株及其培养方法和应用
CN116948869A (zh) * 2023-05-30 2023-10-27 甘肃省科学院生物研究所 一株嗜酸乳杆菌fz1及其用于发酵五味子酒渣在替代抗生素中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555611A (zh) * 2013-09-27 2014-02-05 上海源耀生物股份有限公司 一种嗜酸乳杆菌培养物饲料添加剂及其制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103555611A (zh) * 2013-09-27 2014-02-05 上海源耀生物股份有限公司 一种嗜酸乳杆菌培养物饲料添加剂及其制备方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
俞涵丽等: "嗜酸乳杆菌活菌体和热灭活菌体对 IPEC-J2细胞的黏附和黏附拮抗效应", 《动物营养学报》 *
刘阳: "发酵豆粕和嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪肠道形态结构、消化酶活性及血液生化指标的影响", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库》 *
刘阳等: "嗜酸乳杆菌培养物对断奶仔猪肠道发育及消化酶活性的影响", 《饲料工业》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109170268A (zh) * 2018-09-26 2019-01-11 江苏傲农生物科技有限公司 一种乳酸菌素plnE的应用
CN111118092A (zh) * 2019-12-30 2020-05-08 江苏盐城源耀生物科技有限公司 一种固态发酵生产乳酸菌素的方法
CN113025539A (zh) * 2021-05-12 2021-06-25 郑州大学 一株抑制病原菌的耐盐耐低温弯曲乳杆菌及其在食品冷链反复冻融保藏中的应用
CN114736838A (zh) * 2022-06-14 2022-07-12 广东容大生物股份有限公司 一种肠源性益生菌株及其培养方法和应用
CN116948869A (zh) * 2023-05-30 2023-10-27 甘肃省科学院生物研究所 一株嗜酸乳杆菌fz1及其用于发酵五味子酒渣在替代抗生素中的应用
CN116948869B (zh) * 2023-05-30 2024-05-03 甘肃省科学院生物研究所 一株嗜酸乳杆菌fz1及其用于发酵五味子酒渣在替代抗生素中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN106399196B (zh) 一株植物乳杆菌hew-a490及其应用
CN103981118B (zh) 一种枯草芽孢杆菌饲料添加剂及其制备方法和应用
CN106260540B (zh) 一种用于教槽料的生物饲料及教槽料
CN103421715B (zh) 一种鼠李糖乳杆菌及其应用
CN106119152A (zh) 一种高产乳酸菌素的嗜酸乳杆菌及其应用
CN103981117A (zh) 一株高抗逆性屎肠球菌及其培养方法和应用
CN102391962B (zh) 一种屎肠球菌制剂及其生产工艺
CN101338283A (zh) 一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用
CN107974421A (zh) 一种嗜酸乳杆菌及其筛选方法和应用、一种菌剂
CN105483050A (zh) 一株植物乳杆菌及其在发酵饲料中的应用
CN108611299A (zh) 一株产抑菌肽的植物乳杆菌及其应用
CN109294940B (zh) 玉米乳杆菌诱变菌及高产乳酸的用途
CN104611256B (zh) 一种微生物冻干制剂及其制备方法
CN113652373B (zh) 一株芽孢杆菌及其应用
CN107177522A (zh) 一株高活性饲用植物乳杆菌及其培养方法和应用
CN105420150A (zh) 一种嗜酸乳杆菌及其应用
CN115094012B (zh) 凝结芽孢杆菌bc-hyc株菌剂的制备方法及应用
CN110257302B (zh) 具有抗氧化能力的乳酸菌菌株的筛选方法及应用
CN108546663B (zh) 一种猪源卷曲乳杆菌及其应用
CN104877940B (zh) 一株嗜热链球菌
CN108179122A (zh) 一种高粘附益生性屎肠球菌及其应用
CN107779422B (zh) 一株高效抑制黄曲霉合成黄曲霉毒素的非脱羧勒克菌生防菌株
CN105670959A (zh) 一株益生菌菌株及其应用
CN107828703A (zh) 空间罗伊氏乳杆菌Fullarton‑9‑35及应用
CN106561977A (zh) 一种牛用复合型合生元微生态制剂及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20161116

RJ01 Rejection of invention patent application after publication