CN115074280B - 一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备方法与应用 - Google Patents

一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备方法与应用，所述具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备原料包括嗜热链球菌和冻干保护剂；所述冻干保护剂包括乳清蛋白水解物和其他保护剂；所述其他保护剂包括海藻糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾、甘油、脱脂乳粉或赖氨酸中的任意一种或至少两种的组合。本发明所述的嗜热链球菌冻干粉比现有技术中的嗜热链球菌冻干粉的发酵活力提高了50％以上，满足了工业发酵剂中对于嗜热链球菌发酵活力的要求，能够缩短发酵时间，节约生产成本，具有良好的应用前景。

Description

一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备方法与 应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备方法与应用。
背景技术
早在19世纪末20世纪初，科学家就已经开始对浓缩发酵剂进行研究，已经实现酸奶发酵剂商业化生产。嗜热链球菌作为酸奶发酵剂的主要应用菌种之一，具有重要的应用价值。在实际生产中，一般以冻干粉的形式进行投料参与发酵，然而目前现有技术中的嗜热链球菌冻干粉的发酵活力较低，而发酵活力低会导致接种量加大而增加染菌风险，且会增加企业的生产成本。
因此如何提高嗜热链球菌冻干粉的发酵活力，进而提高发酵速度，缩短酸奶的凝乳时间，节约成本，提高产量，以便于大量的工业化生产，成为了本领域目前迫切需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备方法与应用。
本发明所述高发酵活力是指：所述嗜热链球菌冻干粉在10％的复原脱脂乳中，按20g/吨接种量，42℃发酵4h，得到的发酵乳的滴定酸度达61°T以上。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉，所述具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备原料包括嗜热链球菌和冻干保护剂。
所述冻干保护剂包括乳清蛋白水解物和其他保护剂。
所述其他保护剂包括海藻糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾、甘油、脱脂乳粉或赖氨酸中的任意一种或至少两种的组合。
所述至少两种的组合例如海藻糖和麦芽糊精的组合、甘油和脱脂乳粉的组合、脱脂乳粉和赖氨酸的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述乳清蛋白水解物为乳清蛋白经蛋白酶水解得到的产物，所述蛋白酶包括胰蛋白酶、木瓜蛋白酶或胃蛋白酶中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如木瓜蛋白酶与胃蛋白酶的组合、胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的组合、胰蛋白酶与胃蛋白酶的组合，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述蛋白酶包括胰蛋白酶和木瓜蛋白酶。
优选地，所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的浓度比为1:(0.5-2)。
上述(0.5-2)中的具体数值例如0.5、0.8、1、1.2、1.5、1.7、2等。
优选地，所述乳清蛋白水解物由包括如下步骤的方法制备得到：
将乳清蛋白、水与蛋白酶混合，在35-40℃下水解20-40min，离心，收集上清，即得。
上述35-40℃中的具体数值例如35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃等。
上述20-40min中的具体数值例如20min、22min、25min、28min、30min、32min、35min、38min、40min等。
优选地，所述乳清蛋白水解物由包括如下步骤的方法制备得到：
将乳清蛋白10-20g溶于100-200mL纯水中，添加20000-40000U蛋白酶，在35-40℃下水解20-40min，离心，收集上清，即得。
上述10-20g中的具体数值例如10g、11g、12g、13g、14g、15g、16g、17g、18g、19g、20g等。
上述100-200mL中的具体数值例如100mL、120mL、150mL、180mL、200mL等。
上述20000-40000U中的具体数值例如20000U、22000U、24000U、26000U、28000U、30000U、32000U、34000U、36000U、38000U、40000U等。
优选地，所述离心的转速为5000-8000g，离心时间为5-15min。
上述5000-8000g中的具体数值例如5000g、5500g、6000g、6500g、7000g、7500g、8000g等。
上述5-15min中的具体数值例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，所述其他保护剂包括海藻糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾、甘油、脱脂乳粉和赖氨酸。
优选地，所述其他保护剂以重量份数计包括海藻糖10-20份、麦芽糊精5-10份、磷酸氢二钾2-4份、甘油2-6份、脱脂乳粉5-10份和赖氨酸2-4份。
上述10-20份中的具体数值例如10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份等。
上述5-10份中的具体数值例如5份、5.5份、6份、6.5份、7份、7.5份、8份、8.5份、9份、9.5份、10份等。
上述2-4份中的具体数值例如2份、2.2份、2.4份、2.6份、2.8份、3份、3.2份、3.4份、3.6份、3.8份、4份等。
上述2-6份中的具体数值例如2份、2.2份、2.4份、2.6份、2.8份、3份、3.2份、3.4份、3.6份、3.8份、4份、4.2份、4.4份、4.6份、4.8份、5份、5.2份、5.4份、5.6份、5.8份、6份等。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，所述制备方法包括将嗜热链球菌与冻干保护剂混合，冻干，即得。
优选地，所述冻干前还包括进行深冷预冻。
优选地，所述深冷预冻在-50～-35℃下进行40-60min。
上述-50～-35℃中的具体数值例如-50℃、-48℃、-46℃、-44℃、-42℃、-40℃、-33℃、-35℃等。
上述40-60min中的具体数值例如40min、42min、44min、46min、48min、50min、52min、54min、56min、58min、60min等。
所述制备方法包括如下步骤：
(1)将活化后的嗜热链球菌接种至发酵培养基中，在35-39℃下培养，得培养液；
(2)培养液降温至15-30℃，离心，收集菌泥；
(3)将菌泥与冻干保护剂混合，冻干，即得。
上述35-39℃中的具体数值例如35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃等。
上述15-30℃中的具体数值例如15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、30℃等。
优选地，所述发酵培养基中含有氨基酸及其衍生物，还含有乳糖、酵母浸膏、蛋白胨、柠檬酸氢二铵、K2HPO4、MgSO4、MnSO4或吐温80中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如乳糖和酵母浸膏的组合、K2HPO4和MgSO4组合、MnSO4和吐温80的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述发酵培养基中的组分以浓度计包含乳糖20-40g/L、蛋白胨5-20g/L、酵母浸膏5-10g/L、柠檬酸氢二铵2-4g/L、K2HPO4 1.5-6g/L、MgSO4 0.04-0.6g/L、MnSO40.08-0.3g/L、氨基酸及其衍生物4-15g/L、吐温80 2-4g/L。
上述20-40g/L中的具体数值例如20g/L、22g/L、24g/L、26g/L、28g/L、30g/L、32g/L、34g/L、36g/L、38g/L、40g/L等。
上述5-20g/L中的具体数值例如5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L等。
上述5-10g/L中的具体数值例如5g/L、5.5g/L、6g/L、6.5g/L、7g/L、7.5g/L、8g/L、8.5g/L、9g/L、9.5g/L、10g/L等。
上述2-4g/L中的具体数值例如2g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.6g/L、2.8g/L、3g/L、3.2g/L、3.4g/L、3.6g/L、3.8g/L、4g/L等。
上述1.5-6g/L中的具体数值例如1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L、4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L等。
上述0.04-0.6g/L中的具体数值例如0.04g/L、0.06g/L、0.08g/L、0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L、0.35g/L、0.4g/L、0.45g/L、0.5g/L、0.55g/L、0.6g/L等。
上述0.08-0.3g/L中的具体数值例如0.08g/L、0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L、0.18g/L、0.2g/L、0.22g/L、0.25g/L、0.28g/L、0.3g/L等。
上述4-15g/L中的具体数值例如4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L等。
优选地，所述氨基酸及其衍生物包括天冬氨酸钠、谷氨酸钠、谷氨酰胺、半胱氨酸盐酸盐、天冬酰胺中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如天冬氨酸钠和谷氨酸钠的组合、半胱氨酸盐酸盐和天冬酰胺的组合、谷氨酰胺和半胱氨酸盐酸盐的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述氨基酸及其衍生物包括天冬氨酸钠和谷氨酰胺。
优选地，所述天冬氨酸钠与谷氨酰胺的质量比为1:(0.3-2)。
上述(0.3-2)中的具体数值例如0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7、2等。
优选地，步骤(1)所述培养的时间为6-10h，例如6h、6.5h、7h、7.5h、8h、8.5h、9h、9.5h、10h等。
优选地，步骤(2)所述降温至15-30℃后还包括维持10-40min，例如10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min等。
优选地，步骤(2)所述离心的转速为5000-8000g，离心时间为5-15min。
上述5000-8000g中的具体数值例如5000g、5500g、6000g、6500g、7000g、7500g、8000g等。
上述5-15min中的具体数值例如5min、6min、7min、8min、9min、10min、11min、12min、13min、14min、15min等。
优选地，步骤(3)中，所述菌泥与冻干保护剂的质量比为1:(0.5-2)。
上述(0.5-2)中的具体数值例如0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5、1.7、2等。
第三方面，本发明提供如第一方面所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉在制备发酵食品中的应用。
所述发酵食品例如发酵豆乳、酸奶等。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
嗜热链球菌是酸奶发酵工艺的必须菌种之一，然而目前嗜热链球菌发酵剂活力较低是一个待解决的问题，一方面，发酵活力低会导致接种量加大而增加染菌风险，且会提高企业的生产成本；另一方面，高发酵活力能够提高产品酸化速度，抑制细菌和酵母等杂菌生长，且能够产生更多的风味物质；为解决以上问题，本发明提出一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备工艺，制成的冻干粉在10％的复原脱脂乳中，按20g/吨接种量，42℃发酵4h，得到的发酵乳pH达到4.5以下，滴定酸度达75°T以上，比现有技术中的嗜热链球菌冻干粉的发酵活力(50°T左右)提高了50％以上，满足了工业发酵剂中对于嗜热链球菌发酵活力的要求，能够缩短发酵时间，节约生产成本，具有良好的应用前景。
1、嗜热链球菌在冻干过程中会造成活力和活菌数的损失，为保证嗜热链球菌的高活性，本发明在保护剂中添加乳清蛋白水解物可以在乳化过程中防止细胞膜结构被破坏及发生功能障碍，从而对菌体活力造成不利影响，其中，采用胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的复合酶水解乳清蛋白得到的乳清蛋白水解物更利于保护细胞膜的结构和功能，从而进一步增加冻干后的活菌数，进而提高了冻干粉的发酵活力。
2、本发明将海藻糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾、甘油、脱脂乳粉、赖氨酸与乳清蛋白水解物共同作为冻干保护剂，七种组分相互配合，缺一不可，共同使嗜热链球菌在冻干过程中的活力和活菌数的损失最小化，显著提高了冻干后的活菌数，进而提高了冻干粉的发酵活力。
3、由于冻干机降温速度较慢，需要1h左右才能达到-40℃，而慢冻会形成大冰晶，对细胞膜损伤严重，从而造成细胞死亡，因此本发明在冻干前先进行深冷预冻，使乳化液快速冻结，使形成的冰晶较小，减小了对细胞损伤，显著提高了冻干后的活菌数，进而提高了冻干粉的发酵活力。
4、嗜热链球菌属于化能异样型生物，对生长环境及营养物质的要求比较苛刻，在保证嗜热链球生长过程当中所需的碳、氮源及其他无机离子外，本发明人发现在培养基中额外添加特定的氨基酸及其衍生物(天冬氨酸钠和谷氨酰胺的)，可被菌体直接利用合成有机酸合成的前体物质，也可作为其他氨基酸及嘌呤、嘧啶的合成前体，间接参与DNA和RNA的修复，有利于酶的合成，显著促进了嗜热链球菌发酵活力的提高，而其他的氨基酸及其衍生物则无法达到此效果。
5、本发明在发酵后期降低培养基的温度，并维持一段时间，能够使嗜热链球菌在低温产生生长拮抗，从而分泌抗冻蛋白以及糖蛋白，更有利于保持菌体冻干时细胞的完整性，从而提高活菌数，进而提高冻干粉的发酵活力。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
下述实施例、对比例所涉及的原料信息如下：
嗜热链球菌来源于微康益生菌(苏州)股份有限公司。
乳清蛋白购自泛亚(乳品)有限公司；胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶均购自南宁庞博生物工程有限公司；海藻糖、麦芽糊精购自淄博康鼎生物科技有限公司；脱脂乳粉购自恒天然集团。
MRS液体培养基配方为：蛋白胨(动物源)10g/L、酵母膏10g/L、牛肉浸粉10g/L、葡萄糖10g/L、乳糖10g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二胺2g/L、K2HPO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O0.1g/L、MnSO4·H2O 0.05g/L、吐温-80 1g/L。
实施例1
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，具体如下：
(1)菌种活化：将保藏于-80℃超低温冰箱的菌种恢复至室温(25℃)后，按2％-4％接种量接种于MRS液体培养基中，连续活化3次。
(2)嗜热链球菌培养：培养基配方为20g/L乳糖、蛋白胨(动物源)5g/L、酵母浸膏5g/L、大豆蛋白胨10g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2HPO4·3H2O 4g/L、MgSO4·7H2O 0.3g/L、MnSO4·H2O 0.1g/L、L-天冬氨酸钠6g/L、L-谷氨酰胺6g/L、吐温80 2g/L，余量为水，37℃培养8h终止后，将培养温度降至20℃，维持20min。
(3)离心浓缩：5000g，离心时间10min，收集菌泥。
(4)冻干乳化液制备：取15g乳清蛋白，溶于150mL无菌水中，加入30000U的蛋白酶(胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的浓度比为2:1)，37℃下水解60min，在4℃下，6000g离心10min，收集上清液，获得乳清蛋白水解物上清液，置于4℃冰箱保存；
称取海藻糖15份、麦芽糊精10份、磷酸氢二钾3份、甘油6份、脱脂乳粉10份、赖氨酸2份，与乳清蛋白水解物上清液混合均匀，制得保护剂，将菌泥与冻干保护剂以1:1.5的重量比混合均匀(室温)，得冻干乳化液。
(5)冻干菌粉制备：将冻干乳化液置于-40℃深冷冰箱预冻50min后，置于冷冻干燥机中干燥42h后，获得嗜热链球菌冻干粉。
实施例2
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，具体如下：
(1)菌种活化：将保藏于-80℃超低温冰箱的菌种恢复至室温后，按2％-4％接种量接种于MRS液体培养基中，连续活化3次。
(2)嗜热链球菌培养：40g/L乳糖、蛋白胨(动物源)10g/L、酵母浸膏5g/L、大豆蛋白胨5g/L、柠檬酸氢二铵4g/L、K2HPO4·3H2O 4g/L、MgSO4·7H2O 0.6g/L、MnSO4·H2O 0.2g/L、L-天冬氨酸钠10g/L、L-谷氨酰胺4g/L、吐温80 4g/L，37℃培养8h终止后，将培养温度降至30℃，维持40min。
(3)离心浓缩：8000g，离心时间5min，收集菌泥。
(4)冻干乳化液制备：取20g乳清蛋白，溶于200mL无菌水中，加入30000U的蛋白酶(胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的浓度比为1:1)，37℃下水解20min，在4℃下，7000g离心10min，收集上清液，获得乳清蛋白水解物上清液，置于4℃冰箱保存；
称取海藻糖20份、麦芽糊精5份、磷酸氢二钾2份、甘油4份、脱脂乳粉6份、赖氨酸4份，与乳清蛋白水解物上清液混合均匀，制得冻干保护剂，将菌泥与冻干保护剂以1:0.5的重量比混合均匀(室温)，得冻干乳化液。
(5)冻干菌粉制备：将冻干乳化液置于-40℃深冷冰箱预冻40min后，置于冷冻干燥机中干燥42h后，获得嗜热链球菌冻干粉。
实施例3
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，具体如下：
(1)菌种活化：将保藏于-80℃超低温冰箱的菌种恢复至室温后，按2％-4％接种量接种于MRS液体培养基中，连续活化3次。
(2)嗜热链球菌培养：30g/L乳糖、蛋白胨(动物源)8g/L、酵母浸膏9g/L、大豆蛋白胨7g/L、柠檬酸氢二铵3g/L、K2HPO4·3H2O 2g/L、MgSO4·7H2O 0.4g/L、MnSO4·H2O 0.3g/L、L-天冬氨酸钠3g/L、L-谷氨酰胺6g/L、吐温80 3g/L，37℃培养8h终止后，将培养温度降至25℃，维持20min。
(3)离心浓缩：6000g，离心时间15min，收集菌泥。
(4)冻干乳化液制备：取10g乳清蛋白，溶于100mL无菌水中，加入30000U的蛋白酶(胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的浓度比为1:2)，37℃下水解40min，在4℃下，5000g离心10min，收集上清液，获得乳清蛋白水解物上清液，置于4℃冰箱保存；
称取海藻糖10份、麦芽糊精8份、磷酸氢二钾4份、甘油2份、脱脂乳粉5份、赖氨酸3份，与乳清蛋白水解物上清液混合均匀，制得冻干保护剂，将菌泥与冻干保护剂以1:2的重量比乳化混合均匀(室温)，得冻干乳化液。
(5)冻干菌粉制备：将冻干乳化液置于-40℃深冷冰箱预冻60min后，置于冷冻干燥机中干燥42h后，获得嗜热链球菌冻干粉。
实施例4
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(2)的发酵培养基中的“L-天冬氨酸钠6g/L、L-谷氨酰胺6g/L”替换为“L-天冬氨酸钠12g/L”，其他条件参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(2)的发酵培养基中的“L-天冬氨酸钠6g/L、L-谷氨酰胺6g/L”替换为“L-谷氨酰胺12g/L”，其他条件参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(2)的发酵培养基中不加L-天冬氨酸钠和L-谷氨酰胺，缺少的量用水补足，其他条件参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(2)的发酵培养基中的“L-天冬氨酸钠6g/L、L-谷氨酰胺6g/L”替换为“L-天冬酰胺6g/L、L-半胱氨酸6g/L”，其他条件参照实施例1。
实施例8
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(2)中，培养8h终止后不进行降温，直接离心浓缩，其他条件参照实施例1。
实施例9
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)中，将蛋白酶替换为等量的胰蛋白酶，其他条件参照实施例1。
实施例10
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)中，将蛋白酶替换为等量的木瓜蛋白酶，其他条件参照实施例1。
实施例11
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)中，将蛋白酶替换为等量的蛋白酶(胃蛋白酶与木瓜蛋白酶的浓度比为2:1)，其他条件参照实施例1。
实施例12
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)中，将“海藻糖15份、麦芽糊精10份、磷酸氢二钾3份、甘油6份、脱脂乳粉10份、赖氨酸2份”替换为“海藻糖25份、麦芽糊精14份、脱脂乳粉10份、赖氨酸2份”，其他条件参照实施例1。
实施例13
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)中，将“海藻糖15份、麦芽糊精10份、磷酸氢二钾3份、甘油6份、脱脂乳粉10份、赖氨酸2份”替换为“海藻糖15份、麦芽糊精15份、甘油6份、脱脂乳粉10份”，其他条件参照实施例1。
实施例14
本实施例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(5)中不进行深冷预冻，其他条件参照实施例1。
对比例1
本对比例提供一种嗜热链球菌冻干粉的制备工艺，其与实施例1的区别仅在于步骤(4)冻干保护剂中不加乳清蛋白水解物，缺少的量用水补足，其他条件参照实施例1。
发酵活力测试
对上述实施例、对比例得到的嗜热链球菌冻干粉进行发酵活力测试，具体方法为：在10％的复原脱脂乳中，按20g/吨接种量分别接种各组嗜热链球菌冻干粉，42℃下发酵4h，测定得到的发酵乳的滴定酸度，滴定酸度的测定方法如下：以酚酞作为指示液，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定10g发酵乳，记录滴定终点时所消耗的氢氧化钠体积，计算得发酵乳的酸度，结果见表1。
表1
结果显示：由实施例1与实施例4-7的对比结果可知，在发酵培养基中同时添加天冬氨酸钠和谷氨酰胺，二者协同增效，促进嗜热链球菌生长，显著促进了嗜热链球菌冻干粉发酵活力的提高，若仅添加单一组分或其他的氨基酸及其衍生物则无法达到如此显著的效果。
由实施例1与实施例8的对比结果可知，在发酵后期降低培养基的温度，并维持一段时间，能够使嗜热链球菌在低温产生生长拮抗，从而分泌抗冻蛋白以及糖蛋白，更有利于保持菌体冻干时细胞的完整性，从而提高活菌数，进而提高冻干粉的发酵活力。
由实施例1与对比例1的对比结果可知，本发明在保护剂中添加乳清蛋白水解物，显著提高了冻干粉的发酵活力。由实施例1与实施例9-11的对比结果可知，采用不同蛋白酶的水解产物对冻干粉发酵活力有一定的影响，采用胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的复合酶进行水解时，其提高冻干粉的发酵活力的效果最好。
由实施例1与实施例12-13的对比结果可知，海藻糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾、甘油、脱脂乳粉、赖氨酸与乳清蛋白水解物共同作为冻干保护剂，七种组分相互配合，缺一不可，共同使嗜热链球菌在冻干过程中的活力和活菌数的损失最小化，显著提高了冻干后的活菌数。
由实施例1与实施例14的对比结果可知，本发明在冻干前先进行深冷预冻，使乳化液快速冻结，使形成的冰晶较小，减小了对细胞损伤，显著提高了冻干后的活菌数，进而提高了冻干粉的发酵活力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉及其制备方法与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (8)

1.一种具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将活化后的嗜热链球菌接种至发酵培养基中，在35-39℃下培养得培养液；
(2)培养液降温至15-30℃，离心，收集菌泥；
(3)将菌泥与冻干保护剂混合，冻干，即得；
其中，步骤(1)中，所述发酵培养基中的组分以浓度计包含乳糖20-40g/L、蛋白胨5-20g/L、酵母浸膏5-10g/L、柠檬酸氢二铵2-4g/L、K2HPO4 1.5-6g/L、MgSO4 0.04-0.6g/L、MnSO4 0.08-0.3g/L、氨基酸及其衍生物4-15g/L、吐温80 2-4g/L；
所述氨基酸及其衍生物为天冬氨酸钠和谷氨酰胺；
步骤(3)中，所述冻干前还包括进行深冷预冻；
所述深冷预冻在-50～-35℃下进行40-60min；
所述冻干保护剂由乳清蛋白水解物和其他保护剂组成；
所述乳清蛋白水解物为乳清蛋白经蛋白酶水解得到的产物，所述蛋白酶由胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成；
所述其他保护剂由海藻糖、麦芽糊精、磷酸氢二钾、甘油、脱脂乳粉和赖氨酸组成。
2.如权利要求1所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述胰蛋白酶与木瓜蛋白酶的浓度比为1:(0.5-2)。
3.如权利要求1所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述乳清蛋白水解物由包括如下步骤的方法制备得到：
将乳清蛋白、水与蛋白酶混合，在35-40℃下水解20-40min，离心，收集上清，即得。
4.如权利要求1所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述其他保护剂以重量份数计由海藻糖10-20份、麦芽糊精5-10份、磷酸氢二钾2-4份、甘油2-6份、脱脂乳粉5-10份和赖氨酸2-4份组成。
5.如权利要求1所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，所述天冬氨酸钠与谷氨酰胺的质量比为1:(0.3-2)。
6.如权利要求1所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述培养的时间为6-10h。
7.如权利要求1所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述降温至15-30℃后还包括维持10-40min。
8.如权利要求1所述的具有高发酵活力的嗜热链球菌冻干粉的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌泥与冻干保护剂的质量比为1:(0.5-2)。
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