RU2549971C1 - Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата - Google Patents
Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата Download PDFInfo
- Publication number
- RU2549971C1 RU2549971C1 RU2014126682/15A RU2014126682A RU2549971C1 RU 2549971 C1 RU2549971 C1 RU 2549971C1 RU 2014126682/15 A RU2014126682/15 A RU 2014126682/15A RU 2014126682 A RU2014126682 A RU 2014126682A RU 2549971 C1 RU2549971 C1 RU 2549971C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- ipc
- solution
- preserving
- drug
- added
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов, используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе. Изобретение заключается в разработке способа консервации иммунопероксидазного конъюгата с применением в качестве стабилизирующей среды высушивания раствора белкового стабилизатора на основе водной эмульсии белка куриного яйца при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей. Изобретение позволяет сохранять стабильность физических и иммунохимических показателей иммунопероксидазных конъюгатов в течение длительного срока. 1 табл., 3 пр.
Description
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии производства иммунопероксидазных конъюгатов (ИПК), используемых для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА).
Конъюгаты на основе иммуноглобулинов G (IgG) и пероксидазы хрена (ПХ) - это специфические белковые биополимеры, имеющие слабожесткую структуру, обладающие способностью связываться с антигенами и ускорять химические реакции. В процессе хранения при температуре 4°C они подвергаются отрицательному влиянию продуктов метаболизма микроорганизмов, буферных изменений, концентрации водородных ионов и других факторов, которые по нашим наблюдениям ограничивают срок их годности от нескольких дней до двух недель.
Известен способ консервации ИПК, заключающийся в том, что после приготовления его хранят при минус 20°C в присутствии бычьего сывороточного альбумина (БСА) концентрацией 10 мг/мл [1].
Недостатками данного способа являются необходимость хранения готового продукта отдельно от остальных ингредиентов для постановки ТИФА и создание особых условий при транспортировке по «холодовой цепи».
Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ консервации ИПК, включающий добавление к нему БСА из расчета 10 мг/мл и лиофилизацию с последующим хранением при 4°C [2].
Недостатком способа является то, что использование БСА в качестве стабилизирующей среды при лиофилизации препарата ограничивает срок годности иммуноферментного конъюгата 12 месяцами [3, 4].
Целью изобретения является разработка способа консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, которая может служить альтернативой БСА при лиофилизации и после растворения препарата с сохранением стабильности физических и иммунохимических показателей на более продолжительный срок.
Технический результат изобретения достигается тем, что при консервации ИПК в качестве стабилизирующей среды высушивания используют белковый стабилизатор (БС), приготовленный на основе водной эмульсии белка куриного яйца, обладающий регулируемым составом белковых биополимеров с инертными поверхностными свойствами. Во время лиофильного высушивания молекулы ИПК оказываются между мономерами белков стабилизатора, благодаря чему активные центры фермента и иммуноглобулинов защищены от потери специфической активности под воздействием факторов окружающей среды во время высушивания и последующего хранения.
Стабилизирующая среда высушивания ИПК должна обладать рядом необходимых свойств: не препятствовать связыванию иммуноглобулинов с антигеном; обеспечивать возможность проникновения субстрата к активному центру ПХ; оставаться инертной по отношению к химическим характеристикам продукта, способствуя сохранению его биологической активности как в жидком, так и в высушенном состоянии; удерживать в процессе лиофилизации высушиваемый продукт внутри ампулы, предотвращая его улетучивание с сублимированными водяными парами; обеспечивать высокий уровень активности препарата в течение срока хранения [5].
Принимая во внимание выше перечисленные факторы, и учитывая свойства биополимеров водной эмульсии белка куриного яйца, очевиден вывод, что наиболее подходящей стабилизирующей средой высушивания для ИПК является БС, приготовленный из белка куриного яйца по ранее разработанному и запатентованному методу [6].
Иммунопероксидазные конъюгаты получали методом перйодатного окисления по методу P.K. Nacane, A. Kawaoi [1]. Для конъюгации IgG использовали фермент ПХ - тип VI-A, RZ-3 (Sigma, США). ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двухуглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия и инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре в течение 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок, что является признаком образования активной формы ПХ. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. Активированную пероксидазу хрена диализировали против 1 л 0,01 M карбонат-бикарбонатного буфера (КББ) pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.
К активированной ПХ добавляли 5 мг IgG против возбудителя туляремии в 1 мл 0,01 M раствора КББ (специфическая активность в реакции иммунодиффузии (РИД) не менее 1:16-1:32). Инкубацию реакционной смеси проводили при перемешивании в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. По истечении времени добавляли 5 мг боргидрида натрия и оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.
БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. БС использовали в различных разведениях (от нативного до 1:2) с 0,1 M раствором стерильного ФСБ и добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C.
Физические свойства (растворимость, цветность, прозрачность, потеря в массе при высушивании) и иммунохимические (специфическая активность, чувствительность) контролировали после лиофилизации ИПК в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) и после разведения. Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Приготовленные серии препарата соответствовали основным требованиям нормативных документов.
В таблице 1 представлены результаты изучения физических и иммунохимических свойств туляремийного ИПК, лиофильно высушенного в присутствии БС, подлежащего хранению в течение 18 месяцев (срок наблюдения).
При использовании в качестве стабилизирующей среды высушивания БС в различных разведениях с 0,1 M раствором стерильного ФСБ наилучшие результаты специфической активности ИПК и его чувствительности, а также стабильность характеристик в процессе хранения получены с разведением 1:1,5 (серия 3).
Таким образом, в результате проведенных исследований отработан способ консервации ИПК путем подбора стабилизирующей среды высушивания, обеспечивающей стабильность физических и иммунохимических показателей лиофилизированного и растворенного препарата.
Возможность практического применения изобретения иллюстрируется примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.
Пример 1. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии нативного БС.
Получение ИПК. ПХ в количестве 5 мг растворяли в 1 мл свежеприготовленного 0,3 M раствора двууглекислого натрия. Добавляли 0,025 мл 0,32%-ного раствора формалина, осторожно перемешивали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин. Затем добавляли 1 мл 0,04 M раствора перйодата натрия, инкубировали на шуттель-аппарате в темном футляре 30 мин, после чего раствор приобретал зеленовато-желтый оттенок. Далее вносили 1 мл 0,16 M раствора этиленгликоля и инкубировали в темноте при легком встряхивании в течение 1 ч. Все перечисленные операции проводили при комнатной температуре. После диализировали против 1 л 0,01 M раствора КББ pH 9,5 при 4°C в течение 18 ч на магнитной мешалке.
Раствор активированной ПХ переносили из диализного мешка во флакон и добавляли IgG против возбудителя туляремии в концентрации 5 мг/мл в 1 мл 0,01 M КББ со специфической активностью в РИД не менее 1:16-1:32, содержимое перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре в темном футляре. Добавляли 5 мг боргидрида натрия, оставляли в темном футляре без перемешивания в течение 2 ч при 4°C. Затем диализировали против 1 л 0,1 M раствора ФСБ pH 7,4 в течение 18 ч при 4°C на магнитной мешалке.
БС готовили следующим образом: к 25 мл белка куриного яйца добавляли 75 мл дистиллированной воды и 1,25 г натрия двууглекислого, перемешивали в течение 10-15 мин на магнитной мешалке. Затем прогревали при температуре 56°C 40-60 мин, фильтровали через 8 слоев марли. К готовому ИПК добавляли БС в нативном состоянии в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°C не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°C. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°C (серия 1).
Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения). Чувствительность и специфическую активность ИПК определяли в «сэндвич»-варианте ТИФА. Для постановки ТИФА использовали все компоненты из набора реагентов тест-системы диагностической для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе «ИФА-Тул-СтавНИПЧИ», кроме иммунопероксидазного конъюгата [4]. Специфическая активность и чувствительность препарата не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.
Пример 2. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:1 в 0,1 M растворе ФСБ.
ИПК получали аналогично примеру 1.
БС готовили аналогично примеру 1.
БС разводили 1:1 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 2).
Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность ИПК не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.
Пример 3. Получение ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного в 1:1,5 в 0,1 M растворе ФСБ.
ИПК получали аналогично примеру 1.
БС готовили аналогично примеру 1.
БС разводили 1:1,5 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 3).
Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность и чувствительность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.
Пример 4. Получение туляремийного ИПК и его контроль после лиофильного высушивания в присутствии БС, разведенного 1:2 в 0,1 M растворе ФСБ.
ИПК получали аналогично примеру 1.
БС готовили аналогично примеру 1.
БС разводили 1:2 0,1 M раствором стерильного ФСБ. Полученный раствор БС добавляли к готовому ИПК в объемном соотношении 1:1. Препарат разливали в ампулы по 0,2 мл, замораживали при температуре минус (45±5)°С не менее 18 ч и лиофилизировали до конечной температуры продукта 25°С. Ампулы с препаратом сразу же после высушивания запаивали в среде атмосферного воздуха. Готовый препарат хранили при 4-6°С (серия 4).
Контролировали физические и иммунохимические свойства препарата после лиофилизации и в процессе хранения в течение 18 месяцев (срок наблюдения) аналогично примеру 1. Специфическая активность - не снижалась в течение 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Чувствительность - снизилась в 2 раза после 18 месяцев хранения (срок наблюдения). Внешний вид и растворимость препарата оставались без изменений в течение всего срока наблюдения.
Claims (1)
- Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата, используемого для выявления антигенов возбудителей инфекционных болезней в твердофазном иммуноферментном анализе, отличающийся тем, что к иммунопероксидазному конъюгату добавляют раствор белкового стабилизатора на основе водной эмульсии белка куриного яйца в 0,1 M растворе фосфатно-солевого буфера (1:1,5) в объемном соотношении 1:1, после чего препарат разливают по 0,2 мл в ампулы, замораживают, лиофилизируют и хранят при температуре 4-6°C в течение 18 месяцев.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014126682/15A RU2549971C1 (ru) | 2014-07-01 | 2014-07-01 | Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2014126682/15A RU2549971C1 (ru) | 2014-07-01 | 2014-07-01 | Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2549971C1 true RU2549971C1 (ru) | 2015-05-10 |
Family
ID=53293783
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2014126682/15A RU2549971C1 (ru) | 2014-07-01 | 2014-07-01 | Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2549971C1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11738075B2 (en) * | 2018-03-20 | 2023-08-29 | National Research Council Of Canada | Method for lyophilizing live vaccine strains of Francisella tularensis |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005118644A2 (en) * | 2004-05-27 | 2005-12-15 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing rabies virus and uses thereof |
WO2010138522A2 (en) * | 2009-05-26 | 2010-12-02 | Advanced Bionutrition Corporation | Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making |
-
2014
- 2014-07-01 RU RU2014126682/15A patent/RU2549971C1/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005118644A2 (en) * | 2004-05-27 | 2005-12-15 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing rabies virus and uses thereof |
WO2010138522A2 (en) * | 2009-05-26 | 2010-12-02 | Advanced Bionutrition Corporation | Stable dry powder composition comprising biologically active microorganisms and/or bioactive materials and methods of making |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
XIAOQIANG WANG et al. Role of Ovalbumin in the Stabilization of Metastable Vaterite in Calcium Carbonate Biomineralization. J. Phys. Chem. B, 2009, 113 (26), PP. 8975-8982. * |
ЖАРНИКОВА И. В. Методологические подходы и разработка биотехнологии иммунобиологических препаратов для диагностики инфекционных особо опасных заболеваний и детекции их возбудителей. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Ставрополь. 2004. С.1-24. МИХАЙЛОВА М. Е. и др. Использование ниосом в качестве носителя для иммобилизации биологически активных веществ. АКТУАЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ ОБЕСПЕЧЕНИЯ САНИТАРНО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКОГО БЛАГОПОЛУЧИЯ В ПРИЧЕРНОМОРСКОМ РЕГИОНЕ. Материалы региональной научно-практической конференции с международным участием 24-25 сентября 2013г., г. Ставрополь. ФКУЗ Ставропольский противочумный институт Роспотребнадзора. С.113-116 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11738075B2 (en) * | 2018-03-20 | 2023-08-29 | National Research Council Of Canada | Method for lyophilizing live vaccine strains of Francisella tularensis |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kim et al. | Solubility and moisture sorption isotherms of whey-protein-based edible films as influenced by lipid and plasticizer incorporation | |
Savva et al. | Molecular architecture and functional analysis of NetB, a pore-forming toxin from Clostridium perfringens | |
ES2551605T5 (es) | Preparaciones de anticuerpos | |
DK146138B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af stabile erythrocytpraeparater | |
CS241478B2 (en) | Carrier system's particles and method of their production | |
ITTO940106A1 (it) | Composizione stabilizzata di troponina per saggi immunologici e procedimento di stabilizzazione di troponina per saggi immunologici | |
Rabea et al. | A novel protocol for bacterial ghosts’ preparation using tween 80 | |
Castellino et al. | The denaturing effectiveness of guanidinium, carbamoylguanidinium, and guanylguanidinium salts | |
Atmeh et al. | Albumin aggregates: hydrodynamic shape and physico-chemical properties | |
CN103933012B (zh) | 一种改性明胶胶囊 | |
JP2019070016A (ja) | ヘプラペプチドの製剤 | |
RU2549971C1 (ru) | Способ консервации иммунопероксидазного конъюгата | |
CN107091826A (zh) | 一种基于痕量荧光免疫定量检测PSI‑OAm‑NAPI两亲聚合纳米药物载体的方法 | |
Teal et al. | Directed Evolution Enables Simultaneous Controlled Release of Multiple Therapeutic Proteins from Biopolymer‐Based Hydrogels | |
Jezek et al. | A heat-stable hepatitis B vaccine formulation | |
Chai et al. | Outer eggshell membrane as delivery vehicle for polysaccharide/protein microcapsules incorporated with vitamin E | |
RU2708636C1 (ru) | Универсальная среда высушивания для стабилизации эритроцитарных диагностикумов туляремийных | |
CN105273021A (zh) | 红霉素半抗原、人工抗原和抗体及其制备方法和用途 | |
RU2447448C1 (ru) | Способ стабилизации антител в водных растворах | |
CN103372202A (zh) | 一种含有乳蛋白和脂肪酸的组合物及其制备方法与应用 | |
Dhiman et al. | Impact of ZIF-8, ArgHCl, and ionic liquid-based formulations on the conformational and colloidal stability of antibodies | |
CN113908285A (zh) | 一种基于自组装晶态材料的复合固体生物制剂,其制备及应用 | |
WO2015032302A1 (zh) | 卵黏蛋白液体制剂及其制备方法 | |
RU2735782C1 (ru) | Способ получения стандартного образца содержания антител IgG человека к вирусу клещевого энцефалита | |
RU2667121C2 (ru) | Способ получения бруцеллезного эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (рнга) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20160702 |