BRPI1013809B1 - composição em pó seca, está'vel, compreendendo microorganismos biologicamente ativos e/ou materiais bioativos e métodos de fabricaçâo da mesma - Google Patents

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Drewes Roger
Carpenter Brian
Artimovich Elena
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Abstract

COMPOSIÇÃO EM PÓ SECA, ESTÁVEL, COMPREENDENDO MICROORGANISMOS BIOLOGICAMENTE ATIVOS E/OU MATERIAIS BIOATIVOS E MÉTODOS DE FABRICAÇÃO DA MESMA. A presente invenção se refere à incorporação de microorganismos vivos ou mortos e/ou materiais bioativos em uma matriz protetora de formulação seca, em que a formulação inclui o microorganismo ou material bioativo, um agente de formulação estabilizadora e um agente protetor. A formulação é preparada mediante dispersão de todos os componentes sólidos em uma solução, com ou sem vácuo, e resfriamento da solução para uma temperatura acima de- sua temperatura de congelamento. Os métodos incluem uma primeira etapa de secagem da formulação sob uma desejada temperatura e período de tempo, e uma acelerada segunda etapa de secagem, sob vácuo máximo e elevada tempera.tura, para se obter uma desejável atividade de água final do material seco.

Description

Referência Cruzada a Pedidos de Patente Correlacionados
O presente Pedido de Patente reivindica prioridade para os Pedidos de Patentes Nos. 61/181.248 e 61/223.295, depositados no Escritório de Marcas e Patentes dos Estados Unidos, em 26 de Maio de 2009 e 06 de Julho de 2009, respectivamente, cujos conteúdos são aqui incorporados por essas referências para todas as finalidades.
Antecedentes da Invenção Campo da Invenção
A presente invenção pertence ao campo de proteção de microorganismos e/ou materiais bioativos, em condições de alta temperatura e umidade. Em particular, a 15invenção concerne a incorporação de microorganismos vivos e/ou materiais bioativos em uma matriz protetora de formulação seca.
Estado da Técnica Correlacionado Os microorganismos bioativos, tais como, bactérias e vírus vivos ou 20mortos, ou materiais bioativos, tais como, proteínas, vitaminas, minerais, hormônios e células, geralmentc, são instáveis quando armazenados sob condições de alta temperatura e umidade. Assim, por exemplo, muitas bactérias probiótícas comercialmente disponíveis, tal como, lactobacillus rhamnosus, podem perder mais de um log de viabilidade em menos de duas semanas, quando armazenadas em uma 25atmosfera ambiente, à temperatura ambiente (aproximadamente, 25 °C). Um processo comum para secar e proteger esses microorganismos bioativos, após a coleta em um vaso de cultura (por exemplo, um dispositivo fermentador), é gotejar uma solução concentrada de células vivas em nitrogênio líquido, depois, armazenar as pérolas congeladas em um meio de refrigeração à temperatura de -80°C, para posterior secagem 30por congelamento ou para despacho para outros locais. A secagem por congelamento foi um método dominante para secagem de material bioativo sensível. Outros métodos, como, secagem por pulverização, secagem de fluido supercrítico, e dessecação, geralmente, não são adequados para materiais bioativos sensíveis, como, por exemplo, II bactérias e vírus vivos ou -atenuados, pelo feto de que altas temperaturasde secagem usadas nesses métodos resultam em significativos danos ao próprio microorganismo. Além disso, esses métodos não podem suficientemente secar o material, para as exigências específicas de umidade residual para a estabilidade do produto e, assim, uma 5adicional etapa de secagem por outros meios pode ser exigida.
Na secagem por congelamento, os microorganismos ou materiais bioativos são comumente misturados em uma solução ou suspensão de agentes protetores, congelados e depois desidratados por sublimação sob vácuo total. As baixas temperaturas do processo de secagem por congelamento diminuem as reações de lüdecomposição do material bioativo, e minimizara a perda de atividade na forma seca final. Entretanto, a exigência para temperaturas abaixo de zero é de energia intensiva, e a baixa área de superfície para proporções de volume do material congelado necessita o uso de longo tempo de secagem (de até diversos dias por ciclo de batelada). A secagem lenta do processo de secagem por congelamento também facilita a formação de cristais 15de gelo, que podem danificar ou desnaturar um material bioativo sensível. Por essa razão, microorganismos ou materiais bioativos, tais como, vírus, bactérias e células, que possuem uma parede celular ou membrana de lipídeo, colocam significativos desafios para o processo de secagem por congelamento.
Uma opção para reduzir a formação de uma estrutura de cristal de gelo é 20adicionar agentes crioprotetores à solução de material bioativo. Esses agentes protetores são produtos químicos altamente solúveis, que são adicionados a uma formulação, para proteger as membranas celulares e proteínas intracelulares durante o congelamento e para aumentar a estabilidade durante o armazenamento. Estabilizadores comuns para bactérias e vírus vivos incluem os açúcares, tais como, sacarose, glicerol ou sorbitol, em 25altas concentrações com o material celular ou bioativo (Morgan et al., 2006; Capela et al., 2006). Entretanto, esses agentes protetores podem não penetrar adequadamente dentro da célula para proteger os componentes bioativos dentro do volume intracelular. Portanto, permanece um significativo desafio para desenvolver um processo e formulação de secagem ótima, que minimize as perdas de secagem, enquanto se obtém 30uma adequada estabilidade ao armazenamento do material seco.
Alguns dos problemas associados com o processo de secagem por congelamento foram resolvidos mediante uso de uma combinação de determinadas formulação e secagem a vácuo, em um estado líquido. Annear (Annear, 1962), - desenvolveu uma formulação contendo bactérias em uma solução de~ -açúcares e aminoácidos, e um processo de secagem a vácuo que envolve fervura e formação de espuma. Roser et aL, (Patente U.S. No. 6.964.771) divulgaram um conceito similar de secagem mediante formação de espuma, o qual incluí uma etapa de concentração de 51íquido, seguida de fervura e formação de bolhas da solução concentrada (xarope) sob vácuo. Para diminuir os danos de oxidação e desnaturação que podem ocorrer durante a etapa de fervura, Bronshtein (Patentes U.S. Nos. 5.766.520, 7.153.472) introduziu uma aperfeiçoada fórmula protetora contendo carboidratos e surfactantes. A secagem da solução protetora também envolveu um processo escalonado de concentração a vácuo lümoderado, antes da aplicação de um vácuo forte, que provoca uma ebulição espumante da água restante, formando uma espuma estável seca. Numa tentativa de eliminar a etapa de ebulição, Busson e Schroeder (Patente U.S. No. 6.534.087) propuseram um processo de secagem de uma formulação em estado líquido, para materiais bioativos insensíveis usando um forno a vácuo sem etapa de ebulição, mediante aplicação de uma pressão de 15vácuo bastante branda, acima de 30 Torr. Após a obtenção de um determinado nível de secagem sem ebulição do material, foi aplicado calor sob temperatura acima de 20°C e o material seco foi colhido depois de somente algumas horas.
Esse tipo de processo de secagem, no qual a solução bioativa é mantida em estado líquido durante todo o processo de secagem, tem a vantagem de uma secagem 20mais rápida devido à convecção do líquido durante a ebulição e ao aumento da área de superfície apresentado pelas superfícies de formação de bolhas. Entretanto, as etapas de ebulição e formação de bolhas exigem a entrada de uma significativa quantidade de calor para proporcionar a necessária fervura da solução. Esse processo de secagem não c bem adaptado para secagem de materiais biológicos sensíveis, como, por exemplo, vírus, 25células ou bactérias viáveis, pelo fato de que o calor aplicado acelera os processos enzimáticos (por exemplo, proteólise) e os processos químicos (por exemplo, oxidação e ataques de radicais livres), que podem destruir a atividade ou a viabilidade do material biológico.
O processo de secagem descrito acima é também limitado quanto à 30capacidade de escala em grandes processos industriais. Para se evitar exigências de congelamento, o processo deverá ser conduzido em um nível moderado de vácuo (>7 Torr), diferentemente de ciclos de processo convencionais de secagem por congelamento ou secagem por congelamento com pulverização. A desvantagem mais significativa dos processos acima é a incapacidade de-controlar e limitar a-expansão da espuma dentro do vaso, bandeja ou fiasco. A fervura incontrolável e a formação de espuma normalmente excessiva torna, pratícamente, impossível desenvolver um processo em escala industrial. A fervura e natureza de formação de bolhas da etapa de ebulição resulta em que uma 5porção do material é salpicada sobre as paredes do vaso e dentro da câmara de secagem.
Para abrandar a fervura durante a ebulição, Bronshtein (Patentes U.S. Nos. 6.884.866 e 6.306.345) sugeriu câmaras especiais e um controlado protocolo de aplicação de temperatura/pressão, que reduz o superaquecimento para um nível aceitável. Outra abordagem de conter a fervura e excessiva formação de bolhas é descrita no Pedido de lOPatente U.S. No. 2008/0229609, no qual a solução bioativa é confinada em um recipiente ou um saco coberto com membranas respiráveis. Uma vez mais, esses protocolos são difíceis de implementar a nível industrial e difíceis de confíavelmente repetir com diferentes formulações.
Assim, uma necessidade permanece para uma adequada formulação lõprotetora, que pode ser seca em um estado líquido, e de um método em escala industrial para secagem de microorganismos bioativos, tais como, vírus, bactérias e células vivas ou mortas, particularmente, sob temperaturas acima de congelamento. Existe uma particular necessidade para um processo rentável de secagem em escala, que seja também adequado para aplicações fora da indústria farmacêutica, como, por exemplo, 20indústria de alimentos e de agricultura. As formulações protetoras e processos de secagem moderados são exigidos para proporcionar adequada secagem, sem exposição a altas temperaturas. Assim, é necessária uma composição que possa proteger esses materiais biológicos durante o armazenamento, sob condições de alta temperatura e umidade. A presente invenção, conforme a descrição feita a seguir, proporciona uma 25soluçâo para todos esses desafios.
Resumo da Invenção
A presente invenção inclui composições e métodos para conservar materiais bioativos, tais como, peptídeos, proteínas, hormônios, vitaminas, minerais, 30fármacos, microbicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, espermicidas, ácidos nucléicos, anticorpos, vacinas e/ou microorganismos bioativos, tais como, bactérias (probióticas ou outras), vírus e/ou suspensões celulares, durante um período de armazenamento. Os métodos de secagem proporcionam um processo de controlável expansão de uma formulação, compreendendo o microorganismo ou material bioativo, um. agente estabilizador de formulação e um agente protetor. A formulação é preparada através de dispersão de todos os componentes sólidos em uma solução, com ou sem a presença de vácuo. A solução é resfriada a uma temperatura acima da sua temperatura de 5congelamento e seca a vácuo, proporcionando uma composição seca, a qual exibe uma estabilidade inesperadamente alta. Os métodos incluem uma etapa de secagem primária da formulação a uma desejada temperatura e período de tempo, e uma acelerada etapa de secagem secundária, sob vácuo máximo e elevada temperatura, de modo a obter uma desejável atividade de água final do material seco.
Em uma modalidade, a formulação compreende suficientes quantidades de agentes estabilizadores de formulação, nas quais os microorganismos estão incorporados. Exemplos de um adequado agente estabilizador de formulação incluem, sem que seja a isso limitado, ftalato acetato de celulose (CAP), carboximetilcelulose, pectina, alginato de sódio, sais de ácido algínico, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), 15metilcelulose, carragenina, goma guar, goma arábica, goma de xántano, goma de alfarroba, quitosana e derivados de quitosana, colágeno, ácido poliglicólico, amidos e amidos modificados, ciclodextrinas e oligossacarídeos (inulina, maltodextrinas, dextranos, etc.), e combinações dos mesmos.
Numa modalidade particular da invenção, o agente estabilizador de 20formulação preferido é alginato de sódio. Preferivelmente, a formulação compreende em percentual em peso de matéria seca total, 0,1-10%, preferivelmente, 1-6%, mais preferivelmente, 2-4% de agente estabilizador de formulação. Em uma adicional modalidade, o estabilizador de formulação compreende uma mistura de alginato de sódio e oligossacarídeos, numa proporção em peso de 1:1-10, mais preferivelmente, de 1:1-5, 25de alginato de sódio/oligossacarídeos. Em ainda outra modalidade da presente invenção, o estabilizador de formulação é reticulado com íons de metais divalentes, para formar um consisten te hid rogei.
Em outra modalidade, a formulação compreende significativas quantidades de agentes protetores, nas quais os microorganismos estão incorporados. 30Exemplos de um adequado agente protetor incluem, sem que seja a isso limitado, proteínas, tais como, albumina humana e albumina de soro bovino, albumina de ovo, gelatina, imunoglobulina, isolado de proteína de soja, proteína de trigo, leite em pó desnatado, caseinato, proteína de soro de leite, proteína de ervilha e quaisquer hidroJisados de proteína; carboidratos, incluindo monossacarídeos (galactose; D-manose, sorbose, etc.), dissacarídeos (lactose, trealose, sacarose, etc.), um aminoácido, tal como, lisina, glutamato monossódico, glicina, alanina, arginina ou histidina, assim como, aminoácidos hidrofóbicos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etc.); uma õmetilamina, tal como, betaína; um sal excipiente, tal como, sulfato de magnésio; um poliol, tal como, alcoóis trüdricos ou de açúcar superior, por exemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, e manitol; propilenoglicol; polietilenoglicol; Pluronics®; surfactantes; e combinações dos mesmos.
Numa modalidade preferida, o agente protetor compreende uma mistura 10de um dissacarídeo, uma proteína e um hidrolisado de proteína. Numa particular modalidade, o agente protetor preferido é uma mistura de trealose, isolado de proteína de soja, ou proteína de soro de leite e seus hidrolisados. Preferivelmente, a formulação compreende em percentual em peso de matéria seca total, 10-90% de trealose, 0,1-30% de isolado de proteína de soja ou proteínas de soro de leite, e 0,1-30% de hidrolisado de 15proteína de soja ou soro de leite. Preferivelmente, 20-80% de trealose, 0,1-20% de proteínas isoladas de soja ou proteínas de soro de leite, c 1-20% de hidrolisado de proteína de soja ou soro de leite, mais preferivelmente, 40-80% de trealose, 0,1-20% de isolado de proteína de soja ou proteínas de soro de leite e 1-20% de hidrolisado de proteína de soja ou soro de leite.
O método da invenção, tipicamente, inclui a mistura, na presença ou não de vácuo, de uma solução concentrada ou pó seco de um microorganismo bioativo (por exemplo, vacinas, bactérias, algas, vírus e/ou suspensões celulares de microorganismos vivos ou mortos) ou um material bioativo (por exemplo, peptídeos, proteínas, hormônios, vitaminas, minerais, fármacos, microbicidas, fungicidas, herbicidas, 25inseticidas, espermicidas, ácidos nucléicos, anticorpos, vacinas), um agente estabilizador e um agente protetor, proporcionando uma formulação homogênea, resfriamento da formulação para uma temperatura acima de sua temperatura de congelamento, e secagem a vácuo a uma temperatura de prateleira acima de 20°C. De acordo com a invenção, o processo de secagem pode envolver uma secagem primária a vácuo, a uma temperatura 30de 20°C ou mais alta, seguida de uma secagem secundária acelerada da formulação sob vácuo máximo e elevada temperatura, por um tempo suficiente para reduzir a atividade da água da formulação seca para 0,3 Awou menos.
Numa modalidade do método de-mistura, o microorganismo ou material bioativo se encontra em uma forma estabilizada seca, sendo ainda misturado seco com os agentes estabilizadores e agentes protetores secos. Essa mistura seca é depois adicionada à água e misturada sob uma condição apropriada de vácuo e agitação, 5proporcionando uma pasta fluida homogênea de densidade desejada.
Em outra modalidade do método de mistura, o microorganismo ou material bioativo se apresenta na forma de uma solução ou pasta concentrada. A solução é misturada com todos os outros ingredientes da formulação, antes da adição à água.
Em ainda outra modalidade do método de mistura, o microorganismo ou lOmaterial bioativo se apresenta na forma de um pó seco. O pó seco é misturado com todos os outros ingredientes da formulação, antes da adição à água.
Em outra modalidade do método de mistura, o microorganismo ou material bioativo seco é misturado com apenas uma porção dos ingredientes da formulação, essa mistura sendo adicionada à pasta fluida previamente formada, lópreparada a partir da adição dos outros ingredientes da formulação à água.
Nas modalidades preferidas dos métodos de secagem, o microorganismo bioativo é fixado sob vácuo em uma solução que inclui um agente estabilizador e um agente protetor de formulação. Em uma particular modalidade, o microorganismo bioativo compreende bactéria viva (por exemplo, bactéria probiótica). Exemplos de 20adequados microorganismos incluem, sem que seja a isso limitado, germes, tais como, Saccharomyc.es, Debaromyces, Candida, Pichia e Torulopsis, fungos, tais como, Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium e Torulopsis, e bactérias, tais como, do gênero Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuriaw, 25Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weiss ella, Aerococcus, Oenococcus e Lactobacillus. Exemplos específicos de adequados microorganismos probióticos podem ser representados pelas seguintes espécies e incluem todos os biótipos de culturas dentro dessas espécies: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentus, B. licheniformis, B. mesentericus, B. lüpumilus, B. subtilis, B. natto, Bacteroides amylophilus, Bac. capillosus, Bac. ruminocola, Bac. suis, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactís, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacety lactis, E faecium, E. intermedias, E. lactisy—E-. muntdi, E. thertnophilus, Escherichia coll, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarias, L. amylovorus, L. crispatus, L. brevis, L. case 4 L. curvatus, L. cellobiosus, L, delbrueckii ss. bulgaricus, L farciminis, L. fermentam, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantaram, L. johnsonii, 5L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarias, Leuconostoc mesenteroides, P. cereviseae. (damnosus), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop, shertnanii, Saccharomyces cereviseae, Staphylococcus carnosas, Staph, xylosus, Streptococcus infantarias, Strep, salivarias ss. thermophilus, Strep. Thermophilus e Strep, lactis.
Nos métodos preferidos, a formulação é misturada sob vácuo à temperatura ambiente (por exemplo, de 20 a 30°C). Após mistura até homogeneização, a formulação é então resfriada a uma temperatura acima da sua temperatura de congelamento. Tipicamente, a formulação é resfriada para a temperatura entre -10°C a +10°C, mais preferivelmente, entre -5°C e +5°C. Numa modalidade preferida, a 15formulação resfriada é então transferida para uma câmara de secagem, onde é aplicado aquecimento (20°C ou mais), ao mesmo tempo em que se controla uma pressão de vácuo inicial, em um nível que mantém a temperatura de pré-resfriamento Original. Tipicamente, a pressão de vácuo desejável é abaixo de 7 Torr, mas, não inferior a 3 Torr. Sob essas condições preferidas, se obtém uma controlada expansão da formulação 20e uma subsequente mais rápida secagem primária. Para acelerara secagem secundária, uma pressão máxima de vácuo é aplicada e a temperatura de suprimento de calor pode ser ainda mais elevada para a faixa de 30°C a 60°C. Para maximizar a estabilidade do produto final, a formulação, preferivelmente, é seca por um período de tempo suficiente para reduzir a atividade da água na formulação para Aw = 0,3, ou um valor inferior. 25Nuroa modalidade preferida da invenção, a secagem secundária compreende a remoção da água a uma pressão inferior a 1 Torr, e numa modalidade especialmente preferida, para uma pressão inferior a 0,2 Torr.
A formulação umedecida pode se apresentar na forma de uma pasta fluida viscosa ou de partículas de hidrogel, variando de 0,05 a 10 mm. A formulação seca pode 30ser usada diretamente como um floco ou pode ser moída para a forma de um pó, com um tamanho médio de partícula de cerca de 10 μm a cerca de 1000 μm. A formulação pode ser administrada diretamente a um animal, incluindo um humano, na forma de um pó —concentrado,- de- um líquido reconstituído-(por exemplo, umabebida); õü pode ser incorporada na forma de floco ou de pó em um alimento existente ou produto de ração.
Breve Descrição dos Desenhos
A figura 1 mostra a tendência de estabilidade da bactéria probiótica, L. rhamnosus, que foi submetida ao armazenamento sob condições de temperatura de 40nC e umidade relativa de 33%.
A figura 2 mostra as temperaturas do processo e a perda de viabilidade cumulativa para um processo de formulação que termina com uma atividade de água lOAw, de 0,28, na etapa de secagem secundária.
A figura 3 mostra o efeito de diferentes estabilizadores de formulação com relação à estabilidade ao armazenamento.
A figura 4 mostra o efeito da viscosidade do alginato com relação à expansão da formulação sob vácuo.
A figura 5 mostra o efeito de diferentes combinações de agentes estabilizadores com relação à viabilidade da bactéria.
A figura 6 mostra o efeito da densidade da formulação com relação à velocidade de expansão sob vácuo.
A figura 7 mostra o efeito da temperatura de pré-resfriamento da 20formulação com relação à expansão sob vácuo.
A figura 8 mostra o efeito da pressão de vácuo com relação à temperatura da formulação, durante a etapa de secagem primária.
A figura 9 mostra o efeito da pressão de vácuo com relação à velocidade de secagem da formulação.
A figura 10 mostra a estabilidade da bactéria probiótica, L. acidophilus, seca com a presente formulação e conforme o método da invenção, sob armazenamento em condições de temperatura de 37°C e umidade relativa de 33%.
A figura II mostra um fluxograma do método de produção de formulação seca estável, a partir de formulação de hidrogel, de acordo com a invenção.
Descrição Detalhada da Invenção
- Definições - -Deverá ser entendido que a terminologia- aqui usada tem a finalidade somente de descrever particulares modalidades, não tendo a intenção de ser limitativa. Conforme usado no presente relatório e nas reivindicações anexas, as formas singulares “um”, “uma” e “o” incluem as correspondentes formas plurais, a menos que o contexto õindique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a referência a ”uma proteína” inclui uma proteína ou uma combinação de duas ou mais proteínas; a referência à “enzima”, “vitamina”, “bactéria”, etc., inclui a forma singular ou uma mistura de diversas, e assim por diante. Na descrição e nas reivindicações da presente invenção, a seguinte lOterminologia será usada, em acordo comas definições estabelecidas abaixo. Temperaturas ambientes ou condições “ambientes” são aquelas em qualquer instante de tempo, em um determinado ambiente. Tipicamente, a temperatura ambiente se situa na faixa de 22-25°C, sob pressão atmosférica ambiente e umidade ambiente facilmente medidas, e irá variar dependendo da estação do ano, tempo e 15condições climáticas, altitude, etc. “Desgaseificação” se refere à liberação de um gás da solução em um líquido, quando a pressão parcial do gás for maior que a pressão aplicada. Isso não é ebulição, podendo frequentemente ocorrer, sob pressões de valor acima de uma pressão que poderia ferver uma solução. Por exemplo, bebidas suaves carbonatadas 20engarrafadas, contidas com uma alta pressão parcial de CO2. A remoção da tampa da garrafa reduz a pressão parcial e a bebida borbulha vigorosamente (se desgaseifica, mas não ferve). “Ebulição” se refere à rápida transição de fase, de líquido para gás, que ocorre quando a temperatura de um líquido está acima de sua temperatura de ebulição. A 25temperatura de ebulição é a temperatura na qual a pressão de vapor de um líquido é igual à pressão aplicada. A ebulição pode ser particularmente vigorosa, quando calor é adicionado a um líquido que já está no seu ponto de ebulição. “Atividade da água” ou “Aw”, no contexto de composições de formulação seca, se refere à disponibilidade de água e representa a situação de energia 30da água em um sistema. É definida como a pressão de vapor da água acima de uma amostra, dividida por aquela da água pura na mesma temperatura. A água pura destilada apresenta uma atividade de água de exatamente 1, ou seja, Aw = 1,0.
“Umidade relativa” ou “RH”, no contexto de estabilidade ao armazenamento, se refere à quantidade de vapor de água no ar a uma determinada temperatura, A umidade relativa é normalmente inferior que a exigida para saturar o ar, sendo expressa em percentual de umidade de saturação. 5 “Secagem primária”, com relação aos processos aqui descritos, se refere à secagem que ocorre a partir do tempo de aplicação do vácuo inicial, até o momento em que começa a secagem secundária. Tipicamente, a maior parte da secagem primária ocorre por evaporação extensiva, ao mesmo tempo em que a temperatura do produto permanece significativamente mais baixa que as temperaturas da fonte de calor. 10 “Secagem secundária”, com relação aos processos aqui descritos, se refere a uma etapa de secagem que ocorre sob temperaturas acima das temperaturas de congelamento da formulação, e próximas da temperatura da fonte de calor. Em um processo típico de secagem de formulação, uma etapa de secagem secundária reduz a atividade da água da formulação para um valor de Aw de 0,3 ou menos. 15 “Microorganismo bioativo” ou “microorganismo ou formulação biologicamente ativos” se referem a preparações de microorganismos vivos ou mortos, que se encontram em tal forma, para permitir que a atividade biológica do microorganismo, de modo inequívoco, seja efetiva. “Microorganismo vivo na forma de pó seco” se refere a uma biomassa bacteriana, na qual, pelo menos, 10% em peso/peso é 20bactéria viva. “Microorganismo morto na forma de pó seco” se refere a uma biomassa bacteriana, na qual, pelo menos, 99,999% em peso/peso é bactéria morta.
“Material bioativo”, “composição bioativa”, “material biologicamente ativo” ou “formulação bioativa” se referem a preparações que se encontram em tal forma, para permitir que a atividade biológica dos ingredientes bioativos, de modo 25inequívoco, seja efetiva. Esses materiais incluem, sem que seja a isso limitado, peptídeos, proteínas, hormônios, vitaminas, minerais, fármacos, microbicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, espermicidas, ácidos nucléicos, anticorpos e vacinas. “Estabilizador ou agente de estabilização” se refere a compostos ou materiais que são adicionados à formulação para aumentar a viscosidade da formulação 30umedecida ou para formar um hidrogel. Exemplos de um adequado agente estabilizador incluem, sem que seja a isso limitado, os polissacarídeos, tais como, ftalato acetato de celulose (CAP), carboximetilcelulose, pectina, alginato de sódio, sais de ácido algínico, hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), metilcelulose, carragenina, goma guar, goma arábica, goma de xantano, goma de alfarroba, quitosana e derivados de quitosana, colágeno, ácido poliglicólico, amidos e amidos modificados, ciclodextrinas e oligossacarídeos (inulina, maltodextrinas, rafinose, dextranos, etc.), e combinações dos mesmos. 5 “Agente de proteção” ou “agente protetor” ou ainda “protetor”, geralmente, se refere a compostos ou materiais que são adicionados para garantir ou aumentar a estabilidade do material bioativo durante e depois do processo de secagem, ou a estabilidade de longo prazo de armazenamento do produto de pó seco. Adequados agentes protetores, geralmente, são facilmente solúveis em uma solução, não se lOespessando ou polimerizando após contato com a água. Adequados protetores são descritos abaixo e incluem, sem que seja a isso limitado, proteínas, tais como, albumina humana e albumina de soro bovino, proteína de soro de leite, proteína de soja, case inato, gelatina, imunoglobulinas, carboidratos, incluindo os monossacarídeos (galactose, D- manose, sorbose, etc.), dissacarídeos (lactose, trealose, sacarose, etc.), um aminoácido, 15tal como, lisina, glutamato monossódico, glicina, alanina, arginina ou histidina, assim como, aminoácidos hidrofóbicos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etc.); urna metilamina, tal como, betaína; um sal excipiente, tal como, sulfato de magnésio; um poliol, tal como, alcoóis triídricos ou de açúcar superior, por exemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, e manitol; propilenoglicol; polietilenoglicol; 20Pluronics@; surfactantes; e combinações dos mesmos.
Uma formulação ou composição “estável” é uma em que o microorganismo ou material bioativo contido substancialmente mantém sua viabilidade e/ou atividade biológica durante o armazenamento. A estabilidade pode ser medida sob condições selecionadas de temperatura e umidade, por um período de tempo 25selecionado. Análises de tendência podem ser usadas para estimar um tempo de vida de prateleira esperado, antes de o material ter sido realmente colocado em armazenamento naquele período de tempo. Para bactéria viva, por exemplo, a estabilidade é definida como o tempo que se leva para perder 1 log de CFU/g de formulação seca, sob condições previamente definidas de temperatura, umidade e período de tempo.
“Viabilidade”, com relação à bactéria, se refere à capacidade de formar uma colônia (CFU) - ou Unidade de Formação de Colônia) em um meio nutriente, apropriado para o crescimento da bactéria. A viabilidade com relação a vírus, se refere à capacidade- de infectar-e reproduzir em uma célula hospedeira adequada, resultando na formação de uma placa ou uma camada de células hospedeiras.
As composições e métodos da presente invenção solucionam o problema de prover processos de secagem rentáveis e em escala industrial, para produção de uma 5formulação seca, contendo microorganismos ou materiais bioativos. tais como, vacinas, bactérias, algas, vírus e/ou suspensões celulares de microorganismos vivos ou mortos, peptídeos, proteínas, hormônios, vitaminas, minerais, fármacos, microbicidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, espermicidas, ácidos nucléicos, anticorpos, vacinas com tempo de vida significativamente prolongado no estado seco. A invenção lOproporciona uma formulação compreendendo um microorganismo ou material bioativo, com um agente estabilizador e um agente protetor em uma solução, com resfriamento da dita formulação para uma temperatura acima de sua temperatura de congelamento, e estabilização da formulação mediante remoção da umidade sob um regime de pressão reduzida, ao mesmo tempo em que se fornece calor à composição.
A maior parte de perda de viabilidade de microorganismos durante os processos de secagem pode ser atribuída a uma combinação de tensões formadas por congelamento/descongelamento, e formação de cristais de gelo, altas tensões osmóticas e oxidantes, forças de cisalhamento e liberação de energia durante cavitaçÕes de borbulhamento associadas com a “ebulição” da solução sob baixa pressão de secagem e 20alta temperatura. A presente invenção proporciona uma formulação e um processo de secagem em escala industrial, que minimiza as perdas durante a secagem e protege, posteriormente, o microorganismo bioativo sob severas condições de armazenamento.
Composições da Invenção
A presente invenção inclui composições de formulação de um microorganismo ou material bioativo, um agente estabilizador e um agente protetor, em uma solução viscosa. As formulações da invenção foram encontradas como sendo inerentemente diferentes na sua estrutura física e funcionamento, com relação às formulações não-viscosas ou concentradas que foram secas sem a etapa de resfriamento 30prévio. Assim, por exemplo, as formulações descritas pelo estado da técnica foram, inicialmente, “espumadas ou tendo a formação de bolhas” para facilitar uma efetiva secagem. A etapa de espumaçao ou formação de bolhas, geralmente, resulta em intensa ebulição e fervura da solução, que é uma inevitável consequência da secagem a vácuo em um estado líquido, e, como resultado, somente pode ser obtida uma capacidade de carregamento de material bastante baixa em um frasco ou um vaso (ver, por exemplo,a Patente U.S. No. 6.534.087, na qual a espessura do produto espumado final é inferior a 2 mm). As composições e métodos de secagem da presente invenção permitem, somente, 5uma limitada e controlada expansão da formulação, desse modo, possibilitando um carregamento de material muito maior por área de secagem e, como resultado, pode ser facilmente colocada em escala, para a produção de grandes quantidades de material.
Microorganismos de célula única tem sido mostrados como vantajosos, particularmente, para as formulações e métodos de secagem da presente, invenção. Em lOuma modalidade, o microorganismo bioativo da invenção é uma bactéria probiótica. A formulação é preparada de acordo com as composições e métodos da invenção, incluindo a obtenção de bactéria probiótica viva na solução concentrada, na forma de pasta, de grânulos congelados ou na forma de pó seco. A mistura da bactéria probiótica é feita sob vácuo, com um agente estabilizador e um agente protetor, com seguinte 15resfriamento da formulação viscosa a uma temperatura acima de sua temperatura de congelamento, aplicação de suficiente pressão de vácuo para manter a temperatura de pré-resfriamento e fornecimento de uma fonte de calor de 20°C ou mais, para facilitar a remoção de água. A manutenção da temperatura pré-resfriada da formulação pode ser através da condução de calor para fora da formulação, e/ou pela perda de calor latente 20devido à evaporação da água. Para acelerar ainda mais o processo de secagem, é aplicada uma etapa de secagem secundária, com um vácuo mais alto de até 0,1 Torr, e em temperatura elevada de até 70flC, para proporcionar uma composição final com atividade de água Aw, de 0,3, ou menos. Essa composição pode permanecer estável em condições de armazenamento de 40°C e umidade relativa de 33%, durante 60 dias ou 25mais (ver a Figura 1). Os processos especificados da invenção demonstraram uma inesperada capacidade das células em manter sua viabilidade, além daquela estabelecida nos processos de secagem. A inicial perda de viabilidade em todo o processo de secagem de acordo com a presente invenção foi somente de 0,3 logs (ver a figura 2).
Formulações paia Preparação de Composições Estáveis de Pó Seco
Os constituintes a serem misturados com o microorganismo ou material preferido para a preparação das composições de pó seco de acordo com a invenção, incluem um agente estabilizador e um agente protetor. Esses constituintes, quando misturados com os-microorganismos ou materiais bioativo s, podem ser processados de acordo com os métodos da invenção, para proporcionar grandes quantidades de composições secas estáveis, para armazenamento e administração dos ditos microorganismos. Os agentes estabilizadores da formulação podem incluir uma mistura 5de um polissacarídeo e um oligossacarídeo. O polissacarídeo preferido, particularmente, para estabilização de microorganismos vivos, é o alginato. Isso, pelo fato de ter sido surpreendentemente encontrado que o alginato é superior aos outros polissacarídeos, tais como, pectina e goma arábica, na redução de perdas por secagem de materiais biológicos sensíveis, como, por exemplo, os materiais probióticos (ver a figura 3). O alginato foi JLOtambém preferido devido as suas características de formar bidrogel com metais não- tóxicos em temperaturas moderadas. O alginato tòi também encontrado como sendo efetivamente estabilizador da formulação sob vácuo, por proporcionar uma apropriada viscosidade à formulação e permitir uma expansão controlada da formulação em uma particular viscosidade (ver a figura 4).
A combinação de um oligossacarídeo com o alginato foi também encontrada para adicionalmente contribuir para a estabilidade global da formulação. A figura 5 mostra o efeito com relação à estabilidade quanto ao armazenamento de diferentes combinações de alginato e oligossacarídeos. Uma combinação de alginato e inulina foi a combinação preferida em termos de seu longo efeito de armazenamento 20cora relação à bactéria probiótica. Numa modalidade da invenção, pelo menos um dos agentes estabilizadores de formulação, preferivelmente, é uma goma, que pode formar um consistente hidrogel mediante reticulação com íons metálicos.
Os agentes protetores da invenção podem incluir diversas proteínas, peptídeos, açúcares, alcoóis de açúcares e aminoácidos. O agente protetor é 25preferivelmente um agente que não cristaliza e/ou desestabiliza o material biologicamente ativo na formulação sob temperaturas de congelamento (por exemplo, -20°C). Pode ser vantajoso se incluir dois ou mais agentes protetores, para inibir a formação de cristais e estabilizar a formulação de material bioativo seco, nas condições de armazenamento, por longos períodos de tempo.
As formulações umedecidas podem incluir uma substancial quantidade de sólidos totais (constituintes menos o solvente, como, a água). Uma maior porção de sólidos totais pode consistir de material bioativo, agente estabilizador e agente protetor. Assim,-por exemplo^ o material bioativo pode_ estar presente na formulação numa concentração na faixa de cerca de 2-50% em peso, o agente estabilizador na faixa de cerca de 1-20% em peso, e o agente protetor na faixa de cerca de 20-80% em peso. Em outro exemplo, o agente estabilizador pode estar presente na 5formulação, numa concentração na faixa de cerca de 0,5-10% em peso, e o agente protetor na faixa de cerca de 10-40% em peso. Preferivelmente, a formulação umedecida pode apresentar teor de sólidos entre 5% e 80%; mais preferivelmente, entre cerca de 30% e 60%. A viscosidade das formulações da invenção, tipicamente, são maiores que 1000 centipoises (cP); mais preferivelmente, maiores que 10.000 cP e inferiores a 10450.000; mais ainda preferivelmente, maiores que 30.000 cP e menores que 100.000 cP.
A viscosidade das formulações da invenção podem ser tão altas quanto 450.000 cP, desde que os agentes protetores sejam completamente dissolvidos na solução. Pastas fluidas altamente viscosas e homogêneas, contendo substancial 15quantidade de sólidos totais, podem ser obtidas em temperaturas elevadas, dependendo da termo- e osmo-sensibilidade do material bioativo. Assim, por exemplo, as formulações de células vivas contendo 30-60% de sólidos totais podem ser misturadas em elevadas temperaturas, de cerca de 35-40°C, e a mistura ser realizada até que todos os agentes protetores sejam completamente dissolvidos.
Métodos de Preparação de Formulações Secas Estáveis
Os métodos de preparação de formulações secas estáveis para a conservação de microorganismos bioativos incluem a obtenção de uma cultura viva de um específico microorganismo, em uma solução concentrada, pasta, grânulos 25congelados ou na forma de pó seco (estabilizada ou não). A preparação de uma formulação é feita através de mistura sob vácuo, do microorganismo ou material bioativo com um agente estabilizador e um agente protetor em uma solução, resfriamento da formulação para uma temperatura de não mais que 10°C acima de sua temperatura de congelamento, e secagem da formulação mediante evaporação da 30umidade sob pressão reduzida, ao mesmo tempo em que se fornece calor à formulação.
Em uma modalidade, por exemplo, uma formulação compreendendo um microorganismo ou material bioativo, um agente estabilizador e um agente protetor é misturada até alcançar a homogeneidade, sob vácuo moderado de cerca de 10-50 Torr, em uma solução. Afigura 6 mostra o efeito de diferentes densidades-da formulação com relação à expansão da mesma sob vácuo. A introdução de ar durante a mistura dos constituintes da formulação em uma solução, resulta em excessiva e descontrolada espumação, mesmo com pressão de vácuo relativamente alta. A etapa de mistura sob 5vácuo, de acordo com a invenção, trata desse problema mediante eliminação da introdução de ar ou gás dentro da solução da formulação, desse modo, eliminando a excessiva e descontrolada espumação ou formação de bolhas da solução.
A solução é então resfriada para uma temperatura acima de seu ponto de congelamento (normalmente, entre -5°C e +5°C). A figura 7 mostra o efeito do pré- lOresfriamento da solução de formulação ou de sua expansão sob pressão de vácuo. Foi surpreendentemente e inesperadamente descoberto que a ebulição pode ser efetivamente eliminada mesmo sob uma pressão de vácuo relativamente mais alta e a expansão da formulação é melhor controlada quando a temperatura da solução for reduzida para não mais que 10°C acima de sua temperatura de congelamento. Conforme pode ser visto na 15 figura 7, uma pressão de vácuo de 3 Torr pode ser aplicada sem que haja excessiva espumação, desde que a formulação seja resfriada para a temperatura de +5°C, preferivelmente, para a temperatura de -3 °C. Uma vez resfriada, a formulação é então seca sob suficiente pressão de vácuo (p°r exemplo, cerca de 3 Torr), para manter a temperatura pré-resfriada durante a 20etapa de secagem primária. A figura 8 mostra o efeito da pressão de vácuo aplicada, com relação à temperatura da solução da formulação. Em uma pressão de vácuo relativamente alta, acima de 8 Torr, o aumento da temperatura da formulação foi de cerca de 6°C, tendo continuado para rapidamente aumentar na direção da temperatura da prateleira ou da câmara. Ao mesmo tempo, a solução continuou a formar bolhas ou 25espumar, c mais ainda se expandir. Essa modalidade é diferenciada daquela do estado da técnica discutida acima (ver, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.534.087, onde a pressão de vácuo aplicada fica entre 3-7 Torr e até mesmo superior), na qual uma pressão de vácuo mais forte é aplicada (<3 Torr), ao mesmo tempo em que se controla a expansão da formulação, Esse processo resulta em uma velocidade de secagem significaíivamente 30mais rápida (ver a figura 9) e possibilita uma alta capacidade de carregamento da formulação. Na presente modalidade, a excessiva espumação e ebulição é eliminada, mesmo sob pressões de vácuo mais baixas, pelo fato dos métodos da invenção proporcionarem: a)-uma específica composição com uma controlada expansão sob vácuo; b) um método que elimina a introdução de ar dentro da formulação durante a mistura; e c) um substancial pré-resfriamento da formulação.
Os métodos típicos citados no estado da técnica envolvem uma intensa 5espumação e/ou salpico e violenta ebulição, que pode ser danoso aos materiais biológicos sensíveis e causar dificuldades para produção em uma escala industrial. Além disso, uma completa e eficiente desgaseificação de pastas fluidas viscosas é difícil, podendo exigir ura prolongado período de tempo. Esses obstáculos foram solucionados pela presente invenção com a realização de todo o processo de mistura sob vácuo lOmoderado, para eliminar, em primeiro lugar, a introdução de gases arrastados dentro da formulação. Qualquer pequena quantidade de gases solúveis que possa permanecer na formulação é então suavemente removida, permitindo que a formulação seja moderadamente expandida sob baixa pressão de vácuo. A adicional etapa de pré- resfriamento da formulação para uma temperatura acima de sua temperatura de 15congelament.o proporciona um adicionado controle da velocidade de expansão e, desse modo, permite uma maior capacidade de carregamento por área de secagem do que foi permitido conforme o estado da técnica. Após o estágio de secagem primária ser completado, a formulação seca estabilizada pode ser mantida em elevadas temperaturas na etapa de secagem secundária (de até 70uC), e sob pressões de vácuo inferiores a 0,2 20Torr, para completar a secagem da formulação em um espaço de tempo bastante curto.
Outra modalidade da invenção proporciona métodos para preparar composições de formulação de hidrogel, para conservação de microorganismos ou materiais bioativos. Assim, por exemplo, numa formulação que contém uma bactéria probiótica numa forma de pó seco, um agente estabilizador e um agente protetor, é feita 25a mistura em uma solução, com reticulação para formar um hidrogel, através da adição de tons metálicos ou de cátions divalentes, depois, a mistura é seca sob baixa pressão de vácuo e sob baixa temperatura, conforme descrito acima. A temperatura pré-resfriada da formulação pode ser mantida por meio de condução do calor para fora da formulação, e/ou pela perda de calor latente devido à evaporação da água.
Em uma particular modalidade da invenção, por exemplo, a formulação inclui uma cultura seca concentrada, fresca ou congelada, de bactéria probiótica (viva), em uma solução de 1 a 2,5% de alginato de sódio (preferivelmente, 1,5% de alginato de sódio), 1% a cerca de 5% de inulina (preferivelmente, 2,5% de inulina), 20% a 60% de trealose (preferivelmente, 40% de trealose) e 3% a 15% de hidrolisadode caseína (preferivelmente, 8% de hidrolisado de caseína). A formulação é misturada a vácuo, a uma temperatura ligeiramente acima da temperatura ambiente (tipicamente, entre 25°C- 37°C), até que todos os componentes sejam completamente dissolvidos, 5 Em uma adicional modalidade da invenção, todos os ingredientes são dissolvidos na solução sob elevada temperatura, depois, a pasta fluida é resfriada para uma temperatura entre 0°C e -5°C, e um pó seco de microorganismo vivo é misturado, até que todos os componentes sejam completamente dissolvidos. Para facilitar a mistura de pó de organismo vivo seco e para evitar obstrução, uma pequena quantidade de lOtrealose pode ser adicionada ao pó seco (tipicamente, é suficiente uma mistura contendo porções iguais de pó seco e trealose). A pasta fluida de formulação é espalhada em bandejas, com capacidade de carregamento de cerca de 200 g/ft2 e as bandejas são colocadas em prateleiras em um secador por congelamento. A temperatura da prateleira é ajustada para a faixa de 0 a 15-5°C (preferivelmente, para a temperatura de -2°C), e a pasta fluida é permitida de esfriar sob essa temperatura. A pressão de vácuo é então aplicada na faixa de 1 a 5 Torr (preferivelmente, 3 Torr), e a temperatura de prateleira é aumentada para a faixa de 20°C a 45°C (preferivelmente, 30°C), para transferência de calor por condução. A temperatura da formulação permaneceu na faixa de temperatura de 0 a -5UC durante a 20etãpa de evaporação primária, para evitar o congelamento da amostra. A etapa de secagem secundária teve um vácuo máximo de 0,1 Torr, e a temperatura da prateleira de 40°C tem início quando a temperatura do produto alcançou cerca de +10°C. Todo o processo de secagem prossegue por cerca de 4 horas, em cujo tempo o produto é colhido e a atividade da água, Aw, tem o valor de 0,3 ou menos. 25 Em outra modalidade da invenção, as bandejas carregadas são pré- resfriadas à temperatura de -2°C em um ambiente frio, depois, imediatamente carregadas em um secador de forno a vácuo, para transferência de calor radiante. As etapas de secagem primária e secundária são então aplicadas conforme descrito acima, para transferência de calor por condução. 30
Preparação da Formulação
As formulações da invenção podem incluir microorganismos vivos frescos, congelados ou secos, formulados em uma solução ou suspensão, contendo um agente estabilizador e um agenteprotetor. O agente estabilizador da”formulaçãõ~e/õu a alta concentração do agente protetor podem ser dissolvidas em uma solução aquosa aquecida, com agitação antes do resfriamento e mistura com os microorganismos bioativos. Os microorganismos, tais como, vírus ou bactéria cultivados, podem ser 5concentrados e separados do meio de cultura por meio de centrifugação ou filtração, depois, diretamente misturados dentro da formulação da presente invenção, ou adicionados com convencionais crioprotetores gotejados dentro de nitrogênio líquido, e os pequenos grânulos congelados, armazenados à temperatura de -80C, até completar a mistura dentro da formulação. Altemativamente, os grânulos congelados podem ser lOsecos por congelamento, moídos na forma de um pó fino, embalados em sacos herméticos ao ar e refrigerados até se realizar a mistura na formulação da invenção. Em uma modalidade da presente invenção, a totalidade de água na formulação é provida no líquido do organismo vivo concentrado, e a suspensão de organismo vivo é mantida a uma temperatura ligeiramenle acima da temperatura ambiente. Os componentes secos do 15agente estabilizador e do agente protetor da formulação são misturados e depois .lentamente adicionados à suspensão aquecida do organismo vivo. A suspensão da formulação é suavemente agitada sob vácuo moderado, em um misturador planetário, até que todos os componentes sejam completamente dispersos e que seja obtida uma pasta fluida uniforme.
Em outra modalidade da presente invenção, o microorganismo bioativo se apresenta na forma de pó seco, sendo pré-misturado seco com os ingredientes da formulação, antes de a resultante mistura seca ser adicionada à água, a uma temperatura ligeiramente acima da temperatura ambiente. O microorganismo ou material bioativo pode proporcionar qualquer 25bioatividade, tal como, atividade enzimática, indução de respostas imunes, multiplicação celular, infecção, inibição do crescimento celular, estimulação do crescimento celular, efeitos terapêuticos, efeitos farmacológicos, efeitos antimicrobianos, e/ou efeitos similares. O microorganismo ou material bioativo pode se constituir de células mortas ou de lipossomos, úteis como vacinas ou veículos de 301iberação para agentes terapêuticos. O microorganismo bioativo da invenção pode ser um vírus vivo e vírus vivo atenuado e/ou similar.
Os agentes estabilizadores de formulação proporcionam estabilidade estrutural para a formulação e/ou benefícios protetores físicos e químicos para os microorganismos bioativos. Os agentes estabilizadores podem proporcionar^vfscõsidade de espessamento para a formulação e um melhor controle com relação às propriedades de expansão da mesma sob pressão de vácuo, e aumento da resistência estrutural para as composições de formulação seca da invenção. 5 Os agentes protetores podem incluir uma variedade de proteínas, hidrolisados de proteína, açúcares, alcoóis de açúcar e aminoácidos. Assim, por exemplo, açúcares, tais como, sacarose e trealose podem fisicamente envolver o material bioativo, para promover a retenção da estrutura molecular em todo o processo de secagem, e vincular rigidez estrutural à matriz amorfa no estado seco. O agente protetor lOpode substituir a água de hidratação perdida durante a secagem, para evitar danos às membranas das células e desnaturação das enzimas. Outras funções dos agentes protetores podem incluir a proteção do material bioativo da exposição a danos causados pela luz, oxigênio, agentes oxidantes e umidade. A maioria dos agentes protetores pode ser facilmente dissolvida numa solução, em quantidades que variam de cerca de 0,1% 15em peso, a cerca de 60% em peso. Pré-resfriamento da Formulação
As formulações da invenção podem ser pré-resfriadas antes da aplicação de pressão de vácuo do processo de secagem, para proporcionar benefícios, tais como, 20adicional espessamento da pasta fluida de formulação, melhor controle com relação à expansão das formulações sob baixa pressão de vácuo, estabilização do microorganismo ou material bioativo e/ou intensificação da penetração dos constituintes da formulação através das membranas das células. O resfriamento pode ser aplicado por meio de qualquer técnica apropriada conhecida na técnica. Assim, por exemplo, o resfriamento 25pode ser por contato e condução com superfícies frias, perda de calor latente e/ou meios similares. Tipicamente, as formulações são mantidas em vasos ou espalhadas em bandejas metálicas, sendo colocadas em contato com uma superfície de temperatura controlada, ou uma câmara onde as bandejas entram em equilíbrio com a temperatura controlada. Tipicamente, as formulações da invenção podem ser pré-resfriadas a uma 30temperatu.ra acima de sua temperatura de congelamento (por exemplo, entre -5°C e +5°C).
Secagem Primária da Formulação
Processos típicos para conservação de microorganismos“bioativos, tais como, organismos vivos ou atenuados, incluem uma combinação de congelamento e condições de vácuo, o que pode resultar em danos à membrana e desnaturação dos constituintes de células. O estado da técnica ensina o uso de altas pressões de vácuo 5(por exemplo, inferiores a 100 Torr), adição de específicos agentes crioprotetores, etapas de concentração para obtenção de soluções espessas (xarope), e/ou temperaturas iniciais mais altas para evitar o congelamento. O uso de formulações e parâmetros de processo da presente invenção supera essas limitações e permite uma maior capacidade de carga por área de secagem, o que significativamente melhora a produção industrial. 10 A formulação na presente invenção é seca por evaporação. A remoção do solvente (umidade) do ambiente gasoso em torno da formulação pode ser proporcionada por meio de condensação ou dessecação. A evaporação do solvente da formulação pode proporcionar uma acelerada secagem primária da dita formulação, sob baixa pressão de vácuo. A expansão controlada da formulação acelera a secagem primária da formulação 15mediante rápida transferência do solvente para fora da formulação. A expansão controlada da formulação é obtida por meio de suave desgaseificação (sem ebulição) dos gases restantes dissolvidos, quando a secagem por vácuo é aplicada. Uma vez que é desejável não ferver ou excessivamente espumar a formulação, pelo fato das cavitações e forças de cisalhamento associadas com a formação de bolhas durante a ebulição, e/ou 20pelo fato da formulação poder entornar do elemento de confinamento ou ter um impacto negativo sobre o microorganismo bioativo. Na medida em que a secagem primária prossegue, a estrutura da formulação é estabilizada. O calor suprido na câmara de secagem compensa a perda de calor latente causada pela evaporação do solvente, e a temperatura da formulação é 25mantida 10°C acima de temperatura de congelamento. Em algum ponto durante o processo de secagem primária, a velocidade de evaporação do solvente diminui e a temperatura da formulação começa a aumentar, devido ao fornecimento supérfluo de calor na câmara de secagem. Esse ponto indica o final da etapa de secagem primária na presente invenção. Como o solvente é direcionado para fora da formulação, os agentes 3üprotetores na solução se tornam concentrados e mais espessos, até a solução parar de circular na forma líquida. A formulação amorfa e/ou vitrificada conserva uma estrutura de formulação estável. Secagem Secundária
A secagem secundária da formulação estruturalmente estável remove a umidade restante retida ou ligada e proporciona uma composição que é estável em armazenamento por um prolongado período de tempo, sob temperaturas ambientes. A 5secagem secundária envolve a aplicação de elevadas temperaturas e um forte vácuo por diversas horas ou dias. Nas modalidades preferidas, o período de tempo necessário para completar a etapa de secagem secundária é o dobro do tempo da etapa de secagem primária. Preferivelmente, a atividade da água (Aw) da formulação, ao final da etapa de lOsecagem secundária é inferior a 0,3. A temperatura de secagem pode variar da temperatura ambiente a cerca de 70°C. Um processo típico de secagem secundária para a maioria de microorganismos bioativos pode incluir a elevação da temperatura de cerca de 30°C para cerca de 40°C, mantendo essa temperatura de cerca de 30 minutos a cerca de 24 horas (preferivelmente, de cerca de 30 minutos a cerca de 4 horas), de modo a 15proporcionar uma composição de formulação seca estável, com atividade da água (Aw) inferior a 0,3. Em uma particular modalidade da secagem secundária, a temperatura de secagem é lentamente elevada das condições de secagem primária, a uma velocidade que pode ainda preservar a atividade dos materiais biológicos vivos, tais como, os microorganismos vivos. Um forte vácuo pode ser provido no processo de secagem 20secundária, para acelerar a velocidade de remoção da água, de modo a diminuir os níveis de umidade residual. O vácuo durante a secagem secundária pode ser inferior a 1 Torr, preferivelmente, inferior a cerca de 0,2 Torr. Os métodos de secagem da invenção resultam em um microorganismo biologicamente ativo ou material bioativo, o qual é incluído dentro de uma matriz 25vitrificada amorfa, desse modo, impedindo o desenvolvimento de proteínas e significativamente retardando as interações moleculares ou reatividade cruzada, devido à mobilidade acentuadamente reduzida do composto e de outras moléculas dentro da composição vitrificada amorfa. Na medida em que o sólido amorfo está a uma temperatura abaixo de sua temperatura de transição vítrea, e a umidade residual 30permanece relativamente baixa (isto é, atividade da água (Aw) inferior a 0,3), o microorganismo bioativo instável pode permanecer relativamente estável. Deve ser observado que a obtenção de um estado vítreo não é um pré-requisito para uma longa estabilidade, como alguns microorganismos ou materiais bioativos podem mêlEór fazer em um estado mais cristalino. Preparação de Pó Seco
A formulação seca pode ser usada em blocos, cortada em formatos e tamanhos desejados, ou esmagada e moída, formando um pó de circulação livre que proporciona fácil processamento posterior, tal como, aglomeração úmida ou seca, granulação, formação de comprimidos, compactação, formação de péletes, ou qualquer outro tipo de processo de liberação. Os processos de esmagamento, trituração, moagem lOou pulverização, são bem conhecidos na técnica. Assim, por exemplo, um moinho de martelo, um moinho de impacto, um moinho de jato, um moinho de pino, um moinho tipo Wiley ou dispositivo de moagem similar, podem ser usados. O tamanho de partícula preferido é inferior a cerca de 1000 μm, preferivelmente, inferior a 500 μm. As composições e métodos aqui descritos preservam a atividade biológica 15do microorganismo biologicamente ativo ou materiais bioativos encapsulados. Assim, por exemplo, as composições são testadas com relação à estabilidade, através da submissão das mesmas a uma elevada temperatura (por exemplo, 40°C) e alta umidade relativa (por exemplo, 33%), e medindo a atividade biológica das formulações. Como um exemplo, no caso de bactéria probiótica (viva), o resultado dos estudos demonstra 20que a bactéria formulada nessas formulações é estável, pelo menos, por 60 dias (ver a figura 1). A estabilidade é definida como o tempo para perda de concentração de um log CFLJ/g. Essas formulações são estáveis mesmo quando são usadas altas concentrações do material biologicamente ativo. Assim, essas formulações são vantajosas pelo fato de que podem ser despachadas e armazenadas sob temperatura ambiente ou acima, de tal 25temperatura, por longos períodos de tempo.
Exemplos
Os exemplos seguintes são apresentados para ilustrar, sem limitar, a invenção reivindicada.
Exemplo 1
- Preparação de Formulação Pré-misturada Seca. Diversas pré-misturas de formulação foram preparadas de acordo com a Tabela 1. A trealose foi obtida da Cargill Minneapolis, MN. O isolado de proteína de soja foi obtido da Fearn Natural Foods, Mequon, WI. O concentrado de proteína de soja foi obtido da Agri-Mark Inc., Middlebury, VT. O lisato de hidro-caseína foi obtido da 5Marcor, Carlstadt, NJf e o alginato de sódio, da ISP Corp., Wayne, NJ. Todos os ingredientes foram combinados e uniforme mente misturados (Tabela 1).
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Exemplo 2
- Pó seco estável contendo bactéria probiótica. Lactobacillus Acidophilus (100g de concentrado congelado, de uma cultura de fermentação de laboratório) foi descongelado à temperatura de 37()C. Uma 15pré-mistura de hidrolisado de proteína (100 g, Tabela 1), foi lentamente adicionada à pasta fluida descongelada de bactéria probiótica em um misturador planetário de camisa dupla (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA)- A mistura foi realizada sob vácuo moderado (25 Torr), a uma velocidade de 40 rpm, temperatura de 37°C, durante 10 minutos. A pasta fluida homogênea foi uniformemente espalhada sobre uma bandeja, 20com uma capacidade de carga de 200 g/ft2 e a bandeja foi colocada em uma prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A temperatura da prateleira foi estabelecida acima da temperatura de congelamento da pasta fluida, a -5°C para resfriamento, mas, para não congelamento da pasta. Uma pressão de vácuo (3 Torr) foi aplicada quando a temperatura da formulação alcançou cerca de -1°C. A pasta fluida 25começou suavemente a desgaseifícar. quando o vácuo atingiu cerca de 7 Ton. Quando o vácuo alcançou 3 Torr, a temperatura da prateleira foi aumentadarpara 50°C. A temperatura da formulação permaneceu na faixa de aproximadamente -1°C a cerca de +5°C durante os primeiros 50 minutos da etapa de secagem primária. Tão logo a temperatura da formulação aumentou para + 10QC, a etapa de secagem secundária foi 5iniciada. Um vácuo máximo de 0,1 Torr foi aplicado, enquanto a temperatura da prateleira continuou a se manter em 50°C. A etapa de secagem secundária continuou por mais 100 minutos, em cujo instante o processo de secagem foi encerrado, e a formulação seca removida do secador por congelamento. A atividade da água (Aw) da formulação seca nesse instante foi de 0,23, medida pelo instrumento Hygropalm Awl (Rotonic lOInstrument Corp., Huntington, NY.). As perdas de viabilidade durante os processos de formulação, preparação e secagem são apresentadas na figura 9. As perdas de viabilidade durante a preparação da formulação foram de 0,26 logs e 0,34 logs durante o processo de secagem, para uma perda cumulativa total de 0,6 logs. 15 A figura 10 mostra a estabilidade ao armazenamento da formulação seca sob condições aceleradas de armazenamento, com temperatura de 37°C e umidade relativa de 33%. Após 4 semanas nessas condições de armazenamento, a perda de viabilidade da bactéria probiótica estabilizada na formulação da invenção foi de apenas 0,8 logs. 20
Exemplo 3
- Preparação de uma Formulação de Hidrogel. Uma pasta fluida concentrada de material probiótico foi preparada de acordo com o exemplo 2, mas, usando a pré-mistura de proteína de soro de leite indicada 25na Tabela 1. A essa pasta, foram adicionadas 0,5 g de fosfato de cálcio dibásico, seguido de 0,5 g de gliconolactona. A pasta fluida foi deixada endurecer à temperatura ambiente durante as duas boras seguintes, de modo a formar um hidrogel sólido. O gel consistente foi fatiado em fibras finas e longas, usando um dispositivo fatiador/desfibrador comercialmente disponível. As fibras finas foram dispostas uma bandeja, com uma 30capacidade de carga de 200g/ft2, e colocadas em um secador por congelamento para secagem, conforme descrito no Exemplo 2. Quatro horas depois de ter se estabelecido um vácuo máximo de 0,1 Torr, o produto seco foi retirado do secador por congelamento. A atividade da água (Aw) da formulação foi de 0,05 (medida pelo instrumento li I  HygroPalm Awly Rotonic Huntington, -NY); A formulação seca for pO3teriórmente moída para a forma de um pó fino, usando um equipamento de moagem tipo martelo padrão, e peneirada através de peneiras de 50-250 microns. A figura 11 apresenta um fluxograma do método de produção de formulação seca estável, a partir de uma 5formulação de hidrogel, de acordo com a invenção.
Exemplo 4
- Preparação de alimento para animal de estimação, a partir de material probiótico. Um alimento para animal de estimação granulado comercialmente lOdispomvel é seco em um forno de convecção, para proporcionar uma atividade de água de 0,1, e depois revestido com a formulação probiótica seca estável, preparada conforme descrito no Exemplo 3. Os grânulos secos são pulverizados com cerca de 5% de uma barreira de umidade à base de gordura (uma mistura de 40% de gordura de galinha, 40% de manteiga de cacau, e 20% de cera de abelha), e misturados em uma báscula de tambor 15com a formulação de pó seco (normalmente, 0,1-0,5% total do alimento de animal de estimação, que proporciona uma dosagem de 10.sup.8 CFU/g) e, finalmente, pulverizados com uma adicional cobertura da barreira de umidade à base de gordura. A quantidade total de revestimento é de cerca de 15% (do alimento de animal de estimação). O tempo de revestimento é de cerca de 30 minutos. 20
Exemplo 5
- Preparação de ração de peixe com diversos microorganismos probióticos. A alimentação granulada para peixes de acordo com a presente invenção foi preparada com uma mistura de diversos materiais probióticos. Uma formulação de 25material probiótico seca e estável, contendo uma mistura de L. rhamnosus, L. acidophilus e Bifidobacterium lactis, foi preparada conforme descrito no Exemplo 2, Uma ração de partida para salmão comercialmente disponível (Zeigler Bros., Gardners, PA) foi primeiramente seca em um forno de convecção, proporcionando uma atividade de água de 0,1, depois, revestida coro a formulação probiótica em uma báscula de 30tambor. Os grânulos (100 g) foram inicialmente pulverizados com cerca de 5% em peso de uma barreira de umidade à base de gordura (uma mistura de 40% de óleo de peixe, 40% de manteiga de cacau, e 20% de cera de abelha), depois, misturados com lg da formulação probiótica seca estável (tendo uma dosagem de 107 CFU/g de ração) e, finalmente pulverizados com adicional cobertura da barreira de umidade à base de gordura. A quantidade total de revestimento foi de cerca de 10% de ração de peixe.
Exemplo 6
- Fórmula infantil contendo a formulação seca da presente invenção. Uma formulação seca estável contendo Lactobacillus GG (Valio Corp, Finlândia) é preparada de acordo com o Exemplo 2, seguido de peneiramento em dois grupos de tamanho de partícula (acima de 50 μm e abaixo de 150 μm). Uma fórmula infantil é preparada mediante mistura de 99 g de Nutramigen (Mead Johnson; lOEvansville, IL), com 0,1 g de partículas de pequeno tamanho (abaixo de 50 μm). O produto final contém cerca de 10 CFU de Lactobacillus GG por 100 g da fórmula infantil.
Exemplo 7
- Pó seco estável contendo uma enzima. Uma fórmula de hidrogel contendo 40% em peso de Savinase (Novozymes, Dinamarca) é preparada mediante mistura sob vácuo moderado, de 60 g de uma pré-mistura de formulação de hidrolisado de proteína (Tabela 1) e 40 g de Savinase, em 100 g de solução aquosa. A formulação umedecida é seca em um forno a vácuo, a 20uma temperatura de secagem de 50l,C. Para determinação da carga e estabilidade ao armazenamento da fórmula seca é feito o seguinte procedimento: a amostra seca é precisamente pesada (uma quantidade <100 mg) em um tubo de micro-centrifugação. Em seguida, são adicionados 200 μl de sulfóxido de dimetila (DMSO). A formulação é dissolvida no tampão de DMSO através de turbilhonamento. A essa amostra, são 25adicionados 0,8 mL de uma solução contendo NaOH 0,05N, SDS a 0,5%, e ácido cítrico 0,075M (sal trissódico). Os tubos são sonicados durante 10 minutos à temperatura de 45°C, seguido de uma breve centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos. Frações da solução transparente de DMSO/NaOH/SDS/Citrato são retiradas de dentro dos poços de uma microplaca e analisadas quanto ao teor de proteína, usando o método de ensaio de 30Bradford. A estabilidade ao armazenamento da formulação de enzima estável é significativamente mais alta que a de uma enzima seca sem a formulação da presente invenção.
Exemplo 8-
- Pó seco estável contendo vitamina A. Uma fórmula de hidrogel contendo 50% em peso de vitamina A (BASF Corp., Florham Park, NJ) é preparada mediante mistura, sob um vácuo de 25 Torr, de 50 5g de uma pré-mistura de formulação de proteína de soja (Tabela 1) e 50 g de pó de vitamina A, em 100 g de solução aquosa. A formulação umedecida é pré-resfriada para a temperatura de -5°C, depois, pulverizada em bandejas com uma capacidade de carga de 200g/ft2 e seca em um forno a vácuo, com uma pressão inicial de vácuo de 3 Torr e temperatura de 70r'C, seguido de uma etapa de vácuo máximo de 0,2 Torr, à temperatura 10de 70°C, uma vez a temperatura de formulação tenha alcançado a temperatura de 5°C.
Exemplo 9
- Preparação de isca de espécie invasiva. Isca granulada para espécie invasiva especificamente almejada, de acordo 15com a presente invenção é preparada contendo um pesticida. A pré-mistura de proteína de soro de leite indicada na Tabela 1. é adicionada a 200 g de água. A essa solução se adicionam 90 g de rotenona e 0,5 g de fosfato de cálcio dibásico, seguido de 0,5 g de gliconolactona. A pasta fluida é deixada endurecer à temperatura ambiente durante 2 horas. O gel consistente é fatiado em fibras finas e longas através de um dispositivo 20fatiador/desfibrador. As fibras finas são dispostas em uma bandeja e colocadas em um secador de forno a vácuo. A secagem é interrompida após se obter uma atividade de água de 0,10. A formulação seca é moída com uma apropriada distribuição de tamanho de partícula, de acordo com a especificação de tamanho da isca, para as específicas espécies almejadas. 25
Exemplo 10
- Preparação de um pesticida protegido em uma formulação solúvel em água. Uma formulação granular solúvel protegida de um pesticida, que caso contrário seria sujeita à decomposição por outros ingredientes na formulação durante o 30armazenamento, é preparada pelo processo da presente invenção. A pré-mistura de proteína de soja indicada na Tabela 1 é adicionada a 200 g de água. A essa solução são adicionadas 80 g de uma formulação seca, de um pesticida sensível formulado. A pasta fluida é transferida para um secador de forno a vácuo e seca, para apresentar uma atividade de água de 0,1. A formulação seca é moída no desejado tamanho desarticula e embalada.
Exemplo 11
- Preparação de um pesticida protegido em uma formulação insolúvel em água. Uma formulação granular insolúvel protegida de um pesticida, que caso contrário seria sujeita à decomposição por outros ingredientes na formulação durante o armazenamento, é preparada mediante a formulação e o método da presente invenção. A pré-mistura de proteína de soja indicada na Tabela 1 é adicionada a 200 g de água. A lOessa solução se adicionam 90 g de uma formulação seca de um pesticida sensível e 0,5 g de fosfato de cálcio dibásico, seguido de 0,55 g de gliconolactona. A pasta fluida é deixada endurecer à temperatura ambiente durante 2 horas, depois, é fatiada em fibras finas e longas através de um dispositivo fatiador/desfibrador. As fibras finas são colocadas em bandejas e secas em um secador de forno a vácuo, para apresentar uma 15atividade de água de 0,1. A formulação seca é posteriormente moída na desejada distribuição de tamanho de partícula e embalada.
Exemplo 12
Dez (10) gramas de Lactobacillus Rhamnosus GG seco são misturadas 20com 100 g de uma pré-mistura de hidrolisado de proteína indicada no Exemplo 1 (Tabela 1). Essa mistura seca é lentamente adicionada a 100 g de água deionizada, à temperatura de 35°C, em um misturador planetário de camisa dupla, onde é misturada por 10 minutos a uma velocidade do misturador de 40 rpm. A pasta fluida homogênea é uniformemente espalhada em uma bandeja com uma capacidade de carga de 100 g/ft2, e 25a bandeja é colocada numa prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A temperatura da prateleira é estabelecida em 5°C para esfriar a pasta. Vácuo é aplicado para reduzir a pressão para 3 Torr, em cujo instante a temperatura da prateleira é elevada para 30nC. Após 2 horas, a pressão é reduzida mais ainda para 150 milliTorr, com a temperatura da prateleira sendo ainda mantida a 30°C. A 30secagem é continuada por mais 3 horas, em cujo instante a temperatura do produto foi elevada de 2°C em relação à temperatura da prateleira. O produto seco é então removido do secador por congelamento e a atividade da água da formulação seca é medida nesse instante por um instrumento Hygropalm Awl. As perdas de viabilidade durante os 31/38 processos de formulação, preparação e secagem são medidas^eTegistfãdãsrXrteste de estabilidade ao armazenamento da formulação seca é conduzido sob aceleradas condições de armazenamento, com temperatura de 32°C e umidade relativa de 20%. Os resultados para o experimento à temperatura de 30°C, com repetição 5também à temperatura de 40°C são mostrados abaixo. 30nC 40°C
Figure img0002
Exemplo .13
Vinte (20) gramas de Lactobacillus Rhamnosus GG seco são misturadas com 100 g de uma pré-mistura de proteína de soro de leite indicada no Exemplo 1. Essa lOmistura seca é lentamente adicionada a 100 g de água deionizada, à temperatura de 35°C, em um misturador planetário de camisa dupla, onde é misturada por 10 minutos a uma velocidade do misturador de 40 rpm. A pasta fluida homogênea é uniformemente espalhada em uma bandeja com uma capacidade de carga de 100 g/ft2, e a bandeja é colocada numa prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Vir tis, 15Gardiner. NY). A temperatura da prateleira é estabelecida em 5°Ç para esfriar a pasta.
Vácuo é aplicado para reduzir a pressão para 3 Torr, em cujo instante a temperatura da prateleira é elevada para 30°C. Após 2 horas, a pressão é reduzida mais ainda para 150 milliTorr, com a temperatura da prateleira sendo ainda mantida a 30üC. A secagem é continuada por mais 3 horas, em cujo instante a temperatura do produto foi elevada de 202°C em relação à temperatura da prateleira. O produto seco é então removido do secador por congelamento e a atividade da água da formulação seca é medida nesse instante por um instrumento Hygropalm Awl. As perdas de viabilidade durante os processos de formulação, preparação e secagem são medidas e registradas.
O teste de estabilidade ao armazenamento da formulação seca é 25conduzido sob condições aceleradas de armazenamento, com temperatura de 32°C e umidade relativa de 20%.
Os resultados para o experimento à temperatura de 30°C, com repetição também à temperatura de 40°C são mostrados abaixo. 30°C 40°C
Figure img0003
Figure img0004
Exemplo 14 Dez (10) gramas de Lactobacillus acidophilis seco são misturadas com 10 g de trealose e rapidamente separadas, enquanto 65,3 g de trealose, 3 g de alginato de 5sódio, 5 g. de inulina e 16,7 g de hidrolisado de soro de leite são misturadas na forma de um pó seco e lentamente adicionadas a 100 g de água deionizada, à temperatura de 35°C, em um misturador planetário de camisa dupla, onde são misturadas durante 5 minutos à velocidade de 40 rpm. A essa pasta fluida se adiciona a pré-mistura seca de Lactobacillus acidophilis e- trealose, a mistura sendo continuada por mais 5 minutos à lOtemperalura de 35°C. A pasta fluida homogênea é uniformemente espalhada em uma bandeja com uma capacidade de carga de 100 g/ft2, e a bandeja é colocada numa prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A temperatura da prateleira é estabelecida em 5°C para esfriar a pasta. Vácuo é aplicado para reduzir a pressão para 3 Torr, em cujo instante a temperatura da prateleira é elevada 15para 30°C. Após 2 horas, a pressão é reduzida mais ainda para 150 milliTorr, com a temperatura da prateleira sendo ainda mantida a 30°C. A secagem é continuada por mais 3 horas, em cujo instante a temperatura do produto foi elevada de 2°C em relação à temperatura da prateleira. O produto seco é removido do secador por congelamento e a atividade da água da formulação seca é medida nesse instante, usando um instrumento 20Hygropalm Awl. As perdas de viabilidade durante os processos de formulação, preparação e secagem são medidas e registradas, O teste de estabilidade ao armazenamento da formulação seca é conduzido sob condições aceleradas de armazenamento, com temperatura de 32°C e umidade relativa de 20%. Os resultados para um experimento em que o secador é mantido à temperatura de 30°C, comparados 25com aqueles em que o secador é mantido à temperatura de 50°C, são mostrados na Tabela abaixo.
Figure img0005
Exemplo 15
Dez (10) gramas de Lactobacillus acidophilis seco são misturadas com 10 5g de trealose e rapidamente separadas, enquanto 65,3 g de trealose, 3 g de alginato de sódio, 5 g de inulina e 16,7 g de hidrolisado de soro de leite são misturadas na forma de um pó seco e lentamente adicionadas a 100 g de água deionizada, à temperatura de 50°C, em um misturador planetário de camisa dupla, onde são misturadas durante 5 minutos à velocidade de 40 rpm. A pasta fluida é resfriada para a temperatura de 4°C. A essa pasta lOfluida resfriada se adiciona a pré-mistura de Lactobacillus acidophilis e trealose, a mistura sendo continuada por mais 5 minutos à temperatura de 4°C. A pasta fluida homogênea é uniformemente espalhada em uma bandeja com uma capacidade de carga de 100 g/ft2, e a bandeja é colocada numa prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A temperatura da prateleira é estabelecida em 155CC para manter a temperatura da pasta fluida fria. Vácuo é aplicado para reduzir a pressão para 3 Torr, em cujo instante a temperatura da prateleira é elevada para 30°C. Após 2 horas, a pressão é reduzida mais ainda para 150 milliTorr, com a temperatura da prateleira sendo ainda mantida a 30°C. A secagem é continuada por mais 3 horas, em cujo instante a temperatura do produto foi elevada de 2°C em relação à temperatura da 20prateleira. O produto seco é removido do secador por congelamento. A atividade da água da formulação seca nesse instante é Aw = 0,23, medida por um instrumento Hygropalm Awl. As perdas de viabilidade durante os processos de formulação, preparação e secagem totalizam 0,6 logs.
Exemplo 16
Cem (100) gramas de uma pré-mistura de soja são lentamente adicionadas a 100 g de água deionizada, à temperatura de 35°C, em um misturador planetário de camisa dupla, onde são misturadas durante 10 minutos à velocidade de 40 rpm. Dez (10) gramas de Bifidobacterium lactis Bb-12 seco são adicionadas lentamente 30sob mistura a 20 rpm, e a pasta fluida é misturada por mais 5 minutos. A pasta fluida homogênea é uniformemente espalhada em uma bandeja com uma capacidade de carga de 100 g/ft2, e a bandeja é colocada numa prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A temperatura da prateleira é estabelecida em 5°C para esfriar a pasta fluida. Vácuo é aplicado para reduzir- a pressão para 3 Torr, em 5cujo instante a temperatura da prateleira é elevada para 30°C. Após 2 horas, a pressão é reduzida mais ainda para 150 milliTorr, com a temperatura da prateleira sendo ainda mantida a 30°C. A secagem é continuada por mais 3 horas, em cujo instante a temperatura do produto foi elevada de 2°C em relação à temperatura da prateleira. O produto seco é removido do secador por congelamento e a atividade da água da lOformulação seca nesse instante é Aw = 0,26, medida por um instrumento Hygropalm Awl. As perdas de viabilidade durante os processos de formulação, preparação c secagem totalizam 0,7 logs. O teste de estabilidade ao armazenamento da formulação seca sob condições aceleradas de armazenamento, com temperatura de 32°C e umidade relativa de 1520%, mostra uma perda de viabilidade da bactéria probiótica estabilizada na formulação da invenção de apenas 0,7 logs após quatro semanas.
Exemplo 17
Os mesmos parâmetros do Exemplo 1, exceto a mistura feita no 20misturador Ross, com 25 polegadas de vácuo, proporciona uma densidade de pasta fluida de 1,2 g/cm\ A atividade da água da formulação seca nesse instante é Aw = 0,26, medida pelo instrumento Hygropalm Awl. As perdas de viabilidade durante os processos de formulação, preparação e secagem totalizam 0,5 logs,
O teste de estabilidade ao armazenamento da formulação seca sob 25condições aceleradas de armazenamento, com temperatura de 32°C e umidade relativa de 20%, mostra uma perda de viabilidade da bactéria probiótica estabilizada na formulação da invenção de apenas 0,7 logs após quatro semanas.
Exemplo 18
30 Cem (100) gramas de um concentrado líquido fresco da bactéria LGG (contendo 10% de sólidos e o restante de água) são adicionadas em misturador planetário de camisa dupla, aquecido à temperatura de 35°C. A essa mistura são lentamente adicionadas 100 g de uma pré-mistura de soro de leite (Tabela 1). A pasta fluida resultante é misturada durante 10 minutos a uma velocidade do misturador de 40 rpm. A pasta fluida homogênea é uniformementè espalhada em uma bandeja com uma capacidade de carga de 100 g/ft , e a bandeja é colocada numa prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A temperatura da prateleira é 5estabelecida em 5°C para esfriar a pasta fluida. Vácuo é aplicado para reduzir a pressão para 3 Torr, em cujo instante a temperatura da prateleira é elevada para 30°C. Após 2 horas, a pressão é reduzida mais ainda para 150 milliTorr, com a temperatura da prateleira sendo ainda mantida a 30“C. A secagem é continuada por mais 3 horas, em cujo instante a temperatura do produto foi elevada de 2°C em relação à temperatura da lOprateleira. O produto seco é removido do secador por congelamento. A atividade da água da formulação seca nesse instante é Aw = 0,25, medida por um instrumento Hygropalm Awl. As perdas de viabilidade durante os processos de formulação, preparação e secagem totalizam 0,5 logs. O teste de estabilidade ao armazenamento da formulação seca sob condições aceleradas de armazenamento, com temperatura de 32°C e umidade 15relativa de 20%, mostra uma perda de viabilidade da bactéria probiótica estabilizada na formulação da invenção de apenas 0,4 logs após quatro semanas.
Exemplo 19
Cem (100) gramas de um concentrado congelado de Lactobacillus IGRhamnosus GG (LGG) ainda congelada e 100 g de uma pé-mistura de hidrolisado de proteína foram adicionadas a um misturador planetário de camisa dupla (DPM, Ipt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA), Esse processo pode também ser feito mediante inicial descongelamento do concentrado congelado. A mistura foi realizada a 40 rpm e temperatura de 37°C, durante 10 minutos. A pasta fluida homogênea teve a viscosidade 25medida (através de viscosímetro Brookfield, Modelo No. LVDVE 115, Brookfield Engineering Laboratories, Inc.), depois, foi uniformemente espalhada em uma bandeja com uma capacidade de carga de 100 g/ft'. Os parâmetros de viscosidade para faixas de alta viscosidade foram: amostra de 300 g em um béquer Pyrex® de 400 mL, temperatura de 33-37°C, Fuso #64, velocidade de 1,0 rpm, operado sem caneleira. A bandeja foi 30depois introduzida em um refrigerador a uma temperatura de -4°C, para resfriamento durante 30 minutos. Após resfriamento, a secagem foi iniciada usando um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY), com uma temperatura de prateleira estabelecida em 30°C, com pressão de 2800 milliTorr durante pelo menos 2 horas e meia. Depois de pelo menos 2 horas e meia, a pressão foi diminuída para 100 milliTorr durante, pelo menos, mais 2 horas e meia. Esse experimento foi repetido com duas diferentes bateladas de LGG fermentada, incluindo a lavagem de uma batelada com 3% de DMV e reconstituição com água deionizada, antes da adição da pré-mistura de 5 hid rol is ado.
Figure img0006
Os parâmetros de viscosidade para as faixas de viscosidade média foram:
Figure img0007
ExeInpLQ 20
Cem (100) gramas de um concentrado congelado de Lactobacil/l.Ls Rhamnosu.s GG (LGG) foram descoiígekdas à temperatura de 37"C e adicionadas a um misturador plane'tário de camisa dupla (DPM, lpt, Ross Engineering, Inc., Savannah, 1'5GA). A este, foram adicionadas 100 g de uma pré-mistura de hidrolisado de protema. Um coneen.trado congelado, ainda congdado, .pode tan]béIrL ser usado. A mistura foi realizada a uma velocidade de 40 rpm e temperatura de 3'7°C, durante 1() minutos, depois, a pasta fluida foi unifòrmemente espalhada em bandejas com uma capacidade de carga de 100 g/h'. As bandejas foram depois introduzidas em um refrigerador a uma 20temperatura de -4°C, para resfriamento durante 30 minutos. Após reshiamento, a secagem foi iniciada usando um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY), coin uma temperatura de prateleira estabe.le'cida em 30'C, com pressão de 2800 tnilliTorr durante pelo menos 2 horas e meia. Depois de pelo menos 2 horas e meia, a pressão foi diminuída para 100 milliTorr durante, pelo menos, mais 2 horas e 25nieia. Este mesmo processo foi aplicado a lO g de material de LGG seco (em pó), que foi misturado em 100 g de iim hidrolisado de prQ'teíha. Essa mistura seca foi depois lentamente adicionada a 90 g de água deionizada, no misturador planetário de camisa dupla.
Figure img0008
Exemplo 21
Pó seco estável contendo enzima. Quarenta (40) gramas de uma enzima proteolftica (Novozymes, Dinamarca), na forma de um pó seco são misturadas com 60 g de pré-mistura de soja (Tabela 1). Essa mistura seca é lentamente adicionada a 100 g de água deionizada, à lOtemperatura de 35°C, em um misturador planetário de camisa dupla, depois, misturada por 10 minutos a 40 rpm. A pasta fluida homogênea é uniformemente espalhada sobre uma bandeja, com uma capacidade de carga de 100 g/ft2 e a bandeja é colocada em uma prateleira de um secador por congelamento (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A temperatura da prateleira é estabelecida em 5°C para esfriar a pasta fluida. Vácuo é lõaplicado para reduzir a pressão para 3 Torr, em cujo instante a temperatura da prateleira é elevada para 60nC. Após 1 hora, a pressão é reduzida mais ainda para 150 milliTorr, com a temperatura da prateleira sendo ainda mantida a 60°C. A secagem é continuada por mais 1 hora, em cujo instante a temperatura do produto foi elevada de 2°C em relação à temperatura da prateleira. O produto seco é removido do secador por 20congelamento. Para determinação da carga e estabilidade ao armazenamento da fórmula seca, o seguinte procedimento foi realizado: a amostra seca é precisamente pesada (uma quantidade <100 mg) em um tubo de micro-centrifugação e 200 ug de sulfóxido de dimetila (DMSO) são adicionados. A formulação é dissolvida no tampão de DMSO através de turbilhonamento. A essa amostra, são adicionados 0,8 mL de uma solução 25contendo NaOH ü,05N, SDS a 0,5%, e ácido cítrico 0,075M (sal trissódico). Os tubos são sonicados durante 10 minutos à temperatura de 45°C, seguido de uma breve centrifugação a 5000 rpm por 10 minutos. Frações da solução transparente de DMSO/NaOH/SDS/Citrato são retiradas de dentro dos poços de uma microplaca e analisadas quanto ao teor de proteína, usando o método de ensaio de Bradford. A estabilidade ao armazenamento da formulação de enzima estável é significativamente mais alta que a de uma enzima seca sem a formulação da presente invenção.
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Claims (12)

1. Método para preparar uma composição seca estável compreendendo (i) um microrganismo ou material bioativo, (ii) pelo menos dois agentes estabilizadores e (iii) pelo menos dois agentes protetores, o método caracterizado por compreender: (i) misturar, sob vácuo, um microrganismo ou material bioativo, os pelo menos dois agentes estabilizadores e os pelo menos dois agentes protetores em um solvente aquoso; (ii) resfriar a mistura da etapa (i) a uma temperatura acima de sua temperatura de congelamento; (iii) secagem primária da mistura resfriada, através de evaporação a vácuo, a uma temperatura acima de sua temperatura de congelamento; (iv) secagem secundária da mistura, sob vácuo a uma temperatura de 20°C ou mais, por um tempo suficiente para reduzir a atividade de água da mistura para Aw = 0,3 ou menos, em que o microrganismo é selecionado a partir do grupo que consiste em leveduras, fungos e bactérias.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela secagem da mistura ser feita por evaporação.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa de secagem secundária ser iniciada quando a temperatura da mistura é aumentada em pelo menos 10°C acima de sua temperatura inicial de secagem.
4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela mistura seca ser cortada, esmagada, moída ou respectivamente pulverizada em um pó de livre circulação e de tamanho de partícula menor que 1000 μm.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos agentes protetores serem dissolvidos no solvente aquoso para formar uma mistura homogênea, em que a secagem primária da mistura resfriada é sob vácuo em uma faixa de 1 Torr a 5 Torr e a uma temperatura acima de sua temperatura de congelamento, e em que a secagem secundária da mistura é a vácuo de menos de 0,2 Torr.
6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo microrganismo ou material bioativo ser adicionado à solução aquosa após os agentes protetores estarem dissolvidos.
7. Composição seca estável produzida por um método conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por: os pelo menos dois agentes estabilizadores compreenderem alginato de sódio e inulina; os pelo menos dois agentes protetores compreenderem uma mistura de um dissacarídeo e um hidrolisado de proteína; e o microrganismo ou material bioativo ser incorporado em uma matriz vitrificada amorfa.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelos estabilizadores estarem presentes em uma quantidade variando de 1% em peso a 20% em peso.
9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelos agentes protetores serem prontamente solúveis em uma solução e não espessarem ou polimerizarem no contato com água.
10. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo hidrolisado de proteína ser selecionado a partir do grupo que consiste em hidrolisados de soro humano, albumina de soro bovino, albumina de ovo, gelatina, imunoglobulinas, proteína isolada de soja, proteína de trigo, leite em pó desnatado, caseinato, proteína de soro de leite e proteína de ervilha.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pela quantidade total de agentes protetores estar entre 20 e 70% em peso.
12. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ser preparada a partir de uma cultura fresca ou congelada ou seca de bactérias probióticas vivas em uma solução de 1% a 2,5% de alginato de sódio, 1% a 5% de inulina, 20% a 60% de trealose e 3% a 15% de hidrolisado de caseína.
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