CN108633288A - 热稳定性β-葡萄糖醛酸糖苷酶制剂 - Google Patents

热稳定性β-葡萄糖醛酸糖苷酶制剂 Download PDF

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Abstract

本文提供了作为水性或冻干制剂，在高温和低温两者下均表现出长期稳定性的β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶制剂。本发明的制剂包含β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶如突变β‑葡萄糖醛酸糖苷酶酶、两性化合物、L‑组氨酸、β‑丙氨酸和糖。本文还提供了制备所述制剂的方法，以及使用所述制剂水解葡萄糖醛酸苷底物(包括阿片类和苯并二氮杂

Description

热稳定性β-葡萄糖醛酸糖苷酶制剂
背景技术
在哺乳动物中，葡萄糖醛酸苷化是使用UDP葡萄醛酸基转移酶系统使化合物去毒化或失活的主要手段之一。化合物通过葡萄糖醛酸基转移酶系统缀合以形成葡萄糖醛酸苷，其然后在尿液中分泌或者在胆汁中分泌到肠道下段。β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶催化多种β-葡萄糖醛酸苷的水解。考虑到葡萄糖醛酸苷化在化合物的去毒化中的关键作用，BGUS酶已被用于检测身体样本中的药物，例如检测犯罪嫌疑人身体样本中违禁药物的存在。例如，可以通过检测BGUS对葡萄糖醛酸苷形式的药物的水解来测试身体样品中可疑药物的存在。BGUS酶对葡萄糖醛酸的水解促进了通过诸如质谱法的方法对药物的分析，因为这种分析仪器在葡萄糖醛酸的存在下较不敏感。
BGUS酶的市售制备物通常作为水性制剂提供，并且可能在宽的温度范围或延长的时间段内不表现出酶稳定性。因此，需要适合于水性和冻干制剂两者的具有增强的热稳定性的BGUS酶制剂。
发明内容
本发明提供了BGUS酶制剂，其作为液体制剂或冻干制剂在低温(例如低于冰点)和高温(例如高于37℃)下均表现出热稳定性。因此，这些制剂允许冷冻/解冻，同时保持酶活性。此外，本文所述的制剂在升高的温度(＞37℃)下表现出延长的时间(例如大于10天)的酶活性，并且具有低聚集倾向，因此提供长的储存寿命。另外，制剂不含可能在某些类型的分析(例如质谱)中干扰酶的使用的赋形剂，例如洗涤剂和聚合物。因此，本发明的热稳定制剂可用于生物样品(例如尿样)的直接分析，具有最低限度的清除。
基于对氨基酸、糖和盐的大组的分析，已经发现含有两性化合物、氨基酸L-组氨酸和β-丙氨酸以及糖的制剂表现出上文讨论的期望的热稳定性和其他有利性质。因此，在一个方面，本发明涉及包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、两性化合物、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖的制剂。
在一个实施方式中，两性化合物选自甜菜碱一水合物、胆碱盐、甜菜碱盐、6-氨基己酸、5-氨基戊酸和4-氨基丁酸(GABA)。在一个实施方式中，两性化合物是甜菜碱一水合物。在一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以50mM-250mM的浓度存在。在又一个实施方式中，甜菜碱一水合物在制剂中以250mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。
在一个实施方式中，糖选自蔗糖、山梨醇、木糖醇、甘油、2-羟丙基-β-环糊精和α-环糊精。在一个实施方式中，糖是蔗糖。在一个实施方式中，糖在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，糖在制剂中以50mM-500mM的浓度存在。在又一个实施方式中，糖在制剂中以500mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。
在一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以至少50mM的浓度存在。在另一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以50mM-250mM的浓度存在。在又一个实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以250mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。
在一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以至少10mM的浓度存在。在另一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以10mM-50mM的浓度存在。在又一个实施方式中，L-组氨酸在制剂中以50mM的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。
在一个实施方式中，BGUS酶在制剂中是重组BGUS酶。在一个实施方式中，重组BGUS酶是突变BGUS酶。在一个实施方式中，突变BGUS酶是突变大肠杆菌BGUS酶，例如具有SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的酶。本文公开了用于制剂的另外的适合BGUS酶。
在一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以至少1mg/ml的浓度存在。在另一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以1-5mg/ml的浓度存在。在又一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以5mg/ml的浓度存在。本文公开了另外的适合浓度。
在一个实施方式中，制剂不含洗涤剂。在另一个实施方式中，制剂不含聚合物。
在一个实施方式中，制剂是水性制剂。在另一个实施方式中，制剂是冻干制剂。
在一个实施方式中，制剂包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、50mM甜菜碱一水合物、10mM L-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖。在一个实施方式中，该制剂还包含浓度为1mg/ml的具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的BGUS酶。在一个实施方式中，制剂是水性制剂。或者，该制剂可以是冻干制剂。
在一个实施方式中，制剂包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、250mM甜菜碱一水合物、50mM L-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖。在一个实施方式中，该制剂还包含浓度为5mg/ml的具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的BGUS酶。在一个实施方式中，制剂是冻干制剂。或者，该制剂可以是水性制剂。
在另一方面，本发明提供了制备本发明的制剂的方法。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种制备β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂的方法，其包括：
(a)制备包含BGUS酶、两性化合物、L-组氨酸和β-丙氨酸的溶液；和
(b)向步骤(a)中制备的溶液中加入糖。
在一个实施方式中，该方法还进一步包括冻干步骤(b)中制备的溶液。
在又一个方面，本发明涉及在用于酶分析之前待稀释(例如用水)的浓缩BGUS酶制剂，例如冻干制剂。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种包装的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂，其包括容器，所述容器包含含有5mg/ml BGUS酶、250mM甜菜碱一水合物、50mM L-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖的冻干制剂；以及在用于酶分析之前，将所述冻干制剂稀释至1mg/ml BGUS酶、50mM甜菜碱一水合物、10mM L-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖的说明书。
在又一个方面，本发明涉及使用本发明的制剂水解葡萄糖醛酸苷连接的方法，例如在生物样品的药物检测中。因此，在一个方面，本发明涉及一种水解包含葡萄糖醛酸苷连接的底物的方法，所述方法包括在使得所述葡萄糖醛酸苷连接的水解发生的条件下使所述底物与本发明的制剂接触。在一个实施方式中，底物是阿片葡萄糖醛酸苷。本文公开了适合的阿片葡萄糖醛酸苷。在另一个实施方式中，底物是苯并二氮杂葡萄糖醛酸苷。本文公开了适合的苯并二氮杂葡萄糖醛酸苷。在一个实施方式中，底物是在从受试者获得的生物样品中，例如血液、尿液、组织或胎粪。
本文进一步详细描述了本发明的其他特征和方面。
附图说明
图1是与野生型大肠杆菌K12序列(SEQ ID NO:1)相比，K1S(SEQ ID NO:2)、K1T(SEQ ID NO:3)、K3(SEQ ID NO:4)、K3Δ1(SEQ ID NO:5)、K3Δ2(SEQ ID NO:6)和K3Δ2S(SEQ ID NO:7)突变体的氨基酸序列的比对。突变体中的F385至S396修饰区、G559S或G559T修饰以及C端GLC修饰以粗体和下划线突出显示。
具体实施方式
本发明涉及具有增强的热稳定性以及另外的有利性质的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂。本发明的制剂可以是液体(水性)或冻干(冷冻干燥)的。本发明的液体制剂允许甚至在冷冻/解冻循环后保持酶活性。本发明的冻干制剂在宽的温度范围(包括高温(例如高于37℃))内保持酶活性。例如，在40或50℃的升高的温度下，冻干酶制剂的储存可允许达到5天而无酶活性的损失。
如实施例中详细讨论的，测试了氨基酸、糖和盐及其组合的大组以鉴定在宽的温度范围内增强BGUS酶的稳定性，同时随时间保持酶活性并避免制剂中的聚集的化合物。这些实验将含有两性化合物(例如甜菜碱)、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖(例如蔗糖)的制剂鉴定为提供最期望的热稳定性性质，同时保持酶活性并避免聚集。
在下面的小节中更详细地描述本发明的各个方面。
I.水性和冻干制剂
本发明的制剂包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、两性化合物、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖。
如本文所用，“两性化合物”指具有作为酸或碱的能力的物质。适合的两性化合物包括甜菜碱一水合物(CAS No.590-47-6；在本文中也简称为“甜菜碱”)、6-氨基己酸(CASNo.60-32-2)、5-氨基戊酸(CAS No.660-88-8)和4-氨基丁酸(GABA)(CAS No.56-12-2)。另外的两性化合物包括胆碱化合物，其包括胆碱乙酸盐(CAS No.14586-35-7)、氢氧化胆碱(CAS No.123-41-1)和氯化胆碱(CAS No.67-48-1)。在一个实施方式中，两性化合物选自甜菜碱一水合物、胆碱盐、甜菜碱盐、6-氨基己酸、5-氨基戊酸和4-氨基丁酸(GABA)。在一个优选实施方式中，两性化合物是甜菜碱一水合物。
在某些实施方式中，两性化合物(例如甜菜碱)在制剂中以至少10mM、或至少25mM或至少50mM的浓度存在。在另外的实施方式中，两性化合物(例如甜菜碱)在制剂中以10-500mM、或25-500mM或50nM-250mM的浓度存在。在另外的实施方式中，两性化合物(例如甜菜碱)在制剂中以10mM或20mM或25mM或30mM或40mM或50mM或75mM或100mM或200mM或250mM或300mM或400mM或500mM的浓度存在。
作为在本发明的制剂中使用两性化合物的替代，氧化胺例如三甲胺N-氧化物也适合代替两性化合物用作酶制剂中的热稳定剂。然而，考虑到这样的化合物与两性化合物的成本相比显著更高的成本，氧化胺如三甲胺N-氧化物的使用较不优选用于制剂中。
在某些实施方式中，在制剂中使用的糖是多元醇。在某些实施方式中，在制剂中使用的糖选自蔗糖、山梨醇、木糖醇、甘油、2-羟丙基-β-环糊精和α-环糊精。在一个优选实施方式中，糖是蔗糖。
在某些实施方式中，糖(例如蔗糖)在制剂中以至少10mM、或至少25mM或至少50mM或至少100mM的浓度存在。在另外的实施方式中，糖(例如蔗糖)在制剂中以10-1000mM、或25-500mM或50mM-250mM或50mM-500mM或50mM-1000mM的浓度存在。在另外的实施方式中，糖(例如蔗糖)在制剂中以50mM或75mM或100mM或200mM或250mM或300mM或400mM或500mM或600mM或700mM或750mM或800mM或900mM或1000mM的浓度存在。
在某些实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以至少25mM或至少50mM的浓度存在。在另外的实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以25-500mM或50-250mM或50-500mM的浓度存在。在另外的实施方式中，β-丙氨酸在制剂中以25mM或30mM或40mM或50mM或75mM或100mM或200mM或250mM或300mM或400mM或500mM的浓度存在。
在某些实施方式中，L-组氨酸在制剂中以至少10mM或至少15mM或至少20mM或至少25mM的浓度存在。在另外的实施方式中，L-组氨酸在制剂中以10-100mM或10-50mM或10-25mM的浓度存在。在另外的实施方式中，L-组氨酸在制剂中以10mM或15mM或20mM或25mM或30mM或35mM或40mM或45mM或50mM或75mM或100mM的浓度存在。
在制剂中使用的适合的BGUS酶在下文小节II中进一步描述。在某些实施方式中，BGUS酶在制剂中以至少1mg/ml或至少2.5mg/ml或至少5mg/ml或至少10mg/ml的浓度存在。在另外的实施方式中，BGUS酶在制剂中以1-10mg/ml或1-5mg/ml或2.5-10mg/ml或2.5-5mg/ml的浓度存在。在另外的实施方式中，BGUS酶在制剂中以1mg/ml或2mg/ml或3mg/ml或4mg/ml或5mg/ml或6mg/ml或7mg/ml或8mg/ml或9mg/ml或10mg/ml的浓度存在。
在某些实施方式中，BGUS酶在制剂中具有至少5,000单位/ml或5,000单位/mg、更优选地至少10,000单位/ml或10,000单位/mg，甚至更优选地至少25,000单位/ml或25,000单位/mg以及甚至更优选地50,000单位/ml或50,000单位/mg的酶活性。在一个实施方式中，制备物中的β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶是在具有至少5,000单位/ml、或至少10,000单位/ml或至少25,000单位/ml或至少50,000单位/ml的酶活性的水溶液中。在另一个实施方式中，制备物中的β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶是具有至少5,000单位/mg、或至少10,000单位/mg或至少25,000单位/mg或至少50,000单位/mg的酶活性的冻干形式。在又一个实施方式中，制备物中的β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶是在重构为水溶液时具有至少5,000单位/ml、或至少10,000单位/ml或至少25,000单位/ml或至少50,000单位/ml的酶活性的冻干形式。
可以使用酚酞-葡萄糖醛酸苷作为底物的标准化葡萄糖醛酸苷连接水解分析测定制备物中的酶的比活，以单位/ml或单位/mg表示。BGUS的比活的标准化在本领域中已经很好地建立。因此，BGUS活性的1Fishman单位定义为在1小时内从酚酞-葡萄糖醛酸苷释放1μg酚酞的酶的量。可用于测定酶制备物(例如水溶液或冻干制备物)的比活(以单位/ml或单位/mg表示)的示例性标准化分析在实施例5中进一步详细描述。本领域技术人员应认识到用于酶分析的另外的方案也是适合的(例如由Sigma Aldrich Chemical Co.描述的那些)。
在一个实施方式中，制剂不含洗涤剂，例如表面活性剂(例如吐温化合物等)。由于BGUS制剂中洗涤剂的存在可能干扰质谱(MS)分析，本发明的制剂中洗涤剂的缺少赋予了制剂可以直接用于待通过MS分析的生物样品的分析中的优势。
在一个实施方式中，制剂不含聚合物(例如合成聚合物等)。由于BGUS制剂中聚合物的存在可能干扰质谱(MS)分析，本发明的制剂中聚合物的缺少赋予了制剂可以直接用于待通过MS分析的生物样品的分析中的优势。
在一个实施方式中，制剂是水性(液体)制剂。在另一个实施方式中，制剂是冻干(冷冻干燥)制剂。制备水性和冻干制剂的方法在下文小节III中进一步描述。关于冻干制剂中BGUS酶和赋形剂的浓度，本文记载的BGUS酶的指示浓度(以mg/ml表示)和赋形剂的指示浓度(以mM表示)是指用于制备冻干制剂的起始水溶液中的BGUS酶和赋形剂的浓度。
在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、两性化合物、L-组氨酸和β-丙氨酸。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、两性化合物、L-组氨酸和糖。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、两性化合物、β-丙氨酸和糖。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、两性化合物和糖。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、两性化合物和L-组氨酸。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、两性化合物和β-丙氨酸。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、L-组氨酸和β-丙氨酸。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、L-组氨酸和糖。在替代性实施方式中，制剂包含BGUS酶、β-丙氨酸和糖。用于这些替代性实施方式的适合组分如上所述。
在一个实施方式中，制剂包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、50mM甜菜碱一水合物、10mM L-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖。用于制剂中的适合的BGUS酶在下文小节II中描述。在一个实施方式中，BGUS酶是突变大肠杆菌BGUS酶。在一个实施方式中，BGUS酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以1mg/ml的浓度存在。在一个实施方式中，制剂是水性制剂。或者，制剂可以是冻干制剂。
在一个实施方式中，制剂包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、250mM甜菜碱一水合物、50mM L-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖。用于制剂中的适合的BGUS酶在下文小节II中描述。在一个实施方式中，BGUS酶是突变大肠杆菌BGUS酶。在一个实施方式中，BGUS酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，BGUS酶在制剂中以5mg/ml的浓度存在。在一个实施方式中，制剂是冻干制剂。或者，制剂可以是水性制剂。
本发明的制剂在宽的温度范围或延长的时间段内表现出酶稳定性。如本文所用，制剂是“稳定的”是指制剂中的BGUS酶在指定时间内和/或在指定温度下保持其酶活性的至少80％、更优选地至少90％、甚至更优选地至少95％。在一个实施方式中，本发明的水性制剂在冷冻/解冻的一个或多个循环(例如在4℃下冷冻和在20℃下解冻)后保持稳定。在一个实施方式中，本发明的水性制剂在冷冻/解冻1-3个循环后保持稳定。在一个实施方式中，本发明的水性制剂在2-8℃(例如在4℃)下保持稳定至少一个月、更优选地至少三个月、以及甚至更优选地至少六个月。在一个实施方式中，本发明的水性制剂在20℃下保持稳定至少7天、更优选地至少14天、以及甚至更优选地至少21天。在一个实施方式中，本发明的水性制剂在37℃下保持稳定至少7天、更优选地至少14天、以及甚至更优选地至少21天。在一个实施方式中，本发明的冻干制剂在40℃下保持稳定至少24小时、或在37℃下至少48小时、或在37℃下至少5天。
II.BGUS酶
如本文所用，术语“β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶”，也称“β-葡萄糖醛酸糖苷酶”或“BGUS”，指水解β-葡萄糖醛酸苷连接的酶。用于本发明制剂中的BGUS酶可以是例如野生型酶或突变酶。“野生型”BGUS酶指该酶的天然存在形式。“突变”BGUS酶指该酶的修饰形式，其中进行了一个或多个修饰，例如氨基酸置换、缺失和/或插入，使得突变BGUS酶的氨基酸序列不同于野生型氨基酸序列。用于本发明制剂中的BGUS酶可以是例如重组BGUS酶。“重组”BGUS酶指BGUS酶的基因工程形式，与从天然生物来源(例如从细菌、蜗牛或鲍鱼中提取的)提取的酶相反。
来自许多物种的野生型BGUS酶的序列是本领域已知的。例如，编码野生型大肠杆菌K12菌株BGUS的核苷酸序列在NCBI参考序列NC_000913.2中显示，并且野生型大肠杆菌K12菌株BGUS的氨基酸序列在图1和SEQ ID NO:1中显示。野生型人(智人)BGUS(亚型1前体)的氨基酸序列在NCBI参考序列NP_000172.2中显示。野生型小鼠(小家鼠(Mus musculus))BGUS(前体)的氨基酸序列在NCBI参考序列NP_034498.1中显示。野生型短乳杆菌(Lactobacillus brevis)BGUS的氨基酸序列在Genbank登录号ACU21612.1中显示。野生型葡萄球菌属RLH1BGUS的氨基酸序列在Genbank登记号AAK29422.1中显示。此外，许多微生物BGUS酶的序列公开于美国专利号6,391,547和EP专利EP 1175495B，其全部内容(包括序列表)通过引用并入本文。
来自许多物种的突变BGUS酶的序列是本领域已知的。适合的突变BGUS酶公开于例如美国专利公布2016/0090582，其全部内容(包括序列)通过引用并入本文。另外的突变BGUS酶已经在本领域中描述，例如在Xiong,A-S.等.(2007)Prot.Eng.Design Select.20:319-325中。此外，适用于本发明的突变BGUS酶是市售的(IntegratedMicro-Chromatography Systems,LLC)。
在一个实施方式中，突变BGUS酶是突变大肠杆菌K12菌株BGUS酶。突变大肠杆菌K12菌株BGUS酶的非限制性实例包括图1和SEQ ID NO:2-7中所示的那些。在一个实施方式中，突变BGUS酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。在一个实施方式中，突变BGUS酶具有SEQ ID NO:2(G559S置换)所示的氨基酸序列。在另一个实施方式中，突变BGUS酶具有SEQ ID NO:3(G559T置换)所示的氨基酸序列。
在一个优选实施方式中，含有BGUS酶的制备物基本上不含另外的非BGUS酶。如本文所用，“基本上不含”指污染非BGUS蛋白质少于5％、优选地少于3％、甚至更优选地少于1％。
在另一个优选实施方式中，含有BGUS酶的制备物缺乏可检测的硫酸酯酶活性。硫酸酯酶活性可以使用本领域已知的分析法测量。例如，制剂中的硫酸酯酶活性可以在在pH6.8、55℃下使用对硝基邻苯二酚硫酸酯作为底物1小时的酶分析中测量。
III.制备物的制备
本发明的水性和冻干制剂可以使用本领域充分建立的方法制备。通常，通过将期望浓度的BGUS酶和赋形剂组合而制备水性制剂。冻干制剂可以通过使用本领域充分建立的技术冷冻干燥水性制剂而制备。用于冷冻干燥(冻干)水溶液的适合条件的非限制性实例在实施例6中给出。用于制剂中的所有赋形剂都是市售的。
此外，已经发现当制备水性制剂时，在加入糖(例如蔗糖)之前首先将BGUS酶与两性化合物(例如甜菜碱)、L-组氨酸和β-丙氨酸组合，导致最有益的热稳定性和另外的有利性质。因此，在一个方面，本发明提供了一种制备β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂的方法，其包括：
(a)制备包含BGUS酶、两性化合物、L-组氨酸和β-丙氨酸的溶液；和
(b)向步骤(a)中制备的溶液中加入糖。
在一个实施方式中，该方法还进一步包括冻干步骤(b)中制备的溶液。
制剂可以用上文小节II中所述的BGUS酶中的任一种制备。制剂可以用上文小节I所述的赋形剂中的任一种在适合浓度的任一个下制备。在一个实施方式中，在比待用于酶分析的浓度更高的浓度下制备制剂(水性或冻干)，然后在用于酶分析之前将制剂稀释(例如用水)。例如，可以制备高度浓缩的冻干制剂，并且与用于在用于酶分析之前稀释制剂的说明书一起包装。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种包装的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂，其包括容器，所述容器包含含有5mg/ml BGUS酶、250mM甜菜碱一水合物、50mM L-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖的冻干制剂；以及在用于酶分析之前，将所述冻干制剂稀释至1mg/ml BGUS酶、50mM甜菜碱一水合物、10mM L-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖的说明书。
用于包装的制剂的适合容器的非限制性实例包括瓶、管、小瓶、安瓿等。优选地，容器是玻璃或塑料，尽管另外的适合的材料在本领域中是已知的。适合的说明书媒介的非限制性实例包括标签、小册子、插入物和数字媒体。
IV.使用制剂的方法
本发明的BGUS酶制剂可用于葡萄糖醛酸苷底物的水解的方法中。这些方法可用于例如临床目的、法医目的、工业制造目的或农业目的。这些方法特别可用于通过检测药物的葡萄糖醛酸苷去毒化产物而分析身体样品中药物的存在，例如出于临床或法医目的。此外，β激动剂已被非法地用于肉类饲养，因为它们可以促进动物中的肌肉生长代替脂肪生长(参见J.Animal Sci.(1998)76:195-207)。因此，BGUS酶制剂也可以出于农业目的用于检测肉类产品中的β激动剂残留。
因此，在另一个方面，本发明涉及一种水解包含葡萄糖醛酸苷连接的底物的方法，所述方法包括在使得葡萄糖醛酸苷连接的水解发生的条件下使底物与本发明的BGUS酶制剂接触。
在一个实施方式中，底物是阿片葡萄糖醛酸苷。适合的阿片葡萄糖醛酸苷底物的非限制性实例包括吗啡-3β-D-葡萄糖醛酸苷、吗啡-6β-D-葡萄糖醛酸苷、可待因-6β-D-葡萄糖醛酸苷、氢吗啡酮-3β-D-葡萄糖醛酸苷、羟吗啡酮-3β-D葡萄糖醛酸苷及其组合。在另一个实施方式中，底物是苯并二氮杂葡萄糖醛酸苷。适合的苯并二氮杂葡萄糖醛酸苷底物的非限制性实例包括奥沙西泮、劳拉西泮、替马西泮和α-羟基-阿普唑仑的葡萄糖醛酸苷。另外的适合底物包括丁丙诺啡、去甲丁丙诺啡、11-nor-Δ9-四氢大麻酚-9-羧酸、睾酮、雄甾酮、他喷他多、环苯扎林、阿米替林及其组合的葡萄糖醛酸苷。在一个实施方式中，底物是β激动剂(例如用于肉类产品分析)。适合的β激动剂葡萄糖醛酸苷底物的非限制性实例包括克仑特罗、莱克多巴胺和沙丁胺醇。
本发明的方法可用于各种不同的身体样品。适合的身体样品的非限制性实例包括获得自受试者的血液、尿液、组织或胎粪。对于肉类产品分析，身体样本可以是肉类样品。使用本领域充分建立的标准方法，可以获得、储存和为分析准备身体样品。
酶水解后，可以通过标准方法(例如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)和/或质谱(MS))分析样品中的裂解产物。这样的用于分析身体样品中药物的存在的方法在本领域中充分建立。例如，Cabrices,O.G.等.,GERSTEL AppNote AN/2014/4-7中描述了尿液样品水解和通过LC-MS/MS分析的全自动工作流程，其可以使用本发明的突变酶应用于水解。适合于与本发明一起使用的另外的液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)方法描述于Sitasuwan,P.等.(2016)J.Analytic.Toxicol.40:601-607。还已经描述了使用UPLC-MS/MS检测肉类产品中的β激动剂残留的方法(www.waters.com/webassets/cms/library/docs/720004388en.pdf)。
本发明通过以下实施例进一步说明，这些实施例不应被解释为进一步的限制。在本申请中引用的序列表、附图和所有参考文献、专利和公布的专利申请的内容通过引用明确地并入本文。
实施例
实施例1：作为热稳定剂的氨基酸的分析
在这个实施例中，检查了一组氨基酸对基因修饰(突变)的重组大肠杆菌β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶的熔解温度的影响。对于实施例中描述的所有实验，BGUS酶(商购自Integrated Micro-Chromatography Systems,LLC)被用于制剂中。
使用蛋白热移位分析检查含有不同氨基酸的制剂中酶的解链温度。对于该分析，使用标准色谱技术纯化酶蛋白，以基于SDS PAGE获得至少＞99％的纯度。首先用具有至少2mg/ml的蛋白浓度水平的纯水(18.2Mohm)透析纯化的重组酶。将这种酶在水中的储备溶液与各种缓冲溶液1:1混合，以达到下表1中所列出的最终浓度。然后如供应商(LifeTechnologies,CA)规定的，将所有样品与ProteinThermal ShiftTM试剂提供的染料混合。该荧光染料在蛋白去折叠时被激活。然后将样品置于使用供应商规定的升温速率和温度的实时PCR仪(StepOnePlusTM)中。使用蛋白热移位软件分析熔解曲线。
所测试的氨基酸组的结果显示在下表1中：
表1：
表1中所示的数值指水中的酶和规定制剂中的酶之间的熔解温度差异。例如，具有50mM L-精氨酸(表1中的制剂#1)的酶显示稳定性立即降低，如Tm降低4.4℃所示。储存三周后，Tm进一步降低30℃。与单独的水相比的这种Tm值降低启示L-精氨酸的去稳定化作用。相比之下，当与在水中的酶相比时，精氨酸和谷氨酸的组合(制剂#2)使Tm值增加2.8℃。这启示稳定性增加。因此，单独的精氨酸使酶去稳定，但与谷氨酸组合，这两种氨基酸共同显示熔解温度升高。然而，精氨酸和谷氨酸的组合与其他赋形剂制剂相比具有显著更高的聚集水平(参见实施例7)。
含有胰蛋白胨的制剂(制剂#10)显示熔解温度升高。然而，该制剂也表现出高聚集水平。
在所有的测试的氨基酸中，只有含有L-组氨酸(制剂#11)或β-丙氨酸(制剂#13)的制剂显示酶的熔解温度升高，同时与其他赋形剂制剂相比未显著诱导聚集。
实施例2：作为热稳定剂的多元醇的分析
在这个实施例中，使用实施例1中所述的蛋白热移位分析，检查了一组多元醇糖对基因修饰的β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶的熔解温度的影响。
所测试的多元醇组的结果显示在下表2中：
表2：
虽然作为赋形剂测试的糖中的大多数在与水相比时最初显示出Tm值的增加，然而仅有两种化合物，木糖醇(制剂#15)和蔗糖(制剂#17)，对于Tm显示出一致的增加。甘油(制剂#19和#20)也改善稳定性。复杂糖如(2-羟丙基)-β-环糊精(制剂#27)和16mMα-环糊精(制剂#28)也通过使Tm值提高1.3℃而在使酶稳定的方面具有一致的改善。
实施例3：作为热稳定剂的盐的分析
在这个实施例中，使用实施例1中所述的蛋白热移位分析，检查了一组盐对基因修饰的β-葡萄糖醛酸糖苷酶酶的熔解温度的影响。
所测试的盐的初始组的结果显示在下表3中：
表3：
在表3中作为赋形剂筛选的盐中的大部分不改善酶的稳定性，除了tacsimate，其是滴定的有机酸盐的混合物。
测试另一组盐，其结果显示在下表4中：
表4：
在所测试的这些盐中，两性化合物如甜菜碱一水合物(制剂#76)、6-氨基己酸(制剂#77)、5-氨基戊酸(制剂#78)和4-氨基丁酸(制剂#79)增加Tm，而直链胺如精胺(制剂#71)和亚精胺(制剂#72)使酶去稳定。除了三甲胺N-氧化物(制剂#73)外，铵基盐中的大部分倾向于使酶去稳定。
因此，基于所测试的盐的组，确定两性化合物是最令人感兴趣的。虽然氧化胺如三甲胺N-氧化物也适用于酶制剂，然而这样的化合物与两性化合物相比更高的成本使它们较不令人感兴趣。
实施例4：组合制剂的分析
在这个实施例中，基于实施例1-3描述的初步筛选，设计了具有两性化合物、氨基酸和糖的各种组合的另外的制剂，以实现更高的Tm值。
进行使用胆碱、甜菜碱、L-组氨酸、β-丙氨酸、糖(蔗糖、甘露醇、山梨醇和木糖醇)的各种混合物测量的差示扫描荧光(DSF)以根据蛋白热移位分析进行扩展。使用本领域已知的标准方法进行DSF(参见，例如，Ristic,M.等.(2015)Acta Crytallog.F.Struct.Biol.Commun.71:1359-1364)。
所测试的组合制剂的组的结果显示在下表5中：
表5：
仅有蔗糖的制剂(#212和#213)具有早发型熔解温度，从约43℃开始。各种盐的添加和不同的浓度提高熔解起始温度并且还提高其总体Tm。基于DSF结果，单独的糖具有通常在约42℃开始的酶变形的早期发生。随着加入β-丙氨酸、L-组氨酸和甜菜碱，这种变形的早期发生急剧偏移。胆碱盐具有不同的作用，取决于其反离子并且取决于供应，以及化合物是否具有使酶去稳定的残留氨污染物。
聚焦于甜菜碱、L-组氨酸和β-氨基酸的进一步研究表明这三种赋形剂对于使酶对聚集稳定和提高熔解温度是至关重要的。从1-10mg/mL增加酶浓度在这些制剂中没有作用，但是更高浓度的甜菜碱、L-组氨酸和β-丙氨酸进一步改善液体形式的酶的稳定性。
实施例5：水性制剂的酶稳定性的分析
在这个实施例中，检查在实施例1-4中鉴定的含有赋形剂的各种制剂的酶活性，以确定赋形剂是否影响酶活性。
为了分析酶活性，使用20mM磷酸钾缓冲液pH 6.8将纯化的酶稀释200倍。使用1mM浓度的底物酚酞葡萄糖醛酸苷。将25uL稀释的酶与含有1mM酚酞葡萄糖醛酸苷的25uL底物溶液混合。将混合物在板式振荡器上混合30秒，并在25℃下孵育30分钟。向反应混合物中加入150uL的0.2M甘氨酸(pH 10.4)以终止反应。使用分光光度计在540nm的固定波长下测量吸光度。所有样品一式三份地测量并以1至5微克酚酞范围的酚酞校准曲线定量。
结果显示在下表6中：
表6：
表6中所示的结果表明，所测试的个体赋形剂(氨基酸、两性化合物和糖)不显著影响酶活性。
在第二系列实验中，在逐渐升高的温度(4℃、20℃或37℃)下在延长的储存(7天、26天或41天)后测试液体形式的包含甜菜碱、L-组氨酸、β-丙氨酸和木糖醇的组合制剂的酶活性。结果显示在下表7中：
表7：
表7中的结果表明包含L-组氨酸、β-丙氨酸、两性化合物(甜菜碱)和糖(木糖醇)的水性组合制剂在延长的时间段内和在逐渐升高的温度下表现出稳定的酶活性。
实施例6：冻干制剂的酶活性的分析
在这个实施例中，制备并冻干(包含L-组氨酸、β-丙氨酸、两性化合物和糖)组合制剂，随后在不同时间段后和在不同温度下测试酶活性。
对于冻干过程，将水性制剂在-80℃下再冷冻；在0.2mBar下真空；在-50℃(搁板温度)、-30℃(样品温度)下冷冻干燥12-36小时，然后将温度缓慢升至-30至-20℃(搁板温度)、-20至-10℃(样品温度)，并放置过夜20-48小时。第二天，将温度升至4℃并保持4小时，然后升至20℃，并在该温度下保持4-16小时。整个过程总共3-6天。
所测试的初始制剂含有L-组氨酸、β-丙氨酸和甜菜碱，并且使用木糖醇作为糖赋形剂用于冷冻干燥。在1mg/ml和4mg/ml测试酶浓度。将冻干制剂的酶活性与冷冻干燥后即刻的和储存1周后的等价液体制剂两者的酶活性进行比较。结果显示在下表8中：
表8：
表8中所示的结果表明在冷冻干燥后，甚至在储存1周后，酶仍保持活性。
然后在-20℃和37℃之间的温度下储存24小时后测试冻干制剂。该实验的酶活性显示在下表9中：
表9：
表9中的结果表明，虽然制剂在较低温度下保持酶活性，但在20℃或高于20℃的温度下酶不再具有活性。因此，尽管赋形剂甜菜碱、L-组氨酸和β-丙氨酸提供了液体形式中增加的酶活性，但是相同制剂(含有木糖醇作为糖)在冷冻干燥过程后不使酶在高温下稳定。
使用不同的糖化合物以及制剂中不同浓度的糖进行进一步实验，以检查是否可以实现更好地保护冻干制剂免受热失活。
在第一组实验中，甜菜碱、L-组氨酸、β-丙氨酸和木糖醇制剂(本文称为制剂A)通过加入不同浓度的蔗糖进行改性。在37℃下24小时或3天后测试液体对比冷冻干燥制剂的酶活性。结果显示在下表10中：
表10：
表10中所示的结果表明，加入高达80mM的蔗糖针对较高温度改善了冷冻干燥酶的活性，但没有给予针对热失活的完全保护。
因此，在第二组试验中，制剂A通过用各种糖(甘露醇、山梨醇、海藻糖或蔗糖)代替木糖醇来改性。本文鉴定为制剂B的一种制剂用蔗糖代替木糖醇，同时保持L-组氨酸、β-丙氨酸和甜菜碱。具有不同浓度的蔗糖的制剂B在高温下的酶活性结果显示在下表11中：
表11：
表11中的结果表明，含有最小浓度250mM蔗糖的制剂B在液体和冻干形式两者中均实现耐高温性。加入甘油和蔗糖而没有另外的制剂B赋形剂(L-组氨酸、β-谷氨酸和甜菜碱)不使酶在高温下稳定。此外，制剂B还赋予液体和粉末形式两者对抗冷冻/解冻的耐受性以及耐高温性，而单独的甘油或蔗糖不提供液体形式对抗低温的保护。
实施例7：聚集分析
在这个实施例中，通过差示扫描荧光测试各种赋形剂和制剂对聚集的影响。对于此实施例中报告的结果，Tm1指当蛋白质解折叠时的第一峰值温度，并且基于固有荧光偏移观察到结构变化；Tagg266指检测到小聚集体的温度；Tagg 473指检测到大聚集体的温度；Z-ave dia(nm)指溶液中所测量的颗粒的直径(更大的平均直径指更多的聚集体)；以及峰1多分散性％指由仪器提供的分散指数(来自Unchained Labs的UNcle)(更低的百分比值表示更小的尺寸分布，其相比于更大的百分比值更优选，其表示尺寸的非均相混合物)。
在第一组试验中，与制剂B(含有甜菜碱、β-丙氨酸、L-组氨酸和蔗糖)相比，检测了各种氨基酸(单独和组合)。结果显示在下表12中：
表12：
在表12报告的实验中，氨基酸精氨酸、谷氨酸和组氨酸被关注，因为当使用热移位分析(参见实施例1)测试时，这些氨基酸显示较高的Tm值。然而，当使用差示扫描荧光测试时，仅有单独的L-组氨酸具有增加的Tm，但单独的L-组氨酸未阻止聚集。在干燥之前和之后两者，只有L-组氨酸、β-丙氨酸、甜菜碱和糖(制剂B)的存在显示高Tm以及高Tagg 266和高Tagg 473值，以及低多分散系数，因此表明制剂B阻止聚集。
在第二组实验中，在不同浓度下测试单独和组合的制剂B的各种组分对聚集的影响。结果显示在下表13中：
表13：
表13中的结果表明与使用少于全部四种组分相比，包含制剂B的所有四种组分改善了Tagg 266值。此外，β-丙氨酸、甜菜碱和L-组氨酸逐渐增加的浓度改善了Tm和Tagg 266(小聚集体)。与水相比，蔗糖或甜菜碱或组氨酸/β-丙氨酸改善了Tagg 473(大聚集体)。总而言之，当酶溶液中加入甜菜碱、β-丙氨酸、L-组氨酸和蔗糖时，观察到对于Tagg 266的增加的增量效益。
在第三组实验中，检查了将牛血清白蛋白(BSA)或1,4-二硫苏糖醇(DTT)加入到制剂B或水中的酶对于聚集的影响。对于该实验，制剂B(FB)含有50mM甜菜碱、50mMβ-丙氨酸、10mM L-组氨酸和50mM蔗糖。结果显示在下表14中：
表14：
表14中的结果表明加入BSA或DTT不提高酶的稳定性。反而是制剂B中赋形剂的存在提高Tm并导致更高的Tagg值。加入还原剂如DTT降低Tm值，并在较低温度下显示聚集，如Tagg 266所示。BSA还使酶去稳定。
因此，总而言之，这些实验证实了制剂B的组分(L-组氨酸、β-丙氨酸、甜菜碱和蔗糖)对于使酶制备物稳定和减少制备物的聚集的有益作用。
实施例8：水性和冻干酶制剂的比较
在这个实施例中，比较了水性和冻干酶制备物在制剂B(50mM甜菜碱、50mMβ-丙氨酸、10mM L-组氨酸和50mM蔗糖)中水解各种葡萄糖醛酸苷连接的能力。酶反应在标准条件下进行。可以使用本领域充分建立的方法分析反应产物，例如通过液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)(例如如Sitasuwan,P.等.(2016)J.Analytic.Toxicol.40:601-607所述)。水性和冻干酶制剂的结果分别显示在下表15和16中。
表15：
表16：
表15和16中的结果表明制剂B中的水性和冻干酶制备物在检测各种葡萄糖醛酸苷化药物的性能方面没有表现出可测量的差异。这些结果是用来自超过40位不同患者的尿液样品证实，测试了广泛的葡萄糖醛酸苷化药物，包括阿片类和苯并二氮杂类，其也显示水性酶制剂相比于冻干酶制备物在性能方面没有可测量的差异。
等价方式
使用不超过常规实验，本领域技术人员应认识到或能够确定本文所述的本发明的具体实施方式的许多等价方式。这样的等价方式旨在被所附权利要求所涵盖。
序列表概要

Claims (40)

1.一种制剂，其包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、两性化合物、L-组氨酸、β-丙氨酸和糖。
2.权利要求1所述的制剂，其中所述两性化合物选自甜菜碱一水合物、胆碱盐、甜菜碱盐、6-氨基己酸、5-氨基戊酸和4-氨基丁酸(GABA)。
3.权利要求1所述的制剂，其中所述两性化合物是甜菜碱一水合物。
4.权利要求3所述的制剂，其中甜菜碱一水合物以至少50mM的浓度存在。
5.权利要求4所述的制剂，其中甜菜碱一水合物以50mM-250mM的浓度存在。
6.权利要求4所述的制剂，其中甜菜碱一水合物以250mM的浓度存在。
7.权利要求1所述的制剂，其中所述糖选自蔗糖、山梨醇、木糖醇、甘油、2-羟丙基-β-环糊精和α-环糊精。
8.权利要求7所述的制剂，其中所述糖是蔗糖。
9.权利要求8所述的制剂，其中蔗糖以至少50mM的浓度存在。
10.权利要求8所述的制剂，其中蔗糖以50mM-500mM的浓度存在。
11.权利要求8所述的制剂，其中蔗糖以500mM的浓度存在。
12.权利要求1所述的制剂，其中β-丙氨酸以至少50mM的浓度存在。
13.权利要求12所述的制剂，其中β-丙氨酸以50mM-250mM的浓度存在。
14.权利要求12所述的制剂，其中β-丙氨酸以250mM的浓度存在。
15.权利要求1所述的制剂，其中L-组氨酸以至少10mM的浓度存在。
16.权利要求12所述的制剂，其中L-组氨酸以10mM-50mM的浓度存在。
17.权利要求12所述的制剂，其中L-组氨酸以50mM的浓度存在。
18.前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述BGUS酶是重组BGUS酶。
19.权利要求18所述的制剂，其中所述重组BGUS酶是突变BGUS酶。
20.权利要求19所述的制剂，其中所述突变BGUS酶具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。
21.前述权利要求中任一项所述的制剂，其中所述BGUS酶以至少1mg/ml的浓度存在。
22.权利要求21所述的制剂，其中所述BGUS酶以1-5mg/ml的浓度存在。
23.权利要求21所述的制剂，其中所述BUGS酶以5mg/ml的浓度存在。
24.前述权利要求中任一项所述的制剂，其不含洗涤剂。
25.前述权利要求中任一项所述的制剂，其不含聚合物。
26.前述权利要求中任一项所述的制剂，其是水性制剂。
27.权利要求1-25中任一项所述的制剂，其是冻干制剂。
28.权利要求1所述的制剂，其包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、50mM甜菜碱一水合物、10mM L-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖。
29.权利要求28所述的制剂，其包含浓度为1mg/ml的具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的BGUS酶。
30.权利要求29所述的制剂，其是水性制剂。
31.权利要求1所述的制剂，其包含β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶、250mM甜菜碱一水合物、50mM L-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖。
32.权利要求30所述的制剂，其包含浓度为5mg/ml的具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的BGUS酶。
33.权利要求32所述的制剂，其是冻干制剂。
34.一种制备β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂的方法，其包括：
(a)制备包含BGUS酶、两性化合物、L-组氨酸和β-丙氨酸的溶液；和
(b)向步骤(a)中制备的溶液中加入糖。
35.权利要求34所述的方法，其还包括冻干步骤(b)中制备的溶液。
36.一种包装的β-葡萄糖醛酸糖苷酶(BGUS)酶制剂，其包括容器，所述容器包含含有5mg/ml BGUS酶、250mM甜菜碱一水合物、50mM L-组氨酸、250mMβ-丙氨酸和250mM蔗糖的冻干制剂；以及在用于酶分析之前，将所述冻干制剂稀释至1mg/ml BGUS酶、50mM甜菜碱一水合物、10mM L-组氨酸、50mMβ-丙氨酸和50mM蔗糖的说明书。
37.一种水解包含葡萄糖醛酸苷连接的底物的方法，所述方法包括在使得所述葡萄糖醛酸苷连接的水解发生的条件下使所述底物与前述权利要求中任一项所述的制剂接触。
38.权利要求37所述的方法，其中所述底物是阿片葡萄糖醛酸苷。
39.权利要求37所述的方法，其中所述底物是苯并二氮杂葡萄糖醛酸苷。
40.权利要求37-39中任一项所述的方法，其中所述底物是在从受试者获得的血液、尿液、组织或胎粪的样品中。
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