JP7369115B2 - 微生物の細胞の測定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、被検試料中の微生物の細胞を測定する方法に関する。
現在、乳製品をはじめとして、乳酸菌などの微生物を添加した食品が広く消費者に受け入れられている（非特許文献１～非特許文献４）。ここで、乳酸菌などの微生物を含む食品を提供するにあたり、食品等の出荷検査や受け入れ先の受け入れ検査等で食品中の微生物含有量を測定する必要がある。
微生物の検出・定量の技術として、例えば、乳酸菌が存在しない飲料中における乳酸菌生細胞による汚染の検出・定量を目的として、被検試料をメンブランフィルターでろ過後、適当な培地中で培養し、生育したコロニーを観察する方法が知られている（特許文献１）。
また、乳酸菌検出培地として改変ＮＢＢ培地を使用する方法（非特許文献５）、ＫＯＴ培地を使用する方法（非特許文献６）も知られている。さらに、菌体中のＡＴＰを利用し、ルシフェリン－ルシフェラーゼ反応による化学発光を用いる方法（非特許文献７、非特許文献８）、また、培地中の菌の生育を培地の電気伝導度の変化で捕らえる方法（非特許文献９）も知られている。
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ところで、製造、出荷、受け入れ、検査等で受けたさまざまな処理、例えば熱処理等によって、細胞中のＤＮＡが切断することがある。細胞中のＤＮＡが切断している場合には、デジタルＰＣＲで測定した被検試料中の細胞のＤＮＡ量を被検試料中の細胞数とすると、誤差が生じる。
前述した背景において、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することのできる技術が求められていた。すなわち、本発明は、被検試料中の微生物の細胞数を精度よく測定する方法を提供することを課題とする。
前記課題を解決する本発明は、
被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法であって、
前記微生物の細胞を含む前記被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、当該被検試料に含まれるＤＮＡを回収するＤＮＡ回収工程と、
前記ＤＮＡ回収工程で回収したＤＮＡを含む被検測定用試料を調製する調製工程と、
前記被検測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅させる増幅工程と、
前記増幅工程で得た測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を算出する細胞数算出工程と、
を有し、
前記細胞数算出工程は、
前記増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを特徴とする。
そして、前記ＤＮＡ切断係数は、
被検試料と同一の処理を受けた基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
基準測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程、によって算出されることを特徴とする。
このような形態とすることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差を解消することができるため、例えば、熱処理を受けたような被検試料中の微生物の細胞数を精度よく測定することができる。
被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法であって、
前記微生物の細胞を含む前記被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、当該被検試料に含まれるＤＮＡを回収するＤＮＡ回収工程と、
前記ＤＮＡ回収工程で回収したＤＮＡを含む被検測定用試料を調製する調製工程と、
前記被検測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅させる増幅工程と、
前記増幅工程で得た測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を算出する細胞数算出工程と、
を有し、
前記細胞数算出工程は、
前記増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを特徴とする。
そして、前記ＤＮＡ切断係数は、
被検試料と同一の処理を受けた基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
基準測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程、によって算出されることを特徴とする。
このような形態とすることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差を解消することができるため、例えば、熱処理を受けたような被検試料中の微生物の細胞数を精度よく測定することができる。
なお、本明細書において「ＤＮＡ切断係数」は、製造、出荷、受け入れ、検査等の過程で微生物が受けたＤＮＡの切断の程度に関する係数を意味する。
ここで、「ＤＮＡ切断係数」は、菌種、菌株ごとに割り当てられた微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の数、及び、微生物が製造、出荷、受け入れ、検査等の過程で受けた処理（例えば熱処理等）の程度に依存し変化し得る係数である。
ここで、「ＤＮＡ切断係数」は、菌種、菌株ごとに割り当てられた微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の数、及び、微生物が製造、出荷、受け入れ、検査等の過程で受けた処理（例えば熱処理等）の程度に依存し変化し得る係数である。
また、本発明において「基準試料」とは、被検試料と同一の処理を受けた試料をいう。また、「被検試料と同一の処理」は、同じ条件のもとに製造された製品において、製造、出荷、受け入れ、検査等で受けた処理、例えば熱処理等の条件が実質的に同一であることを意味する。
本発明の好ましい形態では、前記細胞数算出工程は、さらに、前記増幅産物の測定結果を予め用意した前記微生物由来のＤＮＡ回収率で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを特徴とする。
そして、前記ＤＮＡ回収率は、
被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
前記基準試料中の総ＤＮＡ量から前記対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、前記基準試料中の前記微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
算出した前記微生物由来のＤＮＡ回収量を、前記基準試料に添加した前記微生物の理論添加量で割る工程、によって算出されることを特徴とする。
このような形態とすることで、抽出操作による測定の誤差を解消することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
そして、前記ＤＮＡ回収率は、
被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
前記基準試料中の総ＤＮＡ量から前記対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、前記基準試料中の前記微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
算出した前記微生物由来のＤＮＡ回収量を、前記基準試料に添加した前記微生物の理論添加量で割る工程、によって算出されることを特徴とする。
このような形態とすることで、抽出操作による測定の誤差を解消することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
本発明の好ましい形態では、前記総ＤＮＡ量測定工程は、分光光度計を用いて前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定することを含む。
このような形態とすることで、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
このような形態とすることで、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
本発明の好ましい形態では、前記細胞が生細胞である。
本発明の好ましい形態では、前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域は、耐熱性タンパク質由来の遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、及びｔｕｆ遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のターゲット領域である。
このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数をより精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数をより精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
本発明の好ましい形態では、前記耐熱性タンパク質はヒートショックプロテインである。
このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数をより精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数をより精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞数をより精度よく測定することができる。
本発明の好ましい形態では、前記ヒートショックプロテインはヒートショックプロテイン６０である。
本発明によれば、被検試料中の微生物の細胞を精度よく測定することができる。
次に、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
＜１＞微生物の細胞の測定方法
本発明は、被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法である。
本発明は、被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法である。
本発明の方法は、微生物の細胞の数を決定する方法に限定されず、微生物の細胞の存在を細胞数についての測定値と共に検出する方法も含む。
測定対象となる微生物の細胞としては、該微生物のＤＮＡを増幅し得る限り特に制限されないが、例えば、細菌、糸状菌、酵母等の細胞を挙げることができる。
また、本発明の方法は、微生物の生細胞を測定対象とすることが好ましい。
また、本発明の方法は、微生物の生細胞を測定対象とすることが好ましい。
中でも、本発明の方法は、グラム陽性細菌の細胞を対象とすることが好ましい。グラム陽性細菌としては、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌、オルセネラ（Ｏｌｓｅｎｅｌｌａ）属細菌、カルノバクテリウム（Ｃａｒｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、ウェイセラ（Ｗｅｉｓｓｅｌｌａ）属細菌、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌、又はビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌等を挙げることができる。
特にラクトバチルス属細菌には人体に有利な生理活性を示すものがあることから、本発明の方法は、ラクトバチルス属細菌の細胞数の測定に適用することが好ましい。
ラクトバチルス属細菌としては、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ
ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等を挙げることができる。
ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）等を挙げることができる。
また、本発明の方法に用いられる被検試料は、例えば熱処理を受けたものである。熱処理としては、加熱、均質化、殺菌などの処理を挙げることができる。なお、当該被検試料は熱処理の有無にかかわらず、本発明の被検試料に採用することができる。
ここで、本発明の方法に用いることのできる被検試料に特に制限はなく、例えば、食品、生体試料、ワクチン製剤、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等を挙げることができる。
特に、生体に有利な生理活性を有する微生物の細胞を測定することの有用性の観点から、食品を被検試料とすることが好ましい。食品として、清涼飲料、炭酸飲料、栄養飲料、果汁飲料、乳酸菌飲料等の飲料（これらの飲料の濃縮原液及び調製用粉末を含む）；アイスクリーム、アイスシャーベット、かき氷等の冷菓；チョコレート、キャラメル、キャンディ、ケーキ、ビスケット、クッキー等の菓子；ミルク、加工乳、乳飲料、発酵乳、バター等の乳製品；経腸栄養食品等の高栄養流動食品、育児用ミルク、スポーツ飲料；特定保健用食品、健康補助食品等の機能性食品を挙げることができる。
本発明において、被検試料は、前述の食品、生体試料、ワクチン製剤、飲料水、工業用水、環境用水、排水、土壌、又は拭き取り試料等そのものであってもよく、これらを希釈もしくは濃縮したもの、又はその他任意の前処理をしたものであってもよい。前処理としては、加熱処理、濾過、遠心分離等を好ましく挙げることができる。
また、被検試料中に存在する測定対象の微生物の細胞以外の細胞、タンパク質コロイド粒子、脂肪及び糖質等の夾雑物は、これらを分解する活性を有する酵素による処理等によって除去又は低減させてもよい。被検試料が乳、乳製品、乳又は乳製品を原料とする食品である場合には、被検試料中に存在する微生物の細胞以外の細胞としてウシ白血球及び乳腺上皮細胞等を挙げることができる。
前記酵素としては、夾雑物を分解することができるものであれば特に制限されないが、例えば、脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素を挙げることができる。酵素は、１種類の酵素を単独で用いてもよいし、２種又はそれ以上の酵素を併用してもよい。中でも、脂質分解酵素及びタンパク質分解酵素の両方、又は脂質分解酵素、タンパク質分解酵素、及び糖質分解酵素の全てを用いることが好ましい。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等を挙げることができる。
また、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ（登録商標）等を挙げることができる。
また、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ－アセチルムラミダーゼ等を挙げることができる。
脂質分解酵素としては、リパーゼ、フォスファターゼ等を挙げることができる。
また、タンパク質分解酵素としてはセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、プロナーゼ（登録商標）等を挙げることができる。
また、糖質分解酵素としてはアミラーゼ、セルラーゼ、Ｎ－アセチルムラミダーゼ等を挙げることができる。
＜２＞ 本発明の方法における各工程について
以下、本発明の方法における各工程について、詳細に説明する。
以下、本発明の方法における各工程について、詳細に説明する。
（１）ＤＮＡ回収工程
ＤＮＡ回収工程は、微生物の細胞を含む被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、被検試料に含まれるＤＮＡを回収する工程である。
ＤＮＡ回収工程は、微生物の細胞を含む被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、被検試料に含まれるＤＮＡを回収する工程である。
ＤＮＡの抽出操作としては、被検試料に対して冷却遠心分離処理とガラスビーズを用いた細胞の破砕操作を好ましく挙げることができる。なお、ＤＮＡの抽出操作に特に制限はない。また、ＤＮＡの抽出操作には、市販のＤＮＡ抽出キットを用いることもできる。
（２）被検測定用試料の調製工程
被検測定用試料の調製工程は、被検試料に必要な試薬の添加や処理を行い、ＰＣＲ法を用いた増幅産物の測定に供するための被検測定用試料（核酸増幅反応液）を調製する工程である。
被検測定用試料の調製工程は、被検試料に必要な試薬の添加や処理を行い、ＰＣＲ法を用いた増幅産物の測定に供するための被検測定用試料（核酸増幅反応液）を調製する工程である。
調製工程では、デジタルＰＣＲ法に通常用いられる試薬を添加する。具体的には、後述するターゲット領域を増幅するためのプライマー、増幅産物を測定するためのプローブのほか、ｄＮＴＰ 混合液、ＤＮＡポリメラーゼ等通常のデジタルＰＣＲに用いられる試薬を添加する。プライマー及びプローブ以外の試薬としては、例えば後述するデジタルＰＣＲ装置を用いる場合には、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ３Ｄ ｄｉｇｉｔａｌ
ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｖ２（×２）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることができる。
ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｖ２（×２）（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることができる。
また、調製工程では、被検試料に核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加することが好ましい。
被検試料に核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加することで、後述する増幅工程での定量性を向上することができる。
被検試料に核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤を添加することで、後述する増幅工程での定量性を向上することができる。
ここで「核酸増幅阻害物質」とは、核酸増幅反応又は核酸伸張反応を阻害する物質であって、例えば、ＤＮＡの鋳型に吸着する正電荷阻害物質、又は核酸合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼなど）に吸着する負電荷阻害物質等を挙げることができる。正電荷阻害物質としては、カルシウムイオン、ポリアミン、ヘム（ｈｅｍｅ）等を挙げることができる。また、負電荷阻害物質としては、フェノール、フェノール系化合物、ヘパリン、グラム陰性菌の細胞壁外膜等を挙げることができる。食品や臨床検体中には、このような核酸増幅反応を阻害する物質が多く含まれているといわれている。
前述したような核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤としては、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、アセトアミド、ベタイン、ジメチルスルホキシド、ホルムアミド、グリセロール、ポリエチレングリコール、大豆トリプシンインヒビター、α２－マクログロブリン、テトラメチルアンモニウムクロライド、リゾチームから、ホスホリラーゼ、及び乳酸脱水素酵素等の親水性薬剤が例示できる。これら親水性薬剤は１種のみを用いてもよいし、複数種を組み合わせて用いてもよい。
前述した親水性薬剤のうち、ポリエチレングリコールとしては、ポリエチレングリコール４００又はポリエチレングリコール４０００が好ましく例示できる。ベタインとしては、トリメチルグリシンやその誘導体等を挙げることができる。また、ホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素としては、ウサギ筋肉由来のグリコーゲンホスホリラーゼ及び乳酸脱水素酵素を挙げることができる。なお、グリコーゲンホスホリラーゼとしては、グリコーゲンホスホリラーゼｂを好ましく挙げることができる。
特に、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びリゾチームを使用することが好ましい。
特に、アルブミン、デキストラン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びリゾチームを使用することが好ましい。
ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）に代表されるアルブミンは、ヘム（ｈｅｍｅ）のような核酸増幅阻害物質に結合することにより、核酸増幅阻害を低減させている可能性が示唆されている（Abu Al-Soudら）。
また、Ｔ４ジーン３２プロテインは１本鎖ＤＮＡ結合性タンパク質であり、核酸増幅過程で鋳型となっている１本鎖ＤＮＡに予め結合することにより鋳型が核酸分解酵素によって分解されることを防いでいるか、または、ＢＳＡと同様の核酸増幅阻害物質に結合することにより核酸増幅阻害を低減しているのであろうと考えられている（Abu Al-Soud, W. et al, Journal of Clinical Microbiology, 38:4463-4470, 2000））。
さらに、ＢＳＡ、Ｔ４ジーン３２プロテイン、及びタンパク質分解酵素阻害剤（proteinase inhibitor）は、タンパク質分解酵素（proteinase）に結合することによりタンパク質分解活性を低減させ、核酸合成酵素の働きを最大限に引き出す可能性が示唆されている。事実、牛乳や血液にはタンパク質分解酵素が残存していることもあり、その際ＢＳＡ又はタンパク質分解酵素阻害剤（大豆トリプシンインヒビターやα２－マクログロブリン）の添加により核酸合成酵素が分解を受けずに核酸増幅反応が良好に進行したケースも紹介されている（Abu Al-Soudら）。
また、デキストランは一般にグルコースを原料として乳酸菌が合成する多糖類である。ムチンという同様の多糖類－ペプチド複合体が腸管粘膜に接着することも報告されており（Ruas-Madiedo, P., Applied and Environmental Microbiology, 74:1936-1940, 2008）、デキストランが負電荷阻害物質（核酸合成酵素に吸着）、又は正電荷阻害物質（核酸に吸着）に予め吸着することにより、それら阻害物質に結合する可能性は十分あるものと推察される。
また、リゾチームは牛乳中に多数含まれていると考えられる核酸増幅阻害物質と吸着しているものと推察される（前記Abu Al-Soudら）。
以上のことから、アルブミン、Ｔ４ジーン３２プロテイン、デキストラン、及びリゾチームに代表される親水性薬剤は、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤であるといえる。
アルブミンとしては、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン、乳アルブミン、ヒト血清アルブミン等を挙げることができる。これらの中ではウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）が好ましく例示できる。アルブミンは精製品でもよく、本発明の効果を損なわない限りグロブリン等の他の成分と組み合わせて用いてもよい。また、アルブミンは分画物であってもよい。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のアルブミンの濃度は、例えば、通常０．０００１～１質量％であり、好ましくは０．０１～１質量％であり、より好ましくは０．２～０．６質量％である。
調製工程においては、被検測定用試料におけるアルブミンの濃度が前記範囲となるように、被検試料にアルブミンを添加することが好ましい。
調製工程においては、被検測定用試料におけるアルブミンの濃度が前記範囲となるように、被検試料にアルブミンを添加することが好ましい。
デキストランとしては、デキストラン４０やデキストラン５００等が挙げられ、特にデキストラン４０を好ましく挙げることができる。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１～８％であり、好ましくは１～６％であり、より好ましくは１～４％である。
調製工程においては、被検測定用試料におけるデキストランの濃度が前記範囲となるように、被検試料にデキストランを添加することが好ましい。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のデキストランの濃度は、例えば、通常１～８％であり、好ましくは１～６％であり、より好ましくは１～４％である。
調製工程においては、被検測定用試料におけるデキストランの濃度が前記範囲となるように、被検試料にデキストランを添加することが好ましい。
Ｔ４ジーン３２プロテインとしては、市販品（例えば、ロシュ社製：ｇｐ３２とも呼ばれる）を用いてもよい。
Ｔ４ジーン３２プロテインの被検測定用試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１～１％であり、好ましくは０．０１～０．１％であり、より好ましくは０．０１～０．０２％である。
調製工程においては、被検測定用試料におけるＴ４ジーン３２プロテインの濃度が前記範囲となるように、被検試料にＴ４ジーン３２プロテインを添加することが好ましい。
Ｔ４ジーン３２プロテインの被検測定用試料（核酸増幅反応液）中の濃度は、通常０．０１～１％であり、好ましくは０．０１～０．１％であり、より好ましくは０．０１～０．０２％である。
調製工程においては、被検測定用試料におけるＴ４ジーン３２プロテインの濃度が前記範囲となるように、被検試料にＴ４ジーン３２プロテインを添加することが好ましい。
リゾチームとしては、卵白由来のリゾチームを好ましく挙げることができる。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１～２０μｇ／ｍＬであり、好ましくは６～１５μｇ／ｍＬであり、より好ましくは９～１３μｇ／ｍＬである。
調製工程においては、被検測定用試料におけるリゾチームの濃度が前記範囲となるように、被検試料にリゾチームを添加することが好ましい。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のリゾチームの濃度は、例えば、通常１～２０μｇ／ｍＬであり、好ましくは６～１５μｇ／ｍＬであり、より好ましくは９～１３μｇ／ｍＬである。
調製工程においては、被検測定用試料におけるリゾチームの濃度が前記範囲となるように、被検試料にリゾチームを添加することが好ましい。
調製工程においては、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤として、リゾチーム及びポリエチレングリコールの少なくとも一方を用いることが好ましい。
リゾチームとポリエチレングリコールは食品に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質を阻害するため、これらを被検試料に添加することにより、微生物の細胞の定量性を向上させることができる。
リゾチームとポリエチレングリコールは食品に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質を阻害するため、これらを被検試料に添加することにより、微生物の細胞の定量性を向上させることができる。
また調製工程において、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤として、リゾチーム及びポリエチレングリコールを組み合わせて用いることが特に好ましい。
リゾチームとポリエチレングリコールが核酸増幅阻害物質に協奏的に作用し核酸増幅阻害物質の表面構造を変質させるため、これらを組み合わせて用いれば、被検試料に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質をより効率的に阻害することができる。
リゾチームとポリエチレングリコールが核酸増幅阻害物質に協奏的に作用し核酸増幅阻害物質の表面構造を変質させるため、これらを組み合わせて用いれば、被検試料に含まれる蛋白質由来の核酸増幅阻害物質をより効率的に阻害することができる。
また、調製工程においては、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液にマグネシウム塩、有機酸塩又はリン酸塩等を添加することが好ましい。
マグネシウム塩としては、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、炭酸マグネシウム等を挙げることができる。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度が、例えば、１～１０ｍＭ、好ましくは２～６ｍＭ、より好ましくは２～５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液にマグネシウム塩を添加することが好ましい。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中のマグネシウム塩の濃度が、例えば、１～１０ｍＭ、好ましくは２～６ｍＭ、より好ましくは２～５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液にマグネシウム塩を添加することが好ましい。
有機酸塩としては、クエン酸、酒石酸、プロピオン酸、酪酸等の塩を挙げることができる。塩の種類としては、ナトリウム塩、カリウム塩等を挙げることができる。また、リン酸塩として、ピロリン酸等を挙げることができる。これらは１種でもよく、２種又は３種以上の混合物であってもよい。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度が、例えば、合計量で０．１～２０ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭ、より好ましくは１～５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液に有機酸塩又はリン酸塩を添加することが好ましい。
被検測定用試料（核酸増幅反応液）中の有機酸塩又はリン酸塩の濃度が、例えば、合計量で０．１～２０ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭ、より好ましくは１～５ｍＭとなるように、被検試料又は被検試料より抽出したＤＮＡの溶液に有機酸塩又はリン酸塩を添加することが好ましい。
なお、調製工程において、前述したプライマー、プローブを含むデジタルＰＣＲ法を用いた核酸増幅、増幅産物の測定のための試薬、核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤、マグネシウム塩、機酸塩又はリン酸塩の添加の順序は問わず、また、同時に（あらかじめ混合する形態を含む）添加してもよい。
（３）増幅工程
増幅工程は、調製工程で調製した被検測定用試料中の細胞のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を測定する工程である。ただし、細胞のＤＮＡのターゲット領域を増幅する手段は、デジタルＰＣＲ法に限られない。
増幅工程は、調製工程で調製した被検測定用試料中の細胞のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅し、増幅産物を測定する工程である。ただし、細胞のＤＮＡのターゲット領域を増幅する手段は、デジタルＰＣＲ法に限られない。
ここで、デジタルＰＣＲ法は、一般的には、測定対象となるＤＮＡを含む試料を多数のウェルを備えるチップに分配し、ウェルごとに個別に核酸増幅を行い、各ウェルでの「増幅の有無」を検出する方法である。
デジタルＰＣＲ法には、市販のデジタルＰＣＲ装置を用いることができる。デジタルＰＣＲとして、例えば、２００００ウェルを備える疎水性のチップにより解析を行うＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ３Ｄ ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いることが好ましい。
核酸増幅反応の条件は特に限定されず、ＤＮＡのターゲット領域の長さ、プライマーのＴＭ値などを考慮して適宜設定することができる。
各ウェルにおける核酸増幅の有無は、蛍光分子などで標識されたプローブを増幅産物にハイブリダイズさせることにより判別することができる。すなわち、核酸増幅反応が起こったウェルではプローブに由来するシグナルが観察される。蛍光分子で標識されたプローブを用いる場合には、ケミルミフォトメータなどの装置によってウェルから発する蛍光を検出することができる。
本発明において「ＤＮＡのターゲット領域」とは、測定対象である微生物のＤＮＡのうち、デジタルＰＣＲによる増幅の目的とする領域である。例えば、被検試料に測定対象の微生物と異なる種類の細胞が含まれる場合には、ＤＮＡのターゲット領域は、測定対象の微生物に特異的な配列を含むように設定することが好ましい。また、目的によっては複数種の微生物に共通する配列を有するものであってもよい。さらに、ＤＮＡのターゲット領域は単一であっても、複数であってもよい。
ＤＮＡのターゲット領域の長さとしては、通常５０～５０００塩基、又は５０～３０００塩基を挙げることができる。核酸の増幅に用いるプライマーは核酸増幅法の原理に基づいて適宜設定することが可能であって、上記ＤＮＡのターゲット領域を特異的に増幅することができるものであれば特に制限されない。
特に、ラクトバチルス・パラカゼイの細胞を測定対象とする場合には、配列番号１及び配列番号２に示すプライマーセット、配列番号３に示すプローブを用いることができる（表４参照）。
また、複数種の微生物に共通するプライマーを用いると、被検試料中の複数種の微生物の細胞を測定することができる。また、特定の微生物に特異的なプライマーを用いると、被検試料中の特定の微生物の細胞を測定することができる。
（４）細胞数算出工程
細胞数算出工程は、前述の増幅工程で得た測定結果に基づいて、被検試料中の微生物の細胞数を算出する工程である。
そして、細胞数算出工程は、前述の増幅工程で得た増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、被検試料中の微生物の細胞数を測定することを含む。
このような形態とすることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差を解消することができるため、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
細胞数算出工程は、前述の増幅工程で得た測定結果に基づいて、被検試料中の微生物の細胞数を算出する工程である。
そして、細胞数算出工程は、前述の増幅工程で得た増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、被検試料中の微生物の細胞数を測定することを含む。
このような形態とすることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差を解消することができるため、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
また、細胞数算出工程は、さらに、増幅産物の測定結果を予め用意した微生物由来のＤＮＡ回収率で割ることにより、被検試料中の微生物の細胞数を測定することがより好ましい。
このような形態とすることで、抽出操作による測定の誤差を解消することができるため、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
このような形態とすることで、抽出操作による測定の誤差を解消することができるため、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
また、細胞数算出工程は、さらに、増幅産物の測定結果を予め算出したＰＣＲマスターミックスの反応率で割ることにより、被験試料中の細胞数を算出することがより好ましい。予め算出したＰＣＲマスターミックスの反応率を用いて被験試料中の細胞数を算出することで、増幅工程で反応しないＰＣＲマスターミックスによる測定の誤差を解消することができるため、より精度の高い測定結果を得ることができる。
また、細胞数算出工程は、さらに、増幅産物の測定結果に測定用試料調製までの希釈倍率を乗ずることにより、被験試料中の細胞数を算出することがより好ましい。測定用試料調製までの希釈倍率を用いて被験試料中の細胞数を算出することで、希釈による測定の誤差を解消することができるため、より精度の高い測定結果を得ることができる。
上述のＤＮＡ切断係数、微生物由来のＤＮＡ回収率、ＰＣＲマスターミックスの反応率の三種の係数は、予め算出する。以下、各種係数の算出方法について、説明する。
（Ａ）ＤＮＡ切断係数
ＤＮＡ切断係数は、基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
基準測定用試料中の微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程と、によって算出される。
ＤＮＡ切断係数は、基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
基準測定用試料中の微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程と、によって算出される。
「微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域」としては、例えば、耐熱性タンパク質由来の遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、及びｔｕｆ遺伝子を好ましく挙げることができる。
中でも、微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域は、耐熱性タンパク質由来の遺伝子であることが好ましい。微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域が耐熱性タンパク質由来の遺伝子であることで、熱処理の影響を受けることなく、ＤＮＡ切断係数を算出することができる。
耐熱性タンパク質由来の遺伝子としては、ヒートショックプロテインを好ましく挙げることができる。中でも、ヒートショックプロテイン６０をより好ましく挙げることができる。
なお、基準測定用試料中の前述の微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する方法は、前述の増幅工程と同様の方法を採ることができる。
ラクトバチルス・パラカゼイ由来のヒートショックプロテイン６０を測定対象とする場合には、配列番号４及び配列番号５に示すプライマーセット、配列番号６に示すプローブを用いることができる（表５参照）。
また、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のｐｈｅＳ遺伝子を測定対象とする場合には、配列番号８及び配列番号９に示すプライマーセット、配列番号１０に示すプローブを用いることができる（表９参照）。
また、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のｒｐｏＢ遺伝子を測定対象とする場合には、配列番号１１及び配列番号１２に示すプライマーセット、配列番号１３に示すプローブを用いることができる（表１０参照）。
また、ラクトバチルス・パラカゼイ由来のｔｕｆ遺伝子を測定対象とする場合には、配列番号１４及び配列番号１５に示すプライマーセット、配列番号１６に示すプローブを用いることができる（表１１参照）。
ここで、微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を同時に測定することがより好ましい。このような形態とすることで、ＤＮＡ切断係数を精度よく算出することができるため、被検試料中の微生物の細胞をより精度よく測定することができる。
微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を同時に測定する方法としては、二種の蛍光標識（例えば、ＦＡＭ標識とＨＥＸ標識）の検出を同時に行う方法を特に好ましく挙げることができる。
（Ｂ）微生物由来のＤＮＡ回収率
微生物由来のＤＮＡ回収率は、
被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
基準試料、及び、対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
基準試料中の総ＤＮＡ量から対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、基準試料中の微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
算出した微生物由来のＤＮＡ回収量を、基準試料に添加した微生物の理論添加量で割る工程と、によって算出される。
微生物由来のＤＮＡ回収率は、
被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
基準試料、及び、対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
基準試料中の総ＤＮＡ量から対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、基準試料中の微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
算出した微生物由来のＤＮＡ回収量を、基準試料に添加した微生物の理論添加量で割る工程と、によって算出される。
ここで、ＤＮＡ量測定工程は、分光光度計を用いて基準試料、及び、対照試料中の総ＤＮＡ量を測定することが、より好ましい。このような形態とすることで、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
また、基準試料に添加した微生物の理論添加量としては、微生物１セルあたりの重量の理論値を好ましく挙げることができる。
（Ｃ）ＰＣＲマスターミックスの反応率
ＰＣＲマスターミックスの反応率は、測定対象となる細胞のＤＮＡのターゲット領域を有する人工合成遺伝子を含む試験試料を用いて、被検試料と同一の操作により反応率算出の対象となるＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲ法による増幅を行う工程と、
増幅産物の結果をＰＣＲマスターミックスの反応率を算出する方法と、によって算出される。
ＰＣＲマスターミックスの反応率は、測定対象となる細胞のＤＮＡのターゲット領域を有する人工合成遺伝子を含む試験試料を用いて、被検試料と同一の操作により反応率算出の対象となるＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲ法による増幅を行う工程と、
増幅産物の結果をＰＣＲマスターミックスの反応率を算出する方法と、によって算出される。
また、増幅産物の結果からＰＣＲマスターミックスの反応率を算出する方法としては、増幅産物の測定結果を、試験試料中の人工合成遺伝子濃度で割る方法を好ましく挙げることができる。このような形態とすることで、より精度よく被検試料中の微生物の細胞数を測定することができる。
以下、実施例を示して本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本実施例では、熱処理を受けた被検試料中の微生物の細胞数の測定を行った。
（１）ＤＮＡ回収率の算出
（１－１）ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）の調製
表１に示すクリニカル食品と同一の条件で製造したクリニカル食品に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）菌体をその菌体濃度が２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．０ｎｇ／μｌ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１ｃｅｌｌ＝５ｆｇ での換算 ））となるよう添加し、菌体の添加後０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを用いて３倍希釈し、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）（菌体濃度５．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（２．５ｎｇ／μｌ））を調製した。
また、菌体を含まないクリニカル食品を対照試料とした。
そして、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）及び対照試料に対し、同一の条件での加熱処理を施した。
（１－１）ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）の調製
表１に示すクリニカル食品と同一の条件で製造したクリニカル食品に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）菌体をその菌体濃度が２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．０ｎｇ／μｌ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１ｃｅｌｌ＝５ｆｇ での換算 ））となるよう添加し、菌体の添加後０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを用いて３倍希釈し、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）（菌体濃度５．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（２．５ｎｇ／μｌ））を調製した。
また、菌体を含まないクリニカル食品を対照試料とした。
そして、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）及び対照試料に対し、同一の条件での加熱処理を施した。
（１－２）ＤＮＡの回収
まず、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）１．５ｍＬに対し、冷却遠心処理（８０００×Ｇ、１０分、４℃）を施すことにより上清を除去した。
次に、ジルコニアビーズ（Ｚｒ－ｂｅａｄｓ）９００ｍｇ（直径０．５ｍｍジルコニアビーズ４５０ｍｇ、直径３．０ｍｍジルコニアビーズ４５０ｍｇ）を加え、激しく１分間撹拌することにより、菌体破砕処理を行った。菌体破砕処理後の破砕物から、ＫＵＲＡＢＯ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（倉敷紡績社）を用いてＤＮＡを抽出し、０．２ｍｌのＤＮＡ回収量算出用ＤＮＡ精製溶液を得た。
また、対照試料に対しても同様の操作を施すことにより、対照ＤＮＡ精製溶液を得た。
まず、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）１．５ｍＬに対し、冷却遠心処理（８０００×Ｇ、１０分、４℃）を施すことにより上清を除去した。
次に、ジルコニアビーズ（Ｚｒ－ｂｅａｄｓ）９００ｍｇ（直径０．５ｍｍジルコニアビーズ４５０ｍｇ、直径３．０ｍｍジルコニアビーズ４５０ｍｇ）を加え、激しく１分間撹拌することにより、菌体破砕処理を行った。菌体破砕処理後の破砕物から、ＫＵＲＡＢＯ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（倉敷紡績社）を用いてＤＮＡを抽出し、０．２ｍｌのＤＮＡ回収量算出用ＤＮＡ精製溶液を得た。
また、対照試料に対しても同様の操作を施すことにより、対照ＤＮＡ精製溶液を得た。
（１－３）ＤＮＡ回収率の算出
分光光度計を用いて、ＤＮＡ回収量算出用試料及び対照ＤＮＡ精製溶液のＯＤ２６０ｎｍ吸光度を測定した。その後、ＤＮＡ回収量算出用試料のＯＤ２６０ｎｍ吸光度から対照ＤＮＡ精製溶液のＯＤ２６０ｎｍ吸光度を引くことにより、試料中のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）のＤＮＡ回収量を算出した。
併せて、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）のＤＮＡ回収量を理論添加量（２．５ｎｇ／μｌ）で割ることにより、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）由来のＤＮＡの回収率を算出した。
分光光度計を用いて、ＤＮＡ回収量算出用試料及び対照ＤＮＡ精製溶液のＯＤ２６０ｎｍ吸光度を測定した。その後、ＤＮＡ回収量算出用試料のＯＤ２６０ｎｍ吸光度から対照ＤＮＡ精製溶液のＯＤ２６０ｎｍ吸光度を引くことにより、試料中のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）のＤＮＡ回収量を算出した。
併せて、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）のＤＮＡ回収量を理論添加量（２．５ｎｇ／μｌ）で割ることにより、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）由来のＤＮＡの回収率を算出した。
（２）ＤＮＡ切断係数の算出
（２－１）ＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）の調製
ＤＮＡ回収工程後のＤＮＡ精製溶液２μｌを表２に示すＰＣＲマスターミックスに加えることで、ＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）を調製した。
ＤＮＡ回収工程後のＤＮＡ精製溶液２μｌを表２に示すＰＣＲマスターミックスに加えることで、ＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）を調製した。
ここで、表２中のｃＤＢＣ（濃縮ダイレクトコンポーネントの略）は核酸増幅阻害物質の働きを抑制する薬剤である。そしてｃＤＢＣは、ウシ血清アルブミン（シグマ社、以下、ＢＳＡと表記）、クエン酸三ナトリウム２水和物（関東化学社、以下、ＴＳＣと表記）、塩化マグネシウム６水和物（ナカライテスク社、以下、ＭｇＣｌ２と表記）、卵白リゾチーム（和光純薬、以下、単にリゾチームと表記）、Ｂｒｉｊ５８（登録商標：シグマ社）を、表３に示す濃度となるように混合することにより、調製することができる。
また、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（微生物固有のＤＮＡのターゲット領域）を測定するために使用したフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの配列を表４に示す。
また、ヒートショックプロテイン６０遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定するために使用したフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブの配列を表５に示す。
（２－２）微生物固有のＤＮＡのターゲット領域、及び微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅
調製したＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ２０Ｋ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔ ｖ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）のチップ中の各ウェル（およそ１８，０００ウェル）に、専用のローダーを用いて８６５ｐＬずつ分注した。分注後、デジタルＰＣＲ装置（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、表６に示すＰＣＲサーマルサイクル条件により、デジタルＰＣＲを実施した。二種の蛍光標識（ＦＡＭ標識とＨＥＸ標識）の検出を同時に行うことにより、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（微生物固有のＤＮＡのターゲット領域）及び、ヒートショックプロテイン６０遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）の増幅産物の有無の確認を行った。
調製したＤＮＡ切断係数算出用測定用試料（基準測定用試料）を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標）３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ ２０Ｋ Ｃｈｉｐ Ｋｉｔ ｖ２（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）のチップ中の各ウェル（およそ１８，０００ウェル）に、専用のローダーを用いて８６５ｐＬずつ分注した。分注後、デジタルＰＣＲ装置（ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ（登録商標） ３Ｄ Ｄｉｇｉｔａｌ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて、表６に示すＰＣＲサーマルサイクル条件により、デジタルＰＣＲを実施した。二種の蛍光標識（ＦＡＭ標識とＨＥＸ標識）の検出を同時に行うことにより、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（微生物固有のＤＮＡのターゲット領域）及び、ヒートショックプロテイン６０遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）の増幅産物の有無の確認を行った。
測定結果を表７に示す。また、測定したラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ量をｈｓｐ６０遺伝子量で割ることにより、ＤＮＡ切断係数を算出した。ＤＮＡ切断係数を表７に示す。
表７のとおり、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ遺伝子（微生物固有のＤＮＡのターゲット領域）の測定結果をヒートショックプロテイン６０遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）の測定結果を割ることで、ＤＮＡ切断係数を算出した。
（３）ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスの反応率の算出
次に、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲを行った場合の、該ＰＣＲマスターミックスの反応率の算出を行った。
次に、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスを用いてＰＣＲを行った場合の、該ＰＣＲマスターミックスの反応率の算出を行った。
（３－１）試験溶液の調製
（ｈｓｐ６０遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｐｈｅｓＳ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｒｐｏＢ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｔｕｆ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ特異領域）を人工的に連結した人工合成遺伝子連結体ｇＢｌｏｃｋｓ (Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ 製 配列番号７、及び、表８ 参照）をＴＥバッファーを用いて表１２に示す濃度となるよう希釈し、試験溶液を調製した。
（ｈｓｐ６０遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｐｈｅｓＳ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｒｐｏＢ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ｔｕｆ遺伝子）ＴＴＴＴＴ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ特異領域）を人工的に連結した人工合成遺伝子連結体ｇＢｌｏｃｋｓ (Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｅｓ 製 配列番号７、及び、表８ 参照）をＴＥバッファーを用いて表１２に示す濃度となるよう希釈し、試験溶液を調製した。
（３－２）ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスの反応率の算出
前述の増幅産物の測定と同様の方法により、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ量及びｈｓｐ６０遺伝子量を測定した。測定した値を基に、表２のＰＣＲマスターミックスの反応率を算出した。
結果を表１２に示す。なお、対照として、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックス中（表２ 参照）のｃＤＢＣを蒸留水に置換したＰＣＲマスターミックス（ｃＤＢＣ非含有ＰＣＲマスターミックス）についても測定を行った。
前述の増幅産物の測定と同様の方法により、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１６ＳｒＤＮＡ量及びｈｓｐ６０遺伝子量を測定した。測定した値を基に、表２のＰＣＲマスターミックスの反応率を算出した。
結果を表１２に示す。なお、対照として、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックス中（表２ 参照）のｃＤＢＣを蒸留水に置換したＰＣＲマスターミックス（ｃＤＢＣ非含有ＰＣＲマスターミックス）についても測定を行った。
なお、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ｐｈｅＳ遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定する場合に使用することのできるフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブの配列を表９に示す。
また、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ｒｐｏＢ遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定する場合に使用することのできるフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブの配列を表１０に示す。
また、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）ｔｕｆ遺伝子（微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域）を測定する場合に使用することのできるフォワードプライマー及びリバースプライマー、並びにプローブの配列を表１１に示す。
表１２の反応率の結果から、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスは、その反応率が高いことがわかった。そして、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスを用いることで、ＰＣＲによる測定（検出）限界が優れるものとなるため、より精度よく細胞数の測定をすることができることがわかった。
（４）細胞数の測定
次に、上述の結果を用いて被験試料中の細胞数の測定を行った。
次に、上述の結果を用いて被験試料中の細胞数の測定を行った。
（４－１）被検試料の調製
表２に示すクリニカル食品と同一の条件で製造したクリニカル食品に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）菌体をその菌体濃度が２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．０ｎｇ／μｌ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１ｃｅｌｌ＝５ｆｇ での換算 ））となるよう添加し、菌体の添加後０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを用いて３倍希釈し、被検試料を調製した。
その後、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）と同一の条件での加熱処理を施した。
表２に示すクリニカル食品と同一の条件で製造したクリニカル食品に、ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）菌体をその菌体濃度が２．０×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍｌ（１．０ｎｇ／μｌ（ラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）１ｃｅｌｌ＝５ｆｇ での換算 ））となるよう添加し、菌体の添加後０．１％Ｔｗｅｅｎ８０－ＰＢＳを用いて３倍希釈し、被検試料を調製した。
その後、ＤＮＡ回収量算出用試料（基準試料）と同一の条件での加熱処理を施した。
（４－２）ＤＮＡの回収
まず、被検試料（１．５ｍＬ）に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、被験試料中のＤＮＡ（０．２ｍＬ）の回収を行った。ここで、ＤＮＡの抽出は、前述の（１－２）と同様の方法により行った。
まず、被検試料（１．５ｍＬ）に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、被験試料中のＤＮＡ（０．２ｍＬ）の回収を行った。ここで、ＤＮＡの抽出は、前述の（１－２）と同様の方法により行った。
（４－３）被検測定用試料の調製
次に、回収したＤＮＡを含む被検測定用試料の調製を行った。ここで、被検測定用試料の調製は、前述の（２－１）と同様の方法により行った。
次に、回収したＤＮＡを含む被検測定用試料の調製を行った。ここで、被検測定用試料の調製は、前述の（２－１）と同様の方法により行った。
（４－４）微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅及び、細胞数の算出
被検測定用試料を用いて、微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅を行った。微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅は、前述の（２－２）と同様の方法により行った。
被検測定用試料を用いて、微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅を行った。微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅は、前述の（２－２）と同様の方法により行った。
（４－５）細胞数の算出
増幅産物の測定結果から得たラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）固有のＤＮＡのターゲット領域の測定結果を、測定したＤＮＡ切断係数と、測定したラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）由来のＤＮＡの回収率と、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスの反応率とで割り、かつ測定用試料調製までの希釈倍率を乗じることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差と、抽出操作による測定の誤差と、増幅工程で反応しないＰＣＲマスターミックスによる測定の誤差と、希釈による測定の誤差と、を解消させ、被検試料中のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の高精度な細胞数の値を算出した。
増幅産物の測定結果から得たラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）固有のＤＮＡのターゲット領域の測定結果を、測定したＤＮＡ切断係数と、測定したラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）由来のＤＮＡの回収率と、ｃＤＢＣを含むＰＣＲマスターミックスの反応率とで割り、かつ測定用試料調製までの希釈倍率を乗じることで、微生物中のＤＮＡの切断による測定の誤差と、抽出操作による測定の誤差と、増幅工程で反応しないＰＣＲマスターミックスによる測定の誤差と、希釈による測定の誤差と、を解消させ、被検試料中のラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）の高精度な細胞数の値を算出した。
本発明は、出荷、受け入れ、検査の過程でのさまざまな処理、例えば熱処理等を受けた被検試料中の微生物の細胞数の測定に応用することができる。
Claims (7)
- 被検試料中の微生物の細胞数を測定する方法であって、
前記微生物の細胞を含む前記被検試料に対してＤＮＡの抽出操作を行うことにより、当該被検試料に含まれるＤＮＡを回収するＤＮＡ回収工程と、
前記ＤＮＡ回収工程で回収したＤＮＡを含む被検測定用試料を調製する調製工程と、
前記被検測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域をデジタルＰＣＲ法により増幅させる増幅工程と、
前記増幅工程で得た測定結果に基づいて、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を算出する細胞数算出工程と、
を有し、
前記細胞数算出工程は、
前記増幅産物の測定結果を予め用意したＤＮＡ切断係数で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを含み、
前記ＤＮＡ切断係数は以下の工程によって算出されることを特徴とする、方法：
前記ＤＮＡ切断係数は、
被検試料と同一の処理を受けた基準試料を用いて、被検試料と同一の操作によりＤＮＡを回収し、基準測定用試料を調製する工程と、
基準測定用試料中の前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域及び前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物を測定する工程と、
前記微生物固有のＤＮＡのターゲット領域の増幅産物の測定結果を、前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域の増幅産物の測定結果で割る工程と、によって算出され、
前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域は、耐熱性タンパク質をコードする遺伝子、ｐｈｅＳ遺伝子、ｒｐｏＢ遺伝子、及びｔｕｆ遺伝子からなる群から選択されるいずれかの遺伝子のターゲット領域であることを特徴とする。 - 前記微生物の細胞の単体が単一で備える遺伝子のターゲット領域が、耐熱性タンパク質をコードする遺伝子であり、
前記耐熱性タンパク質は、ヒートショックプロテインであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 - 前記ヒートショックプロテインは、ヒートショックプロテイン６０であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
- 前記基準試料が、被検試料と同じ条件のもとに製造された製品において、製造、出荷、受け入れ、検査等で受けた処理、熱処理の条件が実質的に同一な試料である、請求項１～３何れか一項に記載の方法。
- 前記細胞数算出工程は、さらに、前記増幅産物の測定結果を予め用意した前記微生物由来のＤＮＡ回収率で割ることにより、前記被検試料中の前記微生物の細胞数を測定することを含み、
前記ＤＮＡ回収率は以下の工程によって算出されることを特徴とする、請求項１～４の何れか一項に記載の方法：
被検試料と同一の処理を受けた基準試料、及び、微生物の細胞を含まない対照試料中のＤＮＡを、被検試料と同一の操作により回収する工程と、
前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定する総ＤＮＡ量測定工程と、
前記基準試料中の総ＤＮＡ量から前記対照試料の総ＤＮＡ量を引くことにより、前記基準試料中の前記微生物由来のＤＮＡ回収量を算出する工程と、
算出した前記微生物由来のＤＮＡ回収量を、前記基準試料に添加した前記微生物の理論添加量で割る工程。 - 前記総ＤＮＡ量測定工程は、分光光度計を用いて前記基準試料、及び、前記対照試料中の総ＤＮＡ量を測定することを含む、請求項１～５の何れか一項に記載の方法。
- 前記細胞が生細胞である、請求項１～６の何れか１項に記載の方法。
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