JP2015035977A - 核酸の損傷の程度の評価方法、食品の加工の程度の評価方法、及び核酸の定量方法 - Google Patents
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Abstract
Description
第1の実施の形態に係る核酸の損傷の程度の評価方法は、分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、PCRの条件を調整することと、調整されたPCRの条件の下、分解作用を受けた鋳型核酸配列から、PCRの条件を調整した時と同じ複数のプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用による鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることと、を含む。
第2の実施の形態に係る食品の加工の程度の評価方法は、分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、PCRで、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、PCRの条件を調整することと、調整されたPCRの条件の下、食品から採取した分解作用を受けた鋳型核酸配列から、PCRの条件を調整した時と同じ複数のプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、食品の加工の程度を求めることと、を含む。
第3の実施の形態に係る核酸の定量方法は、分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、PCRで、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、PCRの条件を調整することと、調整されたPCRの条件の下、分解作用を受けた鋳型核酸配列から、PCRの条件を調整した時と同じ複数のプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成し、複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用を受ける前の鋳型核酸配列の量を求めることと、を含む。
以下に本発明の実施の形態を説明する。但し、本発明は以下の実施例に限定されないことはもちろんである。
(鋳型DNA溶液の調製)
TOPO TA Cloning Kit(Life Technologies社製)を用いて、分解作用を受けていないコムギ18SrRNA配列(Accession No.AY049040)をプラスミドDNAに導入した。得られた組換えプラスミドDNAをEcoRVを用いて切断し、分解作用を受けていない18SrRNA遺伝子が挿入された直鎖状組換えプラスミドDNAを含む鋳型DNA溶液を調製した。
表1に記載の4つのプライマーペアと、蛍光標識核酸プローブと、を用意した。4つのプライマーペアは、配列番号1の共通するフォワードプライマーを有する。また、第1のプライマーペアは配列番号2のリバースプライマーを有し、第2のプライマーペアは配列番号3のリバースプライマーを有し、第3のプライマーペアは配列番号4のリバースプライマーを有し、第4のプライマーペアは配列番号5のリバースプライマーを有する。
上記の10μLの反応液の鋳型プラスミドに代えて、動物由来のDNA、酵母由来のDNA、及び微生物由来のDNAをそれぞれ20ng加えた反応液を調製した。これらの非植物由来のDNAを加えた以外は上記の調整されたPCRの条件を用いて、リアルタイムPCRを実施した。その結果、図3ないし図6に示すように、植物由来の鋳型DNAのみが増幅されて、増幅産物が増幅曲線としてグラフに現れた。動物由来のDNA、酵母由来のDNA、及び微生物由来のDNAは増幅されず、増幅曲線は現れなかった。したがって、表1に示す第1ないし第4のプライマーペアのいずれもが、動物由来のDNA、酵母由来のDNA、及び微生物由来のDNAと交差しないことが確認された。
上記の10μLの反応液において、鋳型DNA溶液における鋳型DNAのコピー数を5種類に分けた反応液を用意した。鋳型DNAのコピー数以外は上記の調整されたPCRの条件を用いて、リアルタイムPCRを実施した。その結果、図7に示すように、鋳型DNA溶液における鋳型DNAのコピー数がいずれであっても、配列長が約100bpの増幅産物の増幅曲線、配列長が約200bpの増幅産物の増幅曲線、配列長が約400bpの増幅産物の増幅曲線、及び配列長が約800bpの増幅産物の増幅曲線が、実質的に同じになった。また、図8に示すように、鋳型DNAのコピー数が減少するにつれて、Ct値が高くなる傾向にあったが、鋳型DNAのコピー数が同一である場合は、配列長が約100bpの増幅産物のCt値、配列長が約200bpの増幅産物のCt値、配列長が約400bpの増幅産物のCt値、及び配列長が約800bpの増幅産物のCt値が、実質的に同じになった。したがって、鋳型DNAの広い濃度範囲において、増幅産物の配列長による生成効率の違いが生じないことが確認された。
コムギ粒7gをマルチビーズショッカー(安井器械社製)で粉砕し、コムギ粉砕物を得た。加熱していないコムギ粉砕物から、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けていないDNAを抽出した。また、120℃で15分、30分、60分、及び120分加熱したコムギ粉砕物のそれぞれから、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けたDNAを抽出した。その後、コムギ粉砕物から抽出したDNAを鋳型DNAとして用いた以外は、上記の調整されたPCRの条件を用いて、リアルタイムPCRを実施した。
大豆粒7gをマルチビーズショッカー(安井器械社製)で粉砕し、大豆粉砕物を得た。加熱していない大豆粉砕物から、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けていないDNAを抽出した。また、160℃で15分、30分、60分、及び120分加熱した大豆粉砕物のそれぞれから、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けたDNAを抽出した。その後、大豆粉砕物から抽出したDNAを鋳型DNAとして用いた以外は、上記の調整されたPCRの条件を用いて、リアルタイムPCRを実施した。
トウモロコシ粒7gをマルチビーズショッカー(安井器械社製)で粉砕し、トウモロコシ粉砕物を得た。加熱していないトウモロコシ粉砕物から、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けていないDNAを抽出した。また、140℃で15分、30分、60分、及び120分加熱したトウモロコシ粉砕物のそれぞれからも、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けたDNAを抽出した。その後、トウモロコシ粉砕物から抽出したDNAを鋳型DNAとして用いた以外は、上記の調整されたPCRの条件を用いて、リアルタイムPCRを実施した。
コムギ、大豆、及びトウモロコシの結果から、種によらず、配列長に対するCt値の増加率が低い場合は、DNAの損傷の程度が小さく、食品の加工の程度も小さいと評価可能であり、配列長に対するCt値の増加率が高い場合は、DNAの損傷の程度が大きく、食品の加工の程度も大きいと評価可能であることが示された。
コムギを例にとり、食品の加工度を、以下のように定義し、算出した。加熱等の加工されたコムギから抽出された鋳型DNA中の100bpのある部分配列が断片化せずに残存している確率をa(0≦a≦1)とすると、鋳型DNA中の100bp当たりの分解率は(1−a)で表される。この100bp当たりの分解率(1−a)は、コムギの加熱による加工度と相関するから、(1−a)をコムギの加工度と定義した。図14ないし図18に示した近似一次関数のそれぞれの傾きをk、PCRの1サイクルあたりの増幅率をbとすると、100bpあたりのCt値の差(増加量)は100kであり、PCR後の鋳型DNA中のある部分配列のコピー数NWLに対して、配列長が100bp短いある部分配列のコピー数NWSの比NWS/NWLはb100kである。この場合、鋳型DNA中の100bpのある部分配列が断片化せずに残存している確率aは、1/(b100k)であり、100bp当たりの分解率(1−a)、すなわち、コムギの加工度(1−a)は、1−1/(b100k)である。
遺伝子組換え作物(GMO)混入食品として、モンサント社のラウンドアップレディー大豆(RRS)が1%混入している大豆サンプルを用意した(IRMMより購入。Code:ERM−BF410DK)。次に、未加熱の大豆サンプルから、鋳型DNAを抽出した。また、160℃で、15分、30分、60分、及び120分加熱した大豆サンプルのそれぞれからも、鋳型DNAを抽出した。その後、上記の方法と同様に、加工度を算出したところ、表3に示すとおりであった。例えば、GMO検出試験を行う場合には、偽陰性が5%未満であること要求され、これは、21回試験を行い、20回以上、GMOを検出できることに相当する。表3に示すように、加工度0.5までは、21回中21回、RRSを検出できたが、加工度0.75では、21回中、RRSを検出できたのは16回だけであった。よって、加工度が0.5以下であれば、正確にRRSの検出試験を行えることが示された。
未加工の大豆をマルチビーズショッカー(安井器械社製)で粉砕し、大豆粉砕物を得た。加熱していない大豆粉砕物から、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けていないDNAを抽出した。その後、抽出したDNAを希釈した後、鋳型DNAとし、大豆内在性遺伝子であるレクチン遺伝子(Le1)を標的として、表4に示す第D1及び第D2のプライマーペア、並びにプローブを用いてデジタルPCRを行った。
未加工のコムギをマルチビーズショッカー(安井器械社製)で粉砕し、コムギ粉砕物を得た。加熱していないコムギ粉砕物から、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けていないDNAを抽出した。その後、抽出したDNAを希釈した後、鋳型DNAとし、18SrRNAをコードするDNA配列内の植物特異的配列を標的として、表1に示した第1及び第2のプライマーペア、並びにプローブを用いてデジタルPCRを行った。
大豆粉をマルチビーズショッカー(安井器械社製)で粉砕し、大豆粉砕物を得た。加熱していない大豆粉砕物から、Dneasy Plant Maxi kitを用いて、加熱による分解作用を受けていないDNAを抽出した。その後、抽出したDNAを鋳型DNAとし、大豆内在性遺伝子であるレクチン遺伝子(Le1)を標的として、表5に示す第5及び第6のプライマーペア、並びにプローブを用いてリアルタイムPCRを行った。
NSL=NSS×d^(LL/LS) ・・・(1)
NSL=NSS÷b^ΔCt ・・・(2)
NSL=NSS×d^(412/118) ・・・(3)
NSL=NSS÷2^5.18 ・・・(4)
(3)式及び(4)式の連立方程式を解くと、加圧加熱処理された大豆粉砕物から抽出されたLe1が断片化せずに残存している確率dは、0.36であった。
19,028÷0.36=52,855 ・・・(5)
上述したように、公知の手法により求められた加熱されなかった大豆粉砕物から抽出されたLe1のコピー数は、53,417であったため、見積もられたコピー数の精度は高かった。したがって、加工される前の食品の入手が困難である場合であっても、加工した食品から抽出したDNAに含まれる鋳型核酸配列の量と、増幅産物のCt値の差と、に基づいて、加工される前の食品に含まれる鋳型核酸配列の量を見積もることが可能であることが示された。
Claims (50)
- 分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、前記複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、
前記調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、分解作用を受けた前記鋳型核酸配列から、前記複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、
前記分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、前記分解作用による前記鋳型核酸配列の損傷の程度を求めることと、
を含む、核酸の損傷の程度の評価方法。 - 前記損傷の程度を求めることにおいて、前記複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物の生成効率と、長い配列長の増幅産物の生成効率と、の差に基づいて、前記鋳型核酸配列の損傷の程度を求める、請求項1に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記生成効率が、前記増幅産物が所定の量生成される時の前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を表す、閾値サイクル値で表される、請求項1又は2に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記閾値サイクル値の増加率を求める、請求項3に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増加率が高いほど、前記損傷の程度が大きいと評価する、請求項4に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応が、リアルタイムPCRである、請求項1ないし5のいずれか1項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応が、デジタルPCRである、請求項1又は2に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記生成効率が、前記ポリメラーゼ連鎖反応を複数回実施した際に前記増幅産物が生成する確率、もしくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応を所定の回数実施した際に前記増幅産物が生成する回数で表される、請求項7に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記生成効率が、増幅が観察されたウェルの数又は当該増幅が観察されたウェルの数に基づく数値で表される、請求項7又は8に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記生成効率の減少率を求める、請求項8又は9に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、温度条件である、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの配列である、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの濃度である、請求項1ないし10のいずれか1項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記鋳型核酸配列が、植物に特異的な核酸配列の少なくとも一部である、請求項1ないし13のいずれか1項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記鋳型核酸配列が、18SrRNAをコードする核酸配列の少なくとも一部である、請求項1ないし14のいずれか1項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 前記鋳型核酸配列が、動物に特異的な核酸配列の少なくとも一部である、請求項1ないし13のいずれか1項に記載の核酸の損傷の程度の評価方法。
- 分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、前記複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、
前記調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、食品から採取した分解作用を受けた前記鋳型核酸配列から、前記複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、
前記分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、前記食品の加工の程度を求めることと、
を含む、食品の加工の程度の評価方法。 - 前記食品の加工の程度を求めることにおいて、前記複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物の生成効率と、長い配列長の増幅産物の生成効率と、の差に基づいて、前記食品の加工の程度を求める、請求項17に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記生成効率が、前記増幅産物が所定の量生成される時の前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を表す、閾値サイクル値で表される、請求項17又は18に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記食品の加工の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記閾値サイクル値の増加率を求める、請求項19に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記食品の加工の程度を求めることにおいて、前記増加率が高いほど、前記食品の加工の程度が大きいと評価する、請求項20に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応が、リアルタイムPCRである、請求項17ないし21のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応が、デジタルPCRである、請求項17又は18に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記生成効率が、前記ポリメラーゼ連鎖反応を複数回実施した際に前記増幅産物が生成する確率、もしくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応を所定の回数実施した際に前記増幅産物が生成する回数で表される、請求項23に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記生成効率が、増幅が観察されたウェルの数又は当該増幅が観察されたウェルの数に基づく数値で表される、請求項23又は24に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記損傷の程度を求めることにおいて、前記増幅産物の配列長に対する前記生成効率の減少率を求める、請求項24又は25に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、温度条件である、請求項17ないし26のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの配列である、請求項17ないし26のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの濃度である、請求項17ないし26のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記鋳型核酸配列が、植物に特異的なDNA配列の少なくとも一部である、請求項17ないし29のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記鋳型核酸配列が、18SrRNAをコードするDNA配列の少なくとも一部である、請求項17ないし30のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記鋳型核酸配列が、動物に特異的なDNA配列の少なくとも一部である、請求項17ないし29のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 前記求められた食品の加工の程度に基づき、前記食品に対して、遺伝子組換え作物検出試験を行うか否かを決定することを更に含む、請求項17ないし32のいずれか1項に記載の食品の加工の程度の評価方法。
- 分解作用を受けていない鋳型核酸配列から、ポリメラーゼ連鎖反応で、複数の異なるプライマーペアを用いてそれぞれ配列長が異なる複数の増幅産物を生成した場合に、前記複数の増幅産物のそれぞれの生成効率が実質的に同じになるよう、前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件を調整することと、
前記調整されたポリメラーゼ連鎖反応の条件の下、分解作用を受けた前記鋳型核酸配列から、前記複数のプライマーペアを用いて複数の増幅産物を生成し、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率を求めることと、
前記分解作用を受けた鋳型核酸配列から生成された前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることと、
を含む、核酸の定量方法。 - 分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることにおいて、前記複数の増幅産物のうち、短い配列長の増幅産物の生成効率と、長い配列長の増幅産物の生成効率と、の差に基づいて、分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量の程度を求める、請求項34に記載の核酸の定量方法。
- 前記生成効率が、前記増幅産物が所定の量生成される時の前記ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル数を表す、閾値サイクル値で表される、請求項34又は35に記載の核酸の定量方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応が、リアルタイムPCRである、請求項34ないし36のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応が、デジタルPCRである、請求項34又は35に記載の核酸の定量方法。
- 前記生成効率が、前記ポリメラーゼ連鎖反応を複数回実施した際に前記増幅産物が生成する確率、もしくは、前記ポリメラーゼ連鎖反応を所定の回数実施した際に前記増幅産物が生成する回数で表される、請求項38に記載の核酸の定量方法。
- 前記生成効率が、増幅が観察されたウェルの数又は当該増幅が観察されたウェルの数に基づく数値で表される、請求項38又は39に記載の核酸の定量方法。
- 分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることが、前記複数の増幅産物のそれぞれ異なる生成効率に基づいて、前記分解作用を受けた鋳型核酸配列のうち、未損傷で残っている鋳型核酸配列の割合を算出することを含む、請求項34ないし40のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることが、前記分解作用を受けた鋳型核酸配列の量を測定することを更に含む、請求項41に記載の核酸の定量方法。
- 分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を求めることが、前記測定された分解作用を受けた鋳型核酸配列の量を、前記未損傷で残っている鋳型核酸配列の割合で除することにより、分解作用を受ける前の前記鋳型核酸配列の量を算出することを更に含む、請求項42に記載の核酸の定量方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、温度条件である、請求項34ないし43のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの配列である、請求項34ないし43のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 前記ポリメラーゼ連鎖反応の条件が、前記複数のプライマーペアのそれぞれの濃度である、請求項34ないし43のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 前記鋳型核酸配列が、植物に特異的なDNA配列の少なくとも一部である、請求項34ないし46のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 前記鋳型核酸配列が、18SrRNAをコードするDNA配列の少なくとも一部である、請求項34ないし47のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 前記鋳型核酸配列が、動物に特異的なDNA配列の少なくとも一部である、請求項34ないし46のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
- 前記鋳型核酸配列が、生物種に特異的な内在性遺伝子配列の少なくとも一部である、請求項34ないし46のいずれか1項に記載の核酸の定量方法。
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