CN103154268A - 用于检测存在于肉中的驴肉的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含特异性引物-探针组的试剂盒，其借助于实时PCRTaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉。本发明能够检测直到0.1皮克的驴肉污染。用对驴物种具有特异性的试剂盒，借助于直到第40个循环与马、猪、牛、绵羊、鸡和火鸡物种无交叉反应，特异性检测在生和热处理的肉混合物中的驴肉成为可能。

Description

用于检测存在于肉中的驴肉的试剂盒
发明领域
本发明涉及包含特异性引物-探针组的试剂盒，其借助于实时PCR TaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉。
发明背景
聚合酶链反应（PCR）简言之是通过与侧接待扩增的DNA区段的3'-末端互补的短单链寡核苷酸序列（引物），对DNA上的一个或多个靶区的酶促扩增过程。在PCR应用中，在扩增属于任何生物的特异性基因或基因区域以获得足够的遗传材料用于分析后，可以使用次级方法通过进一步分析扩增子（PCR产物）执行物种鉴定。近年来，开始使用给出定量结果的实时聚合酶链反应（PCR）方法，以便检测肉产品中的物种。在实时PCR方法中，靶基因的扩增通过增加的荧光信号进行监控，所述荧光信号与反应中的PCR产物量按比例增加。
在实时PCR方法中，水解探针（TaqMan®探针）方法在为检测肉物种执行的研究中是特别优选的，因为发出的荧光信号的强度与每个循环中产生的PCR产物（扩增子）的量平行。在这种方法中，使用荧光标记的寡核苷酸探针（荧光标记的短单链寡核苷酸分子）。它设计为在PCR反应的退火和延伸期期间退火到引物内部的靶序列。以其游离完整形式，无法测量荧光发射，因为报道染料的荧光发射被猝灭染料吸收。然而，一旦在探针退火到靶链之一后，探针将被Taq聚合酶的5' -3'外切核酸酶活性降解。因此，报道和猝灭染料变得分离，并且报道染料的发射不再转移至猝灭染料，导致报道荧光发射增加。这个过程在每个循环中发生且不干扰PCR产物的指数累积。荧光的增加按循环进行测量且与形成的PCR产物量直接关联。在其下超过阈值的循环数目称为“Ct（循环阈值）值”，并且它给出关于靶DNA区域的起始量的信息。
对于靶物种特异性的PCR引物仅在合适反应条件下在它们对于其特异性的DNA的存在下产生PCR产物。待扩增的DNA片段根据所检测的目的个体、群体、物种或家族所显示的差异水平进行选择。待用于物种区分的靶DNA片段的碱基序列需要显示出在物种之间的最大差异和在物种内的个体和群体之间的最小差异。因此，将在靶向基因区域的扩增中使用的寡核苷酸引物和探针的特异性直接鉴定方法的特异性。
关于用实时PCR TaqMan探针技术检测肉产品中的驴的首个和仅有研究已由Chisholm等人执行。他们使用TaqMan探针方法执行关于马和驴物种的检测的研究，并且他们使用线粒体细胞色素b（cytb）基因设计引物和探针[1]。但是他们的研究中使用的方法在第30个循环（Ct 30）后不足以区分紧密相关的物种，并且出现非特异性反应。扩增子大小对于马物种是69 bp（碱基对），并且对于驴物种是119 bp。马特异性引物和探针组显示出牛和驴DNA的非特异性反应。并且对于驴特异性的引物和探针组引起与马DNA的交叉反应（Ct 30.77）。在这个应用中，发现对于马的检测极限是25ng和对于驴的检测极限是1 ng。
Doole等人描述了通过使用在线粒体细胞色素b（cytb）上设计的特异性引物和探针组的基于实时PCR的检测方法，以便鉴定在肉和肉产品中存在的牛、绵羊、猪、火鸡和鸡物种组织。对于猪特异性的引物和探针组显示出与牛、绵羊、鸡和火鸡的交叉反应。对于这些物种检测到的Ct值分别为31.13、37.08、30.00、34.64，并且对于猪的理论检测极限是0.02%。
Tanabe等人在线粒体细胞色素b基因上设计了对于猪、鸡、牛、绵羊和马特异性的引物和探针，并且用实时PCR TaqMan技术以100 fg/μl水平检测每个物种[3]。
Jonker等人也开发了通过使用物种特异性引物和探针组以0.01%水平用于鉴定加工的肉产品中存在的牛、猪、马、绵羊、鸡和火鸡物种的实时PCR方法[4]。
Frezza等人可以通过使用16S rRNA基因以0.01-0.05ng水平检测牛和绵羊物种，以及通过使用细胞色素b基因以0.5ng水平检测鸡和猪物种[5]。
Köppel等人开发了通过使用β-肌动蛋白和促乳素受体基因以0.32-32ng水平用于检测牛、猪、鸡和火鸡物种的多重实时PCR方法[6]。
现有技术已知的申请，国际专利文件号WO2007119066，公开了致使食物中存在的肉类中的动物组织能够通过使用PCR技术进行检测的试剂盒。
发明概述
本发明的目的是实现包含用于检测其它肉产品中的驴肉的特异性引物探针组的试剂盒。
本发明的另一个目的是实现包含特异性引物探针组的试剂盒，其致使能够检测到肉产品中直到0.1皮克的驴DNA。本发明的其他目的是实现包含特异性引物探针组的试剂盒，其直到第40个循环不显示与可以存在于反应混合物中的属于其他动物物种的DNA的任何交叉反应，并且因此仅显示与驴DNA的反应，并且致使能够特异性检测驴物种。
本发明的另外一个目的是实现包含特异性引物探针组的试剂盒，其致使能够检测热处理的肉产品中的驴DNA。
发明详述
实现为达到本发明的目的的“用于检测肉产品中的驴肉的试剂盒”在附图中举例说明，其中
（图1）是响应在0.0001和100ng之间的驴DNA的DNA稀释度所接受的荧光信号视图。
（图2）是响应驴DNA的对数浓度检测到的Ct值之间的线性关系视图。
本发明包含借助于实时PCR TaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉的特异性引物-探针组。特异性引物-探针组是用实时PCR技术检测驴物种所需的组分之一。在试剂盒内，存在设计为对于驴物种特异性的具有21个核苷酸长度的正向引物，对于驴物种特异性的具有18个核苷酸长度的反向引物，和其为具有28个核苷酸长度的水解探针的TaqMan探针，其可以特异性退火到用正向和反向引物扩增的区域。
在试剂盒内还存在无核酸酶水和实时PCR反应混合物。第一次DNA分离应从肉产品完成，以便通过使用试剂盒检测驴物种。分离的DNA的纯度需要很高，它不应包含PCR抑制剂，并且其260/280nm比应是至少1.7。实时反应在200μ1的PCR管和50μ1的总体积中执行。反应混合物由以下组成:商购可得的实时PCR主混合物（25μ1）（在实时PCR主混合物中：存在HotStarTaq DNA聚合酶、PCR缓冲液、dNTP混合物和8 mM MgCl2）、0.8μΜ正向和反向引物、0.2μΜ TaqMan探针、2μΜ分离的DNA（其浓度小于500ng）和21.2 μl无核酸酶水。在实时PCR装置中，使用对于在其下用于标记TaqMan探针的荧光染料（报道荧光色素）的激发和发射的波长合适的滤光器。执行的温度循环为在95℃激活15分钟后在95℃15秒、在60℃1分钟共40个循环。
提及的试剂盒中存在的引物探针组由正向引物、反向引物和双重标记的寡核苷酸探针组成，它们互补靶向线粒体DNA NADH脱氢酶亚单位5基因（ND5）上的区域（图表1）。引物-探针组包括位于ND5基因（登记号X97337）上的11802-11823核苷酸之间的21核苷酸长度正向引物；位于11867-11884核苷酸之间的20核苷酸长度反向引物；和位于11827-11855核苷酸之间的28核苷酸长度双重标记的寡核苷酸探针（表1）。
在引物探针组的设计中，线粒体DNA（MtDNA）的重复数目和针对热效应分解的抗性高于核DNA（nDNA）。由于这个原因，选择线粒体DNA，因为它致使能够检测驴物种，其具有足够高的突变率以致使能够即使在低浓度下测定并分开紧密相关的物种。
对于驴物种特异性的引物和TaqMan探针组在线粒体ND5（NADH脱氢酶亚单位5）基因上进行设计，并且使它适配用于检测驴的试剂盒。ND5基因的核苷酸长度和突变程度足以设计物种特异性引物-探针。因此，在通过使用用于检测驴肉的引物和探针组实现的实时PCR方法中，反应继续，即使直至第40个循环，也不会出现与其它动物物种的交叉反应。并且这增加了所开发的方法的灵敏度。
对于驴物种特异性设计的引物的核苷酸序列以及扩增产物的长度和基因组定位在表1中给出。
表1. 用于检测驴物种的引物和探针组的核苷酸序列和基因组定位信息
Figure 767605DEST_PATH_IMAGE002
*：ND5：NADH脱氢酶亚单位5基因
** ：bp ：碱基对
*** ：报道染料
**** 猝灭染料
并且引物和探针组的寡核苷酸序列与广泛食用的其他动物物种的靶基因区域的寡核苷酸序列的比较在图表1给出。
图表1. 驴的靶DNA与其他动物物种的比较
Figure 2011800457276100002DEST_PATH_IMAGE003
当对于驴物种特异性的引物和探针的核苷酸序列与其他广泛食用的动物物种的核苷酸序列比较时，观察到正向引物与马物种相差6 bp，探针相差5bp，以及反向引物相差4bp，所述马物种是遗传上最紧密的物种（图表1）。这致使能够特异性检测驴物种。
驴肉可以在肉产品如意大利香肠、香肠、肉丸、肉罐头等中检测到。PCR产物仅可以通过使用对于肉产品中的驴物种特异性的引物-探针组在驴DNA的存在下获得。
在表2中，给出了用不同装置检测的设计的引物和探针的CT值。可见用两种不同装置用设计的引物-探针组对驴物种的检测可能直到0.0001ng。
表2. 对于驴物种特异性的引物-探针的灵敏度测试结果
Figure 248527DEST_PATH_IMAGE004
对于驴物种特异性的引物-探针的特异性测试结果在表3给出。据此，观察到对于驴物种特异性的每一个引物和探针直到第40个循环均不显示与其他测试的动物物种的交叉反应。
表3. 对于驴物种特异性的引物-探针的特异性测试结果
Figure 2011800457276100002DEST_PATH_IMAGE005
ND：未检测到
在实时PCR中，通过针对靶核酸的系列十倍稀释的对数浓度标绘Ct值（第一次检测到荧光信号的循环数目）获得的标准曲线是用于确定测定质量的非常有用的工具。在图2中，给出了通过使用得自驴DNA的系列10倍稀释（范围为0.0001 - 100 ng DNA）的Ct值构建的标准曲线。其为斜率函数的测定效率主要是PCR反应已如何良好地进行的指示。当标准曲线的斜率是3.33时，实时PCR的效率接纳为100%。用对于驴物种特异性设计的引物-探针组标绘的标准曲线的斜率是3.23，发现这非常接近于3.33值。测定在DNA浓度和Ct值之间的关联是0.999（图2）。在ct值和DNA浓度之间的线性关系的存在致使驴物种能够用设计的引物-探针组在0.0001-100 ngDNA浓度之间以高准确度定量检测。
对于生和熟肉丸检测到的Ct值在表4中可见。目的在于测试在肉产品的生产中应用的热处理对本发明试剂盒的准确度的作用，通过将驴肉以不同量（0.0001、0.001、0.01、0.1、1、10和100 ng）加入牛肉中制备肉混合物。在200℃30分钟或在120℃在15psi的压力下（高压灭菌）30分钟，将两种不同的热处理应用于提及的肉混合物。确定具有对于驴特异性的引物-探针组的TaqMan探针方法给出成功结果，并且检测极限对于在200℃热处理30分钟的样品是0.001ng，并且对于在120℃在15pis下热处理30分钟的样品是0.01ng。因此，发现对肉产品应用热处理对用提及的方法用于检测来自驴物种的肉的方法的灵敏度没有负面作用（表4）。
表4. 对于生和熟肉丸检测到的Ct值
Figure 28264DEST_PATH_IMAGE006
ND：未检测到
本发明试剂盒对于检测直到0.0001 %水平的在牛肉中的驴肉是合适的。因此，它对于检测通常通过将牛肉与驴肉混合执行的掺杂是合适的。
本发明试剂盒对于检测在生肉和在120℃在15 psi的压力下和在200℃的烘箱温度30分钟热处理的肉中的驴肉是合适的，因此，它可以用于熟肉产品或肉罐头中。
参考文献
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3．Tanabe, S., Hase, M., Yano, T., Sato, M., Fujimura, T., Akiyama, H.; "A Real-Time Quantitative PCR Detection Method for Pork, Chicken, Beef, Mutton, and Horseflesh in Foods". Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry Vol. 71 (2007) , No. 12 pp.3131-3135.
4．Jonker, K. M., Tilburg, J. J. H. C, HaGele, G. H., De Boer, E.; "Species identification in meat products using real-time PCR. Food Additives and Contaminants," (2008), 25(5): 527-533.
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6．Köppel, R., Ruf, J., Zimmerli, F., Breitenmoser, A.; "Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef, pork, chicken and turkey." Eur Food Res Technol (2008), 227:1199-1203.

Claims (6)

1.一种试剂盒，其特征在于与线粒体ND5基因上的区域互补的正向引物、反向引物和探针，其包含用实时PCR TaqMan探针技术检测肉产品中存在的驴肉的引物-探针组。
2.根据权利要求1的试剂盒，其特征在于位于11802-11823核苷酸之间的21核苷酸长度正向引物；位于11867-11884核苷酸之间的20核苷酸长度反向引物；和位于ND5基因上的11827-11855核苷酸之间的28核苷酸长度双重标记的寡核苷酸探针。
3.根据权利要求1 – 2的试剂盒，其特征在于引物-探针组直到用实时PCR TaqMan探针技术用于检测肉产品中存在的驴肉的第40个循环，显示仅与驴物种的DNA的反应。
4.根据权利要求1 – 3的试剂盒，其特征在于引物-探针组能应用于在其中检测驴肉的肉产品，例如意大利香肠、香肠、肉丸和肉罐头。
5.根据权利要求1 – 4的试剂盒，其特征在于引物-探针组能应用于生肉和在120℃和在15psi的压力下热处理的肉产品。
6.根据权利要求1 – 5的试剂盒，其特征在于引物-探针组能应用于在200℃热处理30分钟的肉产品。
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