CN111440881B - 一种检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用，涉及猪肉检测技术领域。本发明利用所述引物组检测肉制品中是否掺杂有猪肉，特异性好，稳定性和重复性好，灵敏度高，可检测猪肉掺杂量为1％的混合样品，可用于快速灵敏检测肉制品中是否掺有猪肉。

Description

一种检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用
技术领域
本发明属于猪肉检测技术领域，具体涉及一种检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用。
背景技术
由于食品食谱和饮食习惯的快速变化，食品安全在当今世界的现代步伐中引起了极大的关注，而肉及肉制品的掺假一直是世界性问题，检测出肉及肉制品中不想要的食品成分与食品质量密切相关，故意掺假可以降低生产成本，在商业加工肉类中识别猪肉是食品工业中最关键的问题之一，因此，需要开发一种准确的猪肉检测方法，以防止食品掺假。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用，特异性好，稳定性和重复性好，灵敏度高，可用于检测猪肉是否掺假。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种检测猪肉的引物组，所述引物组包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述探针被FAM标记。
本发明还提供了一种检测猪肉的试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物组，还包括2×ddPCR Master Mix和ddH2O。
本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在检测猪肉中的应用。
本发明还提供了一种利用上述引物组或上述试剂盒检测猪肉的方法，包括以下步骤：以样品基因组DNA为模板，利用所述引物组进行微滴数字PCR；
当检测样品中出现典型的扩增信号，且终点荧光信号值超过荧光阈值，则判定该样品为阳性，表示所述样品中存在猪源性基因成分。
优选的，所述微滴数字PCR的体系以20μL计，包括：10μL 2×ddPCR Master Mix，上游引物和下游引物各1μL、探针0.5μL，模板2μL，ddH2O补至20μL。
优选的，在配制所述微滴数字PCR的体系后，还包括制微滴，利用所述微滴进行微滴数字PCR；
所述制微滴的方法，包括：将20μL所述微滴数字PCR的体系和70μL微滴生成油加入微滴生成卡，覆盖后置入微滴生成仪，生成微滴。
优选的，所述微滴数字PCR的程序，包括：94℃预变性10min；94℃变性15s，60℃退火60s，45个循环；98℃热失活10min。
本发明还提供了一种上述引物组或上述试剂盒在检测肉制品是否掺杂猪肉中的应用。
本发明还提供了一种检测肉制品中是否掺杂猪肉的方法，包括以下步骤：以肉制品的基因组DNA为模板，利用所述引物组进行微滴数字PCR。
本发明提供了一种检测猪肉的引物组，根据猪源性基因涉及特异性引物，同时结合探针进行定量检测。本发明利用所述引物组进行猪肉微滴数字PCR(ddPCR)检测，特异性好，只在猪源样品中有扩增现象，在其他物种如羊、牛、马、驴、鸭、鹅和兔的肌肉组织中均不产生扩增现象，可以满足实际检测工作；稳定性和重复性好，反应阳性点与阴性点的区分非常明显，实验结果不会受到荧光阈值限变化的影响；灵敏度高，2copies/μL的量即可被检测到，在10copies/μL到2000copies/μL的范围内具有较高的检测线性，RSD值小于25％，可检测猪肉掺杂量为1％的混合样品，可用于检测肉制品中是否掺有猪肉。
附图说明
图1为猪源性微滴数字PCR检测体系特异性验证图，其中蓝色点为阳性点，灰色点为阴性点，红色线为荧光阈值限；
图2为不同猪源性基因拷贝数含量下微滴数字PCR反应热点图。
具体实施方式
本发明提供了一种检测猪肉的引物组，所述引物组包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-ACCCAGACGAACTGCTCAA-3’；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-TGGCGTCACTGATAGGTAAAT-3’；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-TCACAGGCGTGGGCTTTCTGC-3’。本发明所述探针优选被FAM标记，表示为FAM-SEQ ID NO.3-BHQ1。
本发明还提供了一种检测猪肉的试剂盒，所述试剂盒中包括上述引物组，还包括2×ddPCR Master Mix和ddH2O。
本发明还提供了上述引物组或上述试剂盒在检测猪肉中的应用。
本发明还提供了一种利用上述引物组或上述试剂盒检测猪肉的方法，包括以下步骤：以样品基因组DNA为模板，利用所述引物组进行微滴数字PCR；当检测样品中出现典型的扩增信号，且终点荧光信号值超过荧光阈值，则判定该样品为阳性，表示所述样品中存在猪源性基因成分。本发明所述微滴数字PCR的体系优选以20μL计，包括：10μL 2×ddPCRMaster Mix，上游引物和下游引物各1μL、探针0.5μL，模板2μL，ddH2O补至20μL。本发明所述上游引物和下游引物的浓度优选为10μmol/L。本发明所述探针的浓度优选为10μmol/L。本发明所述模板的浓度优选为40ng/μL。本发明对所述样品基因组DNA的制备方法并没有特殊限定，优选利用试剂盒法提取猪的肌肉内的基因组DNA，本发明实施例中利用购自天根生化科技(北京)有限公司的快速DNA提取检测试剂盒提取基因组DNA作为模板。
本发明在配制所述微滴数字PCR的体系后，优选还包括制微滴，利用所述微滴进行微滴数字PCR。本发明所述制微滴的方法，优选包括：将20μL所述微滴数字PCR的体系和70μL微滴生成油加入微滴生成卡，覆盖后置入微滴生成仪，生成微滴。本发明所述微滴数字PCR的程序，优选包括：94℃预变性10min；94℃变性15s，60℃退火60s，45个循环；98℃热失活10min。本发明在所述微滴数字PCR结束后，优选还包括信号读取，将扩增的96孔板置入微滴读取仪中读取信号，使用软件QuantaSoft V1.3.2.0分析实验数据，获得绝对定量数值。本发明所述微滴数字PCR优选在QX100 Droplet Digital PCR系统上进行，包括微滴生成仪和微滴读取仪(Bio-Rad,美国)。在本发明中，ddPCR是一种绝对定量技术，不需要建立标准曲线，可直接测得待测样中靶标基因的绝对拷贝数。ddPCR的计算公式为A＝-ln[(N-X)/N]×N，其中A为反应体系中目标分子的拷贝数，X为微滴数字PCR的阳性体系数，N为总体系数。计量资料描述以均数±标准差(x±s)表示。
本发明优选根据数字PCR结果中扩增反应的基线或者体系中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限，当检测样品出现典型的扩增信号，且终点荧光信号值超过荧光阈值；同时阴性对照、阳性对照及空白对照结果均正常，则判定该样品为阳性，表示该样品中存在猪源性基因成分。当测试样品没有出现明显的扩增信号，扩增终点荧光信号值位于阈值限之下，同时阴性对照、阳性对照及空白对照结果均正常，判定该样品为阴性，表示该样品中不含可检出的猪源性基因成分。
本发明还提供了一种上述引物组或上述试剂盒在检测肉制品是否掺杂猪肉中的应用。鉴于本发明所述引物组或试剂盒的高灵敏度和特异性，可利用所述所述引物组或试剂盒用于检测样品中是否掺有猪肉。
本发明还提供了一种检测肉制品是否掺杂猪肉的方法，包括以下步骤：以肉制品基因组DNA为模板，利用所述引物组进行微滴数字PCR。本发明所述方法中，所述微滴数字PCR的体系和程序优选与上述方法相同，在此不再赘述。本发明所述肉制品优选为生肉制品，更优选为肌肉制品。利用本发明所述方法，即便是1％的样本掺假量(质量百分含量)，也可以很灵敏和稳定的检测出猪肉的存在。
下面结合实施例对本发明提供的检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.1材料和试剂
本实施例中所有肉品材料均购自于北京美廉美超市，所有肉类均选用新鲜组织的肌肉组织，并所有肉品的肥肉以及结缔组织去除；dsDNA Kit试剂盒购自英潍捷基(上海)贸易有限公司；ddPCR Master、MixDroplet Generation、OilDroplet Reader Oil购自美国伯乐公司；快速DNA提取检测试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；引物和探针由上海英潍捷基公司合成。
1.2主要仪器
Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白检测仪(Thermo Scientific，美国)；QX100Droplet Digital PCR系统包括微滴生成仪和微滴读取仪(Bio-Rad,美国)。
1.3 DNA提取
肉类肌肉组织基因组DNA的提取参照快速DNA提取检测试剂盒说明书进行，提取的DNA通过超微量核酸蛋白检测仪检核浓度和纯度。
1.4 ddPCR反应
以猪源性内标准基因(NC_010454.3)为检测目标，以FAM标记的探针进行定量检测，探针序列为：5’-FAM-TCACAGGCGTGGGCTTTCTGC-BHQ1-3’(SEQ ID NO.3)，上游引物序列为：5’-ACCCAGACGAACTGCTCAA-3’(SEQ ID NO.1)，下游引物序列为：5’-TGGCGTCACTGATAGGTAAAT-3’(SEQ ID NO.2)。
ddPCR体系：10μL 2×ddPCR Master Mix，10μmol/L猪源性特异性正向引物和反向引物各1μL、探针0.5μL，DNA模板2μL(模板浓度精确至40ng/μL)，ddH2O补至20μL。
生成微滴：将20μL PCR体系和70μL微滴生成油(droplet generation oil)加入微滴生成卡，覆盖专用胶垫后置入微滴生成仪，生成微滴，铺板至96孔PCR板。扩增循环：94℃预变性10min；94℃变性15s，60℃退火60s，45个循环；扩增结束后进行98℃、10min的热失活，每个模板重复5个平行检测孔。
信号读取：将扩增的96孔板置入微滴读取仪中读取信号，使用软件QuantaSoftV1.3.2.0分析实验数据，获得绝对定量数值。
1.5猪源性ddPCR检测体系特异性检测
以猪的肌肉组织为靶标，选取不同物种羊肌肉组织、牛肌肉组织、马肌肉组织、驴肌肉组织、鸭肌肉组织、鹅肌肉组织以及兔肌肉组织为特异性鉴定的研究对象，验证本研究中猪源性ddPCR检测方法的特异性，所有组织进行ddPCR反应方法与1.4中反应体系相同。
检测结果如图1所示，微滴读取仪热点图显示猪源性ddPCR检测体系在其他的物种中无扩增现象，特异性可以满足实际检测工作。
1.6猪源性ddPCR检测体系定量范围及检测限验证
由全式金公司合成猪源性内标准基因扩增序列，并构建至pEASY-T5-Pork标准质粒，质粒经过超微量核酸蛋白检测仪测定浓度(ng/ul)，以(6.02×1023)×(ng/μl×10-9)/(DNA碱基长度×660)＝拷贝数(copies)/μL计算出标准质粒浓度下的靶标基金拷贝数，通过将原始质粒分子进行梯度稀释，稀释得到理论拷贝数分别为2000、1000、200、100、20、10、2、0copies/μL的标准质粒溶液，以此为DNA模板，参照1.4中ddPCR反应方法进行上机检测，进行猪源性ddPCR检测体系定量范围以及检测限的验证。
ddPCR反应热点如图2所示，ddPCR反应阳性点与阴性点的区分非常明显，结果稳定性和重复性较好，实验结果不会受到荧光阈值限变化的影响。
猪源性基因拷贝数微滴数字PCR定量结果如表1所示，ddPCR检测体系在10copies/μL到2000copies/μL的范围内具有较高的检测线性，根据标准质粒已知拷贝数求得标准曲线为y＝1.058×x-11.48，R2值为0.9913大于0.95，根据实际检测拷贝数求得不同组内的RSD值小于25％；由于微滴数字PCR的方法在较高浓度下同样具有较高的精确性和稳定性，因此不再进行上限验证；在模板为2copies/μL的检测管中可以出现阳性结果，但是所有平行重复不全为阳性，所有检测下限定为体系为10copies/μL。
表1猪源性基因拷贝数微滴数字PCR定量结果分析
1.7猪源性ddPCR检测体系在掺杂样本中的验证
建立猪肉和羊肉的混合样本，其中猪肉成分占比分别为100％、10％、5％、1％以及0％。参照1.3提取DNA，以此为模板，通过1.4微滴数字PCR反应进行上机检测，以ddPCR的定量计算方式得到混合样品中猪源性样本的实际样品拷贝数，以《转基因动物及其产品成分检测猪内标准基因定性PCR方法》(农业部2122号公告-1-2014)标准方法为对照，验证猪源性ddPCR检测体系的灵敏度和稳定性。
以混合样品进行稀释猪源性样品，结果如表2所示，本发明所述方法可以特异性的识别不同成分含量混合样品中的猪源性成分，并且相比标准方法有更高的灵敏度和稳定性。
表2微滴数字PCR实际样品检测结果
注：表2中*表示辨别结果比较困难。
本发明提供了一种检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用，可以高效准确肉制品中是否掺有猪肉，让掺假肉鉴别技术能够体现快速检测的同时，尽可能的保证高特异性和高灵敏度，为广大消费者及执法部门提供安全、快速、准确的检测结果，为肉类食品安全和肉类食品消费提供保障。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 兰州海关技术中心
<120> 一种检测猪肉的引物组、试剂盒及检测方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acccagacga actgctcaa 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tggcgtcact gataggtaaa t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcacaggcgt gggctttctg c 21

Claims (3)

1.一种检测肉制品是否掺杂猪肉的方法，其特征在于，包括以下步骤：以样品基因组DNA为模板，利用引物组进行微滴数字PCR；所述引物组包括上游引物、下游引物和探针；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述探针一端被FAM标记，另一端被BHQ1标记；所述微滴数字PCR的程序，包括：94℃预变性10min；94℃变性15s，60℃退火60s，45个循环；98℃热失活10min；
当检测样品中出现典型的扩增信号，且终点荧光信号值超过荧光阈值，则判定该样品为阳性，表示所述样品中存在猪源性基因成分。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述微滴数字PCR的体系以20μL计，包括：10μL2×ddPCRMasterMix，上游引物和下游引物各1μL、探针0.5μL，模板2μL，ddH2O补至20μL。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，在配制所述微滴数字PCR的体系后，还包括制微滴，利用所述微滴进行微滴数字PCR；
所述制微滴的方法，包括：将20μL所述微滴数字PCR的体系和70μL微滴生成油加入微滴生成卡，覆盖后置入微滴生成仪，生成微滴。
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