KR102639686B1 - 고래류 확인 및 종 식별을 위한 실시간 pcr 프라이머 및 프로브 - Google Patents

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Abstract

본 발명에 따른 실시간 PCR 프라이머 및 프로브를 이용한 고래류 확인 및 고래의 종 식별 과정은 고래 개체의 전유전체 염기서열 분석이나 DNA 바코딩에 비하여 염기서열분석의 과정이 따로 필요하지 않고, 증폭 여부를 실시간으로 확인하여 분석이 가능하므로 분석 시료의 오염위험도가 낮을 뿐만 아니라 더 경제적이고 신속하게 결과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명자들은 실제 실시간 PCR을 수행한 결과 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브가 고래류 및/또는 고래 종에 대해 높은 특이성 및 민감도를 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명을 이용하여 고래류 확인 및 고래 종 식별을 수행시 종래 기술보다 신속하고 정확하게 결과를 얻을 수 있으며, 특히 본 발명을 미세유세칩(Microfluidic chip) 등을 이용한 현장 신속 검사법 (On-site rapid RT-PCR)에 적용하여 현장에서 즉시 채취한 살점이나 혈흔을 분석하고 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 불법적인 고래 포획의 수사 등에 적극적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

고래류 확인 및 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 {Real-Time PCR primers and probes for identifying Cetacea and distinguishing the species thereof}
본 발명은 고래류 확인 및 고래 종 식별을 위한 프라이머 및 프로브 등에 관한 것이다.
고래고기는 서양 문화권을 포함한 중국과 아시아 대부분의 지역에서는 섭취하지 않고, 전통적으로 포경을 해오던 북극권 지역과 카리브해 연안 일부 지역과 아시아에서는 일본과 한국에서 섭취한다. 우리나라 밍크고래 혼획량은 연간 70여 마리로 일본과 함께 전 세계 대형고래 혼획량의 80%를 차지하고 있다. 그러나, 대한민국은 혼획에 의해 유통되는 고래고기는 식약처에서 공식적인 식품원료로 규정하고 있지 않다. 즉, 우리나라에서는 고래육이 가공, 도축의 과정에서 지자체가 위생을 단속하고 관리할 수 없으므로, 고래고기가 비위생적으로 유통되는 상황이 빈번하게 발생하고 있으며 특히 불법으로 유통되는 고래육은 위생관리가 무시된 채 판매되고 있다. 일부 고래 종(상괭이, 참고래 등)은 국내에서 보호종으로 공식 지정되어 혼획되어도 유통이 불가능함에도 불구하고 이들 종에 대한 불법 포획이 성행하고 있으며, 보호종으로 공식 지정되지 않아 혼획시 유통이 허용되는 고래 종(밍크고래, 큰돌고래 등)의 경우 또한 불법 포획의 주된 표적이 되고 있다.
고래류는 형태학적으로 뚜렷한 차이점을 가지고 있지 않기 때문에 비전문가가 고래종을 판별하기가 쉽지 않다. 이러한 결과로 인해 종이 잘못 판단되어 유통되어서는 안 되는 해양보호생물 고래종이 유통 가능한 종으로 위판되는 경우가 종종 있다. 해경이 고래의 외부에 생긴 상처 흔적이나 금속 탐지기를 이용해 불법포획을 판별할 수는 있지만 고래종을 판단하기는 힘든 실정이다. 특히, 불법 포획 선박은 해경에 적발 즉시 작살 등 고래 포획 도구와 고래 사체를 바다에 던져버리는 경우가 빈번하므로, 해경이 수사할 당시 가장 먼저 발견한 살점이나 혈흔이 고래류의 것인지 확인하는 과정이 필요하며, 이 때 DNA 분석 기술이 활용될 수 있다.
고래를 불법으로 포획하는 선박이 발견된 경우, 현장에서 확보된 생물 시료의 DNA가 고래류 특이적인 DNA인지 분석하는 과정이 필요하며, 고래류임이 확인된다면 해당하는 고래류가 어떤 종인지 식별하는 과정이 필요하다. 이 과정을 통해 해당 고래종이 해양생물보호종인지 판별할 수 있고, 혼획되었다고 신고된 고래의 종과 일치하는지도 확인할 수 있다.
현재까지 고래식별을 위해 사용하는 방법은 포획된 고래 개체의 전유전체(whole genome)의 염기서열을 분석하거나 종별로 디자인(design)되어 있는 종별 프라이머(primer)를 이용하여 PCR을 통해 증폭된 특정 유전자 부위 (gene region)를 염기서열 분석하여 (DNA sequencing) 일치 여부를 통해 개체의 종을 식별하는 DNA 바코딩 (DNA barcoding) 기법을 이용한다. 그러나 이 과정을 통한 고래의 식별은 모두 PCR 증폭 이후 염기서열 분석이 필요하므로, 시간이 지나치게 소요되는 단점이 있다. 따라서, 현장에서 보다 신속하고 정확환 고래류 확인 및 고래 종 식별 방법에 대한 요구가 있다.
대한민국 등록특허 제10-2155967호
본 발명자들은 염기서열분석의 과정이 따로 필요하지 않아 현장에서 보다 신속하게 고래류 및 고래 종을 식별할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위한 연구를 수행하였으며, 그 결과 생물 시료에서 정제한 DNA에 대해 실시간 PCR(Real-Time PCR) 수행시 고래류의 DNA만 특이적으로 증폭시키는 프라이머 세트 및 특정 고래 종의 DNA만 특이적으로 증폭시키는 프라이머 및 프로브 세트를 발굴하여, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 생체시료에 대한 고래류 확인을 위한 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 고래 종식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 혼획 시 유통 불가하여 폐기처분하도록 규정된 보호종으로 지정된 고래 2종 (상괭이, 참고래) 과 혼획 시에는 유통 가능하여 불법 포획의 주된 표적이 되는 고래 2종 (밍크고래, 큰돌고래) 의 종식별을 위한 다중 실시간 PCR (Multiplex RT-PCR) 프라이머 및 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 고래류 확인 및/또는 고래 종 식별을 위한 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 고래류 확인 방법 및 고래류 종 식별 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는, 고래류 확인을 위한 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 고래류는 상괭이(Neophocaena asiaeorientalis), 참돌고래(Delphinus delphis), 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata), 낫돌고래(Lagenorhynchus obliquidens), 쇠돌고래(Phocoena phocoena), 큰돌고래(Tursiops truncatus), 흑범고래(Pseudorca crassidens), 큰머리돌고래(Grampus griseus), 남방큰돌고래(Tursiops aduncus), 범고래(Orcinus orca), 까치돌고래(Phocoenoides dalli), 참고래(Balaenoptera physalus), 브라이드고래(Balaenoptera brydei), 및 들쇠고래(Globicephala macrorhynchus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 실시간 PCR 프라이머 세트는 삽입 염료(intercalating dye) 기반 실시간 PCR용일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트를 포함하는, 고래류 확인을 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 프라이머 및 프로브 세트 중 하나 이상을 포함하는, 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다:
(i) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 상괭이(Neophocaena asiaeorientalis) 식별용 프라이머 및 프로브 세트;
(ii) 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 참고래(Balaenoptera physalus) 식별용 프라이머 및 프로브 세트;
(iii) 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata) 식별용 프라이머 및 프로브 세트; 또는
(iv) 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 큰돌고래(Tursiops truncatus) 식별용 프라이머 및 프로브 세트.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 실시간 PCR 프라이머 세트는 가수분해 프로브(hydrolysis probe) 기반 실시간 PCR용일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트는
(i) 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 상괭이(Neophocaena asiaeorientalis) 식별용 프라이머 및 프로브 세트; 및
(ii) 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 참고래(Balaenoptera physalus) 식별용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트로서, 상기 실시간 PCR은 다중 실시간 PCR (Multiplex RT-PCR) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트는
(iii) 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata) 식별용 프라이머 및 프로브 세트; 및
(iv) 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하는, 큰돌고래(Tursiops truncatus) 식별용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트로서, 상기 실시간 PCR은 다중 실시간 PCR (Multiplex RT-PCR) 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는 상기 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단은 제1형광염료로 표지되고, 상기 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프로브; 또는 상기 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브의 5' 말단은 제2형광염료로 표지되며, 이 때 상기 제1형광염료 및 제2형광염료는 발광(emission) 파장대가 서로 다른 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 형광염료는 FAM, JOE, HEX, TAMRA, VIC, Yakima Yellow, TET, NED, ROX, Quasar, CAL Flour 560, CAL Flour 610, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, 및 Biosearch Blue로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 고래 종 식별을 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트 및 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 고래류 확인 및 고래 종 식별을 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩(chip) 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 고래류 확인 방법을 제공한다:
(S1) 분석 대상체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, 제1항의 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(S3) 상기 단계 (S2)의 PCR 반응 산물을 검출하는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 고래 종 식별 방법을 제공한다:
(S1) 분석 대상체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
(S2) 상기 단계 (S1)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, 제5항의 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(S3) 상기 단계 (S2)의 PCR 반응 산물을 검출하는 단계.
본 발명에 따른 실시간 PCR 프라이머 및 프로브를 이용한 고래류 확인 및 고래의 종 식별 과정은 고래 개체의 전유전체 염기서열 분석이나 DNA 바코딩에 비하여 염기서열분석의 과정이 따로 필요하지 않고, 증폭 여부를 실시간으로 확인하여 분석이 가능하므로 분석 시료의 오염위험도가 낮을 뿐만 아니라 더 경제적이고 신속하게 결과를 얻을 수 있다. 또한, 본 발명자들은 실제 고래 시료 및 기타 종 시료를 이용하여 실시간 PCR을 수행한 결과 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브가 고래류 및/또는 고래 종에 대해 높은 특이성 및 민감도를 갖는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명을 이용하여 고래류 확인 및 고래 종 식별을 수행시 종래 기술보다 신속하고 정확하게 결과를 얻을 수 있으며, 특히 본 발명을 미세유세칩(Microfluidic chip) 등을 이용한 현장 신속 검사법 (On-site rapid RT-PCR)에 적용하여 현장에서 즉시 채취한 살점이나 혈흔을 분석하고 결과를 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명은 불법적인 고래 포획의 수사 등에 적극적으로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 고래류 특이적 마커(WD specific marker)의 프라이머의 염기서열에 대한 14종의 고래의 서열의 NCBI BLAST 결과를 나타낸다 (WD-F: WD specific marker forward primer; WD-R: WD specific marker reverse primer).
도 2는 WD specific marker의 프라이머 서열과 대한 타종의 서열의 염기서열 유사도(homology)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 WD specific marker를 통한 실시간 PCR 결과를 나타낸다 (좌측 A 그래프: 고래류 14종의 실시간 PCR 결과; 우측 B 그래프: 고래류가 아닌 대조군의 실시간 PCR 결과).
도 4는 WD specific marker를 통한 실시간 PCR의 Melting curve를 나타낸다 (좌측 A 그래프: 고래류 14종의 DNA 증폭 결과에 따른 melting curve; 우측 B 그래프: 고래류가 아닌 대조군의 DNA 증폭 결과에 따른 melting curve).
도 5는 WD specific marker를 통한 실시간 PCR 산물의 전기영동 결과를 나타낸다 (L:Ladder(100bp), 1a:상괭이, 2a:참돌고래, 3a:밍크고래, 4a:낫돌고래, 5a:쇠돌고래, 6a:큰돌고래, 7a:흑범고래, 8a:큰머리돌고래, 9a:남방큰돌고래, 10a:범고래, 11a:까치돌고래, 12a:참고래, 13a:브라이드고래, 14a:들쇠고래, 1b:가자미, 2b:갈치, 3b:고등어, 4b:넙치(광어), 5b:눈볼대, 6b:대구, 7b:멸치, 8b:병어, 9b:삼치, 10b:조피볼락(우럭), 11b:청어, 12b:양, 13b:인간, 14b:NTC).
도 6은 각 시료의 실시간 PCR 증폭에 따른 검출 횟수와 검량선을 나타낸다 (도 6a: 상괭이 시료 분석 결과, 도 6b: 참돌고래 시료 분석 결과, 도 6c: 밍크고래 시료 분석 결과, 도 6d: 낫돌고래 시료 분석 결과, 도 6e: 쇠돌고래 시료 분석 결과, 도 6f: 큰돌고래 시료 분석 결과, 도 6g: 흑범고래 시료 분석 결과, 도 6h: 큰머리돌고래 시료 분석 결과, 도 6i: 남방큰돌고래 시료 분석 결과, 도 6j: 범고래 시료 분석 결과, 도 6k: 까치돌고래 시료 분석 결과, 도 6l: 참고래 시료 분석 결과, 도 6m: 브라이드고래 시료 분석 결과, 도 6n: 들쇠고래 시료 분석 결과).
도 7은 Multiplex RT-PCR을 위한 종별 마커 서열의 이합체를 Multiple Primer Analyzer로 확인한 결과를 나타낸다.
도 8은 WD species ID marker를 통한 실시간 PCR 결과를 나타낸다 (QuantStudio 3).
도 9는 AP 보호종으로 지정된 (상괭이 및 참고래)의 multiplex RT-PCR 증폭 그래프를 나타낸다 (QuantStudio 3).
도 10은 AT 보호종으로 지정되지 않은 (밍크고래 및 큰돌고래)의 multiplex RT-PCR 증폭 그래프를 나타낸다 (QuantStudio 3).
도 11은 각 시료의 실시간 PCR 증폭에 따른 검출 횟수와 검량선을 나타낸다 (도 11a: AP set RT-PCR에서 상괭이 시료의 결과, 도 11b: AP set RT-PCR에서 참고래 시료의 결과, 도 11c: AT set RT-PCR에서 밍크고래 시료의 결과, 도 11d: AT set RT-PCR에서 큰돌고래 시료의 결과).
도 12는 WD specific marker를 통한 현장 신속 RT-PCR(On-site rapid RT-PCR) 결과를 나타낸다 (좌측 A 그래프: 고래류 14종의 실시간 PCR 결과; 우측 B 그래프: 고래류가 아닌 대조군의 실시간 PCR 결과).
도 13은 WD species ID marker (AP set)를 통한 현장 신속 RT-PCR 그래프를 나타낸다 (Veri-Q PCR 316).
도 14는 WD species ID marker (AT set)를 통한 현장 신속 RT-PCR 그래프를 나타낸다 (Veri-Q PCR 316).
본 발명자들은 생물 시료에서 정제한 DNA에 대해 실시간 PCR 수행시 고래류의 DNA만 특이적으로 증폭시키는 프라이머 세트 및 특정 고래 종의 DNA만 특이적으로 증폭시키는 프라이머 및 프로브 세트를 발굴하여, 본 발명을 완성하였다.
구체적으로, 본 발명의 일 실시예에서는 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트를 디자인하였으며, 상기 프라이머 세트를 이용하여 고래류 및 기타 종 시료에 대해 실시간 PCR을 수행한 결과 고래류에서만 DNA 증폭이 일어났으며, 증폭 산물의 크기가 모두 동일한 것을 확인하였다 (실시예 1).
본 발명의 다른 실시예에서는, 고래 종 식별을 위한 4가지의 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 디자인하였으며, 상기 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 고래 시료에 대해 실시간 PCR을 수행한 결과 각각 상괭이(N. asiaeorientalis), 참고래(B. physalus), 밍크고래(B. acutorostrata), 또는 큰돌고래(T. truncatus)를 특이적으로 증폭시킨 것을 확인하였다. 또한 두 세트씩 짝을 지어 다중 실시간 PCR(Multiplex RT-PCR)을 수행한 결과 2종의 고래 종 식별이 동시에 가능함을 확인하였다 (실시예 2).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 Labchip 기반으로 실시간 PCR을 수행한 결과 고래류 확인 및/또는 고래종 식별이 가능함을 확인하여, 현장 신속 검사법에 적용할 수 있음을 확인하였다 (실시예 3).
따라서, 본 발명의 목적은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함하는, 고래류 확인을 위한 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) 프라이머 세트를 제공하는 것이다. 상기 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트는 “WD (Whale & Dolphin) specific marker”로 지칭될 수 있다.
본 발명에 있어서, “고래류(Cetacea)”란 유선형 몸체에 수평 꼬리지느러미 및 머리 꼭대기의 분수공이 있는 해양 포유동물을 지칭한다. 고래류는 폐호흡을 하고 자궁 내에서 태아가 자라며 배꼽을 갖는 등 포유동물의 특징을 지니고 있으며, 치아 유뮤에 따라 두 분류의 고래하목으로 나뉜다. 현재까지 80여종이 넘는 고래종이 존재하는 것으로 알려져 있는데, 2011년 내지 2017년 동안 한국 연해안에서 혼획된 고래 종은 상괭이(Neophocaena asiaeorientalis), 참돌고래(Delphinus delphis), 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata), 낫돌고래(Lagenorhynchus obliquidens), 쇠돌고래(Phocoena phocoena), 및 큰돌고래(Tursiops truncatus) 순으로 많다. 일부 고래종은 해양보호생물로 지정되어 보호되고 있는데, 한국 연해안에서 발견되는 고래류 중 해양보호생물로 지정된 것은 발견빈도가 높은 순서로 상괭이, 남방큰돌고래(Tursiops aduncus), 및 참고래(Balaenoptera physalus)가 있다.
본 발명에 있어서, “프라이머(primer)”란 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에서 증폭되는 표적 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이고, 적합한 온도에서 중합효소 연쇄 반응액 중 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 의미한다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어지나, 표적 핵산의 복합도(complexity), 반응 온도, 이온 강도 등에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 있어서 프라이머로 이용되는 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 뿐만 아니라 뉴클레오티드 유사체(analogue)일 수 있으며, 예를 들면 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid), 또는 삽입 물질(intercalating agent) 등이 이에 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “중합효소연쇄반응 (Polymerase chain reaction, PCR)”이란, 핵산 내의 표적 부위에 특이적인 프라이머 쌍 (정방향 및 역방향 프라이머) 및 DNA 중합효소 (DNA polymerase)를 이용한 연쇄 반응에 의해 표적 부위를 증폭시키는 반응을 지칭한다. 중합효소 연쇄반응의 반응액의 조성 및 반응 조건은 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어, “실시간 PCR (Real-Time PCR)”이란 PCR 증폭 과정 중 형광 신호 변화를 검출함으로써 증폭된 산물의 양을 실시간으로 확인할 수 있는 PCR 반응으로, 증폭된 양을 측정하여 정량할 수 있으므로 정량 PCR(quantitative PCR, qPCR)이라고도 불린다. PCR 반응에서 형광 신호를 발생시키는 방법에 따라 두 가지 실시간 PCR 반응이 이용된다: (1) 생성된 이중-가닥 DNA에 삽입되어 형광을 내는, 삽입 염료(intercalating dye) 기반 실시간 PCR, (2) 증폭시키고자 하는 표적 핵산과 상보적인 서열을 갖는 프로브(probe)에 표지되어 표적 서열이 중합됨에 따라 프로브가 가수분해되면 형광을 내는, 가수분해 프로브(hydrolysis probe) 기반 실시간 PCR. 상기 삽입 염료로는 일반적으로 SYBR (예를 들어, SYBR Green I), EvaGreen, Diamond, GelGreen, GelRed, RedSafe 등이 주로 사용되며, 상기 가수분해 프로브로는 TaqMan probe, Molecular beacons, Scorpion probe 등이 주로 사용되나, 이에 한정되지 않는다. 형광염료를 이용한 실시간 PCR은 닫힌 튜브 내에서 반응이 일어나고 분석이 완료되어 오염 위험이 적고, 별도의 염기서열 분석과정 없이 증폭 유무 및 증폭량을 판단할 수 있으므로 보다 경제적이고 신속하게 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “프로브(probe)”는 표적 서열에 상보적인 서열, 즉 표적 부위 특이적 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)을 프로브의 말단에 부착시켜 가수분해 프로브 기반 실시간 PCR을 수행할 수 있다.
특히 가수분해 프로브 기반 PCR에서 reporter로 사용되는 형광염료는 공의 흡수(excitation) 영역의 파장대와 발광(emission) 영역의 파장대를 가지고 있으므로, 프로브의 5' reporter 자리에 적절한 형광염료를 부착시킬 수 있는데, 서로 다른 파장대의 형광 염료가 부착된 프로브를 이용하면 한 개의 실시간 PCR 반응 튜브 내에서 여러 종류의 목적 DNA를 동시에 분석할 수 있다(즉, 다중 실시간 PCR). 따라서, 다중 실시간 PCR을 수행하는 경우, 특정 고래 종을 식별하기 위한 프로브의 5' 말단을 제1형광염료로 표지하였다면, 다른 고래 종을 식별하기 위한 프로브의 5' 말단은 제2형광염료로 표지하여야 하며, 이 때 제1형광염료 및 제2형광염료의 발광(emission) 파장대는 서로 달라야한다. 즉, 다중 실시간 PCR에서 사용되는 프라이머들은 목적하는 종에 따라 서로 다른 형광염료로 표지되어야 하며, 각 형광염료의 발광 파장대는 서로 달라야 한다.
본 발명에 있어서 형광염료는 프로브에 부착될 수 있는 것으로서 형광을 방출할 수 있는 것이라면 제한 없이 포함될 수 있으나, 구체적인 예로는 FAM, JOE, HEX, TAMRA, VIC, Yakima Yellow, TET, NED, ROX, Quasar, CAL Flour 560, CAL Flour 610, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, 및 Biosearch Blue 등을 들 수 있다.
앞서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 실시간 PCR은 단일 또는 다중 실시간 PCR (Multiplex Real-Time PCR)로 수행될 수 있다. “다중 실시간 PCR”이란 2 이상의 표적에 대한 서로 다른 한 쌍의 프라이머를 사용하여 단일 반응 공간에서 여러 표적을 동시에 증폭 및 검출하는 실시간 PCR을 지칭한다.
또한, 본 발명에 따른 실시간 PCR은 칩(Chip) 기반 실시간 PCR일 수 있다. 칩 기반 실시간 PCR은 튜브(tube) 기반 실시간 PCR에 비해 더 빠르게 온도를 조절할 수 있으며 적은 용량으로 분석을 실시할 수 있다. 또한, 하나의 칩 내에 여러 개에 채널이 있어 한 개의 칩 분석을 통해 여러 개의 시료를 동시에 분석할 수 있다. 바이오칩 (biochip)은 크게 마이크로어레이(microarray) 칩과 미세유체칩(microfluidic chip)으로 분류될 수 있다. 마이크로어레이 칩은 DNA, 펩타이드, 세포 등을 미세간격으로 배열시킨 후 분석 대상 물질과의 상호작용을 분석하는 기술이며, 미세유체 칩 기술은 미세유체 제어 기술을 이용하여 유체샘플에 포함되어 있는 분석 대상 물질을 칩 상의 생체물질, 세포, 조직 또는 검출 장치와의 상호작용을 분석하는 기술이다. 다양한 유형의 칩이 실제 상용되어 있으므로 (예를 들어, Veri-Q PCR 316) 사용 조건 및 분석하고자 하는 시료의 개수 등에 따라 통상의 기술자가 적절한 칩을 선택할 수 있다.
본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머를 포함할 수 있고, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어지나, 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 서열 상동성은 예를 들면, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%의 서열 상동성을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 고래류는 상괭이(Neophocaena asiaeorientalis), 참돌고래(Delphinus delphis), 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata), 낫돌고래(Lagenorhynchus obliquidens), 쇠돌고래(Phocoena phocoena), 큰돌고래(Tursiops truncatus), 흑범고래(Pseudorca crassidens), 큰머리돌고래(Grampus griseus), 남방큰돌고래(Tursiops aduncus), 범고래(Orcinus orca), 까치돌고래(Phocoenoides dalli), 참고래(Balaenoptera physalus), 브라이드고래(Balaenoptera brydei), 및 들쇠고래(Globicephala macrorhynchus)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트를 이용하면 모든 고래류에서 DNA 증폭이 일어나지만, 고래류가 아닌 타종(예를 들어, 기타 어류 및 인간)의 DNA는 증폭되지 않는 것을 확인하였다. 특히, 고래류에서 증폭되는 표적 염기서열과 유사도(Homology)가 93% 이상인 양(sheep)의 DNA 역시 본 발명에 따른 프라이머 세트를 사용하더라도 DNA 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트는 고래류 DNA에 민감하고 특이적이기 때문에 고래류의 신속한 확인에 효과적이다.
또한, 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트는 실제 고래 시료를 대상으로 실시간 PCR을 수행했을 때 비특이적 산물이 존재하지 않고 목표로 하는 하나의 증폭 산물만이 존재하는 것을 (즉, 고래 종별로 하나의 Tm 값만이 존재함) 확인하였다. 또한, 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트는 실제 고래 시료를 대상으로 실시간 PCR을 수행했을 때 모든 고래 종에서 단일한 크기의 DNA 단편이 증폭되는 것을 특징으로 한다. 따라서 본 발명에 따른 PCR 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 결과 특정 시료에서 2 이상의 증폭 산물이 검출되더라도, 다른 고래류의 시료에 대해 PCR을 수행하였을 때 나타난 PCR 증폭 산물과 (전기영동 등을 통해) 크기를 비교하면 목적으로 하는 증폭 산물의 존재 유무를 쉽게 판별할 수 있다. 고래 시료를 대상으로 본 발명에 따른 실시간 PCR 프라이머를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였을 때, PCR 증폭 산물의 크기는 바람직하게는 80 내지 90bp 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 82 내지 86 bp 일 수 있고, 가장 바람직하게는 84bp 일 수 있다. 다만, 발명에 따른 프라이머 세트 사이의 염기서열은 고래 종별로 상이하므로, 실시간 PCR을 통해 증폭된 DNA의 전체 염기서열은 종별로 상이할 수 있다.
본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트의 고래류에 대한 검출확률이 95% 이상인 검출한계 (LOD95%) 농도 값은 5 pg/μl 내지 2 ng/μl, 5 pg/μl 내지 0.2 ng/μl, 5 pg/μl 내지 100 pg/μl, 5 pg/μl 내지 50 pg/μl, 또는 5 pg/μl 내지 20 pg/μl 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출한계 농도 값은 5 pg/μl 내지 15 pg/μl 일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 7 pg/μl 내지 12 pg/μl 일 수 있으나, 가장 바람직하게는 9 pg/μl 내지 11 pg/μl 일 수 있다. 상기 “검출한계 (Limit of Detection, LOD)”란 DNA 주형(template)이 들어있지 않은 대조군인 NTC(Non Template Control)의 CT(Threshold cycle) 값과 명확하게 그 값의 차이를 보이는 실험체의 DNA 농도 값을 말한다.
달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 성분, 반응 조건, 성분의 함량을 표현하는 모든 숫자, 값 및/또는 표현은, 이러한 숫자들이 본질적으로 다른 것들 중에서 이러한 값을 얻는 데 발생하는 측정의 다양한 불확실성이 반영된 근사치들이므로, 모든 경우 "약"이라는 용어에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 기재에서 수치범위가 개시되는 경우, 이러한 범위는 연속적이며, 달리 지적되지 않는 한 이러한 범위의 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지의 모든 값을 포함한다. 더 나아가, 이러한 범위가 정수를 지칭하는 경우, 달리 지적되지 않는 한 최소값으로부터 최대값이 포함된 상기 최대값까지를 포함하는 모든 정수가 포함된다.
본 명세서에 있어서, 범위가 변수에 대해 기재되는 경우, 상기 변수는 상기 범위의 기재된 종료점들을 포함하는 기재된 범위 내의 모든 값들을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예를 들면, "5 내지 10"의 범위는 5, 6, 7, 8, 9, 및 10의 값들뿐만 아니라 6 내지 10, 7 내지 10, 6 내지 9, 7 내지 9 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 5.5, 6.5, 7.5, 5.5 내지 8.5 및 6.5 내지 9 등과 같은 기재된 범위의 범주에 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한 예를 들면, "10% 내지 30%"의 범위는 10%, 11%, 12%, 13% 등의 값들과 30%까지를 포함하는 모든 정수들뿐만 아니라 10% 내지 15%, 12% 내지 18%, 20% 내지 30% 등의 임의의 하위 범위를 포함하고, 10.5%, 15.5%, 25.5% 등과 같이 기재된 범위의 범주 내의 타당한 정수들 사이의 임의의 값도 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명은 또한, 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다. 상기 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트는 “WD species ID marker”로 지칭될 수 있다.
상기 PCR 프라이머 및 프로브 세트는 특정 고래종의 DNA 만을 특이적으로 증폭시킨다. 즉, 상기 프라이머 및 프로브 세트는 분석하고자 하는 고래종 외의 나머지 다른 고래종에서는 증폭이 일어나지 않도록 종별 염기서열의 차이가 분명하도록 한 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트는 형태적으로 구별하기 힘들고 혼동하기 쉬운 종들을 표적으로 하는 것으로서, 혼획의 경우에도 유통 불가한 보호종인 상괭이(N. asiaeorientalis) 및 참고래(B. physalus)와 혼획의 경우에는 유통이 가능하여 불법 포획의 주된 표적이 되는 고래종인 큰돌고래(T. truncatus), 및 밍크고래(B. acutorostrata)를 식별하기 위한 총 4종류의 프라이머 및 프로브 세트로 이루어진다.
구체적으로, 보호종인 상괭이를 식별하기 위한 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하며, Asi-프라이머 (Asi-F 및 Asi-R) 및 Asi-프로브 (Asi) 로 명명하였다. 상기 프라이머 및 프로브는 상괭이의 ND1(NADH dehydrogenase subunit 1) 유전자를 기초로 디자인되었다.
보호종인 참고래를 식별하기 위한 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하며, Phy-프라이머 (Phy-F 및 Phy-R) 및 Phy-프로브 (Phy) 로 명명하였다. 상기 프라이머 및 프로브는 참고래의 CYTB(cytochrome b) 유전자를 기초로 디자인되었다.
보호종으로 지정되지 않아 불법 포획의 주된 표적이 되는 밍크고래를 식별하기 위한 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하며, Acu-프라이머 (Acu-F 및 Acu-R) 및 Acu-프로브 (Acu) 로 명명하였다. 상기 프라이머 및 프로브는 밍크고래의 12S rRNA(12S ribosomal RNA) 유전자를 기초로 디자인되었다.
보호종으로 지정되지 않아 불법 포획의 주된 표적이 되는 큰돌고래를 식별하기 위한 프라이머 및 프로브 세트는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 정방향 프라이머, 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 역방향 프라이머, 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프로브를 포함하며 Trun-프라이머 (Trun-F 및 Trun-R) 및 Trun-프로브 (Trun) 로 명명하였다. 상기 프라이머 및 프로브는 큰돌고래의 ND4(NADH dehydrogenase subunit 1) 유전자를 기초로 디자인되었다.
상술한 프라이머 및 프로브는 각각 해당 서열번호의 염기서열과 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 해당 서열번호의 염기서열로 이루어진다.
본 발명은 또한 2종 이상의 프라이머-프로브 세트를 통한 실시간 PCR이 가능하도록 한, 고래 종 식별을 위한 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다.
다중 실시간 PCR 진행시 함께 존재하는 프라이머 및 프로브가 비특이적으로 이합체(dimer)를 형성하는 경우 RT-PCR의 효율이 떨어지므로, 이합체 형성 가능성 여부를 확인하여 (예를 들어, Thermo Fisher Scientific사의 Multiple Primer Analyzer를 이용), 서로 상보적인 서열이 존재하지 않는 가장 효율적인 프라이머-프로브 세트 짝을 찾았다.
따라서, 본 발명은 상기 상괭이 식별용 프라이머 및 프로브 세트; 및 상기 참고래 식별용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 보호 고래 종 식별을 위한 다중 실시간 PCR용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다 (“AP(Asi-Phy)”). 또한, 본 발명은 상기 밍크고래 식별용 프라이머 및 프로브 세트; 및 상기 큰돌고래 식별용 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 불법 포획의 주된 표적이 되는 고래 종 식별을 위한 다중 실시간 PCR용 프라이머 및 프로브 세트를 제공한다 (“AT(Acu-Trun)”).
상술한 바와 같이, 다중 실시간 PCR에서, 특정 고래 종을 식별하기 위한 프로브의 5' 말단은 제1형광염료로 표지되고, 다른 종을 식별하기 위한 프로브는 제2형광염료로 표지될 수 있으며, 이 때 상기 제1형광염료 및 제2형광염료는 발광 파장대가 서로 다른 것을 특징으로 한다. 단일 PCR 반응으로 식별할 수 있는 종의 총 개수를 늘리기 위해 다른 종류의 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 추가할 수 있으며, 이 때 추가되는 프로브의 5' 말단에는 기타 종을 식별하기 위한 프로브에 표지된 형광염료와는 다른 발광 파장대를 가진 형광염료를 결합시킬 수 있다. 당업자는 단일 반응으로 식별하고자 하는 종의 개수 및 비특이적 이합체 형성 가능성을 고려하여 적절한 프라이머 및 프로브 세트의 조합, 및 적절한 형광염료를 선택할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 이용하면 목표로 하는 특정 종에서만 특이적으로 DNA에서만 증폭이 일어나고, 다른 고래 종의 DNA는 증폭되지 않는 것을 확인하였다. 특히, 보호종 식별을 위한 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 다중 실시간 PCR을 수행한 결과, 상괭이 식별용 프라이머 및 프로브 세트는 상괭이 DNA 시료만을, 참고래 식별용 프라이머 및 프로브 세트는 참고래 DNA 시료만을 증폭하여 각각 다른 파장의 형광을 발하는 것을 확인하였다. 마찬가지로, 보호종에 해당하지 아니하여 불법 포획의 주된 표적이 되는 고래종의 식별을 위한 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 다중 실시간 PCR을 수행한 결과, 밍크고래 식별용 프라이머 및 프로브 세트는 밍크고래 DNA 시료만을, 큰돌고래 식별용 프라이머 및 프로브 세트는 큰돌고래 DNA 시료만을 증폭하여 각각 다른 파장의 형광을 발하는 것을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트는 다중 실시간 PCR에도 적합하여, 2 이상의 프라이머 및 프로브 세트로 2 이상의 고래 종을 동시에 식별할 수 있다.
본 발명에 따른 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트의 고래류에 대한 검출확률이 95% 이상인 검출한계 (LOD95%) 농도 값은 1 pg/μl 내지 2 ng/μl, 1 pg/μl 내지 0.2 ng/μl, 1 pg/μl 내지 20 pg/μl, 1 pg/μl 내지 10 pg/μl, 1 pg/μl 내지 5 pg/μl, 1 pg/μl 내지 2.5 pg/μl 일 수 있다. 바람직하게는, 상기 검출한계 농도 값은 50 pg/μl 내지 1 ng/μl 일 수 있고, 더욱 바람직하게는, 0.1 ng 내지 0.7 ng/μl 일 수 있으나, 가장 바람직하게는 0.4 ng/μl 내지 0.6 ng/μl 일 수 있다. 다만, 상괭이, 참고래, 및 밍크고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트의 LOD95% 값은 1 내지 1.5 pg/μl 일 수 있고, 가장 바람직하게는 1 pg/μl 내지 1.3 pg/μl 일 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 PCR 프라이머 세트 및/또는 본 발명에 따른 고래 종 식별을 위한 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는, 고래류 확인 및/또는 고래 종 식별을 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에는 프라이머 및 프로브 이외에도 PCR 반응을 용이하게 수행하기 위한 성분들, 예컨대 DNA 중합효소, dNTP, DNase 억제제, DEPC, 멸균수, 및 통상의 PCR 반응 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있으며, PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분 또는 공지된 품종에 대한 동정 기준표들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 상술한 바와 같이 본 발명에 따른 키트는 PCR 키트뿐만 아니라 DNA 칩(chip) 키트일 수 있으며, 따라서 다중 실시간 PCR을 수행하기 위한 성분들, 예컨대 상용화된 Labchip 등을 추가로 포함할 수 있다. 아울러 현장에서 쉽고 빠르게 고래류를 확인하고 종을 식별할 수 있도록, Labchip 기반의 현장 신속 검사법 (On-site rapid RT-PCR) 분석 장비 및 이에 필요한 기타 요소를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 고래류 확인 방법을 제공한다: (S1) 분석 대상체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (S2) 상기 단계 (S1)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 고래류 확인을 위한 실시간 프라이머 세트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 (S3) 상기 단계 (S2)의 PCR 반응 산물을 검출하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (S2) 단계의 실시간 PCR 과정 중 결합(annealing) 및 신장(elongation) 반응은 60℃ 내지 70℃에서 20초 내지 1분으로 반복 수행될 수 있고, 바람직하게는 60℃ 내지 65℃에서 25초 내지 35초로 반복 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 63℃ 내지 65℃에서 28초 내지 32초로 반복 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 고래 종 식별 방법을 제공한다: (S1) 분석 대상체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (S2) 상기 단계 (S1)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 고래 종 식별을 위한 실시간 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 (S3) 상기 단계 (S2)의 PCR 반응 산물을 검출하는 단계.
본 발명에 있어서, 상기 (S2) 단계의 실시간 PCR 과정 중 결합(annealing) 및 신장(elongation) 반응은 60℃ 내지 70℃에서 30 내지 90초로 반복 수행될 수 있고, 바람직하게는 65℃ 내지 70℃에서 50초 내지 70초로 반복 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 67℃ 내지 69℃에서 55초 내지 65초로 반복 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 고래류 확인 또는 고래종 식별 방법에 있어서, 상기 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 혈흔지, 체액, 뇨, 세포, 조직, 융모막, 양수, 태반, 또는 제대혈 등의 시료일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 그로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 이용되는 방법에 의해 DNA를 분리할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 고래류 확인 또는 고래종 식별 방법에 있어서, PCR 반응 산물의 검출 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 DNA 증폭 산물의 검출 방법(예를 들어, 형광 검출, 전기영동 등) 중 통상의 기술자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 고래류 확인 또는 고래종 식별 방법은 연속적으로 수행될 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 고래류 확인 방법을 통해 분석 대상체가 고래류인지 일차로 판단한 후, 본 발명에 따른 고래 종 식별 방법을 통해 상기 분석 대상체의 구체적인 종을 확인할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험예]
실험예 1. 시료 수집 및 DNA 정제
1-1. 시료 수집
실험에 사용된 고래류 (whales and dolphins) 시료는 국립수산과학원 고래연구소 (울산광역시 남구 장생포고래로 250)에서 총 14종의 고래를 냉동조직의 상태로 제공받았다(표 1).
특이도 평가를 위하여 사용된 대조시료인 어류(Bony fish)의 조직 시료는 일반적으로 고래가 혼획되어 조직 및 혈흔이 발견되기 쉬운 국내 어선에 다수 존재하는 어류종을 얻기 위해 시중에서 유통되는 국내산 어류를 구입하였다(표 2). 또한, 본 발명에 따른 고래류 특이적 프라이머 (Whale & Dolphin specific marker)의 RT-PCR을 통해 증폭된 전체 DNA 염기서열 84bp 중 78bp가 일치하여 염기서열 유사도(Homology)가 93%인 양(Ovis aries)의 조직 시료 또한 시중에서 유통되는 양고기를 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시료는 냉동조직의 상태로 -70℃ 초저온냉동고에 보관하였다. 인간표준 유전체 DNA(genomic DNA; gDNA)는 프로메가코리아(유한)(Promega, Madison, WI, USA)에서 구매하여 사용하였다.
[표 1]
[표 2]
1-2. DNA 정제
조직 시료의 genomic DNA(gDNA)를 추출하기 위해 QIAamp DNA Mini kit(키아젠)(Qiagen, Hiden, Germany)를 사용하였고 조직 시료를 정제하는 프로토콜에 따라 gDNA를 정제하였다. gDNA 추출은 고래 조직 시료 14점, 어류 조직 시료 11점, 양 조직 시료 1점을 각 20mg씩 전자저울(WBA-320, (주)대한과학)로 무게를 달아 추출을 진행하였다.
실험예 2. 고래류 특이적 마커 (WD specific marker)의 발굴
2-1. WD specific marker 염기서열 조건 및 디자인
고래류 확인은 수집한 생물 시료가 고래류의 것인지 확인하기 위한 과정이다. 따라서, 실시간 PCR을 통하여 분석하였을 때 고래류에만 특이적으로 프라이머가 결합하여 DNA가 증폭되고, 고래류가 아닌 다른 종에서는 프라이머가 결합하지 않아 DNA 증폭이 일어나지 않는 프라이머(primer) 쌍을 디자인하였다. 고래 14종 간에서는 염기서열의 변이가 가장 적고 공통적인 서열이 존재하지만, 고래류가 아닌 다른 종에서는 식별될 정도의 차이가 나는 유전자 염기서열 부위를 발굴하였다. 염기서열 관련 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 사이트에서 확인하였다. 고래류에서 공통적으로 존재하는 선택된 염기서열 중 실시간 PCR을 통한 증폭 효율이 높고 고래류가 아닌 타종과 구분이 될 수 있을 정도의 특이도를 가지도록 프라이머(primer) 쌍을 primer-BLAST software (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여 디자인하였다.
2-2. WD specific marker 확인 및 명명
실시간 PCR 분석을 통하여 고래류에만 특이적으로 프라이머가 결합하여 DNA가 증폭되도록 디자인된 WD(Whale & Dolphin) specific marker의 프라이머(primer) 쌍은 정방향 프라이머인 WD-F (Whale & Dolphin Forward primer)와 역방향 프라이머인 WD-R (Whale & Dolphin Reverse primer)로 명명하여 구성되었다. 디자인된 프라이머 쌍은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES) 사에 의뢰하여 합성하였다. WD primer (WD-F, WD-R)의 염기서열은 NCBI BLAST 분석을 실시하여 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 고래류 14종 간 공통적으로 유사한 것을 확인하였다. 반면 고래류가 아닌 다른 종의 염기서열은 WD primer (WD-F, WD-R)의 염기서열과 실시간 PCR 증폭이 일어나지 않을 정도로 차이가 있었다.
타종과의 염기 서열 유사도(Homology)를 확인하기 위하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)에 등재되어있는 염기서열 정보를 이용하여 대한민국에서 발견될 수 있는 타종과의 염기서열 유사도(Homology)를 NCBI BLAST 분석을 통하여 확인하였다.
실험예 3. 고래류 종식별 마커 (WD species ID marker) 발굴
3-1. WD species ID marker 염기서열 조건 및 디자인
고래 종식별 과정은 고래류에만 특이적으로 결합하는 WD primer (WD-F, WD-R)를 통해 해당 생물 시료가 고래류임을 확인한 다음, 특정 고래종에서만 특이적으로 증폭하는 프라이머-프로브(primer-probe)를 디자인하여 해당 고래류가 어떤 고래종인지 식별하는 과정이다. 고래 종 식별은 고래류 전체를 확인하는 것보다 더 높은 특이도를 요구하는 바, 프라이머(primer) 이외에 프로브(probe)를 통해 한번 더 염기서열을 특정함으로써 특이도를 더 높일 수 있었다.
종별 프라이머-프로브(primer-probe)의 염기서열은 분석하고자 하는 고래종 외의 나머지 다른 고래종에서는 증폭이 일어나지 않도록 종별 염기서열의 차이가 분명하도록 하였다. 염기서열 정보는 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 사이트에서 제공받았으며 위의 조건을 충족하는 프라이머-프로브(primer-probe)를 NCBI에서 제공하는 primer-BLAST software (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하여 디자인하였다.
3-2. WD species ID marker 확인 및 명명
고래 종식별을 위한 프라이머-프로브(primer-probe)가 디자인된 고래종은 형태적으로 구분하기 힘들고 혼동하기 쉬운 종들로 선정하였다. 보호종으로 지정된 상괭이(N. asiaeorientalis)와 보호종으로 지정되어 있지 않은 큰돌고래(T. truncatus), 보호종으로 지정된 참고래(B. physalus)와 보호종으로 지정되어 있지 않은 밍크고래(B. acutorostrata)를 식별하기 위하여 총 4종류의 프라이머-프로브(primer-probe)를 각 종별로 디자인하였다.
보호종인 상괭이를 식별하기 위한 프라이머-프로브는 정방향 프라이머인 Asi-F(N. asiaeorientalis Forward primer)와 역방향 프라이머인 Asi-R(N. asiaeorientalis Reverse primer)가 쌍으로 이루어져 있고 Asi 프로브(probe)로 각 명명하여 구성되었다. 보호종인 참고래를 식별하기 위한 프라이머-프로브는 정방향 프라이머인 Phy-F(B. physalus Forward primer)와 역방향 프라이머인 Phy-R(B. physalus Reverse primer)가 쌍으로 이루어져 있고 Phy 프로브(probe)로 각 명명하여 구성되었다.
보호종으로 지정되지 않은 밍크고래를 식별하기 위한 프라이머-프로브는 정방향 프라이머인 Acu-F(B. acutorostrata Forward primer)와 역방향 프라이머인 Acu-R(B. acutorostrata Reverse primer)가 쌍으로 이루어져 있고 Acu 프로브(probe)로 각 명명하여 구성되었다. 보호종으로 지정되지 않은 큰돌고래를 식별하기 위한 프라이머-프로브는 정방향 프라이머인 Trun-F(T. truncatus Forward primer)와 역방향 프라이머인 Trun-R(T. truncatus Reverse primer)가 쌍으로 이루어져 있고 Trun 프로브(probe)로 각 명명하여 구성되었다.
또한, 고래 종식별 WD species ID marker의 각 종별 프로브(probe)의 3’ Reporter 자리에 서로 다른 종류의 형광염료를 달아 다중의 프라이머-프로브를 통한 실시간 PCR이 가능하도록 한 다중 증폭 실시간 PCR(multiplex real-time PCR)을 하였다.
multiplex RT-PCR을 진행할 때 함께 존재하는 프라이머(primer)와 프로브(probe)가 비특이적으로 이합체(dimer)를 형성한다면 RT-PCR의 효율이 떨어지게 된다. 따라서 이합체 형성의 가능성을 Thermo Fisher Scientific사의 사이트에 있는 ‘Multiple Primer Analyzer’를 통해 확인하여 가장 효율적인 짝을 찾았다. 그 짝을 프라이머-프로브 세트(primer-probe set)로 함께 다중 증폭 실시간 PCR을 진행하여 한 번의 실시간 PCR 분석을 통해 2종을 식별해낼 수 있도록 하였다. 디자인된 프라이머 쌍은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES) 사에 의뢰하여 합성하였고 형광 probe는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다.
실험예 4. 실시간 PCR (real-time PCR, RT-PCR)
4-1. 고래류 특이적 마커 (WD specific marker)의 RT-PCR 분석
WD specific marker로 디자인된 WD primer (WD-F, WD-R) 쌍으로 실험을 진행하였다. 실시간 PCR 반응은 전체 20μL 안에서 이루어졌으며 PCR 주형으로는 추출한 고래 14종의 DNA, 어류 11종의 DNA, 양 DNA, 인간표준 DNA를 각 1ng/μl로 희석하여 2uL씩 첨가하였다. 반응물은 2μM의 WD-F와 WD-R 프라이머(primer) 쌍을 2uL 첨가하였고 10uL의 2x SensiFAST SYBR Lo-ROX mix (Cat. no. BIO-94005, 바이오라인)로 구성되었으며 나머지는 증류수로 부피를 채워주었다(표 3). 실시간 PCR(Real-Time PCR)은 SYBR Green I을 기반으로 한 실시간 PCR이며 반응조건은 최초 변성(Denaturation) 95℃ 10분으로 시작하며, 변성 95℃ 15초, 결합(Annealing) 및 신장(Elongation) 64℃ 30초로 이루어진 주기를 32회 반복하였다. 상기 반응 조건 하에서 QuantStudioTM3 Real-Time PCR 시스템(Applied BiosystemsTM)을 이용하여 실험을 진행하였다.
SYBR Green I PCR을 진행할 때에는 이중나선을 가지는 비특이적 산물이 없는지 확인하기 위하여 Melting curve를 분석하였고, RT-PCR 최종 산물의 전기영동 결과 값을 분석하여 모두 동일한 산물이 증폭되었는지 확인하였다.
[표 3]
4-2. 고래 종식별 마커 (WD species ID marker)의 RT-PCR 분석
WD species ID marker로 디자인된 각 4종의 프라이머-프로브(primer-probe) 세트로 실험을 진행하였다. RT-PCR 반응은 전체 20uL 안에서 이루어졌으며 PCR 주형으로는 추출한 고래 14종의 DNA를 각 1ng/μl로 희석하여 2μL씩 첨가하였다.
보호종인 상괭이(N. asiaeorientalis)와 참고래(B. physalus)를 구분하는 AP(Asi-Phy) multiplex RT-PCR에서는 2μM의 Asi-F, Asi-R, Phy-F, Phy-R로 구성되어 있는 프라이머(primer)를 2μL 첨가하였고, 2μM의 Asi, Phy 로 구성되어 있는 프로브(probe)를 2uL 첨가하였다. 그리고 10uL의 2x SensiFAST Probe Lo-ROX mix (Cat. no. SF590-BO61520, 바이오라인)를 첨가하였고 나머지는 증류수로 부피를 채워주었다.
보호종으로 지정되지 않은 밍크고래(B. acutorostrata)와 큰돌고래(T. truncatus)를 구분하는 AT(Acu-Trun) multiplex RT-PCR에서는 2μM의 Acu-F, Acu-R과 4μM의 Trun-F, Trun-R로 구성되어 있는 프라이머(primer)를 2μL 첨가하였고 1μM의 Acu와 2μM의 Trun으로 구성되어 있는 프로브(probe)를 2μL 첨가하였다. 그리고 10μL의 2x SensiFAST Probe Lo-ROX mix (Cat. no. SF590-BO61520, 바이오라인)를 첨가하였고 나머지는 증류수로 부피를 채워주었다(표 4).
실시간 PCR (Real-time PCR)은 TaqMan probe를 기반으로 한 실시간 PCR이며 반응조건은 최초 변성(Denaturation) 95℃ 10분으로 시작하며, 변성 95℃ 15초, 결합(Annealing) 및 신장(Elongation) 68℃ 1분으로 이루어진 주기를 32회 반복하였다. 이러한 반응 조건 하에서 QuantStudioTM3 Real-Time PCR 시스템 (Applied BiosystemsTM)을 이용하여 실험을 진행하였다.
[표 4]
4-3. 현장 신속 검사법 (On-site rapid RT-PCR) 분석
본 발명에 따른 WD (Whale & Dolphin) specific marker와 4종을 식별하는 WD (Whale & Dolphin) species ID(identification) marker로 실험을 진행하였다. RT-PCR 반응은 전체 10μL 안에서 이루어졌으며 전체 혼합물의 8μL를 Lapchip에 주입하였다.
고래류 확인을 위한 WD specific marker의 현장 신속 검사법을 위한 PCR 주형으로는 추출한 고래 14종의 DNA, 어류 11종의 DNA, 양 DNA, 인간표준 DNA를 각 1ng/μl로 희석하여 2μL씩 첨가하였다. 반응물은 2μM의 WD-F와 WD-R 프라이머(primer) 쌍을 1μL 첨가하였고 5μL의 기기전용 2x qPCR Master Mix(JS Biotech, 경기도, 대한민국)로 구성되었으며 나머지는 증류수로 부피를 채워주었다(표 5). 실시간 PCR (Real-time PCR)은 SYBR Green I을 기반으로 한 실시간 PCR이며 반응조건은 최초 변성 (Denaturation) 95℃ 8초로 시작하며, 변성 95℃ 7초, 결합(Annealing) 및 신장 (Elongation) 64℃ 14초로 이루어진 주기를 32회 반복하였다. 이러한 반응 조건 하에서 Veri-Q PCR 316 ((주)미코바이오메드) 기기를 통해 실험을 진행하였다.
[표 5]
고래 종 식별을 위한 WD species ID marker의 현장 신속 검사법을 위한 PCR 주형으로는 추출한 고래 14종의 DNA를 각 1ng/ul로 희석하여 2μL씩 첨가하였다. 상괭이(N. asiaeorientalis)와 참고래(B. physalus)를 구분하는 AP(Asi-Phy) multiplex RT-PCR에서는 2uM의 Asi-F, Asi-R, Phy-F, Phy-R로 구성되어 있는 프라이머(primer)를 1uL 첨가하였고 2uM의 Asi, Phy 로 구성되어 있는 프로브(probe)를 1uL 첨가하였다. 밍크고래(B.acutorostrata)와 큰돌고래(T. truncatus)를 구분하는 AT(Acu-Trun) multiplex RT-PCR에서는 2uM의 Acu-F, Acu-R과 4uM의 Trun-F, Trun-R로 구성되어 있는 프라이머(primer)를 1uL 첨가하였고 1uM의 Acu와 2uM의 Trun으로 구성되어 있는 프로브(probe)를 1uL 첨가하였다. 5uL의 기기전용 2x qPCR Master Mix(JS Biotech, 경기도, 대한민국)를 첨가하였고 나머지는 증류수로 부피를 채워주었다(표 6). 실시간 PCR(Real-Time PCR)은 TaqMan probe를 기반으로 한 실시간 PCR이며 반응조건은 최초 변성(Denaturation) 95℃ 8초로 시작하며, 변성 95℃ 7초, 결합(Annealing) 및 신장(Elongation) 68℃ 14초로 이루어진 주기를 32회 반복하였다. 이러한 반응 조건 하에서 Veri-Q PCR 316 ((주)미코바이오메드) 기기를 통해 실험을 진행하였다.
[표 6]
실험예 5. 유효성 검토 (Validation)
5-1. 특이성 확인 (Analytical Specificity, Selectivity)
WD(Whale & Dolphin) specific marker의 특이성 확인을 통해 고래류 및 기타 생물 시료가 공존하는 상황에서 시험 대상 물질인 고래류에만 해당 마커가 특이적임을 확인하였다. WD primer (WD-F, WD-R)를 통하여 SYBR Green I을 기반으로 한 RT-PCR을 증폭하였을 때 고래 시료 14종 전체에서 증폭이 일어나는지 확인하였고, DNA 증폭 과정이 끝난 뒤 Melting curve를 분석하여 비특이적으로 생성된 이합체(dimer) 없이 목표하는 이중나선 DNA의 특이적인 증폭 산물이 한 종류인지 확인하였다. 한 종류의 증폭 산물이 있다는 것을 Melting curve 분석을 통해 확인하였다면, 전기영동 분석을 통해 크기를 확인하여 모두 목표하는 동일한 크기의 DNA 증폭 산물인지를 확인하였다. 실험한 시료는 고래 14종의 DNA, 어류 11종의 DNA, 양 DNA, 인간 DNA, NTC (Non template control)로 모두 각 6회 반복 실험하여 일정한 결과를 얻도록 하였다.
WD(Whale & Dolphin) species ID(identification) marker의 특이성 확인을 통해 전체 고래류 중 목적으로 하는 특정 고래종에서만 특이적이고 나머지 다른 고래종에는 특이적이지 않음을 확인하였다. 즉, 종별 프라이머-프로브(primer-probe)를 통해 TaqMan probe를 기반으로 한 RT-PCR을 증폭하였을 때 특정 고래종에서만 증폭이 일어나는지 확인하였고, 나머지 다른 13종의 고래종에서는 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였다. 시료는 고래 14종의 DNA와 NTC (Non template control)였다. 각 2종씩 프라이머-프로브 세트를 선정하여 multiplex RT-PCR 하였고 모두 6회 반복 실험하여 일정한 결과를 얻었다.
본 실험 과정은 QuantStudioTM3 Real-Time PCR 시스템 (Applied BiosystemsTM)을 이용하여 진행하였다(표 7).
5-2. 민감도 확인 (Analytical Sensitivity, Limit of Detection (LOD))
검출한계(Limit of Dectection, LOD)는 DNA template가 들어있지 않은 대조군인 NTC(Non Template Control)의 CT(Threshold cycle) 값과 명확하게 그 값의 차이를 보이는 실험체의 DNA 농도 값을 말한다. WD(Whale & Dolphin) specific marker는 고래 14종 시료를 각각 6개의 농도순서(2ng/ul, 0.2ng/ul, 100pg/ul, 50pg/ul, 10pg/ul, 5pg/ul)로 희석하였고, 총 6회씩 반복 실험을 하였다. 각 농도는 검량선(Calibration curve)으로부터 직선성의 상관계수(correlation coefficient, R2)를 구하여 상관계수(R2)의 값이 0.990 이상의 직선성을 가지는 구간을 농도 범위로 정하였다. 실험을 통해 구해진 검출한계(LOD) 농도 값을 신뢰할 수 있도록 6회 반복 실험을 통한 검출 확률이 95% 이상이 되도록 하였다. 즉 전체 6회 반복 중 6회 모두 분별 가능한 CT 값을 가지는 농도를 LOD95%로 정하였다. 구해진 각 14개 고래종의 LOD95% 농도 값에서 가장 농도가 높아 모든 14종에서 검출 가능한 값을 WD specific marker의 LOD95%로 선정하여 모든 고래 14종에서는 선정된 LOD95% 농도 값에서 증폭이 일어날 수 있도록 하였다.
WD(Whale & Dolphin) species ID(identification) marker는 고래 4종의 프라이머-프로브(primer-probe)의 LOD값을 각 4종별로 구하였다. 상괭이(N. asiaeorientalis), 참고래(B. physalus), 밍크고래(B. acutorostrata)는 7개의 농도순서(2ng/ul, 0.2ng/ul, 20pg/ul, 10pg/ul, 5pg/ul, 2.5pg/ul, 12.5pg/ul)로 희석하였고, 큰돌고래(T. truncatus)는 7개의 농도순서(2ng/ul, 1ng/ul, 0.5ng/ul, 100pg/ul, 50pg/ul, 12.5pg/ul, 6.25pg/ul)로 희석하여 모두 6회 반복 실험을 하였다. 검량선의 상관계수의 값(R2)이 0.990 이상의 직선성을 가지도록 농도 구간을 나누었고 검출확률이 95% 이상이 되도록 6회 실험 중 6회 모두 검출이 된 농도 값을 각 종의 LOD95%로 정하였고, 4종의 LOD95% 농도 값 중에서 가장 높은 값을 WD species ID marker의 LOD95% 값으로 선정하였다. 구해진 각 4 고래종의 LOD95% 농도 값에서 가장 농도가 높아 모든 4종에서 검출이 가능한 값을 WD species ID marker의 LOD95%로 선정하여 고래 4종에서는 선정된 LOD95% 농도 값에서 식별할 수 있는 증폭이 일어날 수 있도록 하였다.
본 실험 과정은 QuantStudioTM3 Real-Time PCR 시스템 (Applied BiosystemsTM)을 이용하여 진행하였다(표 7).
[표 7]
[실시예]
실시예 1. 고래류 특이적 마커의 실시간 PCR 분석
1-1. WD specific marker 염기서열의 특성 및 검증
상술한 바와 같은 고래류 확인을 위한 조건을 충족하는 WD specific marker는 고래 미토콘드리아 DNA의 12S ribosomal RNA(12S rRNA) 유전자에서 프라이머(primer) 쌍을 디자인하여 완성했다. 고래류에만 특이적으로 증폭하는 WD specific marker의 프라이머(primer) 쌍의 서열은 정방향 프라이머 (Forward primer) WD-F(5'-TCT AGA GGA GCC TGT TCT GTA AM-3') (서열번호 1)와 역방향 프라이머 (Reverse primer) WD-R(5'-TGA AGA TGG CGG TAT ATA GAC TGA AG-3') (서열번호 2)이며 해당 프라이머 쌍을 통한 증폭 산물의 크기는 84bp이다. 프라이머 서열의 특성은 표 8과 같다.
[표 8]
WD primer의 염기서열이 고래류 14종 간에 공통적으로 유사한 것을 NCBI BLAST 분석 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 통해 확인하였다(도 1). 반면 고래류가 아닌 다른 종의 염기서열은 WD primer 쌍의 염기서열과 실시간 PCR 증폭이 일어나지 않을 정도로 차이가 있었다. 타종과의 염기서열 유사도를 확인하기 위하여 NCBI에 등재되어있는 염기서열 정보를 이용하여 대한민국에서 발견될 수 있는 타종과의 염기서열 유사도(Homology)를 확인하였으며, 실제 실험에서 증폭이 일어나지 않는지 확인하기 위해 WD primer (WD-F, WD-R)와 염기서열 유사도(Homology)가 93% 일치하는 양(Ovis aries)을 대조시료로 채택하였다(도 2).
1-2. 특이성 확인 (Analytical Specificity, Selectivity) 결과
고래류에만 특이적으로 증폭을 하는 WD (Whale & Dolphin) specific marker를 통한 RT-PCR 분석의 결과는 도 3에 나타냈다. 전체 고래 14종은 모두 DNA 증폭이 일어난 반면(좌측 A 그래프), 고래류와의 식별을 위한 대조군이었던 어류 11종, 양, 인간, NTC에서는 모두 DNA 증폭이 일어나지 않았다(우측 B 그래프). 고래류의 CT(Threshold cycle)값은 하기 표 9에 정리하였다.
이어서, 비특이적 산물의 증폭 유무를 확인하기 위해 Melting curve 분석을 하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 고래 14종의 전체 Melting curve 그래프는 하나의 피크(peak)만 존재하여 한 종류의 산물만 증폭되었다는 것을 확인할 수 있었고(좌측 A 그래프), 고래류와의 식별을 위한 대조군이 었던 어류 11종, 양, 인간, NTC에서는 증폭 산물이 존재하지 않았으므로 Melting curve가 생성되지 않았다(우측 B 그래프).
[표 9]
또한, PCR 증폭 산물로 전기영동(electrophoresis)을 수행한 결과, 고래 14종 모두에서 동일한 크기(84 bp)의 산물이 증폭되었고, 대조시료에서는 증폭 산물이 없음을 확인할 수 있었다 (도 5).
1-3. 민감도 확인 (Analytical Sensitivity, Limit of Detection(LOD)) 결과
고래 14종 각각을 모두 6구간의 농도순서(2ng/μl, 0.2ng/μl, 100pg/μl, 50pg/μl, 10pg/μl, 5pg/μl)로 희석한 고래류 DNA와 NTC로 나누어 실험하여 결과를 확인할 수 있었다(도 6a 내지 6n). 참돌고래(D. delphiunus), 흑범고래(P. crassidens), 남방큰돌고래(T. aduncus)는 6회 반복 실험의 결과 6회 모두 검출된 검출한계농도(LOD95%)값은 각 10pg/μl 이었고, 이 3종을 제외한 나머지 11종 (상괭이(N. asiaeorientalis), 밍크고래(B. acutorostrata), 낫돌고래(L. obliquidens), 쇠돌고래(P. phocoena), 큰돌고래(T. truncatus), 큰머리돌고래(G. griseus), 범고래(O. orca), 까치돌고래(P. dalli), 참고래(B. physalus), 브라이드고래(B. brydei), 들쇠고래(G. macrorhynchus)) 은 모두 6회 반복 실험 결과 6회 모두 검출된 검출한계농도(LOD95%)값이 5pg/μl 이었다. 따라서 WD(Whale & Dolphin) specific marker의 고래류 14종에 대한 LOD95% 농도 값은 10pg/μl로 선정하였다.
실시예 2. 고래 종식별 마커의 실시간 PCR 분석
2-1. WD species ID marker 염기서열의 특성 및 검증
고래 종식별을 위한 프라이머-프로브(primer-probe)는 보호종으로 지정된 상괭이와 보호종으로 지정되지 않은 큰돌고래, 보호종으로 지정된 참고래와 보호종으로 지정되지 않은 밍크고래를 식별하기 위하여 총 4종류의 프라이머 및 프로브 세트를 각각 디자인하였다. 4종류 모두 미토콘드리아(mitochondria) DNA의 유전자를 통해 디자인되었다. 상괭이(N. asiaeorientalis)는 ND1(NADH dehydrogenase subunit 1) 유전자, 참고래(B. physalus)는 CYTB(cytochrome b) 유전자, 밍크고래(B. acutorostrata)는 12S rRNA(12S ribosomal RNA) 그리고 큰돌고래(T. truncatus)는 ND4(NADH dehydrogenase subunit 1) 유전자에서 각각 프라이머-프로브(primer-probe)를 디자인하였다.
고래 종식별 WD species ID marker는 서로 다른 종류의 형광염료 Reporter가 달린 프로브(probe)를 달아 여러 개의 프라이머-프로브를 통한 실시간 PCR이 가능하도록 한 multiplex RT-PCR을 하였다. multiplex RT-PCR을 진행할 때 함께 존재하는 프라이머와 프로브가 비특이적으로 이합체(dimer)를 형성한다면 RT-PCR의 효율이 떨어지게 된다. 따라서 이합체 형성의 가능성을 Thermo Fisher Scientific사의 사이트에 있는 ‘Multiple Primer Analyzer’를 통해 확인하여 가장 효율적인 짝을 찾았다(도 7). 그 결과, 서로 상보적인 서열이 존재하지 않는 상괭이(N. asiaeorientalis)와 참고래(B. physalus)가 AP(Asi-Phy) 프라이머-프로브 세트로 multiplex RT-PCR 하였고, 밍크고래(B. acutorostrata)와 큰돌고래(T. truncatus)가 AT(Acu-Trun) 프라이머-프로브 세트로 multiplex RT-PCR를 진행하였다.
각 종별 WD species ID marker의 프라이머 쌍의 염기서열과 특성은 표 10과 같고, 형광 프로브의 염기서열과 특성은 표 11과 같다. 프라이머 쌍은 IDT(INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES) 사에 의뢰하여 합성하였고 형광 probe는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다.
[표 10]
[표 11]
2-2. 특이성 확인(Analytical Specificity, Selectivity) 결과
특정 고래종에서만 특이적으로 증폭하여 식별이 가능한 WD(Whale & Dolphin) species ID(identification) marker의 전체 고래 4종 (상괭이(N. asiaeorientalis), 참고래(B. physalus), 밍크고래(B. acutorostrata), 큰돌고래(T. truncatus)) 에 대한 실시간 PCR 결과는 도 8에 나타냈다.
또한, 한 번의 RT-PCR 분석으로 각 2종씩 식별할 수 있도록 multiplex RT-PCR을 실시하였다. 14종 전체 고래 시료를 이용하여 각 프라이머-프로브(primer-probe) 세트를 분석하였다.
AP(Asi-Phy) multiplex RT-PCR 분석에서는 보호종으로 지정된 상괭이(N. asiaeorientalis) 시료에서 상괭이 특정 프라이머(Asi-F/R primer)와 프로브(Asi probe)에 의해 형광염료 FAM (494λmax/nm(absorption), 518λ max/nm(emission))의 파장대에서 증폭이 일어났고, 참고래(B. physalus) 시료에서 참고래 특정 프라이머(Phy-F/R primer)와 프로브(Phy probe)에 의해 형광염료 JOE (520λmax/nm(absorption), 548λmax/nm(emission))의 파장대에서 특이적으로 증폭이 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 9).
AT(Acu-Trun) multiplex RT-PCR 분석에서는 보호종으로 지정되지 않은 밍크고래(B. acutorostrata) 시료에서 밍크고래 특정 프라이머(Acu-F/R primer)와 프로브(Acu probe)에 의해 형광염료 FAM (494λmax/nm(absorption), 518λmax/nm(emission))의 파장대에서 증폭이 일어났고, 큰돌고래(T. truncatus) 시료에서 큰돌고래 특정 프라이머(Trun-F/R primer)와 프로브(Trun probe)에 의해 형광염료 JOE (520λmax/nm(absorption), 548λmax/nm(emission))의 파장대에서 특이적으로 증폭이 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 10). WD species ID marker에 의한 multiplex RT-PCR를 통하여 목표로 하는 특정 종에서만 특이적으로 DNA 증폭하여 CT값을 확인할 수 있었다(표 12).
[표 12]
2-3. 민감도 확인(Analytical Sensitivity, Limit of Detection(LOD)) 결과
고래 4종 중 3종 (상괭이(N. asiaeorientalis), 참고래(B. physalus), 밍크고래(B. acutorostrata))은 각각 7구간의 농도순서(2ng/μl, 0.2ng/μl, 20pg/μl, 10pg/μl, 5pg/μl, 2.5pg/μl, 1.25pg/μl)로 희석한 고래 3종의 DNA와 NTC로 나누어 실험하여 실시간 PCR 결과를 확인하였다(도 11a 내지 11c). 고래 4종 중 1종인 큰돌고래(T. truncatus)는 모두 7구간의 농도순서(2ng/μl, 1ng/μl, 0.5ng/μl, 100pg/μl, 50pg/μl, 12.5pg/μl, 6.25pg/μl)로 희석한 고래종의 DNA와 NTC로 나누어 실험하여 결과를 확인하였다(도 11d).
상괭이(N. asiaeorientalis), 참고래(B. physalus), 밍크고래(B. acutorostrata)는 6회 반복 실험의 결과 6회 모두 검출된 검출한계농도(LOD95%) 값이 각 1.25pg/μl 이었고, 큰돌고래(T. truncatus)는 6회 반복 실험 결과 6회 모두 검출된 검출한계농도(LOD95%) 값이 0.5ng/μl 이었다. 따라서 WD(Whale & Dolphin) species ID(identification) marker의 고래류 4종에 대한 multiplex RT-PCR의 LOD95% 값은 0.5ng/μl로 선정하였다.
실시예 3. 현장 신속 검사법 (On-site rapid RT-PCR) 분석
3-1. 고래류 특이적 마커의 현장 신속 검사법 분석 결과
Labchip을 기반으로 Veri-Q PCR 316 ((주)미코바이오메드) 장비를 이용하여 WD(Whale & Dolphin) specific marker를 통한 실시간 PCR 분석을 수행했다. 그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 고래 14종 전체에서 SYBR Green I PCR의 증폭이 일어났고(좌측 A 그래프) 고래류와 식별을 하기 위한 대조시료인 11종의 어류 DNA, 양 DNA, 인간 DNA, NTC에서는 모두 증폭이 일어나지 않았다(우측 B 그래프). 전체 분석은 모두 30분 이내에 종결되었다. 고래류의 CT(Threshold cycle) 값은 표 13에 정리하였다.
[표 13]
3-2. 고래 종식별 마커의 현장 신속 검사법 분석 결과
Labchip을 기반으로 한 Veri-Q PCR 316 ((주)미코바이오메드) 장비에서 분석 결과 고래 4종 (상괭이(N. asiaeorientalis), 참고래(B. physalus), 밍크고래(B. acutorostrata), 큰돌고래(T. truncatus))에 대한 특이적인 TaqMan probe PCR의 증폭을 통하여 종식별이 가능하였다. 또한 한 번의 실험으로 각 2종씩 식별할 수 있도록 multiplex RT-PCR을 실시하였다. 14종 전체 고래 시료를 이용하여 각 프라이머-프로브(primer-probe) 세트를 분석하였다.
구체적으로, AP(Asi-Phy) multiplex RT-PCR 분석에서는 보호종으로 지정된 상괭이(N.asiaeorientalis) 시료에서 상괭이 특정 프라이머(Asi-F/R primer)와 프로브(Asi probe)에 의해 형광염료 FAM (494λmax/nm(absorption), 518λmax/nm(emission))의 파장대에서 증폭이 일어났고, 참고래(B. physalus) 시료에서 참고래 특정 프라이머(Phy-F/R primer)와 프로브(Phy probe)에 의해 형광염료 JOE (520λmax/nm(absorption), 548λmax/nm(emission))의 파장대에서 특이적으로 증폭이 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 13).
AT(Acu-Trun) multiplex RT-PCR 분석에서는 보호종으로 지정되지 않은 밍크고래(B. acutorostrata) 시료에서 밍크고래 특정 프라이머(Acu-F/R primer)와 프로브(Acu probe)에 의해 형광염료 FAM (494λmax/nm(absorption), 518λmax/nm(emission))의 파장대에서 증폭이 일어났고, 큰돌고래(T. truncatus) 시료에서 큰돌고래 특정 프라이머(Trun-F/R primer)와 프로브(Trun probe)에 의해 형광염료 JOE (520λmax/nm(absorption), 548λmax/nm(emission))의 파장대에서 특이적으로 증폭이 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 14).
또한, WD species ID marker에 의한 multiplex RT-PCR 수행시 특정 종에만 특이적으로 DNA가 증폭되어 CT값을 확인할 수 있었다(표 14).
[표 14]
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Real-Time PCR primers and probes for identifying whales and dolphins and distinguishing the species thereof <130> MP21-056 <160> 14 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WD specific marker_FW primer <400> 1 tctagaggag cctgttctgt aam 23 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> WD specific marker_RV primer <400> 2 tgaagatggc ggtatataga ctgaag 26 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asi_FW primer <400> 3 tccaccacta tattcatcat cgca 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asi_RV primer <400> 4 tttatgttga tcagggagtg tggt 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phy_FW primer <400> 5 agttcttgtt ctgagtccta gtcg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phy_RV primer <400> 6 atgcgagttg gcctacaatt atgt 24 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acu_FW primer <400> 7 gcttgattga ataaggccat gg 22 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acu_RV primer <400> 8 ctgagttaat gaacaggggc tcta 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trun-FW primer <400> 9 ccctttatgg gctacatctt tgat 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trun-RV primer <400> 10 tagcctccga gttttagtag tacg 24 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Asi probe <400> 11 ccctggccct caccatgtga gcccc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Phy probe <400> 12 cggcggccaa ccagtagaac acccc 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Acu probe <400> 13 acgcacacac cgccccgtca ccctc 25 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Trun probe <400> 14 agcacatgta gaagccccca ttgcaggct 29

Claims (15)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. (i) 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 상괭이(Neophocaena asiaeorientalis) 식별용 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 6의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 참고래(Balaenoptera physalus) 식별용 프라이머 및 프로브 세트;를 포함하는 상괭이 및 참고래의 식별을 위한 다중 실시간 PCR(Multiplex RT-PCR) 프라이머 및 프로브 세트; 및
    (ii) 서열번호 7의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 밍크고래(Balaenoptera acutorostrata) 식별용 프라이머 및 프로브 세트; 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머, 서열번호 10의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머, 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프로브를 포함하는, 큰돌고래(Tursiops truncatus) 식별용 프라이머 및 프로브 세트;를 포함하는 밍크고래 및 큰돌고래의 식별을 위한 다중 실시간 PCR(Multiplex RT-PCR) 프라이머 및 프로브 세트를 포함하고,
    상기 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프로브; 또는 상기 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 프로브의 5' 말단은 제1 형광염료로 표지되고,
    상기 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브; 또는 상기 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프로브의 5' 말단은 제2 형광염료로 표지되며,
    상기 제1 형광염료 및 제2 형광염료는 발광(emission) 파장대가 서로 다른 것인, 고래류 중에서 상괭이, 참고래, 밍크고래 및 큰돌고래의 식별을 위한 다중 실시간 PCR(Multiplex RT-PCR) 프라이머 및 프로브 세트.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트는 가수분해 프로브(hydrolysis probe) 기반 다중 실시간 PCR용인 것인, 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 제 5 항에 있어서,
    상기 제1 형광염료 및 제2 형광염료는 FAM, JOE, HEX, TAMRA, VIC, Yakima Yellow, TET, NED, ROX, Quasar, CAL Flour 560, CAL Flour 610, CY3, CY5, CY3.5, CY5.5, 및 Biosearch Blue로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트.
  11. 제 5 항 또는 제 6 항에 따른 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 포함하는 고래류 중에서 상괭이, 참고래, 밍크고래 및 큰돌고래의 식별을 위한 키트.
  12. 삭제
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 키트는 PCR 키트 또는 DNA 칩(chip) 키트인 것인, 키트.
  14. 삭제
  15. 하기 단계를 포함하는, 고래류 중에서 상괭이, 참고래, 밍크고래 및 큰돌고래의 식별 방법:
    (S1) 분석 대상체 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (S2) 상기 단계 (S1)에서 분리한 DNA를 주형으로 하고, 제5항에 따른 다중 실시간 PCR 프라이머 및 프로브 세트를 이용하여 다중 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
    (S3) 상기 단계 (S2)의 PCR 반응 산물을 검출하는 단계.
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KR101248425B1 (ko) * 2011-02-16 2013-03-28 대한민국(관리부서:국립수산과학원) 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정을 위한 프로브 조성물, 이를 포함하는 ｄｎａ 칩 및 키트 그리고 이를 이용한 고래목에 속하는 동물의 분류체계 결정방법
KR102155967B1 (ko) 2019-09-24 2020-09-15 재단법인 게놈연구재단 미토콘드리아 삽입 마커에서 유래한 가시배새우 종 판별용 유전자 마커 조성물 및 이를 이용한 가시배새우 판별방법

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