ES2310063B1 - Deteccion de bacterias del acido lactico productoras de histamina mediante reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (qrt-pcr) y sus aplicaciones. - Google Patents
Deteccion de bacterias del acido lactico productoras de histamina mediante reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (qrt-pcr) y sus aplicaciones. Download PDFInfo
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Abstract
Detección de bacterias del ácido láctico
productoras de histamina mediante reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR) y
sus aplicaciones.
La presente invención describe un procedimiento
de amplificación cuantitativa a tiempo real del gen hdcA por
QRT-PCR, basado en el uso de una pareja de oligonucleótidos cebadores y una sonda Taqman específica del gen hdcA de Lb. buchneri NIZO 301 bajo unas condiciones adecuadas de amplificación del fragmento de doble cadena flanqueado por dichos oligonucleótidos. Dicho procedimiento identifica bacterias potencialmente productoras de histamina que permiten tomar decisiones en el ámbito de la seguridad alimentaria, preferentemente en el sector de los productos lácteos o en el sector vinícola, tanto para asegurar la caracterización de las cepas que pueden formar parte de un cultivo iniciador como para controlar los procesos de fermentación una vez iniciados y de alimentos ya elaborados. Las ventajas del procedimiento que se propone, son, además de la especificidad y la sencillez, la altísima sensibilidad y la rapidez.
QRT-PCR, basado en el uso de una pareja de oligonucleótidos cebadores y una sonda Taqman específica del gen hdcA de Lb. buchneri NIZO 301 bajo unas condiciones adecuadas de amplificación del fragmento de doble cadena flanqueado por dichos oligonucleótidos. Dicho procedimiento identifica bacterias potencialmente productoras de histamina que permiten tomar decisiones en el ámbito de la seguridad alimentaria, preferentemente en el sector de los productos lácteos o en el sector vinícola, tanto para asegurar la caracterización de las cepas que pueden formar parte de un cultivo iniciador como para controlar los procesos de fermentación una vez iniciados y de alimentos ya elaborados. Las ventajas del procedimiento que se propone, son, además de la especificidad y la sencillez, la altísima sensibilidad y la rapidez.
Description
Detección de bacterias del ácido láctico
productoras de histamina mediante reacción en cadena de la
polimerasa cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR) y
sus aplicaciones.
Industria alimentaría. Seguridad alimentaría.
Diagnóstico por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa
cuantitativa a tiempo real (QRT-PCR). El método
desarrollado puede ser aplicado en cualquiera de los pasos del
proceso de fermentación de alimentos y bebidas en los que
participen bacterias del ácido láctico (BAL) como cultivos
iniciadores o como microbiota secundaria como por ejemplo en el
sector de productos lácteos o el sector
vinícola.
vinícola.
Las BAL son esenciales en la Industria
Alimentaría como iniciadores de la fermentación, sin embargo, la
actividad metabólica de algunas cepas puede dar lugar a la
formación de unas sustancias tóxicas conocidas como aminas biógenas
(AB). Estos compuestos nitrogenados de bajo peso molecular se
forman por descarboxilación de determinados aminoácidos (M. H. Silla
Santos. 1996. Int. J. Food Microbiol. 29:
213-231). La ingestión de alimentos con niveles
altos de AB puede ocasionar graves trastornos, llegando incluso a
comprometer la vida del consumidor, especialmente en aquellas
personas con deficiencias en la actividad
amino-oxidasa intestinal, enzima responsable de su
destoxificación (S. Bodmer, C. Imark y M. Kneubühl. 1999. Inflamm.
Res. 48: 296-300). Además, las AB son
precursoras de las nitrosaminas, de conocido efecto cancerígeno (B.
ten Brink, C. Daminkm H.M.L.J. Joosten y J.H.J. Huis in't Veld.
1990. Int. J. Food. Microbiol. 11: 73-84).
Por todo ello, las autoridades alimentarías recomiendan evitar la
presencia de AB en alimentos y bebidas. En general, las AB que
aparecen con mayor frecuencia y en mayor concentración en alimentos
fermentados son la tiramina y la histamina, producidas por
descarboxilación enzimática de los aminoácidos tirosina e histidina
respectivamente (B. ten Brink, C. Daminkm H.M.L.J. Joosten y J.H.J.
Huis in't Veld. 1990. Int. J. Food. Microbiol. 11:
73-84).
La mayoría de los quesos que consumimos se
elaboran a partir de leches pasteurizadas que se inoculan con
cultivos iniciadores industriales. Las cepas que forman parte de
estos cultivos deben de cumplir una serie de características como
capacidad acidificante, resistencia a bacteriófagos, producción de
aroma y sabor entre otras. Además, con el fin de garantizar las
cualidades sanitarias del producto final se debería de evitar la
inclusión de aquellas cepas cuya actividad metabólica pueda dar
lugar a la formación de AB.
Los métodos actuales de detección de AB en
alimentos son métodos cromatográficos (M.T.
Veciana-Nogues, T. Hernández-Javer,
A. Marine-Font y M.C. Vidal-Carou.
1995. JAOAC Int. 78: 1045-1050) que detectan
la presencia de estos compuestos al final del proceso productivo y
por lo tanto no se puede evitar la pérdida del producto final con
el consiguiente perjuicio económico. También se puede comprobar si
las cepas utilizadas como cultivos iniciadores producen AB en el
laboratorio. En la actualidad se usan dos tipos de métodos:
cuantitativos y/o cualitativos. Los métodos cualitativos se basan en
el crecimiento de los microorganismos en medios diferenciales, con
un indicador de pH y en presencia del aminoácido que actúa como
sustrato de la reacción (S. Boyer-Cid y W.H.
Holzapfel. 1999. Int. J. Food Microbiol. 53:
33-41). La dificultad para el crecimiento en estos
medios de algunas cepas de BAL productoras de aminas y los largos
períodos de incubación necesarios (72 horas) ha conducido a la
búsqueda de nuevas técnicas alternativas. Los métodos cuantitativos
se basan en técnicas cromatográficas (I. Krause, A. Bockhardt, H.
Neckerman, T. Henle y H. Klostermeyer. 1995. J. of Chromatography
715: 67-79), en este caso hay que tener en
cuenta que la producción de estos compuestos está inducida por
determinadas condiciones ambientales, como por ejemplo la presencia
del aminoácido sustrato o la acidez del medio (N. Connil, N.
Connil, Y. L. Breton, X. Dousset, Y. Auffray, A. Rincé y H.
Prévost. 2002. Appl. Environ. Microbiol. 68:
3537-3544). Esto indica que un resultado negativo en
el momento de realizar el análisis no puede garantizar la seguridad
de la cepa ensayada, ya que en condiciones distintas si podría
producir AB que se acumularían en el alimento o bebida
correspondiente. La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ha
sido aplicada para la detección de cepas productoras de tiramina
(M. Fernández, D.M. Linares y M.A. Alvarez. 2004. J. of Food
Protection. 67: 2521-2529; solicitud de
española de patente nº ES200302572), histamina tanto bacterias del
ácido láctico (C. Le Jeune, A. Lonvaud-Funel, B.
ten Brink, H. Hofstra y J.M.B.M. van der Vosse. 1995. J. Appl.
Bacteriol. 78: 316-326) como Gram negativas
(H. Takahashi, B. Kimura, M. Yoshikawa, y T. Fujii. 2003. Appl.
Environ. Microbiol. 69: 2568–2579) y para la detección
simultanea de histamina, tiramina, putrescina y cadaverina (B. de
las Rivas, A. Marcobal, y R. Muñoz. 2005. FEMS Microbiol. Letters
en prensa; solicitud de española de patente nº ES200402314). En
estas reacciones el producto final o amplicon es analizado mediante
su visualización en geles de agarosa. En los últimos años el
desarrollo de la PCR cuantitativa en tiempo real permite la
amplificación y la detección en un solo paso y ofrece importantes
avances frente a la PCR convencional, como son una mayor
especificidad y sensibilidad, no es necesario el procesamiento
post-PCR de la muestra y permite cuantificar el
material genético de partida.
Uno de los criterios de selección de los
microorganismos que forman parte de los cultivos iniciadores de
alimentos y bebidas fermentadas es su inocuidad, de forma que esté
garantizada la calidad sanitaria del producto final. Esta
necesidad, en combinación con la demanda de métodos cada vez más
rápidos y sensibles que puedan ser fácilmente aplicados en
cualquier punto de la cadena alimentaria hacen de la reacción de
PCR cuantitativa a tiempo real un método atractivo para la
detección de cepas productoras de histamina. Nuestro objetivo era
diseñar una nueva pareja de oligonucleótidos y una sonda Taqman para
poder detectar y cuantificar de forma específica cepas de bacterias
lácticas productoras de histamina.
El objeto de la presente invención lo constituye
un procedimiento de detección de cepas de bacterias del ácido
láctico productoras de histamina de forma rápida y sensible. La
detección se realiza mediante amplificación del gen hdcA por
la técnica de reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real
(QRT-PCR) usando una pareja de oligonucleótidos
cebadores y una sonda Taqman específicos. Este sistema permite la
detección de cepas productoras de histamina mediante el uso de los
oligonucleótidos específicos y de la sonda Taqman, diseñados a
partir de la secuencia del gen hdcA que codifica el enzima
histidina descarboxilasa implicado en la biosíntesis de histamina, y
bajo unas condiciones adecuadas para la amplificación específica de
los fragmentos de doble cadena flanqueados por los
cebadores.
cebadores.
La novedad de la presente invención radica en el
uso conjunto de la pareja de oligonucleótidos cebadores, de la
sonda Taqman y del procedimiento de QRT-PCR, para
la detección e identificación rápida del gen hdcA.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
lo constituye un kit de diagnóstico de cepas productoras de
histamina por QRT-PCR mediante el gen hdcA
de Lb. buchenri que utilice para ello cualquier combinación
posible de cebadores y sonda Taqman que contenga la presente
invención. Las ventajas más importantes del procedimiento que se
propone, son, además de la especificidad y la sencillez, la
altísima sensibilidad y rapidez junto con la posibilidad de
cuantificar el producto de partida. Partiendo de una colonia aislada
o de material genético obtenido a partir de células crecidas en
cualquier medio de cultivo se puede conocer, en treinta minutos, si
esa cepa contiene el gen hdcA y es potencialmente productora
de histamina.
El segundo tema clave, es que, como se ha dicho,
la detección de histamina mediante métodos tradicionales (HPLC,
mediante métodos colorimétricos) basados en la detección del
producto de la reacción histamina no se puede aplicar en las
primeras etapas de la fermentación ya que la concentración de
histidina, el sustrato de la reacción, es muy baja en estos
momentos. Así que la principal ventaja, además de su rapidez, sería
la sensibilidad del método que permite su aplicación en cualquier
punto del proceso de elaboración de alimentos fermentados.
Igualmente se pueden analizar alimentos ya elaborados, tanto
lácteos, como cárnicos o vinos.
La detección de cepas productoras de histamina
en los productos finales permitiría evitar los problemas de salud
asociados a la ingesta de histamina.
La presente invención consiste en un
procedimiento de detección e identificación de cepas de bacterias
del ácido láctico (BAL) productoras de histamina mediante reacción
en cadena de la polimerasa a tiempo real (QRT-PCR)
a través de la detección del gen hdcA, tanto a partir de
cepas aisladas que formen parte de un cultivo iniciador, o en
muestras de alimentos, leche o sus derivados fermentados. Estas
cepas productoras se pueden detectar rápidamente y de forma
específica y bajo unas condiciones adecuadas para la amplificación
específica del fragmento de doble cadena flanqueado por la pareja
de oligonucleótidos.
El diseño de los oligonucleótidos adecuados que
permiten la amplificación específica del DNA deseado comienza con
la comparación de las secuencias de nucleótidos del gen que se
quiere amplificar procedente de distintas especies de BAL como
Lactobacillus buchneri NIZO 301, Oenococcus oeni,
Lactobacillus 30A y Lactobacillus hilgardii. La
comparación ha permitido la identificación de regiones altamente
conservadas entre las distintas especies.
En la invención que se presenta se diseñaron los
oligonucleótidos específicos para el gen hdcA a partir de
las secuencias nucleotídicas disponibles en las bases de datos de
Lb. buchneri (número de acceso Genbank AJ749838), O.
oeni (número de acceso Genbank U58865), Lb. 30A (número
de acceso Genbank J02613) y Lb. hilgardii (número de acceso
Genbank AY651779). En base a la secuencia de la zona mas conservada
de este gen (Figura 1) se diseñaron como parte de la presente
invención los oligonucleótidos cebadores específicos cuya secuencia
se muestra a continuación:
| 5'-TGCTGTGCTAACAAAGGTGTCA-3' | (oligo hdcA1, SEQ ID NO 1) |
| 5'-TCCTTGACCTGGCTTCATGTC -3' | (oligo hdcA2, SEQ ID NO 2) |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos oligonucleótidos pueden ser directamente
utilizados para la reacción de QRT-PCR empleando
Sybrgreen como fluoróforo.
Además con el fin de aumentar la especificidad
de la reacción, se diseñó una sonda Taqman en la región comprendida
entre los oligonucleótidos cebadores hdcA1 y hdcA2 anteriormente
descritos. Así se diseñó, como parte de la presente invención, la
sonda cuya secuencia se muestra a continuación:
| 5'-AACGTCCAAAGAACG-3' | (sonda Taqman hdcA3, SEQ ID NO 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
Así, un objeto de la presente invención lo
constituye un procedimiento de amplificación del gen hdcA
por la técnica de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa
a tiempo real (QRT-PCR), en adelante procedimiento
de la presente invención, basado en el uso de una pareja de
oligonucleótidos cebadores específicos del gen hcdA de
Lb. buchneri NIZO 301, entre otros, los oligonucleótidos
hdcA1 y hdcA2, y de una sonda específica hdcA3 y bajo unas
condiciones adecuadas de amplificación del fragmento de doble cadena
flanqueado por dichos oligonucleótidos, como por ejemplo, las
siguientes:
- \ding{51}
- un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto.
- \ding{51}
- 40 ciclos:
- \bullet
- Desnaturalización a 94ºC (5 segundos)
- \bullet
- Anillamiento y extensión a 58ºC (30 segundos)
\vskip1.000000\baselineskip
Hay que señalar que las condiciones de la
reacción QRT-PCR descritas anteriormente pueden
adaptarse fácilmente por un experto medio de la técnica de la
presente invención dependiendo del termociclador, pudiéndose
modificar las condiciones de desnaturalización, la temperatura de
anillamiento, la temperatura de extensión, la polimerasa así como
la secuencia de los cebadores, y de la sonda etc, de tal forma que
estos procedimientos de amplificación del gen hdcA por PCR
forman parte de la presente invención.
Otro objeto de la presente invención lo
constituye un kit de diagnóstico por PCR del gen hdcA que
contenga la pareja de oligonucleótidos cebadores y la sonda Taqman
de la presente invención.
Finalmente, otro objeto de la presente invención
lo constituye el uso de la pareja de oligonucleótidos cebadores, de
la sonda Taqman y del procedimiento de la presente invención para
la amplificación por QRT-PCR del gen hdcA.
Esto permitirá detectar y cuantificar bacterias productoras de
histamina que permitan tomar decisiones en el ámbito de la
seguridad alimentaría, preferentemente en el sector de los
productos lácteos o vinícolas, tanto para asegurar la
caracterización de las cepas que pueden formar parte de un cultivo
iniciador como para controlar los procesos de fermentación una vez
iniciados y los productos finales productos lácteos como el queso
entre otros o vinos, cervezas, etc,).
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1.- Comparación de las secuencias
nucleotídicas del gen histidina descarboxilasa de Lb.
buchneri NIZO 301. (número de acceso en GenBank AJ749838) O.
oeni (número de acceso en GenBank U58865), Lb. hilgardii
(número de acceso en GenBank AY651779) y Lb. 30A (número de
acceso en GenBank J02613). En rojo se indican los nucleótidos
idénticos en los tres géneros.
Figura 2.- QRT-PCR de diluciones
seriadas de DNA de la cepa productora de histamina Lb.
buchenri NIZO 301.
Figura 3.- Relación entre la CT y la
concentración de histamina en distintas muestras a lo largo del
proceso de elaboración de un queso artesanal, desde leche (L),
cuajada (C) hasta 90 días (90D).
Figura 4.-. Relación entre la CT y la
concentración de histamina entre distintos quesos (Q1 a Q 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Se comprobó si los oligonucleótidos y las
condiciones de la reacción de PCR diseñados permitían la
identificación de cepas productoras de histamina mediante la
amplificación específica del fragmento interno del gen hdcA.
Se analizaron 6 cepas distintas, pertenecientes a los géneros
Lactobacillus (3 cepas), Lactococcus (2 cepas) y
Enterococcus (1 cepa). Algunas de estas cepas
(Lactobacillus y Enterococcus) son productoras de
histamina como se comprobó mediante su capacidad de hidrólizar
histidina en placa y mediante análisis cromatográfico. Se obtuvo
DNA cromosómico de todas ellas por procedimientos estándares y se
realizó la reacción de PCR.
Las reacciones de amplificación se realizaron en
un termociclador 7500 FAST REAL TIME PCR SYSTEM
(Applied Biosystem). Se utilizó un kit Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem), en el que se incluyen los dideoxinucleótidos el enzima AmpliTaq gold y el tampón de reacción y se añadieron 900 nM de cada cebador y 200 nM de sonda y 1 \mul de muestra en 10 \mul totales de reacción.
(Applied Biosystem). Se utilizó un kit Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem), en el que se incluyen los dideoxinucleótidos el enzima AmpliTaq gold y el tampón de reacción y se añadieron 900 nM de cada cebador y 200 nM de sonda y 1 \mul de muestra en 10 \mul totales de reacción.
Las condiciones de la reacción son las
siguientes:
- \ding{51}
- un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto.
- \ding{51}
- 40 ciclos:
- \bullet
- Desnaturalización a 94ºC (5 segundos)
- \bullet
- Anillamiento y extensión a 58ºC (30 segundos)
En todos los casos se observó amplificación en
las muestras de DNA correspondientes a las cepas productoras como
un incremento en la fluorescencia, no detectándose este incremento
en el caso de cepas no productoras (Tabla 1). La
QRT-PCR permite además la cuantificación del
material de partida ya que es posible determinar el número de ciclo
en que el lector empieza a detectar un incremento de la
fluorescencia significativo con respecto a la señal de base (CT) y
que es inversamente proporcional a la concentración inicial de DNA
diana de la muestra. Hemos podido establecer por lo tanto una
relación lineal entre la concentración del DNA utilizado para la
reacción de PCR y la CT obtenida (Figura 2).
A partir de las distintas muestras obtenidas a
lo largo del proceso de elaboración de un queso artesanal, leche,
cuajada, queso de 3, 7, 15, 30, 60 y 90 días se obtuvo DNA (J.O
Ogier, O. Son, A. Gruss, P. Tailliez, y A.
Delacroix-Buchet. 2002. Appl. Environ. Microbiol.
68: 3691-3701).
Las reacciones de amplificación se realizaron en
un termociclador 7500 FAST REAL TIME PCR SYSTEM
(Applied Biosystem). Se utilizó un kit Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem), en el que se incluyen los dideoxinucleótidos el enzima AmpliTaq gold y el tampón de reacción y se añadieron 900 nM de cada cebador, 200 nM de sonda y 1 \mul de muestra en 10 \mul totales de reacción.
(Applied Biosystem). Se utilizó un kit Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem), en el que se incluyen los dideoxinucleótidos el enzima AmpliTaq gold y el tampón de reacción y se añadieron 900 nM de cada cebador, 200 nM de sonda y 1 \mul de muestra en 10 \mul totales de reacción.
| 5'-TGCTGTGCTAACAAAGGTGTCA-3' | (oligo hdcA1, SEQ ID NO 1) |
| 5'-TCCTTGACCTGGCTTCATGTC-3' | (oligo hdcA2, SEQ ID NO 2) |
| 5'-AACGTCCAAAGAACG-3' | (sonda Taqman hdcA3 , SEQ ID NO 3) |
Las condiciones de la reacción son las
siguientes:
- \ding{51}
- un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto.
- \ding{51}
- 40 ciclos:
- \bullet
- Desnaturalización a 94ºC (5 segundos)
- \bullet
- Anillamiento y extensión a 58ºC (30 segundos)
\vskip1.000000\baselineskip
Con todas las muestras analizadas se obtiene
amplificación, si bien los valores de CT obtenidos varían de unas
muestras a otras. Se observa una disminución en los valores de CT
durante las primeras etapas de elaboración (leche, cuajada, queso 3
días) que se relaciona con un aumento en la población microbiana
durante estas etapas. Cuando se comparan estos datos con la
detección de histamina por HPLC (Figura 2) se puede observar como
en las primeras etapas de producción es posible detectar la
presencia de las cepas productoras mediante QRT-PCR
y sin embargo no se detecta histamina por HPLC. En las muestras
correspondientes a las últimas etapas de elaboración no se observan
cambios significativos en los valores de CT y se observa un
incremento en la concentración de histamina debido a la acumulación
de estos compuestos en las muestras de alimentos.
\vskip1.000000\baselineskip
El método de detección de la presente invención
ha sido aplicado para analizar productos ya elaborados, Para ello
se seleccionaron cinco muestras distintas de quesos y se obtuvo el
DNA (J.O Ogier, O. Son, A. Gruss, P. Tailliez, y A.
Delacroix-Buchet. 2002. Appl. Environ. Microbiol.
68: 3691-3701).
Las reacciones de amplificación se analizaron en
un termociclador 7500 FAST REAL TIME PCR SYSTEM
(Applied Biosystem). Se utilizó el kit Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem), en el que se incluyen los dideoxinucleótidos el enzima AmpliTaq gold y el tampón de reacción y se añadieron 900 nM de cada cebador, 200 nM de sonda y 1 \mul de muestra en 10 \mul totales de reacción.
(Applied Biosystem). Se utilizó el kit Taqman Fast Universal PCR Master Mix (Applied Biosystem), en el que se incluyen los dideoxinucleótidos el enzima AmpliTaq gold y el tampón de reacción y se añadieron 900 nM de cada cebador, 200 nM de sonda y 1 \mul de muestra en 10 \mul totales de reacción.
| 5'-TGCTGTGCTAACAAAGGTGTCA-3' | (oligo hdcA1, SEQ ID NO 1) |
| 5'-TCCTTGACCTGGCTTCATGTC -3' | (oligo hdcA2, SEQ ID NO 2) |
| 5'-AACGTCCAAAGAACG-3' | (sonda Taqman hdcA3, SEQ ID NO 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de la reacción son las
siguientes:
- \ding{51}
- un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto.
- \ding{51}
- 40 ciclos:
- \bullet
- Desnaturalización a 94ºC (5 segundos)
- \bullet
- Anillamiento y extensión a 58ºC (30 segundos)
\vskip1.000000\baselineskip
En cuatro de las muestras analizadas se observó
amplificación, lo que coincide con las muestras en las que se
detectó histamina por HPLC. Además se observa una relación
inversamente proporcional entre la concentración de histamina de
las muestras y los valores de CT obtenidos (Figura 3).
Estos resultados demuestran la eficacia de la
invención para la detección de cepas productoras de histamina así
como su utilidad.
<110> Consejo Superior de Investigaciones
Científicas
\hskip1cmÁlvarez González, Miguel A
\hskip1cmMartínez Linares, Daniel
\hskip1cmDel Río Lagar, Beatriz
\hskip1cmFernández García, María
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> DETECCIÓN DE BACTERIAS DEL ÁCIDO
LÁCTICO PRODUCTORAS DE HISTAMINA MEDIANTE REACCIÓN EN CADENA DE LA
POLIMERASA CUANTITATIVA A TIEMPO REAL (QRT-PCR) Y
SUS APLICACIONES.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130>
HIS-QRT-PCR.prj
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> hdcA1 oligonucleotide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer_bind
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> specific of hdcA gen of
Lactobacillus buchneri and its equivalents
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgctgtgcta acaaaggtgt ca
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> hdcA2 oligonucleotide
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> primer
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(21)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> specific of hdcA gen of
Lactobacillus buchneri and its equivalents
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptccttgacct ggcttcatgt c
\hfill21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial Sequence
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> hdcA3 gen Taqman probe
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipaacgtccaaa gaacg
\hfill15
Claims (14)
1. Procedimiento de detección de cepas
productoras de histamina caracterizado por el uso la técnica
de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real
(QRT-PCR) mediante una única reacción con
oligonucleótidos y sonda Taqman específicos del gen hdcA de
Lb. buchneri y sus equivalentes en otras especies
bacterianas.
2. Procedimiento de detección de cepas
productoras de histamina según la reivindicación 1
caracterizado porque la pareja de oligonucleótidos cebadores
específicos del gen hdcA de Lb. buchneri y sus
equivalentes en otras especies bacterianas, está constituida por
los oligonucleótidos hdcA1 (SEQ ID NO 1) y hdcA2 (SEQ ID NO 2).
3. Procedimiento de detección de cepas
productoras de histamina según la reivindicación 1
caracterizado porque la sonda Taqman específica del gen
hdcA de Lb. buchneri y sus equivalentes en otras
especies bacterianas, está constituido por la sonda Taqman hdcA3
(SEQ ID NO 3) comprendida entre los oligonucleótidos cebadores
indicados en la reivindicación 2.
4. Procedimiento de detección de cepas
productoras de histamina según las reivindicaciones 1 a 3
caracterizado porque la reacción de amplificación
QRT-PCR se lleva a cabo bajo las siguientes
condiciones:
- -
- Un ciclo de desnaturalización a 94ºC durante 1 min. y
- -
- 40 ciclos consistentes en desnaturalización a 94ºC durante 5 segundos, anillamiento y extensión a 58ºC durante 30 segundos.
5. Procedimiento de detección de cepas
productoras de histamina según las reivindicaciones 1 a 4
caracterizado porque se utilizan como material de partida
sustratos, tanto vegetales como animales, susceptibles de
fermentaciones alimentarias.
6. Procedimiento de detección de cepas
productoras de histamina según las reivindicaciones 1 a 4
caracterizado porque se utilizan como material de partida
productos de origen animal, leche o derivados lácteos.
7. Procedimiento de detección de cepas
productoras de histamina según las reivindicaciones 1 a 4
caracterizado porque se utilizan como material de partida
productos de origen animal, carnes o pescados susceptibles de ser
sustratos de fermentación.
8. Secuencias de oligonucleótidos cebadores para
la detección de cepas productoras de histamina según el
procedimiento de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizadas
porque hibridan específicamente con secuencias del gen hdcA de
Lactobacillus buchneri y con secuencias de genes equivalentes
a hdcA en otras especies bacterianas productoras de histamina.
9. Pareja de oligonucleótidos cebadores según la
reivindicación 8 caracterizados por las secuencias de
nucleótidos SEQ ID No 1 y SEQ ID No 2.
10. Sonda Taqman para la detección de cepas
productoras de histamina según el procedimiento de las
reivindicaciones 1 a 7 caracterizada porque hibrida
específicamente con una secuencia específica del gen hdcA de
Lb. bucheri y con secuencias de genes equivalentes a
hdcA en otras especies bacterianas.
11. Sonda Taqman según la reivindicación 10
caracterizada por la secuencia de nucleótidos SEQ ID No.
3.
12. Kit de diagnóstico para la detección de
cepas productoras de histamina según el procedimiento de las
reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque comprende los
oligonucleótidos específicos según las reivindicaciones 8 a 11.
13. Uso del procedimiento de detección de
detección de cepas productoras de histamina según las
reivindicaciones 1 a 7 en productos alimenticios de origen animal
y/o vegetal, en aditivos de los mismos y en cultivos iniciadores de
uso en la industria alimentaria.
14. Uso del procedimiento de detección de
detección de cepas productoras de histamina según la reivindicación
13 en muestras de leche, o en sus derivados fermentativos, como el
yogur, cuajada y queso entre otros.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200501880A ES2310063B1 (es) | 2005-07-29 | 2005-07-29 | Deteccion de bacterias del acido lactico productoras de histamina mediante reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (qrt-pcr) y sus aplicaciones. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200501880A ES2310063B1 (es) | 2005-07-29 | 2005-07-29 | Deteccion de bacterias del acido lactico productoras de histamina mediante reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (qrt-pcr) y sus aplicaciones. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2310063A1 ES2310063A1 (es) | 2008-12-16 |
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| ES200501880A Expired - Fee Related ES2310063B1 (es) | 2005-07-29 | 2005-07-29 | Deteccion de bacterias del acido lactico productoras de histamina mediante reaccion en cadena de la polimerasa cuantitativa a tiempo real (qrt-pcr) y sus aplicaciones. |
Country Status (1)
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104160276A (zh) * | 2011-07-21 | 2014-11-19 | 生命大地女神有限公司 | 细菌组胺的产生和应用 |
-
2005
- 2005-07-29 ES ES200501880A patent/ES2310063B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
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|---|
| COTON, E. et al., "{}Multiplex PCR for colony direct detection of Gram-positive histamine- and tyramine-producing bacteria."{}, JOURNAL OF MICROBIOLOGICAL METHODS, 2005 Dic, Vol. 63, No. 3, páginas 296-304. [publicación 'on line': 01.06.2005]. Todo el documento. * |
| LANDETE, J.M. et al., "{}Which lactic acid bacteria are responsible for histamine production in wine?."{}, JOURNAL OF APPLIED MICROBIOLOGY, 2005, Vol. 99, Vol. 3, páginas 580-586. [publicación 'on line': 21.06.2005]. Todo el documento. * |
| LE JEUNE, C. et al., "{}Development of a detection system for histidine decarboxylating lactic acid bacteria based on DNA probes, PCR and activity test."{}, JOURNAL OF APPLIED BACTERIOLOGY, 1995, Vol. 78, No. 3, páginas 316-326. Todo el documento. * |
| MARTÍN, M.C. et al., "{}Sequencing, characterization and transcriptional analysis of the histidine decarboxylase operon of Lactobacillus buchneri."{}, MICROBIOLOGY, 2005 Abr, Vol. 151, Pt. 4, páginas 1219-1228. Todo el documento. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104160276A (zh) * | 2011-07-21 | 2014-11-19 | 生命大地女神有限公司 | 细菌组胺的产生和应用 |
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| ES2310063A1 (es) | 2008-12-16 |
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