PL184823B1

PL184823B1 - Preparat do przechowywania substancji biologicznie aktywnych oraz sposób wytwarzania preparatu do przechowywania substancji biologicznie aktywnych

Info

Publication number: PL184823B1
Application number: PL96323902A
Authority: PL
Inventors: Bruce J. Roser; Enda M. Gribbon
Original assignee: Quadrant Holdings Cambridge
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2002-12-31
Also published as: DE69628007T2; CN1193908A; IL122482A; EP0831790B1; JP4502406B2; PT831790E; CN1245957C; AP852A; HUP9901716A2; NO975773D0; HUP9901716A3; MX9709716A; CA2223438C; AP9701151A0; SK167597A3; AU713599B2; CA2223438A1; KR19990022710A; ES2194992T3; JPH11506467A

Abstract

1. Preparat do przechowywania substancji biologicznie aktywnych, znamienny tym, ze stanowi spienione szkliste podloze z weglowodanu z wbudowanym w to podloze srod- kiem terapeutycznym lub diagnostycznym. 7. Sposób wytwarzania preparatu do przechowywania substancji biologicznie ak- tywnych, znamienny tym, ze (a) odparowuje sie wiekszosc rozpuszczalnika z mieszaniny zawierajacej co najmniej jeden weglowodan zdolny do tworzenia szklistego podloza, jego rozpuszczalnik oraz srodek terapeutyczny lub diagnostyczny, (b) wytworzony syrop poddaje sie dzialaniu cisnienia i temperatury wystarczaja- cych do spowodowania wrzenia syropu, i (c) ewentualnie z wytworzonego spienionego szklistego podloza usuwa sie reszt- kowa wilgoc do zawartosci 0,1 do 12% (wagowo-wagowe) resztkowej wilgoci w podlozu. PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest preparat do przechowywania substancji biologicznie aktywnych oraz sposób wytwarzania preparatu do przechowywania substancji biologicznie aktywnych. W szczególności, przedmiotem wynalazku jest preparat stanowiący podłoże ze stabilnie wbudowaną substancją aktywną.

Znane jest przechowywanie substancji biologicznych, które w temperaturze otoczenia są niestabilne w roztworach (zwłaszcza substancji takich jak białka lub DNA), za pomocą liofilizacji. Proces ten polega na rozpuszczeniu substancji, zamrożeniu powstałego roztworu i poddaniu powstałego ciała stałego działaniu próżni w takich warunkach, że pozostaje ono stałe, zaś woda i wszelkie inne lotne substancje są usunięte w procesie sublimacji. Powstały suchy osad zawiera substancje biologiczne i wszelkie sole oraz inne nielotne substancje dodane do roztworu przed liofilizacją. Ta metoda, stosowana rutynowo w braku innych efektywnych rozwiązań, często powoduje poważne straty w aktywności przechowywanej substancji (Pikał, 1994, ACS Symposium 567:120-133). Ponadto, wiele z rozmaitych parametrów w procesie liofilizacji pozostaje słabo scharakteryzowanych, co prowadzi do strat całych szarż produkcyjnych.

Pomimo oczywistej równomierności liofilizacji, wiele zliofilizowanych substancji pozostaje niestabilne w temperaturze otoczenia (Pikał, 1994: Carpenter i wsp., 1994, ACS Symposium 567:134-147). Stratom spowodowanym w procesie liofilizacji można zapobiec do pewnego stopnia poprzez zastosowanie substancji ochronnych, tzw. krioprotektantów (Carpenter i wsp., 1994). Jednakże, krioprotektanty mogą następnie reagować z wysuszoną substancją co powoduje niestabilność przechowywanych substancji liofilizowanych.

Inne metody wytwarzania suchych, stabilnych preparatów z niestabilnych biologicznych i chemicznych substancji, przykładowo, suszenie w temperaturze otoczenia, krystalizacja czy współstrącanie - także mają swoje wady. Techniki suszenia w temperaturze otoczenia eliminują etap zamrażania i związane z tym uszkodzenia substancji. Techniki te są szybsze i zużywają mniej energii na usunięcie wody (Crowe i wsp., 1990, Cryobiol. 27.219-231). Jednakże suszenie w temperaturze otoczenia często powoduje denaturację lub nawet inaktywację substancji, jeśli nie zastosuje się odpowiednich substancji stabilizujących. Krystalizacja lub współstrącanie mogąbyć zastosowane tylko do niewielu substancji, a powstałe produkty odznaczają się słabą rozpuszczalnością. Dodatkowo mogą wystąpić problemy z usunięciem resztek wilgoci.

Trehaloza, czyli α-D-glukopiranozyl-a-D-glukopiranozyd, jest występującym naturalnie, nieaktywnym i nietoksycznym dwusacharydem, który początkowo został wykryty jako substancja związana z zapobieganiem uszkodzeń powodowanych przez wysychanie pewnych roślin oraz zwierząt, które mogą wyschnąć bez szkody, a następnie ożywić się, gdy z powrotem się nawilżą. Wykazano, że trehaloza może znaleźć zastosowanie w zapobieganiu denaturacji podczas odwadniania i późniejszego składowania wielu substancji, takich jak białka, wirusy, oraz produkty żywnościowe. Preparaty wytworzone poprzez suszenie na powietrzu w obecności trehalozy miały znacznie przedłużony okres przechowywania (opisy patentowe US nr 4 891 319, 5 149 653 oraz 5 026 566; Blakely i wsp., 1990, Lancet 336:854; Roser, July 1991, Trends in Food Sci. and Tech, str 166-169; Colaco i wsp., 1992, Biotechnol. Internat, str. 345-350; Roser, 1991, BioPharm. 4:47; Colaco i wsp., 1992, Bio/Tech. 10:1007; Roser i Colaco, 1993, New Scientist 138:25-28; oraz Crowe, 1983, Cryobiol. 20:346-356),

Trehaloza także stabilizuje liofilizowane białka, takie jak dehydrogenazę metanolu (Argall i Smith, 1993, Biochem. Mol. Biol. Int. 30:491) oraz zapewnia termostabilność enzymom z drożdży (Hottiger i wsp., 1994, Eur. J. Biochem. 219:187). Trehaloza także hamuje reakcję Maillarda pomiędzy grupami karbonylowymi cukrów redukujących i grupami aminowymi białek (Loomis i wsp., 1979, J. Exp. Zool. 208:355-360; oraz Roser i Colaco, 1993, New Scientist 138:24-28). Trehaloza i wiele rozmaitych stabilizujących polioli znalazły również zastosowanie w preparatyce leków w stanie stałym.

Celem wynalazkujest opracowanie stabilnego preparatu do przechowywania substancji biologicznie aktywnych, z jak najmniejszą ilością pozostałości wilgoci w końcowym produkcie, odznaczającego się zwiększoną stabilnością dłuższym okresem przechowywania, oraz

184 823 możliwością ponownego uwodnienia, która to cecha jest zwłaszcza pożądana dla stosowanych doustnie preparatów z substancjami farmakologicznymi.

Według wynalazku preparat do przechowywania substancji biologicznie aktywnych, charakteryzuje się tym, że stanowi spienione szkliste podłoże z węglowodanu z wbudowanym w to podłoże środkiem terapeutycznym lub diagnostycznym.

Korzystnie, środkiem terapeutycznym lub diagnostycznym jest związek organiczny, zwłaszcza proteina, peptyd lub kwas nukleinowy, komórka, mikroorganizm bakteryjny lub wirus.

Korzystnie, węglowodanem jest glukoza, sacharoza, laktoza lub trehaloza, przy czym trehaloza jest najkorzystniejsza.

Korzystnie, spienione szkliste podłoże zawiera resztkową wilgoć w ilości 0,1 do 12% (wagowo/wagowe).

Sposób wytwarzania preparatu do przechowywania substancji biologicznie aktywnych, według wynalazku charakteryzuje się tym, że (a) odparowuje się większość rozpuszczalnika z mieszaniny zawierającej co najmniej jeden węglowodan zdolny do tworzenia szklistego podłoża, jego rozpuszczalnik oraz środek terapeutyczny lub diagnostyczny, (b) wytworzony syrop poddaje się działaniu ciśnienia i temperatury wystarczających do spowodowania wrzenia syropu, i (c) ewentualnie z wytworzonego spienionego szklistego podłoża usuwa się resztkową wilgoć do zawartości 0,1 do 12°% (wagowo/wagowe) resztkowej wilgoci w podłożu.

Korzystnie, etap (a) prowadzi się w temperaturze wyższej niż temperatura otoczenia oraz pod ciśnieniem niższym niż ciśnienie atmosferyczne, zwłaszcza pod ciśnieniem 0,013 do 4,0 łk>a.

W etapie (b), korzystnie, ciśnienie wynosi 0,0013 do 4,0 kPa, zaś temperatura powyżej

25°C.

Korzystnie, w etapie (a) poddaje się odparowaniu mieszaninę zawierającą dodatkowo lotną sól lub sól rozkładającą się, jak również zawierającą dodatkowo środek stabilizujący pianę.

Korzystnie, w etapie (a) stosuje się mieszaninę zawierającą rozpuszczalnik organiczny, zwłaszcza alkohol, eter, olej lub ciekły węglowodór.

Sposobem według wynalazku wytwarza się suche spienione szkliste podłoże (FGM) ze stabilnie wbudowaną w to podłoże substancją aktywną

Na rysunku fig. 1 jest fotografią przedstawiającą spienione szkliste podłoża (FGMs) wytworzone w fiolkach farmaceutycznych o różnej wielkości.

Figura 2 jest fotografią przedstawiającą FGMs wytworzone przy różnych ciśnieniach (2A) oraz fotografią preparatów otrzymanych przez liofilizację (2B). Próbki pokazane na fig. 2B były identyczne jak na fig. 2A, z wyjątkiem tego, że próbki na fig. 2A były wbudowane w fGM sposobem według wynalazku, zaś próbki na fig. 2B były liofilizowane.

Figura 3 jest fotografią przedstawiającą FGMs wytworzone z dodatkiem lotnych soli.

Figura 4 jest fotografią przedstawiającą FGMs wytworzone z materiałów o różnej lepkości.

Figura 5 jest fotografią przedstawiającą FGMs zawierające ludzkie czerwone krwinki.

Figura 6 jest fotografią przedstawiającą FGMs oktaoctanu trehalozy wytworzone z roztworu organicznego.

Figura 7 jest fotografią przedstawiającą FGMs wytworzone w dwóch uprzednio napełnionych strzykawkach.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że węglowodany, tworzące szkliste podłoża, mogą być przetworzone w spienione (gąbczaste) szkliste podłoża, które są szczególnie użyteczne do stabilnego wbudowywania substancji, takich jak substancje aktywne, w tym szczególnie substancje biologicznie aktywne. Stosowany tutaj termin „substancja” oznacza jakąkolwiek substancję biologicznie aktywną, która może być przechowywana w suchej, nieciekłej postaci. Sposób według wynalazku umożliwia wytworzenie preparatu o znacznie zredukowanej resztkowej wilgotności w porównaniu do gęstych (zbitych), niegąbczastych podłoży szklistych. W efekcie, preparat według wynalazku jest bardziej suchy, bardziej stabilny i ma wyższą

184 823 temperaturę przemiany w stan szklisty. Dodatkowo, duża powierzchnia czynna FGM daje w efekcie znacząco wyższe szybkości rozpuszczania w trakcie rekonstytucji. Jest to szczególnie użyteczne dla substancji słabo rozpuszczalnych, takich jak substancje organiczne, a zwłaszcza takich jak Cyklosporyna A, lipidy, zestryfikowane cukry, substancje blokujące beta, agonisty i antagonisty H2, sterydy, hormony płciowe, fenobarbitale, substancje przeciwbólowe, substancje przeciw mikroorganizmom, wirusom, insektycydy, pestycydy i podobne. Preparat według wynalazku ma zatem wszystkie zalety preparatu otrzymanego poprzez liofilizację, natomiast nie posiada żadnych wad takiego preparatu, którymi to wadami są, między innymi, długie i pochłaniające wiele energii procesy suszenia z zastosowaniem bardzo niskich temperatur oraz przedłużony czas rozpuszczania. Preparat według wynalazku jest szybko rozpuszczalny, z zupełnym rozpuszczeniem się substancji, co może być łatwo ustalone gołym okiem. Sposób według wynalazku jest prosty, dający się standaryzować, oraz powtarzalny. FGM są użyteczne do przechowywania dowolnych substancji. FGM są szczególnie użyteczne w przypadku substancji słabo rozpuszczalnych, takich jak związki organiczne Ponadto, FGM są szczególnie przydatne dla barwników, dodatków smakowych, biomolekuł, układów molekularnych, komórek i innych niestabilnych substancji. Preparat według wynalazku nadaje się do wytwarzania pojedynczych dawek substancji czynnych biologicznie, które są stabilne w przechowywaniu w temperaturze otoczenia, a nawet w podwyższonych temperaturach. Przykładowo, pojedyncza dawka może być wytworzona w strzykawce. Wytwarzanie gotowych, napełnionych strzykawek eliminuje te metody, których stosowanie może spowodować zanieczyszczenie substancji w strzykawce przed infekcją, oraz eliminuje błędy w dozowaniu substancji aktywnej. Po rekonstytucji, uzyskiwana jest pojedyncza dawka substancji aktywnej biologicznie. Pojedynczą dawką może być na przykład pojedyncza terapeutyczna dawka substancji biologicznie czynnej, takiej jak epinefiyna, erytropoietyna, cytokiny, czynniki wzrostu i inne farmaceutyki, albo pojedyncza mieszanina reakcyjna potrzebna w testach owulacyjnych, ciążowych czy innych testach diagnostycznych. Z powodu zwiększonej stabilności substancji biologicznych, przechowywanie ich oraz wysyłka są znacznie ułatwione.

Opisywane „spienione szkliste podłoża” (FGM) są podłożami ze spienionego (gąbczastego) materiału szklistego, mającymi dużą powierzchnię czynną. FGM mogą mieć różną grubość, włączając w to cienką lub ultra-cienką. Zwykle FGM ma znacznie mniejszą gęstość od niegąbczastego amorficznego materiału szklistego, z powodu zwiększonej powierzchni czynnej i rozrzedzenia materiału szklistego tworzącego ścianki pęcherzyków gąbczastego podłoża szklistego.

Korzystnie, węglowodanem (poliolem), lub jego pochodną, tworzącym szkliste podłoże jest trehaloza, laktitol i palatynit. Najlepiej, gdy stabilizującym poliolem jest trehaloza. Odpowiednimi stabilizującymi poliolami są te, w których pożądana substancja może być wysuszona i przechowywana bez znaczącej straty aktywności wskutek denaturacji, agregacji lub wskutek innych mechanizmów. Termin „węglowodany” dotyczy, lecz nie jest do nich ograniczony, monosacharydów, disacharydów, trisacharydów, oligosacharydów i ich odpowiednich alkoholi cukrowych, związków polihydroksylowych takich jak pochodne cukrów i chemicznie zmodyfikowanych węglowodanów, hydroksyetylowej skrobi oraz kopolimerów cukrów. Zarówno naturalne jak i syntetyczne cukry mogą być stosowane do wytworzenia FGM. Węglowodany syntetyczne reprezentują (lecz nie są do nich ograniczone) takie, w których wiązanie glikozydowe jest zastąpione wiązaniem tiolowym lub węglowym. Mogą być stosowane zarówno formy cukrów D jak i L. Węglowodany mogą być redukujące lub nieredukujące.

Ochrona przed utratą aktywności może być zwiększona przez dodanie różnych dodatków takich jak inhibitory reakcji Maillarda, jak opisano poniżej. Dodatek takich inhibitorów jest szczególnie zalecany w połączeniu z cukrami redukującymi.

Cukrami redukującymi, stosowanymi do wytwarzania preparatu według wynalazku, są dobrze znane cukry, które obejmują zwłaszcza glukozę, maltozę, laktozę, fruktozę, galaktozę, mannozę, maltulozę oraz laktulozę. Cukrami nieredukującymi są zwłaszcza nieredukujące glikozydy związków polihydroksylowych wybrane spośród alkoholi cukrowych oraz inne polialkohole o prostym łańcuchu węglowym. Do innych węglowodanów znajdujących zastosowanie należą rafinoza, stachioza, melezytoza, dekstran, sacharoza, cellobioza,

184 823 mannobioza i alkohole cukrowe. Jako glikozydy alkoholi cukrowych są preferowane monoglikozydy, szczególnie związki otrzymane na drodze redukcji dwusacharydów takich jak laktoza, maltoza, laktuloza i maltuloza.

Szczególnie zalecanymi węglowodanami są trehaloza, maltitol (4-O-P-D-glukopiranozylD-glucitol), lakcitol (4-O-P-D-galaktopiranozylo-D-glucitol), palatynit [mieszanina GPS (α -D-glukopiranozyl-1->6-sorbitol) i GPM (a-D-glukopiranozylo-1—>6-mannitol)], oraz poszczególne związki alkoholi cukrowych GPS i GPM.

Różne mieszaniny oraz naczynia o różnych kształtach i rozmiarach mogą być stosowane jednocześnie. Najlepiej, gdy rozmiar zastosowanego naczynia jest wystarczający, aby zawierać początkową mieszaninę oraz przechowywać uformowaną z niej objętość fGm. Zwykle jest to zależne od masy materiału formującego szkliste podłoże, powierzchni naczynia oraz od warunków wytwarzania FGM. Masa materiału formującego szkliste podłoże musi być wystarczająca, aby utworzyć lepki syrop, który musi się pienić; praktycznie rozumie się przez to minimalną masę na jednostkę powierzchni naczynia. Ten stosunek jest różny dla różnych mieszanin oraz naczyń, ale może być łatwo ustalony doświadczalnie przez fachowca znającego się na tych technikach i stosującego się do procedur tutaj opisanych.

Mogą być zastosowane dowolne fiolki, włączając w to fiolki wytłaczane Wheatona oraz fiolki cięte z rurek. Figura 1 przedstawia FGM wytworzone w fiolkach o różnych rozmiarach.

Pomimo, iż mogą być używane pojedyncze formy, można także zastosować więcej niż jeden materiał tworzący szkliste podłoże, więcej niż jeden dodatek lub więcej niż jedną substancję. Optymalne ilości tych składników mogą być łatwo ustalone przez fachowca.

Rozpuszczalnik, w którym materiał tworzący szkliste podłoże jest rozmieszany może być wodny, organiczny, lub stanowić mieszaninę obydwu. Zastosowanie kombinacji organicznych i wodnych rozpuszczalników może być dodatkowo korzystne, ponieważ użycie lotnych rozpuszczalników organicznych ułatwia tworzenie się gąbczastego szklistego podłoża. Stosowanie lotnej lub rozkładającej się soli, jak niżej podano, wpływa korzystnie na tworzenie się gąbczastego szklistego podłoża. Dodatkowo, można zastosować wystarczającą ilość rozpuszczalnika wodnego dla rozpuszczenia materiału tworzącego szkliste podłoże, oraz wystarczającą ilość rozpuszczalnika organicznego dla rozpuszczenia hydrofobowej substancji, co pozwala na wytworzenie FGM zawierającego substancję lub substancje hydrofobowe.

Wybór rozpuszczalnika zależy od charakteru materiału wybranego do tworzenia szklistego podłoża, a także charakteru któregokolwiek z dodatków i/lub substancji, która ma zostać wbudowana w podłoże. Rozpuszczalnik powinien mieć stosowne właściwości oraz powinien zostać użyty w ilości umożliwiającej dostateczną solubilizację materiału tworzącego szkliste podłoże oraz jakiejkolwiek substancji dodatkowej i/lub substancji aktywnej. Jeżeli substancja jest materiałem hydrofilowym, rozpuszczalnik powinien być raczej wodny, aby uniknąć jakichkolwiek potencjalnych strat aktywności spowodowanych niekorzystnymi interakcjami z rozpuszczalnikiem. Najlepiej, gdy wodny rozpuszczalnik stanowi jakikolwiek stosowny wodny rozpuszczalnik znany w tych technikach, włączając w to, lecz nie ograniczając, wodę i biologiczne roztwory buforowe. Najkorzystniej, gdy rozpuszczalnik wodny jest obecny w ilości 5 do 95% objętościowych.

Objętość rozpuszczalnika może się zmieniać i będzie zależna od materiału tworzącego szkliste podłoże i substancji aktywnej, która ma zostać wbudowana, a także od dodatków. Minimalną potrzebną objętością jest ilość niezbędna do rozpuszczenia różnych składników. Jednakże homogennie zdyspergowane zawiesiny jednej lub wielu substancji także mogą być zastosowane. Odpowiednie ilości składników w specyficznych materiałach otaczających mogą łatwo zostać ustalone przez fachowców na podstawie podanych przykładów realizacji wynalazku.

Różne dodatki mogą zostać dodane do materiału tworzącego szkliste podłoże. Zwykle, dodatki wspomagają proces tworzenia się piany i/lub proces suszenia, lub ułatwiają solubilizację substancji. Z drugiej strony, dodatki wspomagają stabilność wbudowanej do FGM substancji. Można stosować jeden lub wiele dodatków.

184 823

Przykładowo, dodatek soli lotnych pozwala na stosowanie większych objętości początkowych i w efekcie prowadzi do większej powierzchni czynnej wewnątrz FGM, dając w efekcie lepsze tworzenie piany oraz szybsze suszenie. Stosowane w procesie według wynalazku sole lotne są solami ulatniającymi się w warunkach, w których wytwarza się FGM. Przykładowo, solami lotnymi są octan amonu, kwaśny węglan amonu i węglan amonu. Sole, które rozkładają się dając gazowe produkty także wspomagają tworzenie piany i szybkie wysychanie. Przykładami takich soli są kwaśny węglan sodu i metadwusiarczyn sodu (Na^Oj). Korzystnie, sole lotne są obecne w ilościach od 0,01 do 5 M, a zwłaszcza w stężeniach do 5 M. Otrzymane w ten sposób FGM mają jednolitą strukturę gąbczastą i są znacząco suchsze w porównaniu do FGM wyprodukowanych bez zastosowania lotnych soli. Wpływ lotnych soli na tworzenie się FGM jest przedstawiony na fig. 3 (przykład 4a).

Lotne rozpuszczalniki organiczne mogą także być użyte w początkowej mieszaninie, w celu polepszenia tworzenia się FGM. Przykładami stosownych lotnych rozpuszczalników organicznych są alkohole, etery, oleje, ciekłe węglowodory i ich pochodne. Chociaż lotne rozpuszczalniki organiczne mogąbyć zastosowane jako rozpuszczalnik dla materiału tworzącego szkliste podłoże, są one częściej stosowane w mieszaninach wodno/organicznych. Korzystnie, składnik wodny mieszaniny stanowi pomiędzy 5 do 80% wagowych w mieszaninie, a zwłaszcza 10 do 50% wagowych.

Innym stosownym dodatkiem jest stabilizator piany, który może być użyty w połączeniu z solą lotną lub rozkładającą się i/lub rozpuszczalnikiem organicznym. Może to być albo składnik zmieniający napięcie powierzchniowe, taki jak cząsteczka amfipatyczna (to znaczy taki jak fosfolipidy lub detergenty) lub substancja zwiększająca lepkość pieniącego się syropu, taka jak środek zagęszczający, przykładowo, guma guarowa i jej pochodne. Na fig. 4 pokazano FGM wytworzone z materiałów o różnej lepkości (przykład 4c).

Innym dodatkiem jest inhibitor reakcji Maillarda. Korzystnie, jeśli substancja i/lub materiał tworzący szkliste podłoże zawiera grupy karbonylowe i aminowe, iminowe lub guanidynowe, a ponadto, mieszanina dodatkowo zawiera co najmniej jeden fizjologicznie akceptowany inhibitor reakcji Maillarda w ilości wystarczającej do znaczącego wyeliminowania kondensacji grup aminowych i reaktywnych grup karbonylowych w preparacie. Inhibitorem reakcji Maillarda może być jakikolwiek inhibitor znany w tego typu technikach. Inhibitor reakcji Maillarda stosuje się w ilości wystarczającej do zapobiegania, lub znaczącego zapobiegania, kondensacji grup aminowych i reaktywnych grup karbonylowych. Na ogół grupy aminowe są obecne w substancji aktywnej, zaś grupy karbonylowe są obecne w materiale tworzącym szkliste podłoże, lub na odwrót. Jednakże grupy aminowe i karbonylowe mogą być także wewnątrz cząsteczek w substancji aktywnej lub w węglowodanie.

Rożne klasy związków są znane z wywierania hamującego efektu na reakcję Maillarda i dlatego mogą być one zastosowane do wytwarzania preparatów według wynalazku. Związki te są na ogół inhibitorami kompetetywnymi lub niekompetetywnymi reakcji Maillarda. Inhibitory kompetetywne obejmują zwłaszcza reszty aminokwasów (zarówno D jak i L), połączenia reszt aminokwasowych i peptydów. Szczególnie preferowane są lizyna, arginina, histydyna i tryptofan. Lizyna i arginina są najbardziej skuteczne. Istnieje wiele znanych inhibitorów niekompetetywnych. Obejmują one zwłaszcza aminoguanidyny i ich pochodne oraz amfoterycyny B. Opis patentowy EP-A-0 433 679 ujawnia inhibitory Maillarda, do których należą pochodne 4-hydroksy-5,8-dioksychinoliny, mogące być stosowane w procesie według wynalazku.

Substancje, które mają zostać wbudowane do FGM są dodawane do mieszaniny przed etapem spienienia węglowodanu. Bardzo różnorodne substancje mogą zostać wbudowane, przykładowo, substancje aktywne biologicznie, takie jak środki farmakologiczne i modyfikatory biologiczne, jak również całe komórki, takie jak czerwone krwinki i płytki krwi.

Dowolna substancja aktywna, która może być homogennie zawieszona w roztworze rozpuszczalnika i materiału tworzącego szkliste podłoże może być przetworzona sposobem według wynalazku. FGM mają poważnie zwiększoną czynną powierzchnię w porównaniu do mieszanin, dawek w formie stałej, czy jakiejkolwiek poprzednio opisanej kompozycji.

184 823

Zwiększona powierzchnia umożliwia łatwe rozpuszczanie i dlatego preparat według wynalazku nadaje się do przechowywania wielu substancji. Dzięki spienieniu homogennej zawiesiny unika się powstawania w FGM obszarów nierównomiernie rozłożonej substancji, które mogłyby mieć negatywny efekt na rozpuszczanie. Korzystnie, stosuje się substancję rozpuszczoną w rozpuszczalniku zastosowanym do wytworzenia początkowej mieszaniny.

Przykładami substancji, które mogą być wbudowane w FGM są dowolne aktywne biologicznie substancje, jak wyżej podano, a zwłaszcza substancje czynne farmakologiczne, takie jak leki przeciwzapalne, przeciwbólowe, przeciwartretyczne, antyspazmowe, antydepresyjne, antypsychotyczne, uspokajające, przeciwlękowe, antagonistyczne do narkotyków, przeciw chorobie Parkinsona, agonistyczne cholinergiczne, leki chemioterapii, substancje immunosupresywne, antywirusowe, antymikroorganizmalne, odbierające apetyt, antycholinergiczne, antyemetyki, antyhistaminy, leki przeciw migrenom, leki rozszerzające naczynia wieńcowe, mózgowe lub obwodowe, hormony, środki zapobiegające ciąży, leki antytrombotyczne, diuretyczne, przeciw wysokiemu ciśnieniu, sercowo-naczyniowe, opioidy, itp,

Substancje nadające się do przechowywania obejmują także środki terapeutyczne i profilaktyczne, zwłaszcza jakiekolwiek działające terapeutycznie biologiczne modyfikatory. Substancje te obejmują składniki komórek, komórki, bakterie, wirusy i cząsteczki, takie jak lipidy, związki organiczne, białka, peptydy (naturalne i syntetyczne), mimetyki peptydów, hormony (peptydowe, sterydowe i kortykosterydowe), polimery D i L aminokwasów, oligosacharydy, polisacharydy, nukleotydy, oligonukleotydy i kwasy nukleinowe, włączając DNA i RNA, hybrydy białek z kwasami nukleinowymi, małe cząsteczki i ich fizjologicznie aktywne analogi, Dodatkowo, te modyfikatory mogą być uzyskiwane ze źródeł naturalnych lub być wytworzone syntetycznie lub na drodze rekombinowanej, włączając analogi, agonisty i homologi.

Termin „białko” oznacza także peptydy i polipeptydy. Takie białka obejmują zwłaszcza enzymy, preparaty biofarmaceutyczne, hormony wzrostu, insulinę, przeciwciała zarówno monoklonalne jak i poliklonalne oraz ich fragmenty, interferony, interleukiny i cytokiny.

Substancje organiczne obejmują zwłaszcza cząsteczki aktywne farmakologicznie z grupami aromatycznymi, karbonylowymi, aminowymi, iminowymi i guanidynowymi.

Odpowiednie hormony sterydowe obejmują zwłaszcza estrogen, progesteron, testosteron i ich aktywne fizjologicznie analogi. Takie analogi obejmują zwłaszcza estradiol, SH-135, i tamoksyfen. Wiele hormonów sterydowych, jak progesteron, testosteron i ich analogi, szczególnie nadaje się do przechowywania za pomocą preparatu według wynalazku.

Ponadto, preparat według wynalazku umożliwia przechowywanie terapeutycznych środków opartych na kwasach nukleinowych. Stosowany tu termin „kwasy nukleinowe” obejmuje jakiekolwiek efektywne terapeutyczne kwasy nukleinowe znane fachowo, obejmując między innymi DNA, RNA i ich fizjologicznie aktywne analogi. Nukleotydy mogą kodować geny lub mogą być jakimkolwiek wektorem znanym w dziedzinie rekombinowanego DNA, obejmując między innymi plazmidy, retrowirusy i pochodne adenowirusów.

Substancje, które są aktywne w profilaktyce i ich przenośniki również mogą być przechowywane dzięki preparatowi według wynalazku. Preferowane kompozycje obejmują immu-nogeny, takie jak szczepionki. Odpowiednie szczepionki obejmują zwłaszcza żywe i attenuowane wirusy, wektory nukleotydowe kodujące antygeny, żywe i attenuowane bakterie, antygeny, antygeny z adjuwantami i haptenami związanymi z przenośnikami. Szczególnie preferowane są szczepionki przeciw dyfterytowi, tężcowi, kokluszowi, jadowi kiełbasianemu, cholerze, Dengue, żółtaczkom zakaźnym typu A, B, C i E, Haemophilus influenza b, Helicobacterium pylori, grypie, Japońskiemu zapaleniu mózgu, meningokokom A, B oraz C, odrze, śwince, wirusom papilloma, pneumokokkom, polio, różyczce, rotawirusom, wirusowi syncytium dróg oddechowych, Shigella, gruźlicy, żółtej febrze i kombinacji tychże. Składnik antygenowy szczepionek może być także produkowany technikami biologii molekularnej w celu uzyskania rekombinowanych peptydów lub białek fuzyjnych zawierających jedną lub więcej części białka uzyskanego z patogenu. Przykładowo, wykazano, że białka fuzyjne zawierające antygen i podjednostkę B toksyny cholery indukują odpowiedź immunologiczną na ten antygen (Sanchez i wsp., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:481-485).

184 823

Szczepionki są szczególnie przydatne do inkorporacji w jednoskładnikowy preparat. Pozostają one ostabilne przez nieokreślony czas podczas przechowywania w temperaturze otoczenia i mogą być rozpuszczone w sterylnym płynie bezpośrednio przed szczepieniem.

Najkorzystniej, preparat immunogenny powinien zawierać pewną ilość adjuwantu, wystarczającą do wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej. Stosowne adjuwanty obejmują zwłaszcza sole glinu, mieszaniny skwalenu (SAF-1), peptyd muramylowy, pochodne saponiny, preparaty ściany komórkowej mykobakterii, lipid monofosforylowy A, pochodne kwasu mykolinowego, niejonowe detergenty blokowo-kopolimerowe, Quil A, podjednostkę B toksyny cholery, polifosfazen i jego pochodne, oraz kompleksy immunostymulatorowe (ISCOM), takie jak opisane przez Takahashi i wsp., (1990) Naturę 344:873-875. Dla celów weterynaryjnych i do produkcji przeciwciał u zwierząt można zastosować mitogenne składniki adjuwantu Freunda.

Takjak przy wszystkich preparatach immunogenicznych, efektywne dawki immunogenu muszą zostać oznaczone doświadczalnie. Czynniki, które należy wziąć pod uwagę obejmują immunogenność, czy immunogen będzie skompleksowany czy też kowalencyjnie sprzężony z adjuwantem lub białkiem nośnikowym czy innym nośnikiem, sposób podania, oraz ilość immunizujących dawek. Te czynniki są znane fachowcom od szczepień i można je bez trudu określić.

Substancja aktywna może być obecna w różnych stężeniach w FGM. Zwykle, minimalne stężenie substancji określa ilość niezbędna do wywołania zamierzonego skutku, podczas gdy maksymalne stężenie zależy od maksymalnego stężenia, które pozostaje w roztworze lub homogennej zawiesinie w mieszaninie początkowej. Na przykład, minimalną ilością środka leczniczego jest korzystnie taka ilość, jaka zapewni pojedynczą dawkę efektywną terapeutycznie.

Roztwory przesycone także mogą być stosowane, jeśli FGM jest tworzony zanim nastąpi krystalizacja. Dla substancji aktywnych biologicznie stężeniem minimalnym jest ilość niezbędna dla uzyskania aktywności biologicznej po rekonstytucji, zaś maksymalnym stężeniem jest wartość, powyżej której nie można utrzymać homogennej mieszaniny. W przypadku jednostek pojedynczego dozowania, ilość ta odpowiada pojedynczej dawce terapeutycznej. Przykładowo, Neupogen (znak towarowy zastrzeżony) jest podawany w dozowaniu 300 mikrogramów (1 ± 0,6 χ 10⁸ U/mg; 5 pg/kg/dzień). A więc, 300 pg byłoby podawane do fiolki w celu wytworzenia pojedynczej dawki preparatu. Ilość substancji aktywnej zależy od jej rodzaju i może być łatwo ustalona przez fachowca.

W trakcie pierwotnej fazy suszenia, rozpuszczalnik jest odparowany w celu uzyskania syropu. Zwykle, „syrop” jest zdefiniowany jako roztwór o lepkości około 10⁹ do 10⁷ paskalosekund. Syrop nie jest definiowany przez określone stężenie, ale jest rezultatem odparowania większości rozpuszczalnika z mieszaniny. Najczęściej syrop jest lepką mieszaniną zawierającą materiał formujący szkliste podłoże i/lub dodatki, i/lub substancje aktywne w stężeniach znacznie wyższych niż w początkowej mieszaninie. Najczęściej etap odparowania jest przeprowadzany w warunkach wystarczających dla usunięcia około 20% do 90% rozpuszczalnika, w celu uzyskania syropu. Korzystnie, lepkość syropu jest taka, że gdy syrop wrze, parowanie ze zwiększonej powierzchni (zapewnione przez powstawanie pęcherzyków) prowadzi do zeszklenia się.

Korzystnie, konsystencja syropu jest zależna od dalszego zastosowania FGM. Rozmiar pęcherzyków jest regulowany przez lepkość, szybkość wrzenia i składnik lub składniki lotne lub stabilizator piany, jeśli takowe są używane.

Długość okresu początkowego suszenia zależy od objętości rozpuszczalnika i stężeń materiałów/materiału tworzącego szkliste podłoże oraz od jakichkolwiek dodatków i/lub substancji (jednej lub wielu) w początkowej mieszaninie, a także od zewnętrznej temperatury i ciśnienia. Dla danego ciśnienia szybkość odparowania rozpuszczalnika wzrasta wraz z zewnętrzną temperaturą. Z uwagi na fakt, że proces odparowania wpływa na ochłodzenie suszonej próbki, zewnętrzna temperatura może zostać podniesiona w celu przyspieszenia szybkości odparowania bez wpływu na temperaturę próbki. Szybkość odparowania wewnątrz próbki jest odwrotnie proporcjonalna do lepkości, zatem, kiedy rozpuszczalnik jest usuwany z próbki

184 823 szybkość odparowania zmniejsza się, co z kolei umożliwia podniesienie temperatury próbki do stanu wrzenia przy zmniejszonym ciśnieniu.

Początkowy etap suszenia może być przeprowadzony pod ciśnieniem niższym od ciśnienia otoczenia. Korzystne jest ciśnienie od 0,013 do 4,0 kPa. Jeszcze korzystniejsze jest ciśnienie od 0,67 do 2,7 kPa. Najkorzystniejsze jest ciśnienie 1,0 do 1,7 kPa oraz zewnętrzna temperatura 40°C. W tych warunkach mogą być przetwarzane wodne lub organiczne roztwory, lub mieszanki tychże. Roztwory rozcieńczone o stężeniach 10 do 50% (wagowo/objętościowe) także mogą być przetwarzane w tych warunkach.

Zredukowanie zewnętrznego ciśnienia daje co najmniej dwa pożądane efekty. Po pierwsze, zredukowanie ciśnienia zewnętrznego wpływa na obniżenie ciśnienia par rozpuszczalnika w fazie gazowej, co przyspiesza proces odparowania rozpuszczalnika i suszenie podłoża szklistego. Zwiększona szybkość odparowania powoduje ochładzanie próbek pod warunkiem, że ciepło z zewnątrz nie zostanie doprowadzone, aby zastąpić utajone ciepło parowania. W warunkach próżni szybkość suszenia jest limitowana tym źródłem energii. Zatem, w przypadku zwiększenia zewnętrznej temperatury następuje zwiększenie szybkości suszenia a nie zwiększenie temperatury próbki. Drugim efektem spowodowanym poprzez zredukowanie zewnętrznego ciśnienia jest drastyczne obniżenie punktu wrzenia próbki. Wrzenie może więc być wywołane przez bardzo umiarkowany wzrost temperatury próbki, który nie ma ujemnego wpływu na produkt.

Syrop uzyskany w wyniku pierwotnego etapu suszenia jest poddany zmniejszonemu ciśnieniu, aby spowodować wrzenie syropu. Stosowany tu termin „wrzenie” jest definiowany jako punkt, w którym ciśnienie par mieszaniny jest równe lub większe od ciśnienia zewnętrznego, na które wystawiona jest próbka. Wrzenie daje się zauważyć jako pienienie się, kiedy rozpuszczalnik i/lub inne lotne składniki szybko ulatniają się. Zwykle, najważniejszym czynnikiem determinującym temperaturę wrzenia próbki jest zewnętrzne ciśnienie. Jeśli w celu zachowania integralności próbki pożądane jest wrzenie w niższej temperaturze, wybrane zewnętrzne ciśnienie będzie niższe od atmosferycznego (to znaczy będzie to próżnia), i w ten sposób zmniejszenie ciśnienia obniży temperaturę niezbędną do uzyskania wrzenia syropu. Ponieważ wrzenie jest w ten sposób osiągane w niższych temperaturach, integralność próbki nie jest zagrożona.

Gdy zastosuje się zmniejszone ciśnienie, szybkie wysychanie jest kontynuowane aż do chwili, gdy lepkość próbki zacznie rosnąć. W tym miejscu zmniejszona ruchliwość cząsteczek wody w lepkim syropie redukuje szybkość ewaporacyjnego ochładzania i temperatura próbki podnosi się aż osiągnie punkt wrzenia przy zredukowanym ciśnieniu.

W czasie wrzenia następuje duży wzrost powierzchni styku pomiędzy gazem a cieczą, spowodowany pienieniem się syropu. Ta zwiększona powierzchnia ewaporacyjna powoduje ostry wzrost szybkości suszenia i ciekła piana wysycha w postaci stałej szklistej piany. Zwykle następuje to wkrótce po doprowadzeniu syropu do wrzenia.

Temperatury etapu wrzenia mogą być powyżej lub poniżej temperatury zewnętrznej. Zewnętrzna temperatura etapu wrzenia może wynosić, przykładowo, 5 do 90°C. Korzystnie, zewnętrzna temperatura wynosi od 15 do 60°C. Najkorzystniej, zewnętrzna temperatura wynosi 25 do 45°C.

Korzystnie, zewnętrzne ciśnienie podczas etapu wrzenia wynosi 2,7 do 0,0013 kPa. a zwłaszcza 0,013 do 0,0067 kPa. Wpływ różnego ciśnienia na tworzenie się fGm przedstawiono na fig. 2. Dla wytworzenia próżni może zostać użyta jakakolwiek suszarka próżniowa z regulacją, najlepiej z programowaną regulacją ciśnienia i temperatury zewnętrznej. Pompa musi być w stanie wytworzyć próżnię 0,0013 kPa oraz uzyskać próżnię w komorze próżniowej 0,027 do 0,0013 kPa w ciągu 15 do 20 minut. Urządzenia stosowane dla zrealizowania niniejszego wynalazku były wyprodukowane przez FTS Systems INC. (Stone Ridge, New York) Model TDS 00078-A z pompą próżniową VP62 i urządzeniem kondensującym FD-00057-A lub też przez Labconco, Inc. (Kansas City): Model No 77560 z urządzeniem kondensującym Lyph-Lock 12 i dwustopniową pompą próżniową Edwards E2M8.

184 823

Etap wrzenia doprowadza do tworzenia pęcherzyków, co bardzo zwiększa powierzchnię parowania syropu. Pozwala to na odparowanie resztek rozpuszczalnika i FGM staje się szkliste jako stała piana pęcherzyków powstałych w etapie wrzenia. Punkt końcowy etapu wrzenia można poznać po zwiększeniu temperatury próbki, którą to temperaturę zaleca się utrzymać przez pewien czas, aby zapewnić kompletne wysuszenie. Jest to różne dla różnych próbek, ale możliwe do ustalenia przez specjalistę.

Resztkowa wilgotność może być ewentualnie usunięta, aby zapewnić całkowite wysuszenie. Ten etap na ogół zachodzi w podwyższonej temperaturze i/lub zmniejszonym ciśnieniu. W końcowym produkcie resztkowa zawartość wilgoci wynosi zwykle około 0,1 do 5% (wagowo/wagowe) i jest usuwana w ciągu 1 do 15 godzin. Resztkowa wilgoć jest usuwana w krótszym czasie, jeżeli zostanie podwyższona temperatura.

Wytwarzanie FGM zachodzi na drodze tworzenia pęcherzyków, co powoduje, że statystyczne ułożenie oraz rozmiary pęcherzyków mogą prowadzić do powstania rejonów o zróżnicowanej zawartości resztkowej wilgoci Tak więc, podczas drugiego etapu suszenia niektóre rejony będą schły szybciej niż inne. Jak wyżej podano, obecność lotnych lub rozkładających się soli i/lub lotnych organicznych rozpuszczalników powoduje powstanie małych pęcherzyków o jednakowych wymiarach, co prowadzi do niższej zawartości resztkowej wilgoci i bardziej równomiernego jej rozłożenia

Substancje wbudowane w szklistej trehalozie mogą być przechowywane w temperaturach otoczenia przez co najmniej przez 3 lata. Substancje aktywne wbudowane w podłoża szkliste z innych polioli także wykazują przedłużoną stabilność.

FGM mogą zostać zrekonstytuowane natychmiast po dodaniu odpowiedniego rozpuszczalnika. Rodzaj i ilość rozpuszczalnika zależy od typu i rodzaju substancji, która ma być zrekonstytuowana, a także od zamierzonego zastosowania zrekonstytuowanej substancji. Zwykle dodaje się minimalną ilość rozpuszczalnika wystarczającą do efektywnej solubilizacji szklistego podłoża i danej substancji. Jeśli substancja należy do preparatów farmaceutycznych lub aktywnych biologicznie, zalecana jest rekonstytucja za pomocą akceptowanego biologicznie buforu. Rekonstytucja może być prowadzona w dowolnej temperaturze, pod warunkiem, że nie uszkodzi znacząco aktywności substancji. Korzystnie, rekonstytucję prowadzi się w temperaturze otoczenia.

Preparat według wynalazku nadaje się do wytworzenia jednostek będących pojedynczymi dawkami substancji aktywnych, które są stabilne podczas przechowywania w temperaturze otoczenia, a nawet wyższej (w niektórych przypadkach aż do 100°C), i które po rekonstytucji w uprzednio odmierzonej ilości odpowiedniego, najlepiej sterylnego, rozpuszczalnika tworzą efektywne terapeutycznie dawki substancji. Jest to szczególnie przydatne w zastosowaniu leków, włączając w to oczyszczone i zrekombinowane białka i substancje aktywne, które są normalnie stabilne w roztworach tylko w temperaturach 4 do 8°C lub poniżej. Zatem, preparat według wynalazku umożliwia wytworzenie preparatów stanowiących pojedynczą dawkę (lub wielokrotne dawki) z bardziej stabilnych produktów, jednostki lub zestawy zawierające jedną lub więcej jednostek typu pojedyncza dawka oraz pojedyncze, odmierzone ilości (najlepiej uprzednio wystandaryzowane) odpowiednich rozpuszczalników. Substancje aktywne, które byłyby szczególnie odpowiednie do przechowywania i rekonstytucji obejmują zwłaszcza faktor VIII, Neupogen (znak towarowy zastrzeżony), Epogen (znak towarowy zastrzeżony), TPA, cytokiny, hormony wzrostu, czynniki wzrostu, szczepionki, lipidy, enzymy i inne preparaty biofarmakologiczne, jak również inne substancje aktywne podawane nie drogą doustną.

Poniższe przykłady ilustrują wytwarzanie preparatu według wynalazku.

Przykład 1.

Przykład ten ilustruje wpływ ciśnienia i temperatury zewnętrznej na pierwotny czas suszenia.

Próbki po 2 ml 10% (wagowo/objętościowe) trehalozy w dejonizowanej destylowanej wodzie były umieszczone w 10 ml fiolkach farmaceutycznych Wheatona i suszone w suszarce FTS w różnych ciśnieniach próżni i ustawieniach temperatury półek. Temperatury próbek

184 823 i czas potrzebny do usunięcia około 90% wody (to znaczy pierwotne suszenie w celu uzyskania syropu) zostały oznaczone. Wyniki przedstawione są w tabeli 1.

Tabela 1

Ciśnienie (kPa)	Punkt wrzenia wody w tym ciśnieniu (°C)	Temperatura półki (°C)	Czas potrzebny do usunięcia około 90% wody (godziny)
3,0	29	45	>3,0
22,7	22,5	30	3,5
		35	2,5
		40	2,167
		40	2,167
		50	1,5
2,0	18	25	>4,0
		50	1,333
1,33	11,2	25	>3,0
		30	2,0
		35	1,667
		40	1,5
0,67	1,5	40	1,667*
0,33	-5,0	40	1,0*
			* sporadyczne wrzenie

Przykład 2.

Wytwarzanie spienionego szklistego podłoża (FGM).

2a) Wytwarzanie FGM z wodnego roztworu węglowodanu.

Próbki po 250, 410 i 500 pi 50% (wagowo/objętościowe) roztworu trehalozy, w farmaceutycznych fiolkach odpowiednio o pojemności 3 ml, 5 ml i 10 ml, były suszone w suszarce FTS przez 16 godzin. Utrzymywano temperaturę półki 25°C przez cały przebieg procesu, zaś próżnię obniżono do 0,004 kPa w ciągu pierwszych 15 minut doświadczenia i była ona utrzymywana na poziomie 0,004 kPa przez resztę doświadczenia. Utworzone FGM pokazane na fig. 1, są w postaci spienionej (gąbczastej), spowodowanej błyskawicznym odparowaniem pęcherzyków tworzących się podczas etapu wrzenia.

2b) Wytwarzanie FGM z wodnego roztworu węglowodanu przyłączającego substancję aktywną, w roztworze.

Rekombmowany antygen powierzchniowy Hepatitis B w 20% (wagowo/objętościowe) roztworze trehalozy ± 0,5% (wagowo/objętościowe) roztwór Byco A w PBS został wysuszony w objętościach 300 pl w 3 ml fiolkach farmaceutycznych. W suszarce FTS utrzymywano ciśnienie 0,004 kPa i temperaturę półek 40°C przez 18-godzinny cykl suszenia. Średnia wilgotność resztkowa FGM wynosiła około 4% (wagowo/wagowe).

2c) Wytwarzanie FGM z organicznego roztworu węglowodanu.

Próbki po 500 pl 50% (wagowo/objętościowe) roztworu oktaoctanu trehalozy w dichlorometanie były suszone w 10 ml fiolkach farmaceutycznych. Temperatura półek i ciśnienie były utrzymywane, odpowiednio, na 30°C i 0,004 kPa, przez 16-godzinny cykl suszenia. Otrzymane

184 823 preparaty są przedstawione na fig. 6. Podczas rekonstytucji obserwowano szybkie rozpuszczanie się FGM.

2d) Wytwarzanie FGM z mieszaniny wodno-organicznej zawierającej węglowodan oraz substancję aktywną.

Próbki po 750 μΐ mieszaniny 50% (wagowo/objętościowe) trehalozy w dejonizowanej wodzie destylowanej i 100 mg/ml aktywnej substancji organicznej, anestetyku atracurium w etanolu, w stosunku 2:1, były suszone w 10 ml fiolkach farmaceutycznych w suszarce FTS. Temperatura półek i ciśnienie były utrzymywane na stałym poziomie 40°C i 0,004 kPa, odpowiednio, przez 18-godzinny cykl suszenia. Rekonstytucja FGM w 20% (objętościowo/objętościowe) etanolu w dejonizowanej destylowanej wodzie spowodowała szybkie rozpuszczenie, dające homogenny roztwór substancji znieczulającej.

2e) Wytwarzanie FGM z wodnego roztworu węglowodanu, plus dodatek, przyłączającego substancję aktywną w homogennej zawiesinie.

Nieorganiczna aktywna substancja, adjuwant wodorotlenek glinu, był suszony w stężeniach zawiesiny wynoszących 2,5 lub 6 mg/ml, albo w PBS albo w 0,9% (wagowo/objętościowe) roztworze NaCl, użytym jako rozpuszczalnik węglowodanu tworzącego szkliste podłoże. Stosowano dodatek lotnej soli, według niżej podanych wariantów, w celu polepszenia formowania się FGM (patrz przykład 4):

i) 20% (wagowo/objętościowe) trehalozy ± kwaśny węglan amonu, ii) 50% (wagowo/objętościowe) trehalozy ± kwaśny węglan amonu, iii) 38,5% (wagowo/objętościowe) trehalozy ± kwaśny węglan amonu, iv) 25% (wagowo/objętościowe) trehalozy ± kwaśny węglan amonu.

Próbki 250 i 300 μΐ, w których stężenie kwaśnego węglanu amonu wynosiło od 0,05 do 0,75 M, były suszone w 3 ml fiolkach farmaceutycznych, przy czym stosowano jeden z dwóch przepisów FTS:

1) Ciśnienie było zredukowane do 0,004 kPa, a temperatura półki podnoszona w odstępach dwugodzinnych od 35 do 50°C i końcowe do 60°C. Całkowity czas cyklu wynosił około 18 godzin. Powstałe FGM miały resztkową wilgotność w zakresie 1,5 do 2,9% (wagowo/wagowe). Rekonstytucja FGM była natychmiastowa.

2) Ciśnienie było utrzymywane na poziomie 2,0 kPa przez 30 minut zanim zostało zmniejszone do 1,33 kPa na 30 minut. Temperatura półki została podniesiona od 10 do 25°C. Ciśnienie zostało zredukowane do 0,004 kPa/mm i utrzymywane w tej wartości przez około 18 godzin. Podczas tego etapu temperatura półki została podniesiona z 25 do 45°C, zaś w dwie godziny później do 60°C. Powstałe FGM przypominały liofilizowane pelety a rehydracja była natychmiastowa.

Powyższy przykład ilustruje wpływ temperatury półek oraz wielkości próżni (patrz przykład 3) i dodatku lotnych soli (patrz przykład 4) na wytwarzanie FGM, ich wygląd oraz resztkową zawartość wilgoci.

Przykład 3.

Przykład ten ilustruje wpływ próżni oraz temperatury półek na wytwarzanie FGM.

3a) Wytwarzanie FGM z roztworu węglowodanu zawierającego dodatek.

Próbki lml lub 500 μΐ 25% (wagowo/objętościowe) trehalozy zawierające albo 0,25 albo 0,5 M kwaśny węglan amonu były suszone w 10 ml fiolkach farmaceutycznych w suszarce FTS. Próbki 1 ml były suszone przy stałej próżni wynoszącej 0,004 kPa przez 14 godzin, przy temperaturze półek początkowo 25°C, podniesionej do 45°C po pierwszych 2 godzinach (to znaczy po uformowaniu się syropu). Próbki 500 μΐ były suszone w stałej temperaturze 25°C i stałej próżni wynoszącej 0,0013 kPa przez 14 godzin. Utworzone FGM (fig. 2, 2A) miały większą objętość od identycznych próbek poddanych liofilizacji (fig. 2, 2B).

3b) Wytwarzanie FGM z roztworu węglowodanu przyłączającego substancję aktywną.

Próbki 300 μΐ roztworu 43,4 mg/ml trehalozy zawierającego 66 mg/ml peptydu antymikroorganizmowego były suszone w 10 ml probówkach polipropylenowych (o przekroju 10 mm) w suszarce FTS. Próbki, w 25°C, były umieszczane na półce, która była uprzednio podgrzana do 35°C. Ciśnienie w komorze było stopniowo redukowane do 2,7 kPa przez 10 minut. To ciśnienie było utrzymywane przez następnych 30 minut zanim zostało dalej

184 823 zredukowane do 0,004 kPa. Po 981 minutach temperatura półki została podniesiona do 50°C. Ta temperatura półki była utrzymywana przez 190 minut, po czym cykl został zatrzymany. Utworzone spienione szkliste podłoża (FGMs) miały otwartą strukturę podobną do zatyczki przypominającą materiały zliofilizowane. Zawartość wilgoci wynosiła 1,1 do 1,3% (wagowo/wagowe). Po rekonstytucji rozpuszczenie nastąpiło natychmiast. Podobne FGMs zostały wytworzone przy stosowaniu sacharozy zamiast trehalozy. FGM zawierające trehalozę, jako materiał tworzący szkliste podłoże, przechowywane w temperaturze podwyższonej do 60°C i w wilgotności otoczenia wykazały brak kurczenia się przez okres ponad 30 dni, a struktura FGM pozostała nienaruszona. Rozpuszczenie próbek pozostało natychmiastowe nawet po przechowywaniu.

Przykład 4.

Wpływ dodatków na wytwarzanie FGM.

4a) Wpływ lotnych soli na wytwarzanie FGM.

Próbki 500 pl 3 do 60% (wagowo/objętościowe) trehalozy w dejonizowanej destylowanej wodzie, o stężeniu w zakresie 0 do 4 M octanu amonu lub kwaśnego węglanu amonu, były suszone w suszarce FTS. Temperatura półki była utrzymywana na 20°C a ciśnienie wynosiło 0,004 kPa przez 18 godzin cyklu suszenia. Resztkowa wilgotność utworzonych FGM była w zakresie 2 do 5,5% (wagowo/wagowe), a uwodnienie FGM podczas rekonstytucji było natychmiastowe. Otrzymane preparaty są przedstawione na fig. 3.

4b) Wpływ soli rozkładającej się na wytwarzanie FGM.

Próbki 500 pl 50% (wagowo/objętościowe) trehalozy ±1M metadwusiarczyn sodowy były suszone w suszarce FTS przez 12 lub 18 godzin. Temperatura półki i ciśnienie były utrzymywane stałe, odpowiednio, na 40°C i 0,004 kPa przez cykl suszenia. W przypadku krótszego, dwunastogodzinnego czasu suszenia FGM utworzone z roztworów zawierających sól rozkładającą się wykazywały znacznie niższą zawartość resztkowej wilgoci. Podczas rekonstytucji obserwowano szybkie rozpuszczenie się wszystkich FGM.

4c) Wpływ dodatku zmieniającego lepkość na wytwarzanie FGM.

Próbki 500 pl 50 do 90% (wagowo/objętościowe) roztworu trehalozy w dejonizowanej destylowanej wodzie lub w PBS, zawierające 0,5 do 2% gumy guarowej (Jaguar HP60), były suszone w fiolkach 5 ml lub 10 ml w suszarce FTS przez 16 godzin. Początkowa temperatura półki 30°C oraz próżnia 4,0 kPa zostały po dwóch godzinach zwiększone odpowiednio do 60°C i 0,004 kPa, i wartości te utrzymywano przez następnych 14 godzin cyklu suszenia. Na fig 4 pokazano reprezentatywne przykłady utworzonych FGM. Wszystkie FGM również wykazały szybkie rozpuszczenie podczas rekonstytucji w wodzie lub w PBS.

4d) Wpływ czynnika zmieniającego napięcie powierzchniowe na wytwarzanie FGM.

Próbki 500 TI preparatu enzymu restrykcyjnego, każda zawierająca 5000 jednostek EcoRI, 50% (wagowo/objętościowe) trehalozy i 0,2% (wagowo/objętościowe) Tritonu-X-100 jako czynnika zmieniającego napięcie powierzchniowe w 50 mM Tris HCl (pH 7,2), 300 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 5,0 mM EGTA, 0,5 mg/ml BSA i 5 pg/ml poli-I-lizyny były suszone w 10 ml fiolkach farmaceutycznych przez 18 godzin w suszarce FTS. Całość preparatu była sterylizowana przez filtrowanie przez filtr 0,22 pm przed dodaniem do sterylnej całości EcoRI. Sposób suszenia polegał na utrzymywaniu początkowo stałej temperatury półki i ciśnienia, odpowiednio, w wysokości 10°C i 1,33 kPa. Potem temperatura została podwyższona do 60°C. Po następnych 20 minutach próżnia została zwiększona do 0,004 kPa. Te wartości były utrzymywane przez pozostałych 17 godzin cyklu suszenia. Zawartość resztkowej wilgoci w utworzonych FGM była w zakresie 1,5 do 3,5% (wagowo/wagowe), a przy rekonstytucji uwodnienie było natychmiastowe.

Przykład 5.

Przykład ten ilustruje wytwarzanie FGM.

5a) Wytwarzanie FGM z węglowodanu, plus dodatek, przyłączającego cząsteczkową substancję aktywną w homogennym roztworze.

Preparaty zawierające aktywną fosfatazę alkaliczną (1 mg/ml) w roztworze z mieszaniną trehalozy w zakresie stężeń od 20 do 50% (wagowo/objętościowe) i HSA (2% wagowo/objętościowe) plus dodatek lotnej soli kwaśnego węglanu amonu (50 mM) były przygotowywane w buforze PBS lub HEPES. Objętości po 250 pl były porcjowane do 3 ml fiolek

184 823 farmaceutycznych i suszone w suszarce FTS. Temperatura półki była początkowo ustawiona na 30°C, a ciśnienie zmieniane w odstępach dwuminutowych od 4,0 kPa w dół do 3,3 kPa, 2,7 kPa, 2,0 kPa, 1,33 kPa i ostatecznie do 0,004 kPa, przed podwyższeniem temperatury półki do 40°C i ostatecznie do 60°C. Całkowity czas cyklu wynosił około 20 godzin. Zawartość resztkowej wilgoci w otrzymanych FGM była około 1% (wagowo/wagowe).

5b) Wytwarzanie FGM z węglowodanu przyłączającego mieszaninę cząsteczkowej substancji aktywnej w homogennej zawiesinie.

Próbki handlowego preparatu szczepionki zawierającego antygen powierzchniowy wirusa żółtaczki zakaźnej B zaadsorbowany na nieorganicznym adjuwancie tlenku glinu, po 300 pl w 20% (wagowo/objętościowe) trehalozy w PBS, był suszony w 3 ml fiolkach farmaceutycznych. Sposób suszenia FTS obejmował wytworzenie ciśnienia 0,004 kPa i utrzymywanie temperatury półki 40°C przez cykl suszenia około 18 godzin. Średnie resztkowe wilgotności FGM wynosiły około 4 do 4,5% (wagowo/wagowe).

5c) Wytwarzanie fGm z węglowodanu przyłączającego makromolekularne substancje aktywne.

Suszono preparaty, w celu uzyskania FGM zawierających wirusa odry lub polio w pożądanych dawkach, które xawierały:

i) 50%(wagowo/objętościowe) trehalozy + 2% (wagowo/objętościowe) HSA ± 50 mM kwaśny węglan amonu, ii) 50% (^,^ag<^'^<^,^ob_L^i^i^i^^i^^i^^e) lakcitol + 2% (wagowo/objętościowee HSA ±50 mM kwaśny węglan amonu, iii) 40% (wagowo/objętościowe) trehalozy + 10% (wagowo/objętościowe) sorbitolu + 2% (wagowo/objętościowe)

HSA ± 50 mM kwaśny węglan amonu.

Próbki były przygotowane stosując albo bufor PBS albo HEPES, i porcje po 250 pl były pipetowane do 3 ml fiolek farmaceutycznych, a następnie suszone w suszarce FTS stosując dwa sposoby suszenia.

a) Dla próbek zawierających dodatek soli lotnej - kwaśnego węglanu amonu, ciśnienie było zmieniane w odstępach dwuminutowych od 4,0 kPa w dół do 3,3 kPa, 2,7 kPa, 2,0 kPa, 1,33 kPa i ostatecznie do 0,004 kPa. Temperatura półki była początkowo ustawiona na 30°C zanim podniesiono ją do 40°C. Całkowity czas cyklu wynosił około 20 godzin. Zawartości resztkowej wilgoci wynosiły około 2% (wagowo/wagowe) i wszystkie FGM wykazały szybkie rozpuszczenie się podczas rekonstytucji.

b) Dla próbek, które nie zawierały dodatku soli lotnej, ciśnienie było początkowo ustawione na 0,004 kPa i utrzymywane przez 20-godzinny cykl suszenia. Temperatura półki była początkowo ustawiona na 30°C zanim została podniesiona do 40°C. Zawartość resztkowej wilgoci w utworzonych FGM wynosiła około 4% (wagowo/wagowe) i wszystkie FGM wykazały szybkie rozpuszczenie się podczas rekonstytucji.

5d) Wytwarzanie FGM z węglowodanu przyłączającego substancje komórkowe.

Suszenie ludzkich krwinek czerwonych.

Erytrocyty o 5% (objętościowo/objętościowe) hematokrytowym stężeniu były preparowane w:

i) 50% ((^alg^ol^c^/ol5j^tc^l^c^ii^ΛW^e trehaloza ±50 mM lkwaśny węglan amonu, ii) 25% (wagowo/objętościśwe) eeehaloaa z KU/o/wagowo/oo/ętościowe) skrobia hydroksyetylowa (HES) w PBS.

Próbki po 200 pl były suszone w 3 ml fiolkach farmaceutycznych w suszarce FTS. Suszono przy stałej temperaturze półki 37°C oraz ciśnieniu zredukowanym natychmiast do 0,004 kPa. Czas cyklu wynosił 18 godzin. Otrzymane FGM miały zawartość resztkowej wilgoci 2,5 do 3% (wagowo/wagowe) i uwadniały się szybko podczas rekonstytucji. Otrzymane preparaty są przedstawione na fig. 5.

Suszenie ludzkich płytek krwi.

Płytki krwi o początkowym stężeniu 500 x 10⁹/L były suszone w preparacie 5% (wagowę/ębjętęśctowe) trehalozy w soli fizjologicznej zbuforowanej HEPES zawierającej 5 mM

184 823 chlorku potasu, 1 mM siarczanu magnezu, 0,05 U/ml hirudyny, 0,0125 U/ml apyrazy, 10 μM indometacyny i 250 mM kwaśnego węglanu amonu. Próbki po 200 μΐ były suszone w 3 ml fiolkach farmaceutycznych w suszarce FTS. Suszono przy stałej temperaturze półki 37°C, zaś ciśnienie zostało natychmiast zredukowane do 0,004 kPa, Czas cyklu wynosił 18 godzin. Powstałe FGM zawierały średnio 1% (wagowo/wagowe) resztkowej wilgoci i szybko się nawadniały podczas rekonstytucji.

Suszenie komórek bakteryjnych (Escherichia coli).

Zawiesina komórek E. coli była przygotowana w 45% (wagowo/objętościowe) roztworu trehalozy zawierającego 1,5% (wagowo/objętościowe) Kollidonu 90. Próbki po 300 μΐ, zawierające 1 x 10⁹ komórek E. coli były umieszczone w 3 ml fiolkach farmaceutycznych. Suszono w suszarce FTS z temperaturą półki i początkową próżnią ustawionymi odpowiednio na 30°C i 0,67 kPa. Po dalszych 30 minutach temperatura półki została podniesiona do 40°C i ciśnienie obniżone do 0,004 kPa. Całkowity czas cyklu suszenia wynosił 18 godzin. Powstałe FGM zawierały 2 do 4,5% (wagowo/wagowe) resztkowej wilgoci i uwadniały się szybko podczas rekonstytucji.

Przykład 6

Przykład ten ilustruje wytwarzanie FGM w uprzednio napełnianych strzykawkach.

Różne strzykawki, w tym o objętościach 1, 2, 5, 10, 30 i 60 ml, typu jednorazowego, były napełniane od 25 do 1000 μl 50% (wagowo/objętościowe) trehalozy + 0,5 M kwaśnego węglanu amonu w sterylnym buforze PBS. Suszenie było dokonywane w suszarce Labconco, temperatura półki początkowo była ustawiona na 10°C. Ciśnienie było zredukowane do 0,4 kPa w ciągu 3 minut. Po dodatkowych 4 minutach ciśnienie było zredukowane do 1,6 Pa, a temperatura półki podniesiona do 40°C. Suszenie było kontynuowane przez następne 19 godzin, po którym to czasie następowało natychmiastowe rozpuszczenie podczas rehydratacji Otrzymane preparaty są przedstawione na fig. 7.

2A 2B

Fig. 2

184 823

Fig. 3

Fig. 4

184 823

Fig. 5

Fig. 6

184 823

Fig. 7

184 823

FIG. 1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.

Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Preparat do przechowywania substancji biologicznie aktywnych, znamienny tym, że stanowi spienione szkliste podłoże z węglowodanu z wbudowanym w to podłoże środkiem terapeutycznym lub diagnostycznym.
2. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że środkiem terapeutycznym lub diagnostycznym jest związek organiczny, komórka, mikroorganizm bakteryjny lub wirus.
3. Preparat według zastrz. 2, znamienny tym, że związkiem organicznym jest proteina, peptyd lub kwas nukleinowy.
4. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że węglowodanem jest glukoza, sacharoza lub laktoza.
5. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że węglowodanem jest trehaloza.
6. Preparat według zastrz. 1, znamienny tym, że spienione szkliste podłoże zawiera resztkową wilgoć w ilości 0,1 do 12% (wagowo-wagowe).
7. Sposób wytwarzania preparatu do przechowywania substancji biologicznie aktywnych, znamienny tym, że (a) odparowuje się większość rozpuszczalnika z mieszaniny zawierającej co najmniej jeden węglowodan zdolny do tworzenia szklistego podłoża, jego rozpuszczalnik oraz środek terapeutyczny lub diagnostyczny, (b) wytworzony syrop poddaje się działaniu ciśnienia i temperatury wystarczających do spowodowania wrzenia syropu, i (c) ewentualnie z wytworzonego spienionego szklistego podłoża usuwa się resztkową wilgoć do zawartości 0,1 do 12% (wagowo-wagowe) resztkowej wilgoci w podłożu.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap (a) prowadzi się w temperaturze wyższej niż temperatura otoczenia.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap (a) prowadzi się pod ciśnieniem niższym niż ciśnienie atmosferyczne.
10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że ciśnienie wynosi 0,013 do 4,0 kPa.
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie (b) ciśnienie wynosi 0,0013 do 4,0 kPa.
12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że etap (b) prowadzi się w temperaturze powyżej 25°C.
13. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie (a) poddaje się odparowaniu mieszaninę zawierającą dodatkowo lotną sól lub sól rozkładającą się.
14. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie (a) poddaje się odparowaniu mieszaninę zawierającą dodatkowo środek stabilizujący pianę.
15. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że w etapie (a) stosuje się mieszaninę zawierającą rozpuszczalnik organiczny.
16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jako rozpuszczalnik organiczny stosuje się alkohol, eter, olej lub ciekły węglowodór.
17. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako węglowodan stosuje się sacharozę, laktozę, glukozę lub trehalozę.
18. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako środek terapeutyczny lub diagnostyczny stosuje się związek organiczny, komórkę, mikroorganizm bakteryjny lub wirus.
19. Sposób według zastrz. 18, znamienny tym, że jako związek organiczny stosuje się proteinę, peptyd lub kwas nukleinowy.

* * *

184 823