CN108504648A - 一种乳酸菌的共价包埋方法及乳酸菌制剂 - Google Patents

Abstract

本申请提供一种乳酸菌的共价包埋方法，所述方法在菌体中添加凝乳酶和谷丙酰胺转氨酶等共价包埋剂，使菌体表面的添加剂发生共价交联反应，经过乳化后，将菌体包埋于囊状结构中，并在囊状结构中形成非常稳定的微环境，避免菌体在冻干过程中受到损伤。本申请还提供一种使用所述方法制备的植物乳杆菌LP6的冻干粉。

Description

一种乳酸菌的共价包埋方法及乳酸菌制剂

技术领域

本发明属于微生态制剂领域，具体涉及一种乳酸菌共价包埋方法。

背景技术

早在70年代，欧美一些发达国家相继开发研制新型微生态制剂，希望在一定程度上替代抗生素，并起到调节人体免疫力的效果。近些年，伴随我国消费者对微生态制剂认识的不断加深，乳酸菌微生态制以其调理胃肠道和提高免疫力方面的显著优势，越来越受到人们的关注。

乳酸菌微生态制剂在投放市场前，通常经过真空冷冻干燥处理。但在实际的生产过程中，传统的真空冷冻干燥技术，在冷冻初期降温过程较为缓慢，由于细胞外部环境中存在多种溶剂以及无机盐，其中，冰点低的溶剂先结晶，冰点低的溶剂后结晶，而体系中的无机盐不结晶，这就导致细胞外部环境的液相浓度越来越大，逐渐转变为玻璃态，从而导致细胞外部环境的渗透压逐渐增大，进而导致细胞内的细胞质发生变化，并且，细胞间及细胞内的冰晶无规则排列，细胞间的压力直接作用在细胞质膜上，改变了细胞质膜的流动性以及其他物理和化学性质，还可能刺破细胞膜。这些因素综合导致细胞膜会遭受氧化损伤，使得乳酸菌自身对外界环境的抗性较差，生物活性逐渐丧失，从而导致乳酸菌固体食品货架期较短，严重制约乳酸菌系列产品的生产、销售和应用。

因此，寻求一种可提高乳酸菌常温条件下贮藏稳定性的加工工艺已经迫在眉睫。

发明内容

本申请的目的之一是提供一株分离的植物乳杆菌菌株，所述植物乳杆菌菌株LP6(Lactobacillus plantarum LP6)，通过以下方法筛选得到：

分离自传统自然发酵的泡菜中，经无菌水适度稀释并涂布于选择性MRS固体培养基，37℃厌氧培养72h。挑取典型菌落进行革兰氏染色镜检挑选后，再划线于MRS固体培养基2-3次培养得到纯菌落。经生理生化鉴定结合16s rRNA分子鉴定为1株植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌LP6(Lactobacillus plantarum LP6)，该菌株已于2017年9月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心。

本申请将该菌株提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCCNo.13458；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏时间：2017年9月25日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本申请所分离的植物乳杆菌菌株(Lactobacillus plantarum LP6)具有如下生物学特性：菌种为革兰氏样性菌，呈直杆状，单个、有时成对或成链状。MRS固体培养基上菌落直径1-3mm，乳白色，凸起，呈圆形，表面光滑。最适生长温度为30～37℃，厌氧或兼性厌氧，最适pH 6.5左右，在MRS液体培养基中生长浑浊。

本申请还提供一种乳酸菌共价包埋方法，所述方法包括：

步骤1，将所述乳酸菌菌体与水、小分子糖、酵母粉混合；

步骤2，将步骤1制备的体系与抗氧化剂混合；

步骤3，将步骤2制备的体系与多孔淀粉混合；

步骤4，将步骤3制备的体系与蛋白质混合，调节体系pH，恒温处理；

步骤5，将步骤4制备的体系与共价交联包埋剂混合，所述共价交联包埋剂为包括0.5wt％～1wt％凝乳酶以及0.3wt％～1.0wt％谷丙酰胺转氨酶的水溶液。

可选地，所述方法在步骤5之后还包括：

步骤6，将步骤5制备的体系进行真空冷冻干燥。

本申请还提供一种由所述方法制备乳酸菌冻干粉，所述乳酸菌为植物乳杆菌LP6，所述乳酸菌冻干粉新制菌粉中活菌数为4.50×10¹¹CFU/g以上，在常温条件下贮存360天，其活菌数可达到3.99×10¹¹CFU/g以上，其存活率为87.0％以上。

本申请提供乳酸菌共价交联包埋方法通过离心收集菌体，在菌体中加入水、小分子糖和酵母粉，在真空冷冻干燥过程中对菌体直到基础保护作用，再在菌体中加入L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶三种抗氧化剂，减少或除去在贮藏过程中菌体微代谢产生的过氧化物对菌体造成损伤，此外，用多孔淀粉对菌体和上述添加物进行吸附包埋，形成相对稳定的微环境；再向体系中加入蛋白质，并将处理后体系与凝乳酶和谷丙酰胺转氨酶等共价包埋剂混合，使菌体表面的添加剂发生共价交联反应，经过乳化后，将菌体包埋于囊状结构中，并在囊状结构中形成非常稳定的微环境，最终通过真空冷冻干燥得到产品，从而实现提高产品贮藏过程稳定性的目的。

采用本发明提供的共价交联包埋方法制备的乳酸菌冻干菌粉可将活菌在25℃条件下稳定贮存12个月，活菌存活率大于80％，显著提高产品贮藏过程稳定性。

具体实施方式

下面结合实施例解释本发明，实施案例仅用于说明本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本申请提供一株分离的植物乳杆菌菌株，所述植物乳杆菌菌株LP6(Lactobacillus plantarum LP6)，其微生物保藏编号为：CGMCC No.13458；分类命名为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)；保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏；保藏时间：2017年9月25日；保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本申请还提供一种乳酸菌共价包埋方法，所述方法包括：

步骤1，将所述乳酸菌菌体与水、小分子糖、酵母粉混合。

所述乳酸菌菌体为植物乳杆菌菌株LP6。

所述小分子糖选自蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的一种或者多种，优选为蔗糖。

在菌体中加入水、小分子糖和酵母粉能够在菌体表面形成保护膜，从而在真空冷冻干燥过程中对菌体起到基础保护作用。

所述乳酸菌菌体、水、小分子糖以及酵母粉的重量比为乳酸菌菌体的重量:水的重量:小分子糖的重量:酵母粉的重量＝1:(3～20):(0.5～5):(0.1～2.0)，优选为1:(5～10):(1.0～2.0):(0.5～1.5)，例如1:20:2:1.5，其中，菌泥的重量以菌泥的总重量计。

所述乳酸菌菌体、水、小分子糖以及酵母粉按照上述比例进行组合，在乳酸菌菌体表面形成的保护膜均匀且致密，能够有效地保护乳酸菌菌体的活性。

本步骤中混合可以为以50～100r/min搅拌的转速，在20℃条件下，搅拌1-3min，既可使菌体与水、小分子糖以及酵母粉混合均，而且能够保持菌体完整，从而保证菌体的活性。

步骤2，将步骤1制备的体系与抗氧化剂混合。

所述抗氧化剂选自L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶中的一种或者多种，优选为L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶的组合物，更优选地，所述L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶的组合物中L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶的重量比为L-半胱氨酸盐的重量:胱氨酸的重量:过氧化氢酶的重量＝(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2)，优选为(0.8～1.5):(1.0～1.8):(0.8～1.8)。

所述抗氧化剂能够减少或除去在贮藏过程中菌体微代谢产生的过氧化物对菌体造成损伤。特别地，所述L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶的组合物能够协同作用除去体系中的氧化性物质，并使体系保持低氧环境，从而减少菌体的氧化损伤。

所述抗氧化剂与所述乳酸菌菌体的重量之比为所述抗氧化剂的重量:所述乳酸菌菌体的重量＝(0.05～0.15):1，优选为(0.09～0.10):1。

按照上述重量比混合抗氧化剂及乳酸菌菌体，既能够保证体系中抗氧化剂的含量，使体系保持低氧环境，而且也不会造成抗氧化剂的浪费。

本步骤中混合可以为以保持搅拌桨60～100r/min的转速转动，在37～42℃条件下，搅拌5～6min，用该条件搅拌，既能够在经过前述处理的菌体表面形成抗氧化剂层，也能够保证菌体细胞的完整。

步骤3，将步骤2制备的体系与多孔淀粉混合。

所述多孔淀粉能够对菌体和上述添加物进行吸附包埋，形成相对稳定的微环境。

所述多孔淀粉与所述乳酸菌菌体的重量之比为所述多孔淀粉的重量:所述乳酸菌菌体的重量＝(0.10～0.5):1，优选为(0.13～0.3):1。

按照上述重量比混合多孔淀粉及乳酸菌菌体，能够在经过前述处理的菌体表面的形成致密保护层，从而形成微囊结构，使菌体细胞被包覆于所述微囊中，便于其保持活性。

本步骤中混合可以为以保持搅拌桨50～90r/min的转速转动，在35～42℃，如37℃条件下，搅拌10～50min，如30min，用该条件搅拌，既能够在经过前述处理的菌体表面形成多孔淀粉层，也能够保证菌体细胞的完整。

步骤4，将步骤3制备的体系与蛋白质混合，调节体系pH，恒温处理。

所述蛋白质选自脱脂乳粉、大豆蛋白粉、脱盐乳清粉中的一种或者多种，优选为脱脂乳粉。

所述蛋白质能够减缓冷冻干燥过程中结晶冰晶形成的速度、减少冰晶数量和粒度，降低冷冻过程中冰晶对菌体细胞结构的破坏，提高冷冻过程中干燥存活率。

所述蛋白质与所述乳酸菌菌体的重量之比为所述蛋白质的重量:所述乳酸菌菌体的重量＝(0.3～3):1，优选为(0.5～2):1。

按照上述重量比混合蛋白质及乳酸菌菌体，减缓结晶冰晶形成速度的作用显著，蛋白质加入量过多，会造成不易冻干等后果。

在本步骤中，可以使用氨水，如25％(V/V)的氨水来调节体系pH，优选地，将体系pH调节至5.0～5.9。使用氨水调节体系pH更为温和，使菌体细胞有适应过程，而不会因环境pH突变造成菌体细胞损伤。

将调节pH后的体系保持恒温25℃～45℃，恒温1～2小时，使菌体细胞内外温度一致。

步骤5，将步骤4制备的体系与共价交联包埋剂混合。

在一种可实现的方式中，所述共价交联包埋剂为包括0.5wt％～1wt％凝乳酶以及0.3wt％～1.0wt％谷丙酰胺转氨酶的水溶液。

在一种可实现的方式中，所述步骤4制备的体系与共价交联包埋剂在乳化机中进行混合。

可选地，所述步骤4制备的体系与共价交联包埋剂的流速之比为步骤4制备的体系的流速:所述共价交联包埋剂的流速＝(10～50):(0.02～0.2)，优选为(20～30):(0.05～0.1)，从而在菌体表面能够充分地包覆有共价交联包埋剂，并使菌体表面的添加剂发生共价交联反应，经过乳化后，将菌体包埋于囊状结构中，并在囊状结构中形成非常稳定的微环境。

可选地，乳化机中的温度为(25～45)℃，以保持菌体活性，并能够使共价交联包埋剂与菌体表面的物质反应，从而形成更为致密的微囊结构。

可选地，所述方法在步骤5之后还包括：

步骤6，将步骤5制备的体系进行真空冷冻干燥。

在一种可实现的方式中，在真空度为18Pa～20Pa的条件按照程序升温的方式进行冷冻干燥。可选地，所述程序升温可以包括三个阶段，依次为10℃保持25h，20℃保持20h，30℃保持3h。按照上述程序升温的方式进行干燥，菌体干燥的完全充分，并且能够保持活性。

本申请还提供一种由所述方法制备的乳酸菌菌粉，所述乳酸菌为植物乳杆菌LP6，所述乳酸菌菌粉新制菌粉中活菌数为4.50×10¹¹CFU/g以上，在常温条件下贮存360天，其活菌数可达到3.99×10¹¹CFU/g以上，其存活率为87.0％以上。

实施例

(一)菌种的活化和培养

将冷冻保存的植物乳杆菌LP6接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养20h，如此传代培养3次得到活化菌种。

其中，MRS液体培养基包括如下重量配比的组分：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰，1000mL蒸馏水，将上述组合混合后调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

(二)高密度发酵

将活化好的植物乳杆菌LP6按照5％(v/v)的比例同时接种到存有经过灭菌的MRS液体培养基的发酵罐中，37℃恒温培养，初始pH＝6.5，通过流加25％(V/V)氨水作为中和剂控制恒pH＝5.5发酵3小时后，再进行自然发酵，当pH低于4.5时，通过流加25％(V/V)氨水作为中和剂控制pH＝5.5发酵5h，再进行自然发酵，如此循环控制20小时，至乳酸菌活菌数达到1×10¹⁰CFU/mL以上，结束发酵。

向发酵后的液相中通入氮气置换其中的空气，置换时间5min，在4℃条件下，用高速转鼓离心机以16000rpm收集菌体细胞。

实施例1

本实施例使用(一)和(二)培养发酵而得的菌液。

需要说明的是，本实施例中所添加物质均经过高能级电子束流扫描物料，快速杀灭物料中的活性菌体，在扫描的过程中，物料厚度2cm，物料传送速度2m/min。

包埋方法具体如下：

本实施例中所用试剂均经过高能级电子束流扫描物料，快速杀灭物料中的活性菌体，物料厚度2cm，物料传送速度1-5m/min。

步骤1，向1Kg(二)离心获得的菌体细胞中加入10Kg水，2Kg蔗糖和1.5Kg酵母粉，保持100r/min搅拌的转速，在20℃条件下，搅拌3min；

步骤2，在步骤1制备的体系中加入0.1Kg抗氧化剂，所述抗氧化剂为L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶，并保持搅拌桨100r/min的转速转动，在42℃条件下，搅拌6min；

步骤3，在步骤2制备的体系中加入0.3Kg多孔淀粉，并保持发酵罐搅拌桨以90r/min的转速转动，在37℃条件下，搅拌30min；

步骤4，在步骤3制备的体系中加入2Kg脱脂乳，用25％(V/V)氨水调节体系pH到5.9，恒温45℃1小时；

步骤5，使用乳化机混合步骤4制备的发酵液和共价交联包埋混合液，其中，所述共价交联包埋混合液为含有1.0wt％凝乳酶和1.0wt％谷丙酰胺转氨酶的水溶液，调节乳化机进液口处步骤4制备的发酵液流量为50L/min，共价交联包埋混合液流量为0.02-0.2L/min，二者在乳化机中发生共价交联反应；

步骤6，将步骤5中制备的体系加入真空冷冻干燥机按照程序升温冻干，程序升温可以为10℃保持25小时，20℃保持20小时，30℃保持3小时，即得到最终产品。

对比例

对比例1

对比例1为实施例1步骤1制备的体系在步骤5的条件下制备的菌粉。

实验例

实验例1产品常温贮存稳定性测试

将实施例1和对比例1制备的菌粉制剂分别放置于在25℃恒温条件下，分别在0天、30天、60天、90天、120天、150天、180天、210天、240天、270天、300天、330天和360天取样，进行活菌数检验，实验数据见表1。

表1共价交联包埋工艺制剂室温贮存稳定性情况

由表1实验结果可知，将该共价交联包埋工艺制剂在常温条件下贮存360天，其活菌数可达到3.99×10¹¹CFU/g，其存活率为87.69％，说明该共价交联包埋工艺所得制剂具有良好的贮存稳定性，具有很高的实际应用价值。

以上结合具体实施方式和范例性实例对本申请进行了详细说明，不过这些说明并不能理解为对本申请的限制。本领域技术人员理解，在不偏离本申请精神和范围的情况下，可以对本申请技术方案及其实施方式进行多种等价替换、修饰或改进，这些均落入本申请的范围内。本申请的保护范围以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种乳酸菌的共价包埋方法，其特征在于，所述方法包括：

步骤1，将所述乳酸菌菌体与水、小分子糖、酵母粉混合；

步骤2，将步骤1制备的体系与抗氧化剂混合；

步骤3，将步骤2制备的体系与多孔淀粉混合；

步骤4，将步骤3制备的体系与蛋白质混合，调节体系pH，恒温处理；

步骤5，将步骤4制备的体系与共价交联包埋剂混合。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

所述乳酸菌菌体为植物乳杆菌菌株LP6；

所述小分子糖选自蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、果糖、低聚果糖、低聚半乳糖中的一种或者多种，优选为蔗糖；和/或

所述抗氧化剂选自L-半胱氨酸盐、抗坏血酸钠、海藻酸钠和阿拉伯胶中的一种或者多种，优选为L-半胱氨酸盐，优选为L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶的组合物；

所述蛋白质选自脱脂乳粉、大豆蛋白粉、脱盐乳清粉中的一种或者多种，优选为脱脂乳粉；和/或

所述共价交联包埋剂为包括0.5wt％～1wt％凝乳酶以及0.3wt％～1.0wt％谷丙酰胺转氨酶的水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌菌体、水、小分子糖以及酵母粉的重量比为乳酸菌菌体的重量:水的重量:小分子糖的重量:酵母粉的重量＝1:(3～20):(0.5～5):(0.1～2.0)，优选为1:(5～10):(1.0～2.0):(0.5～1.5)，例如1:20:2:1.5，其中，菌泥的重量以菌泥的总重量计。

4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶的组合物中L-半胱氨酸盐、胱氨酸和过氧化氢酶的重量比为L-半胱氨酸盐的重量:胱氨酸的重量:过氧化氢酶的重量＝(0.5～2):(0.5～2):(0.5～2)，优选为(0.8～1.5):(1.0～1.8):(0.8～1.8)。

5.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂与所述乳酸菌菌体的重量之比为所述抗氧化剂的重量:所述乳酸菌菌体的重量＝(0.05～0.15):1，优选为(0.09～0.10):1。

6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于，所述多孔淀粉与所述乳酸菌菌体的重量之比为所述多孔淀粉的重量:所述乳酸菌菌体的重量＝(0.10～0.5):1，优选为(0.13～0.3):1。

7.根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于，所述蛋白质与所述乳酸菌菌体的重量之比为所述蛋白质的重量:所述乳酸菌菌体的重量＝(0.3～3):1，优选为(0.5～2):1。

8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4制备的体系与共价交联包埋剂在乳化机中进行混合，

所述步骤4制备的体系与共价交联包埋剂的流速之比为步骤4制备的体系的流速:所述共价交联包埋剂的流速＝(10～50):(0.02～0.2)，优选为(20～30):(0.05～0.1)。

9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，在步骤5之后，还包括：

步骤6，将步骤5制备的体系进行真空冷冻干燥。

10.一种根据权利要求9所述方法制备的乳酸菌菌粉，其特征在于，所述乳酸菌为植物乳杆菌LP6，所述乳酸菌菌粉新制菌娄中活菌数为4.50×10¹¹CFU/g以上，在常温条件下贮存360天，其活菌数可达到3.99×10¹¹CFU/g以上，其存活率为87.0％以上。