CN115975858A - 一株嗜酸乳杆菌ls001及其培养方法与抑制幽门螺杆菌的应用 - Google Patents
一株嗜酸乳杆菌ls001及其培养方法与抑制幽门螺杆菌的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一株嗜酸乳杆菌LS001及其培养方法与抑制幽门螺杆菌的应用，属于微生物的技术领域。所述嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)LS001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.23649，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明提供的嗜酸乳杆菌LS001制品可以作为日常膳食食用，也可以进行日常的身体调理食用，又可以作为药品用于治疗疾病，能够很好的预防和抑制幽门螺杆菌，从而维护胃肠道内的微生态平衡。
Description
技术领域
本发明涉及微生物的技术领域，具体涉及一株嗜酸乳杆菌LS001及其培养方法与抑制幽门螺杆菌的应用。
背景技术
当前社会，生活节奏越来越快，工作压力也越来越大，许多人的作息无规律，饮食不规律，高盐高油高脂食物摄入过多，导致胃部不适症状增加。胃病种类多、成分复杂。胃病的病因主要是由幽门螺杆菌感染、长期受到刺激性物质的伤害、药物的刺激、外部环境改变、生活饮食不规律等因素引起的。
早在1994年，国际癌症研究机构(IARC)把幽门螺杆菌纳入了I类人类致癌物，致癌风险确认无误。幽门螺杆菌(Hp)是一种革兰氏阴性菌，生存能力极强，它可以寄生在胃黏膜，藏在胃小凹内，既能避免胃酸环境的影响，也不易随着食物排出体外。在生长繁殖过程中会产生毒素，破坏胃黏膜，引发慢性、浅表性胃炎等疾病，逐步发展为胃溃疡甚至胃癌。67-80％的胃溃疡，95％的十二指肠溃疡都与Hp有关，且能增加4-6倍的胃癌风险。幽门螺杆菌感染发展到胃癌，还需要经历慢性浅表性胃炎、萎缩性胃炎、肠上皮化生、不典型增生四个阶段。因此，只要我们及时阻断肠上皮化生及之前的病变，同时清除幽门螺杆菌，就能阻止胃癌的发生。随着时间的变迁，Hp对常用抗生素的耐药性逐渐增加，因而导致Hp的根治率越来越低。
以菌治菌的新思路已经成为目前治疗Hp的新手段。主要是通过益生菌来抑制、根除体内的幽门螺杆菌，达到缓解胃部问题，养胃护胃的作用。因此开发更多的益生菌菌株对抗幽门螺杆菌是目前微生物领域亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中在对抗幽门螺杆菌中存在的上述不足，本发明提供一株嗜酸乳杆菌LS001及其培养方法与抑制幽门螺杆菌的应用，以解决上述技术问题。
本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一株嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)LS001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.23649，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述的嗜酸乳杆菌LS001是利用现代微生物技术内蒙古自治区锡林浩特的牧民自制酸奶中分离纯化所得。
所述的嗜酸乳杆菌LS001的DNA序列如SEQ ID No.1所示。
第二方面，本发明提供一种上述嗜酸乳杆菌LS001的高密度培养方法，具体步骤如下：
(1)发酵菌种的活化
将嗜酸乳杆菌LS001斜面保藏菌种接种至已灭菌的10-20ml 10％的脱脂乳摇瓶中进行活化，然后按照体积比1％-5％的接种量接种于已灭菌的MRS液体培养基中，以适应菌株在培养基中的生长，活化好的菌株放于4℃冰箱中，备用。
(2)种子培养
按照体积比1％-10％的接种量将步骤(1)活化好的菌种接种于已灭菌的MRS液体培养基中，37℃静置培养12-36h。
(3)发酵培养
将步骤(2)培养好的种子液按照1％-10％的接种量转接至已灭菌的改良肉汤培养基中，于30-37℃，50-200rpm，0.01-0.02Mpa培养12-36h，培养过程中流加60％-70％葡萄糖溶液，通过流加氨水控制发酵液pH值为5.5-6.0，得到高密度的嗜酸乳杆菌LS001发酵液。
优选的，所述步骤(3)中改良肉汤培养基包括以下组分：酵母粉1-10g/L，酵母蛋白胨1-10g/L，葡萄糖5-15g/L，KH2PO41-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2/L，番茄浸出粉1-5g/L，吐温800.5-1.0g/L，硫酸亚铁0.05-0.15g/L，硫酸锰0.05-0.15g/L，生物素0.01-0.1g/L，VB120.01-0.5g/L，烟酰胺0.01-0.5g/L，盐酸硫铵0.01-0.1g/L，pH 5.5-6.0。
优选的，所述步骤(3)中培养方法为：按照通气量1：0.01通入无菌空气，保持罐压0.01-0.02Mpa。
第三方面，本发明提供一种包含上述嗜酸乳杆菌LS001的发酵制品。
所述发酵制品的制备方法如下：
(1)收集菌体
将高密度的嗜酸乳杆菌LS001发酵液通过微滤膜进行过滤处理，当浓缩1-5倍时，加入等体积的纯化水，再进行过滤浓缩；直至滤出液的电导率≤2s/m，浓缩1-5倍后收集菌体。
(2)配料
根据步骤(1)浓缩液中嗜酸乳杆菌LS001的菌体数量，添加等量的其他类型的益生菌和干燥保护剂，搅拌均匀，使物料维持10-15℃。
(3)干燥
将复配液均匀的平铺在真空低温连续带式干燥机的干燥带上，控制温度25℃-30℃进行真空干燥。
(4)粉碎、包装
收集干燥后的物料，用粉碎机进行粉碎，粉碎过程控制温度≤30℃。按照产品类型进行无菌包装。
所述步骤(2)中的益生菌为鼠李糖乳杆菌GS014；所述鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述步骤(2)中，干燥保护剂为：10％-15％低聚半乳糖、10％-15％低聚果糖、5％-10％脱脂乳粉、5％-10％异麦芽糊精、0.5％-1％硅酸钙。
第四方面，本发明提供一种嗜酸乳杆菌LS001在抑制幽门螺杆菌中的应用。
本发明的有益效果为：
(1)本发明中的嗜酸乳杆菌LS001高密度发酵工艺能够使各批次之间菌体差异最小化，提高菌体的稳定性。
(2)本发明中的制品在生产过程中添加了同类型的乳酸菌，使各益生菌之间起到了互助作用，更利于预防和抑制幽门螺杆菌。
(3)本发明提供的嗜酸乳杆菌LS001制品可以作为日常膳食食用，也可以进行日常的身体调理食用，又可以作为药品用于治疗疾病，能够很好的预防和抑制幽门螺杆菌，从而维护胃肠道内的微生态平衡。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明具体实施方式中嗜酸乳杆菌LS001的平板培养基生长情况图。
图2为本发明具体实施方式中嗜酸乳杆菌LS001的革兰氏染色图。
图3为本发明具体实施方式中嗜酸乳杆菌LS001对幽门螺杆菌的抑菌图。图中，对照为无菌MRS培养基；LS001为嗜酸乳杆菌LS001采用37℃MRS培养18h后取200μl进行抑制幽门螺杆菌实验；LS023为嗜酸乳杆菌LS023采用37℃MRS培养18h后取200μl进行抑制幽门螺杆菌实验。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
嗜酸乳杆菌LS001菌株的筛选
具体筛选方法如下：
采用溶钙圈法进行筛选。用一次性采样杯采集适量的内蒙古自治区锡林浩特的牧民自制酸奶，用无菌生理盐水梯度稀释至10-6，取稀释液涂布于已灭菌的含有碳酸钙的MRS固体培养基上，37℃静置培养48h。挑取产生溶钙圈的菌落反复在MRS固体培养基上划线，挑选单菌落进行染色，经镜检确认为纯种。挑选革兰氏阳性杆菌单菌落，接种至液体MRS培养基中，37℃静置培养24h，配置成10-20％的甘油菌悬液，于液氮罐中进行保藏。
嗜酸乳杆菌LS001菌株的鉴定
(1)菌落形态的观察
将挑选的菌株接种至MRS固体培养基上，37℃静置培养48h，观察菌落的形态特征，结果如图2所示。对菌落进行革兰氏染色，在电子显微镜下观察形态，结果如图3所示。
(2)种属鉴定
将嗜酸乳杆菌LS001交于上海生工进行DNA测序，鉴定菌株的种属。测定结果为嗜酸乳杆菌lactobacillus acidophilus。嗜酸乳杆菌(lactobacillus acidophilus)LS001，已于2021年10月22日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.23649。
实施例2
嗜酸乳杆菌LS001的高密度发酵
(1)发酵菌种的活化
将嗜酸乳杆菌LS001斜面保藏菌种接种至已灭菌的20ml 10％的脱脂乳摇瓶中进行活化，然后按照体积比2％的接种量接种于已灭菌的MRS液体培养基中，以适应菌株在培养基中的生长，活化好的菌株放于4℃冰箱中，备用。
(2)种子培养
按照体积比5％的接种量将步骤(1)活化好的菌种接种于已灭菌的MRS液体培养基中，37℃静置培养24h。
(3)发酵培养
将步骤(2)培养好的种子液按照2％的接种量转接至已灭菌的改良肉汤培养基：酵母粉5g/L，酵母蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，KH2PO42g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，番茄浸出粉2.5g/L，吐温80 1.0g/L，硫酸亚铁0.1g/L，硫酸锰0.1g/L，生物素0.05g/L，VB12 0.05g/L，烟酰胺0.05g/L，盐酸硫铵0.05g/L中，于37℃，100rpm，无菌空气通气量1：0.1，罐压0.01Mpa培养36h，培养过程中流加60-70％葡萄糖溶液，通过流加氨水控制发酵液pH值为5.5±0.1，得到高密度的嗜酸乳杆菌LS001发酵液，嗜酸乳杆菌LS001的菌体密度达到5.75×1011CFU/mL。
实施例3
嗜酸乳杆菌LS001的耐受性实验
(1)胃液耐受性实验
人工胃液的制备：准确称取胰蛋白胨2g，葡萄糖5g，酵母粉1g，氯化钠1g，加入适量的纯化水，充分溶解，定容至950mL，用稀盐酸调节pH值1.5，115℃灭菌20min。取3.5g胃蛋白酶，加入50mL纯化水，充分溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，然后加入到上述溶液中，混匀，备用。
在无菌状态下，取发酵结束的嗜酸乳杆菌LS001发酵液1mL，8000rpm，4℃离心10min，弃上清液，用无菌水清洗至无色，离心，弃上清，然后加入人工胃液重悬。将菌悬液转至100mL的人工胃液中，37℃恒温消化培养4h，每隔2h取样，梯度稀释108，用固体MRS培养基划线检测活菌数量。
表1-人工胃液消化后的活菌数量
| 时间/h | 0 | 2 | 4 |
| 活菌数CFU/mL | <![CDATA[5.75×10<sup>9</sup>]]> | <![CDATA[5.74×10<sup>9</sup>]]> | <![CDATA[5.72×10<sup>9</sup>]]> |
从上表可以看出，嗜酸乳杆菌LS001在pH1.5的环境中，能够很好的存活，说明该菌具有很高的耐酸性，能够承受胃部的消化。
(2)胆盐和肠液耐受性实验
人工肠液的制备：准确称取胰蛋白胨2g，葡萄糖5g，酵母粉1g，氯化钠1g，KH2PO413.6g，猪胆盐0.3g，加入适量的纯化水，充分溶解，定容至950mL，用氢氧化钠调节pH值1.5，115℃灭菌20min。取5g胃蛋白酶，加入50mL纯化水，充分溶解，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，然后加入到上述溶液中，备用。
取(1)消化液50mL，9000rpm，4℃离心10min，弃上清液，然后加入人肠胃液重悬。将菌悬液转至100mL的人工肠液中，37℃恒温消化培养4h，每隔2h取样，梯度稀释107，用固体MRS培养基划线检测活菌数量。
表2-人工肠液消化后的活菌数量
| 时间/h | 0 | 2 | 4 |
| 活菌数CFU/mL | <![CDATA[2.87×10<sup>9</sup>]]> | <![CDATA[2.87×10<sup>9</sup>]]> | <![CDATA[2.86×10<sup>9</sup>]]> |
从上表可以看出，在人工肠液中消化4h，该菌的存活率依然很高，说明该菌可以在肠道内定植生存，发挥益生作用。
实施例4
嗜酸乳杆菌LS001冻干粉的制备
(1)收集菌体
将高密度的嗜酸乳杆菌LS001发酵液通过旋转式陶瓷膜进行过滤处理，当浓缩5倍时，加入等体积的纯化水，再进行过滤浓缩。直至滤出液的电导率≤2s/m，浓缩5倍，收集菌体。
(2)配料
根据(1)浓缩液中嗜酸乳杆菌LS001的菌体数量，添加等量鼠李糖乳杆菌GS014和冻干保护剂：10％低聚半乳糖、10％低聚果糖、5％脱脂乳粉、5％异麦芽糊精、0.75％硅酸钙，搅拌均匀，控制物料温度维持15℃。所述鼠李糖乳杆菌(lactobacillus rhamnosus)GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNO.23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
(3)干燥
将复配液均匀的平铺在真空低温连续带式干燥机的干燥带上，控制温度30℃进行真空干燥。
(4)粉碎
收集干燥后的物料，用100目万能粉碎机进行粉碎，粉碎过程控制温度≤30℃，即得嗜酸乳杆菌LS001冻干粉。
实施例5
嗜酸乳杆菌LS001固体菌粉对幽门]螺杆菌的抑制性实验
运用打孔法检测嗜酸乳杆菌LS001对幽门螺杆菌的抑制作用。
(1)幽门螺杆菌菌悬液的制备：在无菌环境下，将幽门螺杆菌菌株接种至已灭菌的LB培养基中，37℃，180rpm，恒温培养14h，即得幽门螺杆菌菌悬液。
(2)嗜酸乳杆菌LS001菌悬液制备：在无菌环境下，取0.1g嗜酸乳杆菌LS001固体菌粉加入100ml无菌水中，充分溶解，即得嗜酸乳杆菌LS001菌悬液。同时取对照菌嗜酸乳杆菌LS023，按照嗜酸乳杆菌LS001菌悬液的制备方法制备嗜酸乳杆菌LS023菌悬液。
(3)平板的制备：往已冷却至50℃左右的LB固体培养基中加入幽门螺杆菌菌悬液，混合均匀，倾注平板(20mL/平板)，水平静置凝固后备用。
(4)添加抑菌剂
用无菌枪头在培养皿上打三个孔，各孔之间相距25mm以上，与培养皿的周围边缘相距15mm以上，打完孔后用无菌针头将琼脂孔中的培养基挑出。孔1中不添加物质；孔2中添加20ul的嗜酸乳杆菌LS001菌悬液；孔3中添加20ul的嗜酸乳杆菌LS023菌悬液。于37℃恒温培养箱中正置培养16-24h，观察结果。用游标卡尺测量抑菌圈的直径。
表3嗜酸乳杆菌LS001固体菌粉抑菌圈的直径
| 组别 | 抑菌圈直径/mm |
| 对照 | 0 |
| LS001菌悬液 | 17.32 |
| LS023菌悬液 | 0 |
从上表可以看出，嗜酸乳杆菌LS001固体菌粉对幽门螺杆菌有良好的抑制作用。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述，但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下，本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换，而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求所述的保护范围为准。
Claims (9)
1.一株嗜酸乳杆菌LS001，其特征在于，所述嗜酸乳杆菌(lactobacillusacidophilus)LS001，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.23649，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
2.一种如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌LS001的高密度培养方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)发酵菌种的活化
将嗜酸乳杆菌LS001斜面保藏菌种接种至已灭菌的10-20ml10％的脱脂乳摇瓶中进行活化，然后按照体积比1％-5％的接种量接种于已灭菌的MRS液体培养基中，以适应菌株在培养基中的生长，活化好的菌株放于4℃冰箱中，备用；
(2)种子培养
按照体积比1％-10％的接种量将步骤(1)活化好的菌种接种于已灭菌的MRS液体培养基中，37℃静置培养12-36h；
(3)发酵培养
将步骤(2)培养好的种子液按照1％-10％的接种量转接至已灭菌的改良肉汤培养基中，于30-37℃，50-200rpm，0.01-0.02Mpa培养12-36h，培养过程中流加60％-70％葡萄糖溶液，通过流加氨水控制发酵液pH值为5.5-6.0，得到高密度的嗜酸乳杆菌LS001发酵液。
3.如权利要求2所述的高密度培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中改良肉汤培养基包括以下组分：酵母粉1-10g/L，酵母蛋白胨1-10g/L，葡萄糖5-15g/L，KH2PO41-3g/L，MgSO4·7H2O1-2/L，番茄浸出粉1-5g/L，吐温80 0.5-1.0g/L，硫酸亚铁0.05-0.15g/L，硫酸锰0.05-0.15g/L，生物素0.01-0.1g/L，VB120.01-0.5g/L，烟酰胺0.01-0.5g/L，盐酸硫铵0.01-0.1g/L，pH＝5.5-6.0。
4.如权利要求2所述的高密度培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中培养方法为：按照通气量1：0.01通入无菌空气，保持罐压0.01-0.02Mpa。
5.一种包含如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌LS001的发酵制品。
6.一种如权利要求5所述的发酵制品的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
(1)收集菌体
将高密度的嗜酸乳杆菌LS001发酵液通过微滤膜进行过滤处理，当浓缩1-5倍时，加入等体积的纯化水，再进行过滤浓缩；直至滤出液的电导率≤2s/m，浓缩1-5倍后收集菌体；
(2)配料
根据步骤(1)浓缩液中嗜酸乳杆菌LS001的菌体数量，添加等量的其他类型的益生菌和干燥保护剂，搅拌均匀，使物料维持10-15℃；
(3)干燥
将复配液均匀的平铺在真空低温连续带式干燥机的干燥带上，控制温度25℃-30℃进行真空干燥；
(4)粉碎、包装
收集干燥后的物料，用粉碎机进行粉碎，粉碎过程控制温度≤30℃；按照产品类型进行无菌包装。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的益生菌为鼠李糖乳杆菌GS014；所述鼠李糖乳杆菌(lactobacillusrhamnosus)GS014，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCCNo.23646，保藏日期为2021年10月22日，保藏机构地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
8.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，干燥保护剂为：10％-15％低聚半乳糖、10％-15％低聚果糖、5％-10％脱脂乳粉、5％-10％异麦芽糊精、0.5％-1％硅酸钙。
9.一种如权利要求1所述的嗜酸乳杆菌LS001在制备抑制幽门螺杆菌产品中的应用。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20230418 |