JP4731907B2 - 受動免疫のための蛋白質およびペプチド発現 - Google Patents
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Description
定義
本発明を説明する際、次の術語は、下記の定義に従って使用される。
酵母菌、真菌、細菌、藻類、昆虫、動物もしくは植物、または、これらの系の組織/細胞培養物などの異種宿主発現系中で、カプシドまたは外膜蛋白質などのウイルス蛋白質および・またはペプチドを産生する工程と、
該ウイルス蛋白質を含む該バイオマスを、最低限の精製を施して飼料または飼料栄養補給剤に処理する工程と、
該バイオマスを動物に与え、該ウイルス蛋白質の総動物飼料中の含有率を0.01〜50%までとして送達する工程と、を含み、
該ウイルス蛋白質の存在が、動物体内で、生きているウイルスと競合して感染を防止する方法である。
該ウイルス結合受容体を含むバイオマスを、最低限の精製を施して飼料または飼料栄養補給剤に処理する工程と、
処理された該バイオマスを動物に与え、該ウイルス結合ドメインの総動物飼料中の含有率を5%までとして送達する工程と、を含み、
該ウイルス結合ドメインの存在が、動物体内で、生きているウイルスの結合および感染を防止する方法である。
WSSV蛋白質VP19の遺伝子は、GenBankのデータベース(AF369029)から入手できる。プライマーを設計して、VP19蛋白質全体を増幅する。PCR/RT-PCRを行い、標準的方法(Sambrookら1989年)を用いてVP19遺伝子の遺伝子全体のみならず、その親水性ドメインをも増幅する。VP19遺伝子全長のクローニングは、pYES2-DES52 Saccharomyces cerevisiae発現系(Invitrogen, Inc.)を用いて行い、GAL1プロモーターを適用して、ガラクトース誘導下でウイルス遺伝子2個を同時に個別発現させる。形質転換体をPCRにより陽性クローンの配列解析を行ってスクリーニングし、原配列との同一性を確実にする。ウェスタンブロット検出法を用い、標準的方法(Sambrookら1989年)により、蛋白質の産生を検証する。
WSSV蛋白質VP26およびVP28のDNA遺伝子は、GenBankのデータベース(AF173992、AF173993)から入手できる。プライマーを設計して、VP26およびVP28蛋白質全体を増幅する。PCR/RT-PCRを行い、標準的方法(Sambrookら1989年)を用いてVP26およびVP28遺伝子の遺伝子全体のみならず、その親水性領域をも増幅する。VP26およびVP28遺伝子全長のクローニングは、Saccharomyces cerevisiae発現系pESC(Stratagene)を用いて行い、GAL1およびGAL10プロモーターを適用して、ガラクトース誘導下で2個のウイルス遺伝子を同時に個別発現させる。形質転換体をPCRにより選別し、陽性クローンの配列解析をして、原配列との同一性を確実にする。ウェスタンブロット検出法を用い、標準的方法(Sambrookら1989年)により、蛋白質の産生を検証する。
WSVコート蛋白質遺伝子に由来する蛋白質を含む組換え型Saccharomyces cerevisiae(実施例1および2の通り)を、エビに与える。これらの蛋白質は、WSV感染に必要とされるウイルス受容体を封鎖して、該動物に受動免疫を提供し、WSSV病からある程度保護するようである。該酵母菌を、完全な形態または破壊形態で、ポリマー状のアルギン酸塩および澱粉からなるビーズ中に微小結合した形にして、直接動物に与える。それに代えて、ポリアクチド(Bootlandら2002年)、カラギーン、アルギン酸塩およびキトサンのような微小結合形式を利用することもできる。標的種がビーズをより摂取しやすいように、誘引物質を加えることができる(エビの場合、オキアミ粉餌がよい代替誘引物質になるだろう)。WSSVに対する取り組みは、組換え酵母菌を与えられたエビの、ウイルス感染に対する生存率の向上に帰着する。
WSSV蛋白質VP26およびVP28の遺伝子は、実施例2の通り、GenBankのデータベース(AF173992、AF173993)から入手できる。VP26およびVP28蛋白質の親水的特徴を利用して、その親水性ドメインを特定する。pESC Saccharomyces cerevisiae発現系(Stratagene)を用いてPCR/RT-PCを行い、標準的方法(Sambrookら1989年)に従って、短縮型VP26およびVP28をクローニングした。この後、組換えクローンをPCRによりスクリーニングし、該クローンの配列解析を行って、原配列との同一性を確実にする。ウェスタンブロット分析により、WSVのVP26およびVP28抗体を用いて、組み換え蛋白質の産生を検定する。VP26抗体は入手可能であり(DiagXotics, Inc.、コネチカット州)、Immuno-Precise Antibodies(ビクトリア州、カナダ)に委託すればポリクローナル抗体として作製される。
Dharおよび同僚らは、エビのLGBP遺伝子のクローニングおよび配列解析を終えており、そのヌクレオチド配列は、GenBankのデータベース(AF473579)(Rouxら2002年)で入手できる。LGBPは、節足動物体内のプロフェノールオキシダーゼ(ProPO)カスケードの既知のエリシターである。ProPOカスケードは、十分にその特徴を知られている、無脊椎動物の防衛メカニズムの1つである。アミノ酸326個からなるオープン・リーディング・フレームをコードするLGBP遺伝子全体を、酵母菌発現系(pYES2.1 TOPO TA発現系、Invitrogen, Inc.)でクローニングする。多糖体のβ−1,3連鎖の推定結合部位と細胞付着結合ドメイン(RGDモチーフ)とを含む、短縮型LGBP遺伝子を、RT-PCRにより増幅し、酵母菌発現カセット(pYES2.1 TOPO TA発現系、Invitrogen, Inc.)にクローニングする。該結合領域から、組み換え蛋白質を作製し、実施例1の通りに、酵母菌発現系中で発現させる。
実施例5で作製した酵母菌を、微小結合形式(実施例3の通り)、または、直接低温押し出し成形によって飼料と混合する。その後、飼料をエビに与え、WSSVへのLGBPの結合、および、ProPOカスケードの活性化によって、WSSVによる感染から保護する。
魚ウイルスである感染性膵臓壊死ウイルスの、VP2カプシド蛋白質の遺伝子を、既存文献(YaoおよびVakharia1998年)に従ってクローニングする。該遺伝子を、大腸菌の蛋白質発現ベクターであるpTrcHisベクター(Invitrogen)にクローニングする。蛋白質を、Trcプロモーター(Trpプロモーターの1種)の後方で発現させ、細胞中で発現させる。IPTG(イソプロピル-1-β-D-ガラクトシド)またはその他のTrcプロモーター誘導物質によって誘導し、該遺伝子を含む細胞全体を採取する。組換え蛋白質の産生を、標準的方法と、本願発明者らの研究室が単離したIPNVに対してImmuno-Precise Antibodiesが産生した抗体とを用いて、ウェスタン分析により検証する(Sambrookら1989年)。
実施例7で作成した組換え細菌を、製剤化するか、カプセルに入れるか、または、そのまま、組換え蛋白質の最終濃度が100mg/kg未満になるように魚(雑種シマスズキまたはサケのような)に与える。VP2は、魚の消化管内で受容体への結合をめぐりウイルスと競合して、IPNV感染から保護する。
WSSVの受容体を発現させた組換え緑藻類(Chlorella vulgaris)を、確立された方法(Choiら2000年)を用いて産生する。細胞を、閉鎖型のフォトバイオリアクター内で光合成によって育てるか(Rebolloso-Fuentesら2001年、Lebeauら2002年)、従来型のファーメンターで培養する(Runningら1994年)。WSSVの大発生を経験しているエビに、組換え細胞をそのまま与え、該ウイルスによる受容体への結合を防止し、それによって疾病を防ぐ。
ヒト、陸生農業用動物(例えば乳牛、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ、ヤギ)、水生動物(例えば魚)および愛玩動物(例えばイヌ、ネコ)のような、より高度な免疫系を持つ動物は、抗体産生の誘導に先立つ大発生中の初期感染に対する保護として、実施例9または実施例1から3に記載した原始的免疫系の動物に対する方法と類似したやり方で保護することができる。感染に対する最初の対応として、ウイルス受容体、または、該受容体への結合を媒介するウイルス蛋白質を提供し、体が免疫系に反応し始めるまでの間、動物を保護することができる。
VP19およびVP28をコードする遺伝子を、pCNR/HUPベクターのNR-プロモーター(硝酸還元酵素)下流に該プロモーターに制御されるように連結し、形質転換プラスミドpCNR/HUP/VP19およびpCNR/HUP/VP28を生成する。これらのプラスミドを用いて、Particle bombardment procedure(Biolistics(登録商標))により、HUP(-)クロレラ(ヘキソース取り込みがない突然変異体)を形質転換し、形質転換体を、暗所にてブドウ糖上で培養(Allnuttら2000年)し選択する。形質転換コロニーを継代培養し、抗体および標準的技法(Sambrookら1989年)を用いて、ウェスタンブロット分析により、VP19およびVP28の産生を試験する。
タウラ症候群病は、タウラ症候群ウイルス(TSV)によって引き起こされ、西半球においてクルマエビ類に最も大きな影響を与えるウイルス性疾患の1つである(Hassonら1995年、Brockら1997年)。1992年エクアドルにおける該疾病の最初の報告以来、該疾病は、南北アメリカの13の異なる国において、また、近年は台湾において、報告されている(Hassonら1999年、Tuら1999年)。タウラ症候群病は、南北アメリカの養殖エビに破滅的損失をもたらしてきた(Brockら1997年)。
TSVカプシド蛋白質遺伝子の配列は、GenBankのデータベース(Accession No. AF277378(Robles-Sikisakaら2001年))で入手できる。4種類のカプシド蛋白質の各々にフランキングするプライマーを個別に設計する。出版されたプロトコル(Robles-Sikisakaら2001年)に従ってRT-PCRを行い、各カプシド遺伝子を増幅する。増幅されたcDNAのそれぞれを、別々に、細菌発現ベクターpQE-30UA(Qiagen, Inc.)にクローニングする。形質転換体をPCRによりスクリーニングし、陽性クローンの配列解析を行って、クローニングされたTSV遺伝子の同一性を確認する。カプシド蛋白質の発現を、大腸菌ML15セルライン中で、IPTG誘導下で実行する。TSVカプシド蛋白質の発現を、標準的方法(Sambrookら1989年)を用いてウェスタンブロット分析により確認する。
TS-VLPを含む組み換えSaccharomyces cerevisiaeをエビに与える。これらのVLPは、TSV感染に必要とされるウイルス受容体を封鎖し、これによって、動物に、TSVに対する受動免疫を与える。酵母菌を、完全な形態または破壊形態で、ポリマー状のアルギン酸塩および澱粉からなるビーズに微小結合させて、えびの飼料に取り込まれる。これに代わり、ポリアクチド(Bootlandら2002年)、カラギーン、アルギン酸塩およびキトサンのような微小結合形式を利用することもできる。オキアミ粉餌のような添加物を添加して、よりエビが好むものにする。感染性TSVによる攻撃よりも前に、TS-VLPを含む食餌をエビに与える。TS-VLPを含む食餌を与えられたエビは、TSV感染に対する生存率が向上した。
4種類の異なるTSVコート蛋白質を発現させた組換え大腸菌を混合した後、市販のエビ食餌と混合する。これらの蛋白質は、感染を開始するために必要とされるTSV受容体を封鎖し、これによって、動物に、TSVに対する受動免疫を与える。該大腸菌は、完全な形態または破壊形態で、ポリマー状のアルギン酸塩および澱粉からなるビーズに微小結合させて、そのままエビの食餌に取り込まれる。感染性TSVによる攻撃よりも前に、TSV組み換え蛋白質を含む食餌をエビに与える。TSV組み換え蛋白質を含む食餌を与えられたエビは、TSV感染に対する生存率が向上した。
4種類の個別TSVカプシド蛋白質を発現させた組み換え緑藻類(Chlorella vulgaris)を、確立された方法(Choiら2000年)を用いて産生する。該細胞を、閉鎖型のフォトバイオリアクターで光合成によって育てるか(Rebolloso-Fuentesら2001年、Lebeauら2002年)、または、従来型のファーメンターで培養する(Runningら1994年)。4種類の異なるTSVカプシド蛋白質を発現させた組み換え細胞を混合し、そのままエビに与え、その後で、感染性TSVよる攻撃を受けるようにする。TSVカプシド蛋白質を発現させた藻類を与えられたエビは、TSV感染を防止することができる。
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Claims (26)
- 甲殻類を白点症候群ウイルス(WSSV)またはタウラ症候群ウイルス(TSV)から保護するための方法であって、前記の方法が、
a. 組換え宿主細胞中で白点症候群ウイルス(WSSV)またはタウラ症候群ウイルス(TSV)由来の1種以上の疾病関連ウイルス蛋白質またはペプチドを産生すること、ここで、前記組換え宿主細胞は、前記疾病関連ウイルス蛋白質またはペプチドをコードする核酸で形質転換され、前記組換え宿主細胞は、前記組換え疾病関連ウイルス蛋白質またはペプチドを発現し、前記疾病関連ウイルス蛋白質またはペプチドは、VP19、VP28、VP26、VP24、TSVカプシド蛋白質、およびその切断された形態からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、
b. 前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドを含む前記形質転換された宿主細胞全体または破壊宿主細胞を含む飼料または飼料添加物を前記甲殻類に送達すること、ここで、前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドは、飼料を消費する前記甲殻類の消化管細胞中でWSSVまたはTSVによるウイルス受容体への結合を阻止または抑制する、を含む方法。 - 前記宿主細胞が細菌、藻類、酵母菌、真菌、昆虫、動物、植物および上記のいずれかの組織培養物から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が藻類である、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主細胞が酵母菌である、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主細胞が細菌である、請求項2に記載の方法。
- 前記発現された組換えウイルス疾病関連蛋白質またはペプチドが、1種以上の前記疾患関連ウイルス蛋白質またはペプチドを含む融合蛋白質である、請求項1に記載の方法。
- 前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドが白点症候群ウイルスの1以上のウイルス蛋白質またはペプチドの断片を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドが白点症候群ウイルス蛋白質VP26の1以上の断片を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドが白点症候群ウイルス蛋白質VP28の1以上の断片を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドが白点症候群ウイルス蛋白質VP19の1以上の断片を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドが白点症候群ウイルス蛋白質VP24の1以上の断片を含む、請求項7に記載の方法。
- 白点症候群ウイルス(WSSV)またはタウラ症候群ウイルス(TSV)由来の1種以上の発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドを含む形質転換された宿主細胞全体または破壊宿主細胞を含む、白点症候群ウイルス(WSSV)またはタウラ症候群ウイルス(TSV)に感受性の甲殻類への経口送達用飼料または飼料添加物であって、前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドは、甲殻類細胞での感染のためにWSSVまたはTSVによって使用される前記甲殻類の消化管細胞中のウイルス受容体に結合することができ、前記発現された組換えウイルス蛋白質またはペプチドは、VP19、VP28、VP26、VP24、TSVカプシド蛋白質からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、飼料または飼料添加物。
- 前記発現された組換え蛋白質またはペプチドが、前記ウイルス蛋白質またはペプチドの少なくとも一部分を含む、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記発現された組換え蛋白質またはペプチドが、白点症候群ウイルスのアミノ酸配列を含む、請求項13に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記発現された組換え蛋白質またはペプチドがVP24、VP28、VP26およびVP19の1つ以上から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項14に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記宿主細胞が細菌、藻類、酵母菌、真菌、昆虫、動物、植物、および上記のいずれかの組織培養物から選択される、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記宿主細胞が細菌、藻類、酵母菌、および真菌から選択される、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記甲殻類がエビである、請求項1に記載の方法。
- 前記甲殻類がエビである、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記藻類が緑藻類Chlorella vulgarisである、請求項2に記載の方法。
- 前記宿主細胞が藻類である、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記宿主細胞が酵母菌である、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記宿主細胞が細菌である、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記藻類が緑藻類Chlorella vulgarisである、請求項21に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記発現された組換えウイルス疾病関連蛋白質またはペプチドが1種以上の前記疾患関連ウイルス蛋白質またはペプチドを含む融合蛋白質である、請求項12に記載の飼料または飼料添加物。
- 前記酵母菌がSaccharomyces cerevisiaeである、請求項22に記載の飼料または飼料添加物。
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