KR100790801B1

KR100790801B1 - 동물용 불활화 백신의 제조방법

Info

Publication number: KR100790801B1
Application number: KR1020050060920A
Authority: KR
Inventors: 성환우; 이윤정; 최준구; 이은경; 권준헌; 김재홍
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-07-06
Filing date: 2005-07-06
Publication date: 2008-01-04
Also published as: KR20070005867A

Abstract

본 발명은 HA 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR을 가지며, 국내유행 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 방어능력을 나타내는 백신제조용 H9N2 혈청형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주를 제공한다. 상기 바이러스주를 백신제조용 원료로 사용하는 경우 양계산업에 있어 산란율 저하 및 폐사 등 지속적인 문제를 일으키는 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자 예방에 활용이 가능하다.

저병원성 조류인플루엔자, H9N2, 백신

Description

동물용 불활화 백신의 제조방법{Method for preparing inactivated vaccine for animals}

도 1은 저병원성 조류인플루엔자 H9N2 혈청형 바이러스(A/chicken/Korea/01310 /2001)의 방어 단백질(헴어굴루티닌; HA) 아미노산 서열

본 발명은 닭에서 급격한 산란율의 저하나 높은 폐사율을 기록하는 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 의한 질병을 효과적으로 예방할 수 있게 하는 동물용 불활화 백신의 제조방법에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 바이러스를 이루고 있는 뉴클레오캡시드(Nucleocapsid ; NP) 단백질 및 매트릭스(Matrix ; M) 단백질의 항원성의 차이에 따라 A형, B형, C형으로 분류하며, 조류에서는 A형 인플루엔자 바이러스만이 분리 보고되고 있다.

A형 인플루엔자 바이러스는 표면당단백질로 헴어글루티닌(Hemagglutinin; HA)과 뉴라미니데이즈(Neuraminidase; NA)를 가지고 있는데, 현재까지 분리된 A형 인플루엔자 바이러스의 경우 HA는 15종류, NA는 9종류의 혈청형이 보고되어 있으며, 이들의 조합에 따라 아형(subtype)으로 구분 되고, 따라서 다양한 혈청형의 인플루엔자 바이러스가 존재하게 된다.

교차면역반응은 서로 다른 아형의 인플루엔자 바이러스 사이에는 일어나지 않는다. 따라서 특정 아형의 인플루엔자 바이러스를 예방하기 위해서는 예방하고자 하는 인플루엔자 바이러스와 동일한 아형의 바이러스로 면역이 이루어져야 방어효과가 나타나게 된다.

A형 인플루엔자 바이러스의 게놈은 8개의 분절로 이루어진 단쇠 RNA로 구성되어 있는데, 서로 다른 A형 인플루엔자 바이러스의 혼합 감염에 의하여 8개의 분절로 이루어진 유전자의 조합이 가능하게 되어 끊임없이 새로운 바이러스들이 출현하게 되며, RNA 바이러스의 특성상 유전자 내의 변이가 비교적 높은 비율로 일어나게 되어 새로운 바이러스의 출현이 빈번한 특징을 갖는다.

따라서 조류인플루엔자 바이러스의 감염을 방어하기 위해서는 현재 유행하고 있는 바이러스와 같은 아형의 바이러스 중 유전적으로 근연도가 높은 바이러스를 백신으로 사용하여야 질병 방어 효과를 나타낼 수 있다.

인플루엔자 백신을 제조하기 위하여는 10∼11일령의 부화란에 바이러스를 주 입하여 바이러스를 증식시키고 여기에서 뇨막강액(allantoic fluid)을 채취한 후 이를 불활화 처리하여 적절한 부형제와 혼합하여 제조하게 된다. 중요한 점은 일정 정도 이상의 항원량이 접종되어야 감염을 예방할 수 있는 면역반응이 백신된 개체에 나타나게 되므로, 기준 함량 이상의 바이러스가 포함되도록 제조하여야 한다. 하지만 대부분의 인플루엔자 바이러스의 경우 종란을 이용한 증식에서 높은 역가로 자라지 못하는 생물학적 성상을 나타내므로 낮은 역가를 보이는 바이러스액을 농축시키는 과정을 거쳐 백신을 제조하여야 소기의 목적을 이룰 수 있으나, 이런 경우 백신의 단가는 높아지게 되므로 경제성에 문제가 생기게 된다. 따라서 이를 극복하기 위하여 고역가로 자랄 수 있는 인플루엔자 바이러스를 선발하거나 고역가로 자랄 수 있는 바이러스와의 재조합(Reassortment)을 통하여 면역원성은 유지되며 높은 역가로 자랄 수 있는 바이러스 선발이 중요한 관건으로 작용하게 된다.

1996년도에 우리나라에서 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자가 최초 발생한 이후 국립수의과학검역원의 통계에 따르면 1997 및 1998년에는 분리보고가 없었으나 1999년에서 2004년까지 연평균 15건 정도씩 지속적으로 발생되고 있으며 국내 계군의 30％ 이상이 H9 혈청형에 대하여 항체 양성반응을 보이고 있는 것으로 보고되고 있으며(대한수의학회지, 2004, 44권 3호 부록, 216p) 실제로 산란율 저하나 높은 폐사율을 보이는 등 양계산업에 상당한 피해를 입히고 있다.

하지만 국내에는 아직까지 H9 혈청형에 대한 조류인플루엔자 백신이 개발되어있지 못한 실정이며, 파키스탄이나 중국 등 몇몇 나라에서는 현재 H9형 조류인플루엔자 백신을 사용하고 있으나, 상기의 이유로 인한 다양한 성상을 갖는 인플루엔 자 바이러스 분리주 들의 출현을 생각할 때, 이들 백신이 국내 유행 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 효과적으로 방어할 수 있을지는 의문스럽다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술이 가지는 문제를 해결하기 위해 제안된 것으로, 본 발명의 목적은 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 우수한 방어효과를 나타내는 백신제조용 바이러스주를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 조류에서 급격한 산란율의 저하나 높은 폐사율을 기록하는 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자에 의한 질병을 효과적으로 예방할 수 있는 백신 및 이의 제조방법을 제공함에 있다.

본 발명은 혈구응집소(HA) 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR을 가지며, 국내유행 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 방어능력을 나타내는 백신제조용 H9 아형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 HA 단백질이 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 H9 아형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 바이러스가 서열번호 1의 단백질을 코딩하는 염기서열을 포함하는 H9 아형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주를 제공한다.

본 발명에 의하면 바람직하게는 상기 바이러스의 아형이 H9N2인 저병원성 조 류인플루엔자 바이러스주를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 특정병원체 부재 종란에 계대배양하여 고증식성의 생물학적 성상을 보이는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 저병원성 조류인플루엔자 H9 혈청형 바이러스를 불활화시켜 이를 유효성분으로 함유하는 동물용 불활화백신을 제공한다.

또한, 본 발명은 저병원성 조류인플루엔자 바이러스로부터 유래되며, 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR인 혈구응집소 단백질을 유효성분으로 함유하는 생물학적 제제를 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 서열번호 1기재의 단백질을 유효성분으로 함유하는 생물학적 제제를 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 저병원성 조류인플루엔자 바이러스로부터 유래되며, 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR인 혈구응집소 단백질을 코딩하는 염기서열을 유효성분으로 함유하는 생물학적 제제를 제공한다.

본 발명에 의하면 바람직하게는 서열번호 1기재의 단백질을 코딩하는 염기서열을 유효성분으로 함유하는 생물학적 제제를 제공한다.

본 발명은 바람직하게는 상기 생물학적 제제가 백신인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 HA 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR을 가지며, 국내유행 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 방어능력을 나타내는 H9 아형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 불활화하는 단계; 상기 불활화된 바이러스를 적당한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 저병원성 조류인플루엔자 H9 아형 바이러스의 백신제조방법을 제공한다.

본 발명은 상기 바이러스의 불활화단계 이전에 특정병원체 부재 종란에 상기 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 계대배양하는 단계를 더 포함하는 백신의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 상기 바이러스의 불활화 단계는 포르말린 또는/및 BEI로 처리하여 수행되어지는 백신의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면 상기 불활화 단계는 바람직하게는 상기 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 0.01M BEI로 30∼40℃에서 처리하는 과정에 의해 수행되어지는 것을 특징으로 하는 백신의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 의하면, 바람직하게는 상기 바이러스의 아형이 H9N2인 백신의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명의 내용을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명에 따른 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주는 H9 아형, 바람직하게는 H9N2 아형으로서, HA 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR의 아미노산 서열을 가지며, 국내유행 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 방어능력을 나타낸다. 상기 바이러스주는 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 배열을 가지는 혈구응집소 단백질을 가진다. 이때 상기에서 단백질 분절부위라 함은 저병원성 조류인플루엔자 H9 아형으로부터 유래된 것으로서, 단백질의 일차 구조중 트립신과 같은 단백질분해효소에 의해 절단되는 부위를 말하며, 구체적으로는 N-말단으로부터 335 ∼338에 위치하는 것으로 한다.

상기한 바와 같은 특징을 가지는 본 발명에 따른 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주를 이용하여 백신으로 제조하고자 하는 경우 감염을 방지하고자 하는 아형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스와 유전적인 근연도가 높고, 병원성이 높은 것으로부터 선발하는 것이 좋다. 이와 같은 조건을 만족하는 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 예로는 본 출원인에 의해 선별된 바 있는 H9N2 아형에 속하는 A/chicken/Korea/01310/2001(01310) 바이러스주를 들 수 있다. 상기 바이러스주의 HA 단백질은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 동 바이러스주는 현재 국립수의과학검역원 조류질병과에 보관되어 있다.

본 발명에 의하면 상기 저병원성 조류인플루엔자 H9N2 아형 바이러스주를 불활화시켜 이를 유효성분으로 함유하는 동물용 불활화백신을 제공한다. 이때, 본 발명에 따른 불활화 바이러스주를 얻기 위한 방법으로, 바람직하게는 포르말린 또는 BEI가 사용되어질 수 있으며, 보다 바람직하게는 상기 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 0.01M BEI로 30∼40℃에서 처리하는 과정에 의해 수행되어질 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 불활화 바이러스주 이외에도 H9 아형 바이러스주로부터 유래되며, 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR인 HA를 유효성분으로 함유하는 생물학적 제제를 제공한다. 이러한 생물학적 제제는 백신, 혈청검사용 항원 등일 수 있으며, 바람직하게는 동물용 백신이다. 상기 HA 단백질은 조류인플루엔자의 병원성과 관련되며, 독자적으로 백신제조용 항원으로도 제공될 수 있다(서브유닛 백신). HA 단백질은 바이러스로부터 직접 추출하거나, 유전자 재조합에 의해 대량으로 생산하는 것도 가능하다. HA 단백질을 직접 추출하고자 하는 경우에는 Gluck 등(Gluck R, Mischler R, Finkel B et al., Immuogenicity of new virosome influenza vaccine in elderly people. Lancet, 1994의;344:160-163) 또는 Gerentes 등(Gerentes L., kessler N., Thomas G. and Aymard M., Simultaneous purification of influenza haemagglutinin and neuraminidase proteins by immunochromatography, J. of Virol. Methods, 1996;58:155-165) 등의 방법에 의해 고수율로 획득할 수 있다. 한편, 유전자 재조합 기술을 이용하여 대량으로 생산하고자 하는 방법으로는 베큘로바이러스를 이용하는 방법(Lakey DL, Treanor JJ, Betts BF, et a. Recombinant baculovirus influenza A hemagglutinin vaccines are well tolerated and immunogenic in health adults. J. Infect. Dis. 1996;174:838-841, Olsen C.W., McGregor M.W., Dybdahl-Sissoko N., Schram B.R., Nelson K.M., Lunn D.P., Macklin M.D., Swain W.F., and Hinshaw V.S., Immunogenicity and efficacy of baculovirus-expressed and DNA-based equine influenza virus hemagglutinin vaccine in mice, Vaccine, 1997, 15(10):1149-1156) 등이 있다.

상기 HA 단백질의 구체적인 예가 도 1에 도시되어 있다 (서열번호 1). 도 1의 HA 단백질은 H9N2 아형의 조류인플루엔자 바이러스주인 A/chicken/Korea/01310/2001(01310)로부터 획득한 것으로 600개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 이중 분절부위의 아미노산은 N-말단으로부터 335∼338 위치의 TSGR을 가지고 있는 것을 확인할 수 있다.

상기 유전자 재조합에는 상기 HA 단백질을 코딩하는 유전자가 이용되어진다. 이때 HA 단백질을 코딩하는 유전자는 바이러스주에 따라, 혹은 재조합시 사용되는 숙주 환경에 따라 다양한 코돈용법(codon usage)이 적용될 수 있으므로 특정한 염기서열에 한정되지는 아니한다. 상기 HA 단백질을 코딩하는 유전자는 벡터에 삽입시켜 숙주(대장균, 효모 등)에 형질전환과정을 통해 도입되어질 수 있고, 이러한 형질전환체는 HA 단백질을 생산하는데 사용할 수 있으므로 본 발명에 따른 상기 유전자는 백신 제조용도의 생물학적 제제로서 제공되어질 수 있음을 시사한다.

또한, 본 발명은 HA 단백질 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR을 가지며, 국내유행 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 방어능력을 나타내는 H9 아형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 불활화하는 단계; 상기 불활화된 바이러스를 적당한 부형제와 혼합하는 단계를 포함하는 저병원성 조류인플루엔자 H9 아형 바이러스의 백신제조방법을 제공한다. 바람직하게는 상기 H9 아형은 H9N2을 포함한다.

상기 본 발명에 따라 불활화 처리된 바이러스주와 함께 혼합되어질 수 있는 부형제의 종류에는 특별한 한정을 요하지는 아니하며, Montanide ISA70(SEPPIC, France), 수산화알루미늄젤(Al(OH)₃-gel), Arlacel A special(ICI, USA), Freund's adjuvant 등이 사용되어질 수 있다.

상기 바이러스주를 이용하여 백신을 제조하는 경우, 바이러스를 불활화처리하는 단계 이전에 바람직하게는 높은 수준의 역가를 부여하기 위해 상기 저병원성 조류인플루엔자 바이러스를 특정 병원체 부재 종란에 계대배양하는 것이 좋다. 이 와 같이 하는 경우 별도로 역가를 높이기 위한 바이러스 농축과정이 불필요하다. 상기에서 특정 병원체 부재 종란이란 특정한 병원성 미생물에 감염되지 않은 것이 확인된 닭으로부터 생산된 유정란이다. 계대배양과정은 특별한 한정을 요하는 것은 아니지만, 9∼10일령의 특정병원체부재 부화란의 뇨막강(Allantoic Cavity)내로 바이러스를 주입하고 37℃에서 2∼3일간 배양후 뇨막강액을 채취하여 다시 위와 같은 절차를 반복하는 과정을 통해 수행되어질 수 있다.

상기와 같은 과정을 거쳐 제조되는 불활화 바이러스 백신은 동물에 투여시 면역원성을 유지하며 높은 역가를 발휘하게 된다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 바이러스주의 분리 및 병원성

바이러스의 분리는 A Laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens(American Association of Avian Pathologists, Rose Printing, 1998(4th Ed.)., pp150-155.)의 방법에 따라 수행하였다. 임상증상을 보이는 국내 사육 닭에서 기관, 맹장편도 등의 조직을 채취하여 멸균된 막자사발에 넣고 10％ 정도 비율이 되도록 항생제가 첨가된 인산완충용액(pH 7.2)을 첨가하여 유제하였다. 이를 1500 ×g정도에서 10분간 원심분리하여 상층액을 분리하였으며, 이를 특정병원체부재 부화란의 뇨막강에 0.2㎖의 양으로 접종한 후 37℃에서 4∼5일간 배양하며 계태아의 생존여부를 관찰하였다. 폐사한 부화란이나 5일간 배양에서도 폐사되지 않은 부화란은 4℃에서 최소 4시간 이상 방치한 후 뇨막강액을 채취하여 혈구응집 여부를 검사하였다. 혈구응집여부는 마이크로타이터 플레이트에 채취된 뇨막강액을 2진 희석한 후 동량의 1％ 닭혈구액을 가하여 확인하였다. 혈구응집을 일으키는 시료는 한천젤면역확산법(Agar Gel Immuno-Diffusion test)을 이용하여 A형 인플루엔자 바이러스 여부를 확인하였으며, 이렇게 확인된 A형 인플루엔자 바이러스는 HA 와 NA 아형 동정을 위하여 표준항혈청으로 혈구응집억제반응(Haemagglutinin Inhibition test) 및 뉴라미니데이즈억제반응(Neuraminidase Inhibition test)를 실시하였다.

백신주로 사용될 바이러스주를 선발하기 위하여 국내 사육 닭으로부터 분리된 인플루엔자 바이러스주들의 특성을 분석한 결과 표 1에서와 같이 년도별로 분리된 H9N2 혈청형 조류인플루엔자 바이러스는 모두 저병원성으로 확인이 되었다. 1996년부터 2003년도까지 우리나라에서 유행하였던 H9N2 혈청형의 저병원성 조류인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 분절부위 아미노산 배열을 분석한 결과, ASYR, ASGR, TSGR, ASVR, VSGR 등의 다양한 배열을 지니고 있었으며, 이중 TSGR/GLFG 의 아미노산 배열을 가진 유행주가 전체 25개 분리주 중 12주로 가장 많았으며, 2001년 이후 지속적으로 나타나고 있는 것을 확인할 수 있었다.(표 1 참조)

<표 1> 닭에서 분리된 H9N2 국내 분리주의 병원성 및 병원성 관련 유전자 비교

바이러스 분리년도	바이러스 수	닭에서의 병원성 (폐사수/접종수)	HA 단백질 분절부위 아미노산배열
바이러스 분리년도	바이러스 수	닭에서의 병원성 (폐사수/접종수)	HA1 -4-3-2-1	HA2 +1+2+3+4
1996	1	0/8	ASYR	GLFG
1999	5	0/8	ASGR	GLFG
2000	4	0/8	ASGR	GLFG
2000	1	0/8	ASVR	GLFG
2001	5	0/8	TSGR	GLFG
2002	6	0/8	TSGR	GLFG
2003	1	0/8	TSGR	GLFG
	1	0/8	ASGR	GLFG
	1	0/8	VSGR	GLFG
총계	25

국내 분리 H9N2 바이러스의 병원성 관련 HA 단백질 분절부위의 아미노산 배열 변화에 따른 바이러스의 병원성을 비교하고자 ASYR 모티프(motif)를 가진 국내 첫 저병원성 조류인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/MS96/1996(MS96)주, ASGR 모티프를 지닌 A/chicken/Korea/99029/1999(99029) 및 TSGR 모티프를 지닌 A/chicken/Korea/01310/2001(01310) 바이러스를 선발하여 특정병원체부재 닭에 각각 기관내로 접종한 결과 폐사는 모두 나타나지 않았다. 그러나 기관 및 분변에서의 바이러스 검출율을 비교한 결과 기관에서는 바이러스간 커다란 차이가 나타나지 않았으나 분변 검출율에서는 바이러스간 다소 차이가 있었다. 즉, 2001년 분리주인 01310 바이러스 접종군은 접종 3일, 5일 및 7일 후에 분변에서의 바이러스 분리율이 각각 37.5％, 62.5％ 및 50％로 1996년 분리주인 MS96 및 1999년 분리주 99029 보다 다소 높은 것으로 나타나 TSGR 모티프를 지닌 바이러스가 비교적 병원성이 높은 것을 확인하였다.(표 2 참조).

조류인플루엔자 바이러스에 대한 항체가 없는 것으로 확인된 12주령 육용계 를 대상으로 각각의 바이러스를 접종한 후 병원성을 비교하였다. 특정병원체부재 닭에서는 치사율이 관찰되지 않았으나 육용계에서는 일부 폐사가 관찰되었다. 이중 TSGR 모티프를 가지는 01310 바이러스의 경우 15수중 4수(26％)가 폐사하여 비교적 높은 병원성을 나타내었다.(표 3 참조) 일반적으로 조류인플루엔자 바이러스의 병원성은 어린 닭보다는 큰 닭에서, 산란계보다는 육용계에 감염시 병원성이 보다 높게 나타나는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서도 산란계인 SPF 닭에서는 전혀 폐사가 나타나지 않았으나 12주령 육용계에서는 폐사가 일부 관찰되는 차이점이 있었다.

<표 2> 특정병원체부재 닭에서의 H9N2 최근 분리주 증식성 비교

바이러스	바이러스 접종후 일별 바이러스 재분리 비교
	3		5		7		9
	기관	총배설강	기관	총배설강	기관	총배설강	기관	총배설강
MS96	8/8	1/8	5/8	1/8	0/8	2/8	0/8	0/8
99029	8/8	0/8	7/8	3/8	0/8	2/8	0/8	0/8
01310	8/8	3/8	6/8	5/8	0/8	4/8	0/8	0/8
None	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8	0/8

1) 7주령 특정병원체부재 닭에 기관내로 접종(마리당 MS96; 10^6.5 EID₅₀, 99029; 10^5.6EID₅₀, 01310 ; 10^7.1 EID₅₀)

2) 바이러스 재분리 개체수/접종 개체수

<표 3> 실용 육용계에서의 H9N2 바이러스간 병원성 비교

바이러스	폐사 개체수수/접종 개체수 (폐사율)
MS96	1/15(6.7％)
99029	1/15(6.7％)
01310	4/15(26.7％)
대조군	0/15(0)

* 12주령 육용계(로스)에 기관내로 접종 (마리당 MS96; 10^5.2 EID₅₀, 99029; 10^5.7 EID₅₀, 01310 ; 10^5.0 EID₅₀)

** 접종후 2주간 관찰

육용계에서 병원성이 가장 높았던 01310주를 조류인플루엔자 항체 음성인 실용 산란계에 접종하여 병원성을 조사하였다. 접종후 4주간 관찰한 결과 폐사율은 나타나지 않았다. 반면 산란율은 접종 1주후부터 감소하여 2주령때는 시험전 산란율에 비해 10.4％가 감소하였다(표 4).

<표 4> 실용 산란계에서의 H9N2 혈청형 최근 분리주의 병원성

접 종 바이러스	폐사율	주간 산란율
		공격접종 전	공격접종후
		공격접종 전	1주	2주	3주	4주
01310	0/30	78.0	72.9	67.6	80.4	79.5
무접종 대조군	0/30	70.0	71.0	73.3	74.2	74.2

* 60주령 실용 산란계(Hy-Line Brown)에 마리당 10^5.5EID₅₀로 기관내 접종

최근 H9N2 분리주의 유전자를 분석하여 국내 최초 분리주 및 외국 분리주들과의 뉴클레오타이드 상동성을 비교하였다. 최근 분리주들의 표면 항원 HA 유전자를 비교한 결과 2001년 분리주는 1999년 분리주와는 96.8％, 1996년 분리주와는 95.2％의 상동성을 보였고 H9N2 혈청형의 중국 분리주 및 홍콩 분리와는 83.7∼89.1％의 상동성을 보여 같은 H9N2형 저병원성 인플루엔자 바이러스 중에서 국내분 리주간의 상동성이 높은 것을 확인할 수 있었다.(표 5)

<표 5> 최근 분리주(Ck/Kor/01310/01(H9N2))와 다른 바이러스간의 뉴클레오타이드 상동성

유전자 바이러스	HA (1742bp)	NP (1565bp)	NA (1466bp)	M (1027bp)	NS (890bp)
Ck/kor/99029/99(H9N2)	96.8	97.6	-	96.7	97.4
Ck/Kor/MS96/96(H9N2)	95.2	93.2	96.5	97.2	-
Dk/HK/Y439/97(H9N2)	89.1	93.5	91.1	94.9	93.3
Dk/HK/Y280/97(H9N2)	83.7	89.4	88.2	92.0	91.3
Ck/Beij/1/94(H9N2)	85.1	90.2	89.5	92.3	92.2
Ck/HK/G9/97(H9N2)	84.4	89.8	88.5	92.3	91.1
Qa/HK/G1/97(H9N2)	84.7	92.3	87.1	92.1	91.3
A/HK/1073/99(H9N2)	85.0	92.3	87.4	92.1	91.5
A/HK/1074/99(H9N2)	85.0	92.3	87.1	92.6	91.5
A/HK/156/97(H5N1)	55.5	92.1	51.7	92.4	91.8

불활화 백신주 선발을 위하여 최근 분리주에 대한 항혈청을 제조하여 바이러스간의 혈청학적 관련성을 조사하였다. 교차 혈구응집억제반응에 의한 r 값을 조사한 결과 0.61∼0.90으로 분리 바이러스간 뚜렷한 차이는 인정되지 않아 국내분리주들 간의 혈청학적 관련성은 비교적 높은 것을 확인할 수 있었다.(표 6)

<표 6> 교차 혈구응집억제반응에 의한 분리주간 혈청학적 관련성

항혈청	바이러스
항혈청	MS96	99029	01310
MS96	169^(1.00)^*	60(0.73)	274(0.90)
99029	239	158(1.00)	181(0.61)
01310	274	181	549(1.00)

* 8수에 대한 평균 혈구응집억제 항체가

** r value, r=√(r1xr2)

r1 = heterogous titer with virus 2 / homologous titer with virus 1

r2 = heterogous titer with virus 1 / homologous titer with virus 2

위에서와 같은 방법으로 특정병원체부재 닭에 접종하였을 때는 병원성을 보 이지 않았으나, 실용 육용계 및 산란계에서 상대적으로 높은 병원성을 보이며, 유전적 근연도도 높고 혈청학적으로 크게 차이나지 않은 바이러스인 2001년도 국내분리 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 A/chicken/Korea/01310/2001주를 백신주로 선발하여 불활화 백신을 제조하기 위하여 우선 바이러스의 불활화 조건을 실험하여 보았다.

바이러스를 0.1％ 포르말린 및 0.01M BEI로 처리후 경과 시간별로 HA 역가변화 및 불활화 여부를 조사하였다. 0.1％ 포르말린으로 37℃에서 처리한 결과 1시간 이후부터 HA 역가가 4배 감소하였다. 반면 20℃에서 포르말린으로 처리한 경우에는 12시간 처리후에도 HA 역가 감소가 없는 것으로 나타났다. BEI를 이용한 불활화 처리시에는 조사된 24시간 범위내에서는 역가감소가 없는 것으로 나타났다 (표 7). 10^7.8 EID₅₀ 역가를 가지는 AIV를 20℃에서 포르말린으로 6시간 처리 이후부터 6시간 간격으로 회수하여 바이러스 생존여부를 조사한 결과 처리 6시간 이후부터 바이러스는 완전히 불활화 처리되는 것으로 확인되었다.

<표 7> 불활화제 처리전후의 바이러스 혈구응집 역가

처리방법	처리시간별 혈구응집역가
처리방법	처리전	1h	2h	6h	12h	24h	36h	48h	54h
0.1％ 포르말린 at 37℃	128	32	32	32	32	32	NT	NT	NT
0.1％ 포르말린 at 20℃	128	128	128	128	128	64	64	64	64
0.01M BEI at 37℃	128	128	128	128	128	128	NT	NT	NT

저병원성 조류인플루엔자 백신의 개발에 있어 현재 국내에서 유행하고 있는 H9N2 혈청형 바이러스와 유전적으로 근연도가 높은 바이러스주를 선발하여 이를 이 용하여 닭에서의 항체 형성능 및 방어능을 측정하여 본 결과 항원의 양을 늘려 숙주동물에 접종하였을 때 보다 높은 수준의 혈청내 항체가 생성됨을 확인할 수 있었으며, 방어능 또한 증가함을 확인하였다. 따라서 면역원성을 유지하며 높은 역가로 자랄 수 있는 바이러스를 얻고자 특정병원체부재 부화란을 이용하여 H9N2 혈청형 조류인플루엔자바이러스를 계대배양하여 백신주로 사용될 바이러스주를 선발하였다.

<실시예 2> 분리주를 이용한 백신의 제조 및 H9N2 혈청형 바이러스에 대한 시험 백신주의 방어능

2001년 분리주인 01310 바이러스를 128 HA 역가로 증폭하여 0.01M BEI(binary ethylenimine)로 37℃에서 6시간 처리하여 바이러스를 불활화 시킨 후 불활화 바이러스액 30％와 부형제로 Montanide ISA 70 (SEPPIC, France) 70％를 혼합하여 시험 백신을 제조하였다. 제조된 시험백신을 3주령 특정병원체부재 닭에 1회접종 혹은 6주령에 추가 접종하여 2주뒤 공격접종하여 바이러스 재분리 여부로 방어능을 조사하였다. 시험결과 혈구응집억제 항체가는 1회 접종군은 7.1±0.8, 2회 접종군은 8.2±0.4로 비교적 높게 생성되었다. 공격접종 후 폐장 및 분변에서 바이러스 재분리율을 조사한 결과 시험 백신 접종군은 폐장에서는 바이러스가 재분리 되지 않았으나 일부 개체의 분변에서는 바이러스가 재분리되어 완벽한 방어는 이루어지지 않았다. 그러나 폐장에서 바이러스가 재분리 되지 않은 것으로 보아, 국소 감염은 완벽하게 방어하지는 못하나 전신감염은 방어할 수 있는 것을 알 수 있었다.(표 8).

<표 8> 불활화 백신 접종후의 항체가 및 방어능

시험군	백신접종		항체가		장기별 공격접종 바이러스 재분리율
시험군	3주령	6주령	1차 백신 접종 3주후	2차 백신 접종 2주후	폐장	분변
1	-	-	0±0	0±0	7/10	6/10
2	+	-	7.0±0.8	7.1±0.8	0/10	1/10
3	+	+	6.9±1.2	8.2±0.4	0/10	2/10

* 2차백신 접종 2주후(8주령) 마리당 01310 바이러스를 10^6.0 EID₅₀씩 음수접종

** 각종 장기에서의 바이러스 재분리율은 공격접종 4일후 장기 채취하여 검사

<시험예 1> H9N2 혈청형 시험백신주의 항원함량에 따른 방어능 비교

128 HA 항원이 함유된 시험 백신과 1024 HA 항원이 함유된 시험 백신을 각각 면역시킨 후 3주후 같은 바이러스로 공격접종하여 공격접종 5일후 희생시켜 구강, 분변 및 폐장에서의 바이러스 재분리를 통하여 방어능을 비교하였다. 폐장에서는 두 시험군 모두에서 바이러스가 분리되지 않아 전신 감염을 방어한 것으로 판단되었다. 그러나 구강 및 분변에서는 바이러스 항원함량이 1024 HA인 시험군에서도 일부 개체에서 바이러스가 재분리되는 것으로 나타나 불활화백신 접종 후에는 분변 및 구강으로의 바이러스 배출방지는 완전하지 못한 것으로 나타났다. 다만 항원함량이 많을 경우에는 분변 및 구강으로의 바이러스 배출율이 감소하는 것으로 나타났다(표 9).

<표 9> H9N2 혈청형 시험 백신주의 항원함량에 따른 방어능 비교

시험군	백신접종 3주후 항체가(log2)	공격접종 5일후 바이러스 재분리율
시험군	백신접종 3주후 항체가(log2)	인후두	총배설강	폐
128 HA 항원	8.2±0.6	6/10	9/10	0/10
1024 HA 항원	8.8±0.4	1/10	3/10	0/10
비백신 대조군		10/10	10/10	7/10

* 01310으로 백신제조

** 백신접종 3주후 01310을 마리당 10^6.0 EID₅₀씩 음수접종

항원 함량을 늘렸을 경우 시험예에서 보는 바와 같이 혈청내 항체역가 및 바이러스 재분리율에서도 다소 높은 결과를 얻을 수 있었다. 높은 역가의 바이러스를 얻기 위하여 특정병원체부재 부화란(Lohman, Germany)을 이용하여 바이러스를 계대배양하여 바이러스 계대수에 따른 바이러스의 역가를 비교하여 본 결과, 표 10 에서와 같이 바이러스 계대수가 증가할수록 혈구응집역가 및 바이러스 역가도 증가하여, 5대 계대배양 바이러스보다 20대 계대배양 바이러스의 경우 약 10배 정도 역가차이를 기록하였다.

이는 5대 계대 바이러스주를 사용하여 20대 계대 바이러스주를 사용하였을 경우와 동등한 방어능을 갖기 위해서는 10배 농축 과정을 거쳐야 함을 뜻하는 것으로 20대 계대 바이러스주를 백신으로 이용할 경우 농축 과정 없이 바로 백신을 제조할 수 있으므로 경제적으로 백신을 제조할 수 있을 것으로 생각된다.

<표 10> 높은 증식성을 갖는 바이러스주의 선발을 위한 계대배양 바이러스주의 역가 비교

바이러스계대수	혈구응집 역가 (log₂)	바이러스역가 (log₁₀EID₅₀/0.1㎖)
CE5	7	7.5
CE7	8	NT
CE10	9	8.5
CE15	10	8.4
CE20	10	8.7

* NT : not tested

본 발명에 의한 저병원성 H9N2 혈청형의 바이러스주는 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 우수한 방어효과를 나타내며, 이를 이용한 백신은 닭에서 급격한 산란율의 저하나 높은 폐사율을 기록하는 등 지속적인 피해를 입히고 있는 H9N2 혈청형 저병원성 조류인플루엔자에 의한 질병을 효과적으로 예방할 수 있게 하여 양계산업에 큰 도움을 줄 수 있다.

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백신제조용 저병원성 조류인플루엔자 바이러스주로서, 서열번호 1의 아미노산을 코딩하는 염기서열을 포함하되, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 혈구응집소(HA) 단백질을 갖고, 상기 혈구응집소(HA) 단백질의 N-말단으로부터 335~338 위치의 분절부위 아미노산 배열의 모티프가 TSGR을 가지며, 국내유행 저병원성 조류인플루엔자 바이러스에 방어능력을 나타내고, 특정병원체 부재 종란에 20대 계대배양하여 10 (log2)의 혈구응집 역가와 8.7 (log10 EID50/0.1㎖)의 바이러스 역가를 가지며, 고증식성의 생물학적 성상을 보이는 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2) 바이러스를 20℃에서 0.1% 포르말린으로 처리하여 불활화하는 단계; 및

상기 불활화된 바이러스를 소정의 부형제와 혼합하는 단계; 를 포함하는 동물용 불활화 백신의 제조방법.
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