BR112016006326B1

BR112016006326B1 - Formulação seca de uma vacina, uso de uma formulação seca, método para fabricação de uma formulação seca de uma vacina estável em temperatura ambiente, e, vacina

Info

Publication number: BR112016006326B1
Application number: BR112016006326-0A
Authority: BR
Inventors: Zhisong Qiao; Kevin O'Connell
Original assignee: Intervet International B.V.
Priority date: 2013-09-27
Filing date: 2014-09-26
Publication date: 2022-12-13
Also published as: EP3049108B1; RU2020140649A; AR097762A1; WO2015044337A2; JP6896802B2; CN116920106A; ES2935172T3; CA2923362A1; EP3049108A2; JP2019196368A; EP3566716B1; ES2749197T5; CA2923362C; RU2016116254A3; RU2016116254A; CA3184048A1; AU2014326855B2; BR122019028014B1; WO2015044337A3; JP2016531859A

Abstract

FORMULAÇÃO SECA DE UMA VACINA, USO DE UMA FORMULAÇÃO SECA, MÉTODO PARA FABRICAÇÃO DE UMA FORMULAÇÃO SECA, E, VACINA. A presente invenção descreve formulações secas de vacinas estáveis em temperatura ambiente, que compreendem um vírus vivo atenuado, um estabilizador de açúcar e um estabilizador de aminoácido. A presente invenção também descreve a produção de tais vacinas e métodos de proteger um animal, pela administração de tais vacinas.

Description

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica prioridade sob 35 U.S.C. § 119(e) do pedido provisório U.S. No. de Série 61/883.661, depositado em 27 de setembro de 2013, cujo conteúdo é por este meio incorporado por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção pertence a formulações secas, estáveis em temperatura ambiente, de vacinas que compreendem um ou mais vírus vivos atenuados. A invenção também pertence à produção de tais formulações secas de vacinas e métodos de vacinação de indivíduos animais com as vacinas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Os vírus vivos atenuados são instáveis quando armazenados em temperatura ambiente por períodos de tempo estendidos. Portanto, a maioria das vacinas de vírus vivo atenuado são secadas por congelamento e refrigeradas antes do uso. Entretanto, o embarque e armazenagem de tais vacinas resultam em significativos custos extras, que devem ser passados para os dispensários de vacina, veterinários, manipuladores/fazendeiros de gados e, finalmente, para o proprietário ou consumidor de animal de estimação. Tais custos podem provar-se proibitivos em comunidades pobres e países do terceiro mundo. Portanto, WHO requer uma sobrevivência mínima de >20% após 18 dias a 37°C para a vacina de BCG humano [ver, por exemplo, Jin et al., Vaccine 29:4848-4852 (2011)].

[004] Há um número significativo de vírus que podem infectar os animais de companhia (tais como cães, gatos e cavalos) ou gado (tal como aves domésticas, gado vacum e suíno). Por exemplo, enquanto sintomas devidos às correspondentes infecções por vírus podem incluir sintomas semelhantes a resfriado suave, outros podem ser rapidamente fatais, como no caso de infecções por vírus da cinomose (VCC) [ver, por exemplo, US 2010/0196420]. Na realidade, o VCC aciona uma infecção multissistêmica, que pode envolver os sistemas ocular, respiratório, gastrointestinal, tegumentar e nervoso. A taxa de mortalidade pelos parvovírus canino (CPV) é também relativamente elevada [ver, por exemplo, US2009/0010955]. O CPV é principalmente um patógeno entérico que infecta cães, especialmente cães jovens, e é distinguida por diarreia aguda, febre e leucopenia em cães e filhotes com mais de 4 a 5 semanas de idade. Mesmo filhotes mais jovens podem sofrer doença do miocárdio. O vírus da cinomose canina e o parvovírus canino são os dois mais importantes vírus caninos de que se deve proteger os filhotes/cães.

[005] Os vírus caninos adicionais incluem: o vírus da parainfluenza canina (CPI), que é um vírus altamente contagioso, que provoca doenças respiratórias e traqueobronquite infecciosa; o adenovírus canino tipo 1 (CAV1), que resulta em hepatite infecciosa; e vírus da influenza (CIV), que é altamente contagioso e pode provocar um tipo severo de doença respiratória. O CIV tem sido relatado ser capaz de provocar 100% de infecção com 80% de morbidez e até 5 - 8% de mortalidade em infecções severas [Crawford et al., Science 310(5747): 482 - 485 (2005); US 7.959.929 B2]. Similarmente, há numerosos vírus felinos que afligem gatos, incluindo calicivírus felino (FCV), vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da panleucopenia felina (FLPV), coronavírus felino (FCoV) e vírus da rinotraqueíte felina (FVR).

[006] Há também um significativo número de vírus que podem infectar gado vacum. Tais vírus incluem vírus da diarreia viral bovina, tipos 1 e 2 (BVDV1 e BVDV2), vírus da rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR), parainfluenza tipo 3 (PI3), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV) e coronavírus respiratório bovino (BRCV). Além disso, há numerosas bactérias que podem infectar gado vacum também, incluindo Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni e Mycoplasma bovis.

[007] Similarmente, há um número significativo de vírus que podem infectar aves domésticas. Tais vírus incluem vírus da bronquite infecciosa (IBV), vírus da doença bursal infecciosa (IBDV), vírus da doença Newcastle (NDV), Laringotraqueíte infecciosa (ILTV), vírus da doença de Marek (MDV), Vírus do Herpes de Perus (HVT), que é também conhecido como MDV3, e metapneumovírus aviário (aMPV). Além disso, há numerosas bactérias que podem infectar também aves domésticas, incluindo Pasteurella multocida, Salmonella ssp., Escherichia coli, Mycoplasma ssp., Avibacterium paragallinarrum, Erysipelas spp., Campylobacer spp. Vibrio ssp., Clostridium perfringens e parasitas tais como Eimeria.

[008] Além disso, há numerosos vírus que podem infectar suínos. Tais vírus incluem vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (PRRS), circovírus suíno (PCV), vírus da gastrenterite transmissível (TGE), vírus da pseudorraiva suína, parvovírus suíno (PPV), vírus da influenza de suíno (SIV), rotavírus suíno (PRV) e vírus da diarreia epidêmica suína (PED). Além disso, há numerosas bactérias que podem infectar suínos também, incluindo Pasteurella multocida de múltiplos sorotipos, Salmonella sspo., Escherichia coli de múltiplos tipos pilus, Haemophilus parasuis, Lawsonia intracellularis, Mycoplasma ssp., Bordetella bronchiseptica, Erysipelas ssp., Campylobacter ssp., Actinbacillus pleuropneumonia, Clostridium perfringens e Clostridium difficile.

[009] É agora largamente aceito que a melhor maneira de evitar doença devida a infecções por vírus em um animal é vacinar esse animal contra estes vírus. Apenas como um exemplo, em cães, as vacinas de vírus da cinomose canina têm a prevalência da correspondente doença significativamente reduzida. Similarmente, a hepatite canina infecciosa foi extremamente limitada pelas vacinas do adenovírus-2 canino (CAV2). O uso de CAV2 vivo atenuado em vacinas em lugar de CAV1 estreitamente relacionado elimina preocupações referentes a nefrite intersticial e opacidade corneana observada em cães que foram inoculados com CAV1 vivo atenuado [Taguchi et al., Can Vet J. 52(9): 983-986 (2011)]. Além disso, as vacinas de vírus vivo atenuado multivalentes podem ser administradas com segurança, limitando o número de injeções de vacina requeridas. Por conseguinte, há diversas vacinas de vírus canino vivo atenuado multivalentes, comercialmente disponíveis, que protegem contra cinomose canina, hepatite infecciosa canina, parvovírus canino e parainfluenza vírus canino. Além disso, novas vacinas multivalentes protegem ainda contra o vírus da influenza canina também. Entretanto, permanece uma grande necessidade de vacinas de vírus vivo atenuado, tais como vacinas virais caninas, que podem ser embarcadas e armazenadas em temperatura ambiente.

[0010] A citação de qualquer referência aqui não deve ser interpretada como uma admissão de que tal referência é disponível como “técnica anterior” no presente pedido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] A fim de superar as deficiências das vacinas atuais, a presente invenção provê novas formulações secas estáveis de vacinas vivas atenuadas, por exemplo, vacina de vírus, que podem ser embarcadas e/ou armazenadas em temperatura ambiente, bem como suas correspondentes composições imunogênicas. Estas formulações secas permanecem eficazes a 27°C por períodos estendidos, tais como 12 meses, 18 meses ou mesmo mais (por exemplo, 1,5 a 3 anos).

[0012] Em certas modalidades, a vacina viva atenuada é uma vacina aviária. Em modalidades particulares deste tipo, a vacina aviária viva atenuada é uma vacina de aves domésticas compreendendo um vírus de aves domésticas vivo atenuado. Em modalidades mais particulares, a vacina de aves domésticas viva atenuada é uma vacina de galinha compreendendo um vírus de galinha vivo atenuado. Em uma modalidade alternativa deste tipo de vacina de aves domésticas viva atenuada é uma vacina de peru, compreendendo um vírus de peru vivo atenuado.

[0013] Em certas modalidades, a vacina viva atenuada é uma vacina de mamífero. Em modalidades particulares deste tipo, a vacina de mamífero viva atenuada é uma vacina humana, compreendendo um vírus humano vivo atenuado. Em outras tais modalidades, a vacina de mamífero viva atenuada é uma vacina bovina compreendendo um vírus bovino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina de mamífero viva atenuada é uma vacina suína, compreendendo um vírus suíno vivo atenuado.

[0014] Em ainda outras modalidades, a vacina de mamífero viva atenuada é uma vacina de animal de companhia. Em modalidades particulares deste tio, a vacina de animal de companhia viva atenuada é uma vacina canina. Em outras modalidades deste tipo, a vacina de animal de companhia viva atenuada é uma vacina felina. Em ainda outras modalidades, a vacina de animal de companhia viva atenuada é uma vacina de equino. Por conseguinte, em modalidades particulares, a vacina canina viva atenuada compreende um vírus canino vivo atenuado. Em outras modalidades, a vacina felina viva atenuada compreende uma vacina felina viva atenuada. Em ainda outras modalidades, a vacina de equino viva atenuada compreende um vírus de equino vivo atenuado.

[0015] Em outras modalidades, a vacina viva atenuada compreende um vírus recombinante. Em modalidades particulares deste tipo, o vírus recombinante é empregado como um vetor recombinante que codifica uma proteína heteróloga. Em modalidades mais particulares deste tipo, a proteína heteróloga é um antígeno viral ou bacteriano.

[0016] A presente invenção provê ainda métodos de produzir as formulações secas estáveis da presente invenção. A presente invenção provê ainda métodos de armazenar as vacinas da presente invenção antes do uso a 27°C por períodos estendidos, tais como 12 meses ou mais (por exemplo, 1,5 a 3 anos) como formulações secas estáveis.

[0017] A presente invenção também provê métodos de administrar a um animal as formulações secas estáveis da presente invenção. Em modalidades particulares, a formulação seca estável é reconstituída em uma vacina líquida antes da administração. A presente invenção provê ainda métodos se evitar uma doença em um animal (isto é, humano, animal de companhia ou animal de fazenda) através da administração da formulação seca (por exemplo, na forma de um pó) e/ou a vacina líquida reconstituída da presente invenção. Em modalidades particulares, o animal de companhia é um cão. Em modalidades relacionadas, o animal de companhia é um felino. Em ainda outras modalidades, o animal de companhia é um cavalo. Em ainda outras modalidades, o animal de fazenda é um bovino. Em ainda outras modalidades, o animal de fazenda é um suíno. Em ainda outras modalidades, o animal de fazenda é uma galinha. Em ainda outras modalidades, o animal de fazenda é um peru.

[0018] Por conseguinte, a presente invenção provê formulações secas de vacinas que são estáveis em temperatura ambiente, que compreendem um vírus vivo atenuado. Em modalidades particulares, as formulações secas da vacina compreendem um estabilizador do açúcar. Em modalidades relacionadas deste tipo, a vacina compreende 15% a 80% (p/p) de estabilizador de açúcar. Em modalidades particulares, as formulações secas da vacina compreendem 30% a 80% (p/p) de estabilizador de açúcar. Em outras modalidades particulares, a vacina compreende 40% a 8% (p/p) de estabilizador de açúcar. Em certas modalidades, a vacina compreende 25% a 50% (p/p) de estabilizador de açúcar. Em modalidades relacionadas, a vacina compreende 30% a 70% (p/p) de estabilizador de açúcar. Em modalidades mesmo mais particulares, a vacina compreende 40% a 60% (p/p) de estabilizador de açúcar.

[0019] Em certas modalidades, o estabilizador de açúcar é um oligossacarídeo não redutor. Em modalidades particulares deste tipo, o oligossacarídeo não redutor é sacarose. Em ainda outras modalidades, oligossacarídeo não redutor é rafinose. Em outras modalidades, o estabilizador de açúcar é um álcool de açúcar. Em uma modalidade particular deste tipo, o álcool de açúcar é sorbitol. Em outras modalidades, o álcool de açúcar é xilitol. Em ainda outras modalidades, o álcool de açúcar é maltitol.

[0020] Em modalidades alternativas, o estabilizador de açúcar é realmente uma combinação de dois ou mais estabilizadores de açúcar. Em modalidades particulares deste tipo, o estabilizador de açúcar é uma combinação de sacarose e trealose. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de açúcar é uma combinação de trealose e sorbitol. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de açúcar é uma combinação de sacarose, trealose e sorbitol.

[0021] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção podem ainda compreender um ou mais estabilizadores de volume. Em modalidades particulares, a quantidade de estabilizadores de volume nas vacinas é de 1% a 6% (p/v) na forma de líquido da vacina e 2% a 25% (p/p) na formulação seca. Em certas modalidades, o estabilizador de volume é manitol. Em modalidades relacionadas, o estabilizador de volume é glicina. Em modalidades particulares, o estabilizador de volume é dextrano. Em certas modalidades, o estabilizador de volume é maltodextrina. Em modalidades particulares, o estabilizador de volume é dextrose. Em certas outras modalidades, o estabilizador de volume é polivinilpirrolidona. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de volume é hidroxietilo de amido. Em ainda outras modalidades, as vacinas compreendem uma combinação de estabilizadores de volume. Em certas modalidades, o estabilizador de volume compreende dois ou mais dos seguintes: dextrano, manitol, glicina, matodextrina, polivinilpirrolidona e hidroxietilo de amido. Em modalidades particulares deste tipo, o estabilizador de volume compreende manitol e glicina. Em modalidades relacionadas, o estabilizador de volume compreende dextrano e glicina. Em ainda outras modalidades deste tipo, o estabilizador de volume compreende manitol, dextrano e glicina.

[0022] Em modalidades particulares, o estabilizador de proteína é gelatina. Em outras modalidades, o estabilizador de proteína é um hidrolisado de caseína integral. Em modalidades particulares, o hidrolisado da caseína integral é um hidrolisado proteolítico de caseína integral. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de proteína é uma combinação de tanto gelatina como um hidrolisado proteolítico de caseína integral.

[0023] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção podem variar em pH de pH 5,5 a pH 8,5. Em modalidades particulares, a faixa de pH é de pH 6,5 a pH 7,8. Em modalidades particulares, a faixa de pH é de pH 6,8 a pH 7,5. Em outras modalidades, a faixa de pH é de pH 6,0 a pH 7,6. Em ainda outras modalidades, a faixa de pH é de pH 6,0 a pH 6,8. Em ainda outras modalidades particulares, a faixa de pH é de pH 7,0 a pH 7,4. Em modalidades mais particulares, o pH é pH 7,2. Em outras modalidades mais particulares, o pH é pH 6,5.

[0024] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção podem compreender um tampão. Em uma modalidade particular deste tipo, o tampão compreende 0,1% a 2% (p/p) de histidina (2,5 a 50 mM antes da secagem). Em uma modalidade particular, o tampão compreende 0,25% a 0,75% (p/p) de histidina. Em modalidades mais particulares, o tampão compreende 0,5% (p/p) de histidina.

[0025] Em outras modalidades, o tampão compreende 0,1% a 2% (p/p) de fosfato (fosfato de sódio, fosfato de potássio ou uma mistura dos dois; 2,5 a 50 mM antes da secagem). Em modalidades relacionadas, o tampão compreende 0,2% a 1% (p/p) de fosfato. Em modalidades particulares, o tampão compreende 0,25% a 0,75% (p/p) de fosfato. Em modalidades mais específicas, o tampão compreende 0,5% (w/w) de fosfato.

[0026] Em ainda outras modalidades, o tampão pode compreender 2,5 a 50 mM Tris. Em modalidades particulares, o tampão compreende 2,5 a 50 mM Tris e 2,5 a 50 mM histidina. Em modalidades mais particulares, o tampão compreende 5 a 20 mM Tris e 5 a 20 mM histidina. Em modalidades ainda mais particulares, o tampão compreende 7,5 a 15 mM Tris e 7,5 a 15 mM histidina.

[0027] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção também podem compreender um estabilizador de aminoácido. Em modalidades particulares, o estabilizador de aminoácido é arginina. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de aminoácido é ácido aspártico. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de aminoácido é lisina. Em modalidades relacionadas, as formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção compreendem dois ou mais estabilizadores de aminoácidos. Em uma modalidade particular deste tipo, o estabilizador de aminoácido é arginina e glutamato.

[0028] Em certas modalidades, a concentração do estabilizador de aminoácido na vacina é 0,1 - 0,4 M na formulação líquida [10% - 40% (p/p) na formulação seca]. Em modalidades particulares, a concentração do estabilizador de aminoácido na vacina é de 0,25 - 0,35 M na formulação líquida. Em modalidades mais particulares, a concentração do estabilizador de aminoácido na vacina é de 0,25 - 0,35 M na formulação líquida. Em modalidades mesmo mais particulares, o estabilizador de aminoácido é 0,3 M arginina na formulação líquida.

[0029] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente, das vacinas da presente invenção, também podem compreender um estabilizador de proteína. O estabilizador de proteína pode ser uma proteína intacta e/ou um hidrolisado de proteína. Em modalidades particulares, a proteína estabilizadora é gelatina. Em modalidades alternativas, o estabilizador de proteína é um hidrolisado de caseína integral. Em certas modalidades, o hidrolisado de caseína integral é um hidrolisado proteolítico de caseína integral. Em modalidades particulares, a formulação seca compreende 2% a 20% (p/p) do estabilizador de proteína. Em outras modalidades particulares, o estabilizador de proteína compreende 1% a 10% (p/p) de gelatina. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de proteína compreende 1% a 10% (p/p) de um hidrolisado de caseína integral.

[0030] As formulações secas de vacinas da presente invenção também podem compreender um estabilizador de proteína que inclui tanto gelatina como um hidrolisado de caseína integral. Em modalidades particulares deste tipo, o estabilizador de proteína compreende 1% a 10% (p/p) de gelatina e 1% a 10% (p/p) de um hidrolisado de caseína integral. Em modalidades mais particulares, o estabilizador de proteína compreende 2% a 5% (p/p) de gelatina e 2% a 6% (p/p) de um hidrolisado de caseína integral. Em outras modalidades particulares, o estabilizador de proteína compreende 0,4% a 3,0% de gelatina (p/p) e 0,5% a 3,0% (p/p) de um hidrolisado de caseína integral. Em modalidades específicas, o estabilizador de proteína compreende 2,3% (p/p) de gelatina e 2,8% (p/p) de um hidrolisado de caseína integral. Em outras modalidades específicas, o estabilizador de proteína compreende 3,5% (p/p) gelatina e 4,2% (p/p) de um hidrolisado de caseína integral.

[0031] Qualquer uma das formulações secas da presente invenção pode ainda compreender 0,02% a 1% (p/p) de um sal de um cátion divalente. Em modalidades particulares, o cátion divalente é 1 mM - 5 mM na forma líquida e 0,1% - 0,5% (p/p) na formulação seca. Em certas modalidades, o cátion divalente é magnésio (Mg++). Em outras modalidades, o cátion divalente é cálcio (Ca++). Em ainda outras modalidades, o cátion divalente é zinco (Zn++). Em ainda outras modalidades, o cátion divalente é uma mistura de Mg++, e/ou Ca++ e/ou Zn++.

[0032] Qualquer uma das formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção pode ainda compreender um ou mais osmólitos. Em modalidades particulares, o osmólito é ectoína. Em outras modalidades particulares, o osmólito é hidroxiectoína. Em ainda outras modalidades, o osmólito é uma combinação de ectoína e hidroxiectoína. Em modalidades particulares, a percentagem do osmólito na formulação é de 0,2% a 7,5% (p/p). Em modalidades mais particulares, a percentagem do osmólito na formulação é de 0,5% a 5% (p/p). Em modalidades ainda mais particulares, a percentagem do osmólito da formulação é de 1% a 35 (p/p).

[0033] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção podem compreender um vírus vivo atenuado. Em um aspecto da presente invenção, o vírus vivo atenuado é um vírus canino. Em uma modalidade relacionada, o vírus vivo atenuado é um vírus felino. Em outra modalidade, o vírus vivo atenuado é um vírus de equino.

[0034] Em ainda outro aspecto da presente invenção, o vírus vivo atenuado é um vírus de animal de fazenda, por exemplo, vírus de animal alimento. Em uma tal modalidade, o vírus vivo atenuado é um vírus de aves domésticas. Em modalidades particulares deste tipo, o vírus de aves domésticas é um vírus de galinha. Em outras modalidades deste tipo, o vírus de aves domésticas é um vírus de peru. Em outras tais modalidades, o vírus vivo atenuado é um vírus de bovino. Em ainda outras modalidades, o vírus vivo atenuado é um vírus suíno.

[0035] Em certas modalidades, o vírus vivo atenuado é vírus da cinomose (VCC). Em outras modalidades, o vírus vivo atenuado é adenovírus. Em ainda outras modalidades, o vírus vivo atenuado é um parvovírus. Em ainda outras modalidades, o vírus vivo atenuado é um parvovírus. Em ainda outras modalidades o vírus vivo atenuado é o vírus da parainfluenza (CPI). Em ainda outras modalidades, o vírus vivo atenuado é um vírus da influenza.

[0036] Em ainda outro aspecto da presente invenção, o vírus vivo atenuado é um vírus canino. Em certas modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus da cinomose canina (VCC). Em outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o adenovírus canino tipo 2 (CAV2). Em ainda outras modalidades, O vírus canino vivo atenuado é parvovírus canino (CPV). Em uma modalidade particular deste tipo, o parvovírus canino é um parvovírus canino 2 (CPV-2). Em outra modalidade particular deste tipo, o parvovírus canino é um parvovírus canino 2a (CPV-2a). Em ainda outra modalidade particular deste tipo, o parvovírus canino é um parvovírus canino 2b (CPV-2b). Em ainda outra modalidade particular deste tipo, o parvovírus canino é um parvovírus canino 2c (CPV-2c). Em uma modalidade específica deste tipo, o CPV-2c é acessão ATCC No. PTA-13492. Em ainda outra modalidade, o parvovírus canino é um parvovírus canino recombinante, que foi construído para compreender um genoma CPV-2C/CPV-2 heterogêneo, isto é, a região codificando as proteínas capsídeas é de um isolado CPV-2c e a região codificando as proteínas não construcionais é de um isolado CPV-2 [ver U.S. 2012/0328652 A1, cujo conteúdo é por este meio incorporado por referência em sua totalidade, em que a sequência de nucleotídeo codificando a proteína capsídea do genoma CPV-2 foi substituída pela sequência de nucleotídeo codificando a proteína capsídea de um CPV-2c, desse modo resultando no genoma CPV-2C/CPV-2 heterogêneo]. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é vírus da parainfluenza (CPI).

[0037] A presente invenção também inclui vetores de vírus recombinantes. Em modalidades particulares, o vetor do vírus recombinante é um vetor do vírus da parainfluenza recombinante. Em certas modalidades, o vetor do vírus da parainfluenza recombinante é um vetor do vírus da parainfluenza canina recombinante. Em modalidades particulares, o vírus da parainfluenza recombinante (por exemplo, um vetor do vírus da parainfluenza canina recombinante) codifica e expressa uma proteína heteróloga. Em certas modalidades deste tipo, a proteína heteróloga é um antígeno não canino. Em modalidades mais particulares, o antígeno não canino é um antígeno viral de ave doméstica ou bacteriano de ave doméstica. Em outras modalidades, o antígeno não canino é um antígeno viral suíno ou bacteriano suíno. Em ainda outras modalidades, o antígeno não canino é um antígeno viral bovino ou bacteriano bovino. Em ainda outras modalidades, o antígeno não canino é um antígeno viral felino ou bacteriano felino. Em certas modalidades, o vírus da parainfluenza recombinante é um Vírus da parainfluenza recombinante 5.

[0038] Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é coronavírus canino. Em outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é pneumovírus canino. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é vírus da hepatite canina infecciosa. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é vírus de herpes canino. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é vírus da raiva. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é o vírus diminuto canino. Em ainda outras modalidades, o vírus canino vivo atenuado é vírus da influenza canina. Em modalidades alternativas, o vírus vivo atenuado é vírus de pseudorraiva.

[0039] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção podem compreender um vírus felino vivo atenuado. Em certas modalidades, o vírus felino vivo atenuado é herpesvírus felino (FHV). Em outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é calicivírus felino (FCV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é pneumovírus felino (FPN). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é parvovírus felino (FPV). Em ainda outras modalidades, O vírus felino vivo atenuado é vírus da leucemia felina (FeLV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é vírus da peritonite infecciosa felina (PIF). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da imunodeficiência felina (FIV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da doença de Borna (BDV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é vírus da influenza felina. Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é o vírus da panleucopenia felina (FPLV). Em ainda outras modalidades, O vírus felino vivo atenuado é coronavírus felino (FECV). Em ainda outras modalidades, o vírus felino vivo atenuado é vírus da rinotraqueíte viral felina (FVR).

[0040] Além disso, a presente invenção provê formulações secas estáveis em temperatura ambiente de vacinas que são vacinas multivalentes. Em modalidades particulares, as vacinas multivalentes da presente invenção compreendem somente vacinas de vírus vivo atenuado. Tais vacinas multivalentes podem conter qualquer combinação de vírus vivos atenuados. Em modalidades particulares deste tipo, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado e parvovírus canino vivo atenuado. Em modalidades relacionadas, vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado tipo 2. Em outras modalidades, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, parvovírus canino vivo atenuado e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, parvovírus canino vivo atenuado e adenovírus canino vivo atenuado tipo 2. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado e adenovírus canino vivo atenuado tipo 2. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, parvovírus canino vivo atenuado, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado e adenovírus canino vivo atenuado tipo 2. Em modalidades particulares, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, parvovírus canino vivo atenuado, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado, adenovírus canino vivo atenuado tipo 2 e coronavírus canino vivo atenuado. Em modalidades relacionadas, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, parvovírus canino vivo atenuado, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado, adenovírus canino vivo atenuado tipo 2 e coronavírus felino vivo atenuado. Em modalidades particulares deste tipo, a vacina multivalente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, adenovírus canino vivo atenuado tipo 2, parvovírus canino vivo atenuado, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado, e vírus da influenza canina vivo atenuado.

[0041] Em outras modalidades, a presente invenção provê formulações secas estáveis em temperatura ambiente de vacinas multivalentes, que compreendem adenovírus vivo atenuado tipo 2 e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende adenovírus canino vivo atenuado tipo 2 e parvovírus canino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende parvovírus canino vivo atenuado e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende adenovírus canino vivo atenuado tipo 2, parvovírus canino vivo atenuado, e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em modalidades particulares deste tipo, a vacina multivalente compreende adenovírus canino vivo atenuado tipo 2, parvovírus canino vivo atenuado, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado e vírus da influenza canina vivo atenuado.

[0042] Em outras modalidades, a presente invenção provê formulações secas estáveis em temperatura ambiente de vacinas multivalentes, que compreendem adenovírus canino vivo atenuado tipo 2 e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende adenovírus canino vivo atenuado tipo 2 e parvovírus canino vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende parvovírus canino vivo atenuado e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina multivalente compreende adenovírus canino vivo atenuado tipo 2, parvovírus canino vivo atenuado e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em modalidades particulares deste tipo, a vacina multivalente compreende adenovírus canino vivo atenuado tipo 2, parvovírus canino vivo atenuado, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado e vírus da influenza canina vivo atenuado.

[0043] Em qualquer uma das modalidades acima mencionadas, o vírus canino vivo atenuado pode ser um vetor de vírus recombinante. Em modalidades particulares, o vetor de vírus recombinante é um vetor do vírus da parainfluenza canina recombinante. Em modalidades particulares deste tipo, o vetor do vírus da parainfluenza canina recombinante codifica e expressa um antígeno heterólogo. Em outras modalidades específicas, as formulações secas de uma vacina multivalente, que compreendem um parvovírus canino (CPV) pode ainda compreender 0,5% a 5% (p/p) de sorbitol.

[0044] Em modalidades particulares, o título de um vírus vivo atenuado das formulações secas de uma vacina (ou de cada um dos vírus de uma vacina multivalente) da presente invenção é 1 X 103 a 1 X 1010. Em modalidades mais particulares, o título é 1 X 104 a 1 X 109. Em ainda outras modalidades mais particulares, o título é 5 X 104 a 1 X 108.

[0045] Por conseguinte, a presente invenção provê formulações secas de uma vacina que compreende um vírus vivo atenuado (por exemplo, vírus canino, ou vírus felino, ou vírus de equino ou vírus suíno, ou vírus bovino, ou vírus de aves domésticas), 30% a 80% (p/p) de um oligossacarídeo não redutor, 6% a 40% (p/p) de um estabilizador de aminoácido, 2% a 20% (p/p) de um estabilizador de proteína e um tampão tendo um pH de 6,0 a 8,0. Em modalidades particulares, as formulações secas permanecem eficazes por pelo menos 18 meses a 27oC. Em modalidades relacionadas, as formulações secas compreendem ainda 2% a 25% (p/p) de um estabilizador de volume. Em modalidades particulares deste tipo, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor e/ou álcool de açúcar é de 0,025 a0,60. Em modalidades mais particulares, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor e/ou álcool de açúcar é de 0,05 a0,40. Em modalidades ainda mais particulares, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor e/ou álcool de açúcar é de 0,075 a 0,30. Em modalidades mesmo mais particulares, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor e/ou álcool de açúcar é de 0,1 a 0,25.

[0046] Em modalidades particulares, um oligossacarídeo não redutor de uma formulação seca de uma vacina da presente invenção compreende sacarose e/ou trealose e/ou rafinose. Em certas modalidades deste tipo, o pH da formulação seca é pH 6,0 a 7,6. Em modalidades particulares da presente invenção, o estabilizador de volume é manitol. Em modalidades relacionadas, o estabilizador de aminoácido é arginina. Em certas modalidades deste tipo, o estabilizador de aminoácido compreende adicionalmente glutamato.

[0047] Em modalidades específicas, a formulação seca de uma vacina da presente invenção compreende uma combinação de 20% a 80% (p/p) de sacarose e 18% a 66% (p/p) de trealose como o oligossacarídeo não redutor, 5% a 20% (p/p) de manitol como o estabilizador de volume, 9% a 34% (p/p) de estabilizador de aminoácido, uma combinação de 2% a 5% (p/p) de gelatina e 2% a 6% (p/p) de um hidrolisado proteolítico de caseína integral como o estabilizador de proteína, e um tampão em pH 6,2 a 7,5. Em modalidades particulares deste tipo, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor é de 0,08 a 0,37.

[0048] Em modalidades mais específicas, o oligossacarídeo não redutor é uma combinação de 45% a 60% (p/p) de sacarose e 15% a 25% (p/p) de trealose, o estabilizador de volume é 5% a 17% (p/p) de manitol, o estabilizador de aminoácido é 10% a 25% (p/p) de arginina; o estabilizador de proteína compreende 1,5% a 3,5% (p/p) de gelatina e 2% a 4% (p/p) de um hidrolisado proteolítico de caseína integral e um tampão em pH 6,2 a 7,5. Em modalidades particulares deste tipo, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor é de 0,l a 0,3.

[0049] Em certas modalidades, a formulação seca de uma vacina canina da presente invenção compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado (VCC), adenovírus canino tipo 2 (CAV2) e vírus da parainfluenza canina (CPI), uma combinação de 15% a 80% (p/p) de sacarose e 15% a 80% (p/p) de trealose como o oligossacarídeo não redutor, com a quantidade combinada de sacarose e trealose sendo 30% a 80% (p/p); 2% a 25% (p/p) de manitol como o estabilizador de volume, com a relação do estabilizador de volume total para o oligossacarídeo não redutor total sendo uma combinação de 1% a 10% (p/p) de gelatina com 1% a 10% ((p/p) de um hidrolisado proteolítico de caseína integral; 6% a 40% ((p/p) de arginina como o estabilizador de aminoácido; e um tampão em pH 6,2 a 7,5. Em modalidades específicas deste tipo, a formulação seca compreende adicionalmente um ou mais, ou todos dos seguintes: (i) 0,5% a 5,0% de ecotoína, (ii) 5% a 15% de glutamato, (iii) 0,02% a 1% de MgSO4 e (iv) de parvovírus canino vivo atenuado (CPV) COM 2% a 5% de sorbitol. Em modalidades mais específicas, o tampão é 0,1% a 2% de fosfato de potássio ou sódio, pH 6,2 a 7,5.

[0050] Em modalidades mais particulares, a formulação seca de uma vacina canina da presente invenção compreende VCC, CAV2 e CPI vivos atenuados; uma combinação de 20% a 80% (p/p) de sacarose e 18% a 66% (p/p) de trealose como oligossacarídeo não redutor, com a quantidade combinada de sacarose e trealose sendo de 45% a 79% (p/p), 5% a 17% (p/p) de manitol como o estabilizador de volume, com a relação do estabilizador de volume total para o oligossacarídeo não redutor total sendo de 0,08 a 0,37; o estabilizador de proteína sendo uma combinação de 2% a 5% (p/p) de gelatina com 2% a 6% (p/p) de um hidrolisado proteolítico de caseína integral; o estabilizador de aminoácido sendo de 9% a 34% (p/p) de arginina; e um tampão em pH 6,5 a 7,2.

[0051] Em modalidades específicas deste tipo, a formulação seca compreende adicionalmente um ou mais ou todos dos seguintes: (i) 1% a 3% de ecotoína, (ii) 7% a 11% de glutamato, (iii) 0,05% a 0,5% de MgSO4 e (iv) CPV atenuado vivo com 3% a 4% de sorbitol. Em modalidades específicas, o tampão é 0,2% a 1% de fosfato de potássio ou sódio, pH 6,5 a7,2. Em certas modalidades destes tipos, a formulação seca da vacina permanece eficaz por pelo menos 18 meses a 27oC.

[0052] Em modalidades mais particulares, a presente invenção provê formulações secas de vacinas que compreendem um parvovírus vivo atenuado, por exemplo, CPV, 23% a 49% (p/p) de um álcool de açúcar, 16% a 50% (p/p) de um estabilizador de volume, 7% a 36% (p/p) de um estabilizador de proteína e um tampão tendo um pH de 7,0 a 7,4. Em modalidades mesmo mais particulares deste tipo, a formulação seca compreende adicionalmente 25% a 36% (p/p) de um estabilizador de aminoácido. Em certas modalidades, a formulação seca da vacina permanece eficaz por pelo menos 18 meses a 27oC.

[0053] O álcool de açúcar das formulações secas destas vacinas de parvovírus monovalentes, por exemplo, vacinas CPV monovalentes, podem ser sorbitol, manitol, xilitol, maltitol e suas combinações, o estabilizador de volume podendo ser dextrano, maltodextrina, polivinilpirrolidona, hidroxietilo de amido, glicina ou qualquer combinação dos mesmos. O estabilizador de proteína pode ser gelatina, um hidrolisado de caseína integral ou uma combinação dos dois. Em certas modalidades deste tipo, o hidrolisado da caseína integral é um hidrolisado proteolítico de caseína integral. Em modalidades particulares, o álcool de açúcar é sorbitol, o estabilizador de volume é uma combinação de dextrano e glicina e o estabilizador de proteína é uma combinação de gelatina e hidrolisado proteolítico de caseína integral.

[0054] Em modalidades mais particulares, a presente invenção provê formulações secas de vacinas que compreendem um parvovírus vivo atenuado, por exemplo, CPV, 10% a 80% de sorbitol como o álcool de açúcar, uma combinação de 5% a 30% (p/p) de glicina e 5% a 40% (p/p) de dextrano como o estabilizador de volume, uma combinação de 2% a 25% (p/p) de gelatina com 2% a 25% (p/p) de um hidrolisado proteolítico de caseína integral como o estabilizador de proteína, e um tampão tendo um pH de 6,5 a 7,8. Em certas modalidades deste tipo, 10% a 50% (p/p) de arginina são incluídos como um estabilizador de aminoácido. Em modalidades específicas, o tampão é 0,2% a 5% (p/p) de fosfato de potássio ou sódio, pH 6,5 a 7,8. Em certas modalidades, a formulação seca da vacina permanece eficaz por pelo menos 18 meses a 27oC.

[0055] Em modalidades mesmo mais particulares, a presente invenção provê formulações secas de vacinas que compreendem um parvovírus vivo atenuado, por exemplo, CPV, 23%"a 49% (p/p) de sorbitol como o álcool de açúcar, uma combinação de 8% a 17% (p/p) de glicina e 8% a 33% (p/p) de dextrano como o estabilizador de volume, uma combinação de 3% a 18% (p/p) de gelatina com 4% a 18% (p/p) de um hidrolisado proteolítico de caseína integral como o estabilizador de proteína; e um tampão tendo um pH de 7,0 a 7,4. Em certas modalidades deste tipo, 25% a 36% (p/p) de arginina são incluídos como um estabilizador de aminoácido. Em modalidades específicas, o tampão é 0,5% a 2% (p/p) de fosfato de potássio ou sódio, pH 7,0 a 7,4. Em certas modalidades, a formulação seca da vacina permanece eficaz por pelo menos 18 meses a 27oC.

[0056] Em modalidades particulares, o parvovírus canino (CPV) é um parvovírus canino 2 (CPV-2). Em outra modalidade particular deste tipo, o parvovírus canino é um parvovírus canino 2a (CPV-2a). Em ainda outra modalidade particular deste tipo, o parvovírus canino é um parvovírus canino 2b (CPV-2b). Em ainda outra modalidade particular deste tipo, o parvovírus canino é um parvovírus canino 2c (CPV-2c). Em uma modalidade específica deste tipo, o CPV-2c é acessão ATCC No. PTA-13492. Em ainda outra modalidade, o parvovírus canino é um parvovírus canino recombinante, que foi construído para compreender um genoma CPV-2c/CPV-2 heterogêneo, isto é, a região codificando as proteínas capsídeas é de um isolado CPV-2c e a região codificando as proteínas não estruturais é de um isolado CPV-2 [ver U.S. 2012/0328652 A1, cujo conteúdo é por este meio incorporado por referência em sua totalidade, em que a sequência de nucleotídeo codificando a proteína capsídea do genoma CPV-2 foi substituída pela sequência de nucleotídeo codificando a proteína capsídea de um CPV-2c, desse modo resultando no genoma CPV-2c/CPV-2 heterogêneo]

[0057] Como parte do processo para produzir as formulações secas estáveis de vacinas vivas atenuadas da presente invenção, as formulações de vacina líquidas correspondentes podem ser aplicadas a uma membrana e/ou congeladas em grânulos e/ou congeladas em recipientes, tais como frascos, e/ou secadas por pulverização e/ou secadas por congelamento pulverizado, e/ou induzidas a espumar e/ou colocadas em um implante de liberação retardada.

[0058] A presente invenção provê ainda métodos de auxiliar na proteção de um animal (por exemplo, felino ou canino) contra uma doença clínica que surge de uma infecção (por exemplo, por um vírus felino ou canino), compreendendo administrar uma vacina reconstituída da presente invenção no animal. Em certas modalidades, a administração é realizada pela mucosa. Em outras modalidades, a administração é realizada parenteralmente. Em ainda outras modalidades, a administração é realizada intradermicamente. Em ainda outras modalidades, a administração é realizada transdermicamente. Em modalidades mais específicas, uma vacina da presente invenção é administrada no animal subcutaneamente. Em outras modalidades específicas, uma vacina da presente invenção é administrada no animal intramuscularmente. A presente invenção também inclui o uso de vacinas primárias e/ou de reforço.

[0059] Em certas modalidades, a quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus vivo atenuado é uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus canino vivo atenuado. Em modalidades específicas deste tipo, a quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus canino vivo atenuado inclui quantidades terapeuticamente eficazes do vírus da cinomose canina vivo atenuado e/ou um adenovírus canino vivo atenuado tipo 2 e/ou um parvovírus canino vivo atenuado, e/ou um vírus da parainfluenza canina vivo atenuado.

[0060] Em modalidades particulares, o indivíduo animal é um canino e o método compreende administrar ao canino uma vacina estável em temperatura ambiente reconstituída da presente invenção, que compreende um vírus vivo atenuado. Em modalidades específicas, a vacina estável em temperatura ambiente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, adenovírus canino vivo atenuado tipo 2 e vírus da parainfluenza canina vivo atenuado. Em certas modalidades deste tipo, a vacina estável em temperatura ambiente compreende vírus da cinomose canina vivo atenuado, adenovírus canino vivo atenuado tipo 2, vírus da parainfluenza canina vivo atenuado e vírus da influenza canina vivo atenuado ou parvovírus canino vivo atenuado ou, alternativamente, tanto vírus da influenza canina vivo atenuado como parvovírus canino vivo atenuado.

[0061] Por conseguinte, a presente invenção provê ainda uma vacina reconstituída, composta de qualquer uma ou mais das formulações secas como providas aqui e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em modalidades particulares, a presente invenção provê uma vacina multivalente feita da combinação de uma formulação seca de uma vacina trivalente VCC, CAV2 e CPI, com uma formulação seca separada de uma vacina CPV monovalente e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[0062] Métodos de produzir e/ou armazenar em temperatura ambiente (por exemplo, 22 - 27oC) qualquer uma e todas as formulações secas estáveis em temperatura ambiente, das vacinas da presente invenção, são também providos. Em certas modalidades, o método compreende preparar uma formulação de vacina combinando-se uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus felino ou canino vivo atenuado com 8% a 30% (p/v) de um oligossacarídeo não redutor, 0,1M a 0,5 M de um estabilizador de aminoácido, 0,9% a 10% (p/v) de um estabilizador de proteína e um tampão tendo um pH de 6,0 a 8,0. Geralmente em seguida, mas não sempre, a formulação de vacina é congelada e então secada sob vácuo para produzir uma formulação seca estável em temperatura ambiente. A temperatura dentro do secador de congelamento pode ser elevada durante este processo para acelerar a remoção da umidade. Preferivelmente, a formulação seca da vacina permanece eficaz por pelo menos 18 meses quando armazenada a 27oC.

[0063] Em modalidades particulares deste tipo, a formulação de vacina compreende adicionalmente 1% a 6% (p/v) de um estabilizador de volume. Em uma modalidade mais particular deste tipo, a relação do estabilizador de volume para oligossacarídeo não redutor é de 0,05 a 0,40. Em certas modalidades, 0,5% a 5% (p/v) de sorbitol são também incluídos. Em modalidades particulares, o estabilizador de volume é manitol. Em certas modalidades, o estabilizador de aminoácido é arginina. Em outras o estabilizador de aminoácido é glutamato. Em ainda outras modalidades, o estabilizador de aminoácido é uma combinação de arginina e glutamato.

[0064] Os métodos de produzir qualquer uma ou todas as formulações secas estáveis em temperatura ambiente, das vacinas da presente invenção, podem incluir, antes da secagem, aplicar a formulação de vacina líquida a uma membrana e/ou congelá-la em grânulos e/ou congelá-la em frascos e/ou secagem por pulverização e/ou secagem por congelamento de pulverização e/ou induzi-la a espumar.

[0065] Em modalidades particulares dos métodos de produzir uma vacina estável em temperatura ambiente, o método compreende combinar uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma vacina viva atenuada com o oligossacarídeo não redutor, que é uma combinação de 5% a 18% (p/v) de sacarose e 5% a 18% (p/v) de trealose, 2% a 4% (p/v) do estabilizador de volume, 0,1 M a 0,3 M do estabilizador de aminoácido e 1,5% a 6% (p/v) do estabilizador de proteína. Em modalidades mais particulares, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor é de 0,08 a 0,37. Em certas modalidades, o vírus vivo atenuado é um vírus canino vivo atenuado. Em modalidades relacionadas, o vírus vivo atenuado é um vírus felino vivo atenuado.

[0066] Estes e outros aspectos a presente invenção serão melhor apreciados por referência à seguinte Descrição Detalhada.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0067] A presente invenção provê vacinas de vírus vivo atenuado eficazes e/ou composições imunogênicas que podem ser armazenadas como formulações secas em temperatura ambiente e ainda permanecem seguras e eficazes por 12 ou 18 ou mesmo 24 meses ou mais. Por conseguinte, uma vantagem principal das formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção é que elas eliminam a necessidade de um refrigerador ou freezer de armazenagem. Isto significativamente diminui a despesa de armazenagem, particularmente em locais remotos e, além disso, elimina a necessidade de adivinhar se a vacina permaneceu segura e eficaz após o mau-funcionamento de um refrigerador ou congelador de armazenagem.

[0068] Além disso, surpreendentemente as formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas de vírus vivo da presente invenção podem incluir vírus vivos atenuados de qualquer tipo. Assim, as formulações estáveis em temperatura ambiente das vacinas vivas da presente invenção podem incluir vírus tanto envelopado como não envelopado. Além disso, as formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas vivas da presente invenção podem incluir vírus vivo atenuado, tendo genomas de RNA de filamento único, genomas de DNA de filamento único ou genomas de DNA de duplo-filamento. Em um aspecto da presente invenção, as vacinas de vírus vivo da presente invenção incluem vírus de canino e/ou felino vivo atenuado. A presente invenção provê ainda vacinas estáveis em temperatura ambiente que são vacinas multivalentes. Além disso, as vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem ainda compreender um vírus morto e ou uma bactéria morta (por exemplo, uma bacterina) e/ou uma subfração de uma bacterina e/ou subunidade do vírus ou bactéria (por exemplo, um antígeno de proteína).

[0069] Além disso, surpreendentemente, as formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas de vírus vivo da presente invenção podem incluir vírus atenuados vivos de qualquer tipo. Assim, as formulações estáveis em temperatura ambiente das vacinas vivas da presente invenção podem incluir vírus tanto envelopado como não envelopado. Além disso, as formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas vivas da presente invenção podem incluir vírus vivos atenuados, tendo genomas de RNA de filamento único, genomas de DNA de filamento único, ou genomas de DNA de filamento duplo. Em um aspecto da presente invenção, as vacinas de vírus vivo da presente invenção incluem vírus de canino e/ou felino vivos atenuados. A presente invenção provê ainda vacinas estáveis em temperatura ambiente, que são vacinas multivalentes. Além disso, as vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem ainda compreender um vírus morte e/ou uma bactéria morta (por exemplo, uma bacterina) e/ou uma subfração de uma bacterina, e/ou uma subunidade do vírus ou bactéria (por exemplo, um antígeno de proteína).

[0070] Além disso, as formulações de vírus vivo estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem compreender vetores recombinantes, tais como vetores de vírus recombinante (incluindo baculovírus recombinantes) que estão sozinhos e/ou com outros tais vetores de vírus recombinantes e/ou com vírus vivos atenuados e/ou em combinação com bactérias mortas e/ou vírus mortos, por exemplo, vírus caninos mortos. Tais vetores de vírus recombinantes podem ainda codificar um ou mais antígenos virais ou bacterianos heterólogo. Um exemplo particular de tal vetor recombinante é um vírus da parainfluenza recombinante, por exemplo, vírus da parainfluenza canina. Um vetor do vírus da parainfluenza recombinante é um Vírus 5 da parainfluenza recombinante, que recentemente foi descrito por Li et al. [J. of Virology 87(10) 5985 - 5993 (2013), por este meio incorporado por referência em sua totalidade]. Tais vetores de vírus recombinante, por exemplo, um Vírus 5 da parainfluenza recombinante ou vetor do vírus da parainfluenza canina recombinante, pode codificar um antígeno heterólogo de um vírus canino e/ou um vírus felino, e/ou vírus de equino e/ou um vírus humano e/ou um vírus de símio e/ou um vírus bovino e/ou um vírus de carneiro e/ou vírus de suíno, e/ou vírus de aves domésticas (por exemplo, um vírus de galinha). Em modalidades particulares, as formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção compreendem um vírus da parainfluenza recombinante (por exemplo, o Vírus 5 da parainfluenza recombinante ou um vírus da parainfluenza canina recombinante) que codifica um ou mais antígenos de um ou mais vírus de galinha e/ou bactérias que infectam galinhas.

[0071] Em modalidades alternativas da presente invenção, as formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção podem compreender vírus e/ou bactérias de bovino vivos atenuados que infectam gado. Em modalidades específicas, a vacina estável em temperatura ambiente compreende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado e vírus IBR vivo atenuado. Em outras modalidades, a vacina estável em temperatura ambiente compreende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, vírus P13 vivo atenuado e BRSV vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina estável em temperatura ambiente compreende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, vírus P13 vivo atenuado, vírus IBR vivo atenuado e BRSV vivo atenuado. Em ainda outras modalidades, a vacina estável em temperatura ambiente compreende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, vírus P13 vivo atenuado, vírus IBR vivo atenuado, BRSV vivo atenuado e BRCV vivo atenuado. Qualquer uma das vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção também pode ser combinada com um ou mais antígenos bacterianos atenuados ou mortos, tais como Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni e Mycoplasma bovis antes da administração. Uma tal modalidade é vacina estável em temperatura ambiente, que compreende BVDV1 vivo atenuado, BVDV2 vivo atenuado, vírus P13 vivo atenuado, vírus IBR vivo atenuado e BRSV vivo atenuado (BRCV mais ou menos vivo atenuado) com Pasteurella multocida vivo atenuado, Mannheimia haemolytica vivo atenuado e Histophilus somni vivo atenuado. Em modalidades particulares, a presente invenção provê métodos compreendendo administrar a um bovino uma vacina estável em temperatura ambiente da presente invenção, que compreende um vírus bovino vivo atenuado.

[0072] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção alternativamente podem compreender vírus e/ou bactérias de aves domésticas vivos atenuados, que infectam as aves domésticas. Em certas modalidades, o vírus de aves domésticas vivo atenuado é o vírus da bronquite infecciosa (IBV). Em outras modalidades, o vírus de ave doméstica vivo atenuado é vírus de doença bursal infecciosa (IBDV). Em ainda outras modalidades, o vírus de ave doméstica vivo atenuado é vírus da doença de Newcastle (NDV). Em ainda outras modalidades, o vírus de ave doméstica vivo atenuado é Laringotraqueíte infecciosa (ILTV). Em ainda outras modalidades, o vírus de ave doméstica vivo atenuado é metapneumovírus aviário (aMPV). Em ainda outras modalidades, o vírus de ave doméstica vivo atenuado é o vírus da doença de Marek (MDV). Em ainda outras modalidades, o vírus de ave doméstica vivo atenuado é Vírus de Herpes de Perus (HVT), [HVT não é patogênico em galinhas].

[0073] Os vírus de ave doméstica vivos podem também ser vetores recombinantes. Isto é especialmente verdadeiro para HVT e os dois outros MDVs, isto é, MDV1 e MDV2. Os vetores HVT recombinantes já são comercialmente disponíveis, codificando antígenos do Vírus da Doença de Newscastle ou Laringotraqueíte infecciosa. Mais recentemente, dois únicos vetores HVT recombinantes foram descritos que codificam antígenos de tanto NDV e ILTV ou de tanto NDV como IBDV [ver, U.S. 2013/0101619 A1 e WO2013057235 A1, respectivamente, cujo conteúdo de ambos é por este meio incorporado por referência em sua totalidade]. As vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem compreender qualquer um destes vetores de vírus de ave doméstica recombinantes, individualmente ou em qualquer combinação, como descrito aqui.

[0074] Além disso, qualquer uma das vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção, que compreenda uma ou mais vacinas de vírus de ave doméstica, pode ainda compreender um vírus morto e/ou bactéria morta e/ou uma subfração de uma bacterina, ou mesmo um parasita, tal como uma Eimeria viva, que seja atenuada ou não atenuada. Em modalidades particulares, a presente invenção provê métodos compreendendo administrar a aves domésticas, por exemplo, uma galinha, uma vacina estável em temperatura ambiente da presente invenção, que compreenda um vírus de ave doméstica vivo atenuado.

[0075] Em ainda outro aspecto, uma formulação seca estável em temperatura ambiente de uma vacina da presente invenção pode compreender um vírus suíno vivo atenuado. Em certas modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é transmissível pelo vírus da gastroenterite (TGE). Em outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é vírus da síndrome reprodutiva e respiratória dos suínos (PRRS). Em ainda outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é vírus da diarreia epidêmica suína (PED). Em ainda outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é vírus da influenza de suíno (SIV). Em ainda outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é rotavírus suíno (PRV). Em ainda outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é parvo vírus suíno (PPV). Em ainda outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é vírus da pseudorraiva suíno (PPRV). Em ainda outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é vírus da pseudorraiva suíno (PPRV). Em ainda outras modalidades, o vírus suíno vivo atenuado é circovírus suíno (PCV).

[0076] As vacinas multivalentes da presente invenção podem conter qualquer combinação de vírus suíno. Em certas modalidades, as vacinas multivalentes da presente invenção compreendem tanto vírus suíno mortos como vírus suíno atenuados. Em uma modalidade particular deste tipo, a vacina multivalente compreende um vírus da influenza de suíno SIV morto, um circovírus suíno morto ou subunidade (PCV) [que inclui antígenos PCV expressos-baculovírus, ver US 8.008.001, cujo conteúdo é por este meio incorporado por referência], junto com vírus da gastroenterite transmissível vivo atenuado (TGE) e parvovírus suíno (PPV) vivo atenuado. Em uma modalidade relacionada, a vacina multivalente compreende antígeno de circovírus (PCV) suíno morto, vírus da influenza de suíno (SIV) morto de múltiplos sorotipos, e morto, junto com vírus da gastroenterite (TGE) transmissível atenuado vivo e rotavírus suíno (PRV) atenuado vivo. Em modalidades particulares, a presente invenção provê métodos compreendendo administrar a um suíno uma vacina estável em temperatura ambiente da presente invenção, que compreende um vírus suíno vivo atenuado. Em modalidades relacionadas, a vacina multivalente compreende um antígeno de circovírus suíno (PCV) vivo atenuado e/ou inativado e/ou subunidade, um antígeno de vírus da síndrome respiratória reprodutiva suíno (PRRS) subunidade, e/ou um antígeno de vírus da diarreia epidêmica suína (PED) subunidade vivo atenuado E/OU inativado ou subunidade.

[0077] As vacinas de vírus suíno vivo atenuado estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem ainda compreender um vírus morto e/ou uma bactéria morta (por exemplo, uma bacterina) e/ou uma subfração de uma bacterina. Em modalidades particulares deste tipo, a vacina multivalente compreende um antígeno pilus, taxoide inativado Clostridium perfringens, extraído de bactérias E. coli de qualquer um dos seguintes sorotipos: K99, K88, 987P ou F41, juntos com o vírus da gastroenterite transmissível (TGE) vivo atenuado e parvovírus suíno (PPV) vivo atenuado. Em uma modalidade relacionada, a vacina suína multivalente compreende um antígeno de circovírus suíno (PCV) morto ou subunidade, Mycoplasma hyopneumonia (M.hyo) morto, uma bacterina Lawsonia intracellularis viva atenuada, juntos com um vírus da síndrome respiratória reprodutiva dos suínos (PRRS) vivo atenuado e/ou inativado e/ou vírus da diarreia epidêmica suína (PED) vivo atenuado ou inativado.

[0078] As formulações secas estáveis em temperatura ambiente das vacinas da presente invenção incluem pelo menos um estabilizador de açúcar, pelo menos um estabilizador de proteína e pelo menos um tampão, para manter a forma líquida da vacina em um pH de 5,5 a 8.5. Pelo menos um estabilizador de volume pode também ser adicionado. As vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção, portanto, são armazenadas como formulações secas. Tais formulações secas podem ser preparadas por métodos incluindo secagem por congelamento em grânulos, por exemplo, tais como esferas conhecidas como uma lioesfera e/ou esferons produzidos por um método anteriormente descrito [ver, por exemplo, WO 2010/125084; US 2012/0049412 A1; e US 2014/0017318, cujo conteúdo é por este meio incorporado por referência em sua totalidade) ou como uma torta, por exemplo, em frascos, ou secadas em uma matriz sólida, por exemplo, em uma membrana ou filtro, ou, alternativamente, como secadas como um pó, ou secadas por pulverização, ou secadas por congelamento por pulverização, ou induzidas a uma espuma.

[0079] As frações imunogênicas ativas das vacinas monovalentes ou multivalentes podem compreender um ou mais vírus e/ou bactérias. Por conseguinte, as vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem ser secadas por congelamento (ou de outro modo reduzidas em volume líquido) para armazenagem e então reconstituídas em um veículo líquido, por exemplo, com um veículo farmaceuticamente aceitável, tal como uma água de grau de vacina ou outro diluente, antes ou na ocasião da administração. Em modalidades particulares, o diluente compreende um ou mais de outros antígenos virais e/ou bacterianos. Alternativamente, as vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem ser injetadas como um sólido, por exemplo, quando o sólido é um pó e o injetor é um injetor de pó sem agulha, tal como PowderJect®.

[0080] O uso de termos singulares por conveniência na descrição não é, de forma alguma, destinado a ser assim limitante. Assim, por exemplo, referência a um “estabilizador de açúcar” inclui referência a um ou mais de tais estabilizadores de açúcar, a menos que de outro modo especificado. O uso de termos plurais não é também destinado a ser limitante, a menos que de outro modo especificado.

[0081] Similarmente, um composto químico que pode ser dito como um ácido ou sua correspondente base, quando indicado aqui, é destinado a significar qualquer forma do composto, a menos que de outro modo especificado. Assim, o uso da expressão “ácido glutâmico” pretende incluir glutamato e vice-versa.

[0082] Como aqui usado, uma “vacina” é uma composição que é adequada para aplicação em um animal (incluindo, em certas modalidades, humanos) que, na administração ao animal induz uma resposta imune bastante forte para minimamente auxiliar na proteção de uma doença clínica surgindo de uma infecção com um micro-organismo tipo-selvagem, isto é, bastante forte para auxiliar na prevenção da doença clínica e/ou evitar, melhorar ou curar a doença clínica. A menos que expressamente indicado de outro modo, o uso do termo vacina inclui vacinas multivalentes.

[0083] Como aqui usado, uma vacina “eficaz” retém suficiente título para um dado antígeno ser condescendente com as exigências regulatórias para aquele antígeno para a jurisdição em que a vacina é administrada, por exemplo, a administração de uma vacina animal nos Estados Unidos é governada pelo United States Department of Agriculture (USDA).

[0084] Como aqui usado, uma “vacina multivalente” é uma vacina que compreende dois ou mais antígenos diferentes. Em uma modalidade particular deste tipo, a vacina multivalente estimula o sistema imune do receptor contra dois ou mais diferentes patógenos.

[0085] Como aqui usado, uma formulação seca “estável em temperatura ambiente” de uma vacina é uma formulação seca de uma vacina (incluindo uma vacina multivalente) que permanece eficaz por pelo menos um ano, quando armazenada a 27oC. Em modalidades particulares, uma formulação seca estável em temperatura ambiente de uma vacina permanece eficaz quando armazenada a 27°C por pelo menos 1,5 ano. Em modalidades mais particulares, uma formulação seca estável em temperatura ambiente de uma vacina permanece eficaz quando armazenada a 27°C por pelo menos 2 anos. Em modalidades ainda mais particulares, uma formulação seca estável em temperatura ambiente de uma vacina permanece eficaz quando armazenada a 27°C por pelo menos 2,5 a 3 anos.

[0086] Como aqui usado, uma “formulação seca” de uma vacina é preparada removendo-se o líquido de uma vacina que foi formulada em uma solução. A remoção do líquido pode ser realizada por, por exemplo, evaporação, tal como por aplicação da vacina líquida a um substrato sólido e evaporação do líquido e/ou por sublimação, tal como por liofilização (secagem por congelamento). As vacinas da presente invenção são armazenadas como formulações secas, geralmente com 0,5% a 10,0 % (p/p) de teor de umidade residual (RMC). As formulações secas podem ser reconstituídas em um veículo farmaceuticamente aceitável antes da administração. Em modalidades particulares, as vacinas da presente invenção são armazenadas como formulações secas compreendendo 0,5% a 5% (p/p) de teor de umidade residual. Em modalidades mais particulares, as vacinas da presente invenção são armazenadas como formulações secas compreendendo 0,5% a 3% (p/p) de teor de umidade residual.

[0087] Em razão de as vacinas da presente invenção serem armazenadas como formulações secas, uma “vacina” da presente invenção também se refere às formulações compreendendo um ou mais antígenos que são armazenados como formulações secas. Como citado acima, algum tempo antes da administração, estas formulações secas podem ser combinadas com um veículo farmaceuticamente aceitável. Os antígenos para uma vacina multivalente podem ser armazenados na mesma formulação seca ou em formulações secas separadas. Por conseguinte, para certas vacinas multivalentes, antígenos individuais de vacina são armazenados separadamente como únicas formulações secas e então antes da administração são combinados juntos com um veículo farmaceuticamente aceitável para formar a vacina multivalente. Alternativamente, múltiplos antígenos de vacina podem ser combinados e armazenados como uma única formulação seca e então antes da administração podem ser misturados juntos com um veículo farmaceuticamente aceitável e um ou mais outros antígenos de vacina, que foram armazenados em uma ou mais formulação(ões) seca(s) separada(s).

[0088] Como aqui usado, o termo “veículo” refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com que o composto é administrado.

[0089] Como aqui usado, o termo “farmaceuticamente aceitável” é usado adjetivamente para significar que o substantivo modificado é apropriado para uso em um produto farmacêutico. Quando é usado, por exemplo, para descrever um excipiente em uma vacina farmacêutica, ele distingue o excipiente como sendo compatível com os outros ingredientes da composição e não desvantajosamente deletério para o receptor pretendido, por exemplo, um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, tais como água e/ou óleos, incluindo aqueles de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo etc. As soluções salinas de solução de água ou aquosas e soluções de dextrose e glicerol aquosas podem ser empregadas como veículos, particularmente para soluções injetáveis. Em modalidades particulares, o veículo farmaceuticamente aceitável é e/ou contém um adjuvante. Em certas modalidades, um veículo farmaceuticamente aceitável pode ainda compreender um ou mais antígenos de vacina que, antes da administração, podem ser combinados com uma formulação seca de uma vacina da presente invenção.

[0090] Como usado aqui, um “adjuvante” é um substrato que é capaz de favorecer ou ampliar a cascata de eventos imunológicos, finalmente conduzindo a uma melhor resposta imunológica, isto é, a resposta corporal integrada para um antígeno. Um adjuvante não é em geral requerido para a resposta imunológica ocorrer, porém favorece ou amplifica esta resposta.

[0091] Como aqui usados, os termos “protege”, “protegendo”, “provê proteção para”, “provendo proteção para” e “auxilia na proteção” não requerem completa proteção de qualquer indicação de infecção. Por exemplo, “auxilia na proteção” pode significar que a proteção é suficiente, de modo que, após desafio, os sintomas da infecção subjacente são pelo menos reduzidos e/ou que uma ou mais das causas celular, fisiológica ou bioquímica subjacentes ou mecanismos causando os sintomas são reduzidos e/ou eliminados. É entendido que “reduzido”, como usado neste contexto, significa em relação ao estado da infecção, incluindo o estado molecular da infecção, não apenas o estado fisiológico da infecção.

[0092] Como aqui usada, a expressão “quantidade terapeuticamente eficaz” é uma quantidade de um dado antígeno, por exemplo, vírus vivo atenuado, que é suficiente para prover proteção para o e/ou auxiliar na proteção do patógeno contra o qual o antígeno está sendo administrado para proteger, quando provida em uma única administração e/ou quando pretendido, provido como uma administração inicial com uma ou mais administração(ões) reforçadoras subsequentes.

[0093] Como aqui usada “administração sistêmica” é administração no sistema circulatório ou no corpo (compreendendo o sistema cardiovascular e linfático), assim afetando o corpo como um todo, em vez de um local específico, tal como o trato gastrointestinal (através da, por exemplo, administração oral ou retal) e o sistema respiratório (através da, por exemplo, administração intranasal). A administração sistêmica pode ser realizada, por exemplo, por administração no tecido muscular (intramuscular), na derme (intradérmica, transdérmica o supradérmica), debaixo da pele (subcutânea), debaixo da mucosa (submucosal), nas veias (intravenosa etc.). “Administração parenteral” inclui injeções subcutâneas, injeções submucosais, injeções intravenosas, injeções intramusculares, injeções intradérmicas, e infusão.

[0094] Como aqui usadas, as expressões “gado’ e “animal de fazenda” incluem gado, porcos, e aves domésticas. Como aqui usados, os termos “bovino” e “gado” são usados intercambiavelmente, a menos que de outro modo observado. Similarmente, os termos “suíno”, “suíno” e “porco” são usados intercambiavelmente, a menos que de outro modo citado. Como usados aqui, os termos “aviário” e “ave” são usados intercambiavelmente com ambos os termos destinados a incluir aves domésticas. Como aqui usada, a expressão “aves domésticas” pode incluir galinhas, perus, patos, ganso, codorna e faisões.

[0095] Como aqui usada, a expressão “animal de companhia” inclui caninos, felinos e equinos.

[0096] Como aqui usado, o termo “felino” refere-se a qualquer membro da família Felidae. Membros desta família incluem membros selvagens, de zoo e domésticos, tais como qualquer membro das subfamílias Felinae, por exemplo, gatos, leões, tigres, pumas, jaguares, leopardos, leopardos de neve, panteras, leões de montanha da América do Norte, chitas, linces, caracais ou quaisquer seus mestiços. Gatos também incluem gatos domésticos, gatos de companhia de raça-pura e/ou mestiços, gatos de show, gatos de laboratório, gatos clonados e gatos selvagem.

[0097] Como aqui usado, o termo “canino” inclui todos os cães domésticos, Canis lupus familiaris ou Canis familiaris, a menos que de outro modo indicados.

[0098] O parvovírus canino “CPV” foi primeiro isolado em 1978 e foi chamado CPV-2 para distingui-lo do vírus parvovírus canino minuto (CMV ou CPV-1).

[0099] Aproximadamente um ano após o isolamento inicial do CPV- 2, uma variante genética, CPV-2a, foi identificada. Nos meados dos 1980’s, uma segunda variante genética, CPV-2b, foi identificada. CPV-2a e CPV-2b logo deslocou completamente CPV-2. Hoje em dia, CPV-2a não é mais detectado nos Estados Unidos [Parrish e Kawaoka, Annu Rev. Micrbiol. 59:553-586 (2005)]. Uma quarta variante CPV desta família, CPV-2c, foi primeiro descrita em 2000 [ver, U.S. 8.227.593; U.S. 8.258.274; Hong et al., J.Vet. Diagn. Invest. (5): 535-9 (2007)]. Os pedidos provisórios U.S. 61/739067, depositado em 19 de dezembro de 2012 e 61/778.761, depositado em 16 de março de 2013, o conteúdo de ambos sendo por este meio incorporado por referência em sua totalidade, descrevem um isolado CPV-2c atenuado específico (acesso ATCC No. PTA-13492), que foi depositado em 24 de janeiro de 2013 na American Type Culture Collection (ATCC) 10801, University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, U.S.A, sob condições que satisfazem as exigências do Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure. Além disso, um parvovírus canino recombinante foi construído que compreende um genoma CPV-2C/CPV-2 heterogêneo, isto é, a região codificando as proteínas capsídeas é de um isolado CPV-2c e a região codificando as proteínas não estruturais é de um isolado CPV-2 [WO2011107534 (A1); US 20120328652; WO2012007589 (A1), cujos conteúdos são por este meio incorporados por referência e suas totalidades, em que a sequência de nucleotídeo codificando a proteína capsídea do genoma CPV-2 foi substituída pela sequência de nucleotídeo codificando a proteína capsídea de um CPV-2c, desse modo resultando no genoma CPV-2c/CPV-2 heterogêneo]. Como aqui usado, uma vacina da presente invenção, que compreende “parvovírus canino”, pode compreender um ou mais destes tipos/variantes/isolados de CPV, incluindo o recentemente construído parvovírus canino recombinante, que compreende o genoma CPV-2c/CPV-2.

[00100] Como aqui usado, um “oligossacarídeo não redutor” é um carboidrato consistindo em dois a dez resíduos monossacarídeos unidos através de ligações glicosídicas, e que, em meio aquoso básico, não gera quaisquer compostos contendo um grupo aldeído. Exemplos de oligossacarídeos não redutores da presente invenção incluem sacarose, trealose e rafinose.

[00101] Como aqui usado, um “estabilizador de açúcar” é um oligossacarídeo não redutor (por exemplo, ver acima) ou um “álcool de açúcar”/poliol (por exemplo, sorbitol, manitol, arabitol, inositol, maltitol).

[00102] Como aqui usado, um “estabilizador de volume” é um composto que auxilia na estabilização de uma vacina em temperaturas elevadas, isto é, 25o - 30°C ou superiores. Exemplos de tais estabilizadores de volume são glicina, dextrano, manitol, maltodextrina, polivinilpirrolidona, hidroxietilo de amido, polietileno glicol (PEG, com uma faixa de peso molecular de 400 daltons a 20 kilodaltons), ou qualquer combinação dos mesmos. Em modalidades particulares, o “estabilizador de volume” é manitol. Como aqui usado, a menos que de outro modo especificamente citado ao contrário, a percentagem (%) de um aditivo sólido, por exemplo, oligossacarídeo não redutor ou estabilizador de proteína, de uma vacina, pode ser dada como peso/peso (p/p) e/ou com base em uma solução de 1% sendo 1 g de sólido/100 ml de volume de vacina, peso/volume (p/v). Como aqui usado, a menos que de outro modo especificamente dito ao contrário, a percentagem (%) de um aditivo líquido, por exemplo, etanol, de uma vacina, é baseada em uma solução de 1% sendo 1 ml de aditivo líquido / 100 ml de volume de vacina (v/v).

[00103] Como provida aqui, a relação de dois reagentes em uma dada formulação, por exemplo, a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor e/ou o álcool de açúcar, é baseada nos reagentes tendo as unidades idênticas, por exemplo, (p/p)).

[00104] Como usado aqui, um “estabilizador de aminoácido” é um aminoácido carregado, isto é, arginina, lisina, ácido glutâmico e ácido aspártico.

[00105] Como aqui usado, um “estabilizador de proteína” pode ser uma proteína intacta e/ou um hidrolisado de proteína. Em modalidades particulares, o “estabilizador de proteína” da presente invenção é uma caseína hidrolisada ou um colágeno/derivativo de colágeno, tal como gelatina. O hidrolisado de caseína integral, que pode ser usado nas vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção, pode ser obtido por numerosos procedimentos, incluindo, por exemplo, como um hidrolisado de ácido ou um hidrolisado enzimático. Tais hidrolisados contêm, na forma de aminoácidos e peptídeos misturados, todos os aminoácidos originalmente presentes na caseína. Um hidrolisado pancreático da caseína integral, que pode ser usado nas vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção é vendido como CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC® por MP Biomedicals. Produtos comparáveis são vendidos sob o nome de NZ-AMINE®, NZ- AMINE® A, NZ-AMINE® AS, NZ-AMINE® B e Tryptone por Sigma- Aldrich.

[00106] Em razão de as vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção idealmente variarem em pH de pH 5,5 a pH 8,5, as vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção compreendem um agente tamponante, isto é, um tampão. Os tampões para uso nas vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção incluem, mas não são limitados a: histidina, fosfato de potássio e/ou sódio, pirofosfato de potássio, imidazol, Tris, Tris-Histidina, BIS-Tris e os tampões Good: BIS-Tris-Propano (BTP), PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, tricina, glicilglicina e HEPES. Os tampões podem ser trazidos para o desejado pH com o uso de qualquer contraíon adequado.

[00107] Como aqui usado, quando um pH de um tampão em uma formulação seca de uma vacina da presente invenção é provido, esse pH é o pH da formulação da vacina compreendendo o tampão antes de remover essencialmente todo o líquido da vacina (isto é, secagem), para torná-lo uma formulação seca. Como aqui usado, a menos que de outro modo especificamente citado ao contrário, o valor do pH provido é o valor de pH determinado/medido a 25oC.

[00108] Vacinas Multivalentes: A presente invenção provê vacinas multivalentes, estáveis em temperatura ambiente, compreendendo vírus humano, de gado ou animal de companhia, como detalhado aqui. Exemplos de vacinas caninas multivalentes, estáveis em temperatura ambiente, incluem mas não são de forma alguma limitadas a: dois ou mais dos seguintes vírus vivo atenuado ou vetores recombinantes: vírus da cinomose canina, adenovírus canino tipo2, parvovírus canino, vírus da parainfluenza canina, vírus da influenza canina, pneumovírus canino, coronavírus canino, vírus do herpes canino, vírus da hepatite canina infecciosa, vírus diminuto canino, vírus da raiva, vírus da pseudorraiva, um vetor de vírus recombinante, por exemplo, um vetor de vírus canino ou felino recombinante, que codifica e expressa um antígeno heterólogo de um patógeno canino e/ou um patógeno felino.

[00109] Além disso, as vacinas caninas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem ainda conter e/ou ser subsequentemente combinadas com um ou mais antígenos atenuados ou mortos, tais como Bordetella bronchiseptica, uma Mycroplasma species, Ehrlichia canis, uma Anaplasma species, Leptospira canicola, Leptospira grippotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira interrogans, Leptospira autmnalis ou Leptospira Bratislava; ou vírus da influenza canina morto, ou coronavírus canino morto antes da administração.

[00110] A presente invenção provê ainda vacinas multivalentes estáveis em temperatura ambiente, compreendendo vetores de vírus recombinantes, tais como vetor de vírus da parainfluenza canino recombinante, que codifica um antígeno heterólogo obtido de um patógeno humano e/ou um patógeno símio, e/ou um patógeno bovino, e/ou um patógeno de carneiro, e/ou um patógeno suíno e/ou um patógeno de aves domésticas (por exemplo, um vírus de galinha).

[00111] Similarmente, uma vacina felina multivalente estável em temperatura ambiente da presente invenção pode compreender dois ou mais dos seguintes vírus felino vivos atenuados: um herpesvírus felino, calicivírus felino, pneumovírus felino, parvovírus felino, vírus da leucemia felina, vírus da peritonite infecciosa felina, vírus da imunodeficiência felina, vírus da doença de Borna, vírus da influenza felina e influenza aviária. Tais vacinas estáveis em temperatura ambiente podem ainda conter e/ou ser subsequentemente combinadas com Chlamydophila felis e/ou Bartonella spp., atenuadas ou mortas (por exemplo, B. henselae) antes da administração.

[00112] As vacinas estáveis em temperatura ambiente e vacinas multivalentes da presente invenção são armazenadas como formulações secas e, portanto, antígenos individuais podem ser empacotados e armazenados separadamente ou em qualquer combinação antes da mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável e administrados ao receptor animal. Em um tal exemplo, uma vacina multivalente, compreendendo um antígeno de vírus da cinomose canina, um vírus da parainfluenza canina e um antígeno de adenovírus canino tipo 2 é armazenada em uma única formulação seca e um antígeno de parvovírus canino é armazenado em uma segunda formulação seca. Antes de administrar ao recipiente canino, as duas formulações secas são combinadas com um veículo multivalente para produzir uma vacina de vírus da cinomose canina, vírus da parainfluenza canina, adenovírus canino tipo 2 e parvovírus canino multivalente.

[00113] Administração da Vacina: Em seguida a serem misturadas com um veículo, as vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção podem ser administradas por qualquer meio convencional, e por administração sistêmica ou por administração parenteral, tal como, sem limitação, administração subcutânea ou intramuscular. Em seguida a serem misturadas com um veículo, vacinas estáveis em temperatura ambiente da presente invenção também podem ser administradas por administração pela mucosa, tais como por administração intranasal, oral, intratraqueal, retal e/ou ocular. Alternativamente, as vacinas podem ser administradas através de um emplastro de pele, escarificação ou administração tópica. É contemplado que uma vacina estável em temperatura ambiente da presente invenção também possa ser administrada através da água potável e/ou alimento do recipiente. É contemplado adicionalmente que tais vacinas possam ser administradas na forma de uma guloseima ou brinquedo.

[00114] As vacinas (incluindo vacinas multivalentes) da presente invenção também podem ser administradas como parte de uma terapia de combinação, isto é, uma terapia que inclui, além da própria vacina, administrar um ou mais agentes ativos, terapias adicionais etc. Nesse exemplo, deve ser reconhecido que a quantidade de vacina que constitui uma quantidade “terapeuticamente eficaz” pode ser mais ou menos a quantidade de vacina que constituiria uma quantidade “terapeuticamente eficaz”, se a vacina fosse para ser administrada sozinha. Outras terapias podem incluir aquelas conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, analgésicos, medicamentos de redução de febre, expectorantes, medicamentos anti-inflamatórios, anti- histamínicos e/ou administração de fluidos.

[00115] O nível de imunogenicidade pode ser determinado experimentalmente por técnicas de estudo de titulação de dose desafiadora, geralmente conhecidas na técnica. Tais técnicas tipicamente incluem a vacinação de um número de indivíduos animais com a vacina em diferentes dosagens e então desafiam os indivíduos animais com o vírus virulento para determinar a dose protetora mínima.

[00116] Fatores afetando o regime de dosagem preferido podem incluir, por exemplo, a espécie ou raça (por exemplo, de um canino ou felino), idade, peso, sexo, dieta, atividade, tamanho do pulmão e condição do indivíduo; a via de administração, a eficácia, segurança e perfis de duração- da-imunidade da vacina particular usada; se um sistema de suprimento é usado; e se a vacina é administrada como parte de uma combinação de uma droga e/ou vacina. Assim, a dosagem realmente empregada pode variar para animais específicos e, portanto, pode desviar-se das dosagens típicas estabelecidas acima. Determinar tais ajustes de dosagem está geralmente dentro da habilidade daqueles versados na técnica de desenvolvimento de vacina empregando meios convencionais.

[00117] Similarmente, o volume com que tal dose pode ser administrada tipicamente situa-se entre 0,1 mL (típico para aplicação intradérmica ou transdérmica) e 5,0 mL. Uma faixa típica para o volume de administração é entre 0,2 e 2,0 mL e 1,0 a 2,0 mL. Para administração intramuscular ou subcutânea.

[00118] É contemplado que a vacina possa ser administrada ao receptor da vacina em uma única vez ou alternativamente, duas ou mais vezes durante dias, semanas, meses ou anos. Em algumas modalidades, a vacina é administrada pelo menos duas vezes. Em certas tais modalidades, por exemplo, a vacina é administrada duas vezes, com a segunda dose (por exemplo, um reforço) sendo administrada pelo menos 2 semanas após a primeira dose. Em modalidades particulares, a vacina é administrada duas vezes, com a segunda dose sendo administrada não mais do que 8 semanas após a primeira dose. Em outras modalidades, a segunda dose é administrada de 1 semana a 2 anos após a primeira dose, de 1,5 semanas a 8 semanas após a primeira dose ou de 2 a 4 semanas após a primeira dose. Em outras modalidades, a segunda dose é administrada 3 semanas após a primeira dose.

[00119] Nas modalidades acima, a primeira e subsequentes doses podem variar, tal como em quantidade e forma. Com frequência, entretanto, as dosagens são as mesmas em quantidade e forma. Quando somente uma única dose é administrada, a quantidade da vacina naquela dose apenas geralmente compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz da vacina. Quando, entretanto, mais do que uma dose é administrada, as quantidades de vacina naquelas doses juntas podem constituir uma quantidade terapeuticamente eficaz. Além disso, uma vacina pode ser inicialmente administrada e então um reforço pode ser administrado. Administrações subsequentes da vacina também podem ser feitas em uma base anual (1 - ano) ou bianual (2-anos), independente quanto a se um reforço foi administrado ou não.

[00120] A presente invenção pode ser mais bem entendida por referência aos seguintes Exemplos não limitativos, que são providos como exemplares da invenção. Os seguintes Exemplos são apresentados a fim de mais totalmente ilustrar as modalidades da invenção. Eles não devem de forma alguma ser interpretados, entretanto, como limitantes do amplo escopo da invenção.

EXEMPLOS Materiais e Métodos

[00121] Materiais: Sacarose e sorbitol de grau ACS mínimo são comprados da Fisher Scientific. Hidrocloreto de arginina-L, L-metionina, L- histidina, manitol, sulfato de magnésio, ectoína, hidroxiectoína, glicina e cloreto de sódio grau molecular, com uma pureza de mais do que 98%, são comprados de Sigma. Dextrano com um peso molecular médio de 70.000 em uma pureza > 95% é comprado de Sigma. Soluções Tris 1,0M (pH 8,0) e EDTA (pH 8,0) de grau de biologia molecular são compradas de Sigma. Solução de 20% de Gelatin bloom 250 e solução de Amina NZ foram preparados de fornecedores comerciais mais disponíveis.

[00122] Preparação da Solução Estoque: As seguintes soluções foram preparadas e esterilizadas por filtragem de 0,2 μm: 80% de sacarose, 70% de sorbitol, 1,0M L-arginina (pH 7,2), 5% L-metionina e 5 mM sulfato de dextrano. Antígenos principais VCC, CAV2, CPV e CPI, tendo títulos entre 6,5 a 9,5, foram congelados a -80°C para serem descongelados imediatamente antes da mistura.

[00123] Mistura, enchimento e secagem da vacina: Antígenos e estabilizantes de vírus são misturados à concentração final de cada componente, como listado na tabela de formulação. Água deionizada é usada para preparar a solução ao volume alvo. Todos os componentes das misturas de vacina são misturados completamente por agitação por pelo menos 10 minutos em uma placa de agitação. Para vacinas secadas em frascos, a mistura é distribuída em frascos de vidro de 2,2 cc a 0,5 mL por frasco, em seguida secada por congelamento em um liofilizador usando-se um ciclo de secagem desenvolvido como mostrado na Tabela 4. Para vacinas secadas em grânulos (por exemplo, liosferas/esferons), a mistura foi distribuída em moldes de aço inoxidável ultrafrios a 100 μL por gota para obter grânulos esféricos congelados. Os grânulos congelados foram transferidos para uma bandeja e secados por congelamento no liofilizador, usando-se o ciclo de secagem otimizado, como mostrado na Tabela 5. Para vacinas secadas em membranas, a mistura da vacina é distribuída em uma membrana e então a membrana é secada em uma câmara com vácuo controlado a 13,3 a 133,3 Pa por cerca de 16 horas a 25oC. Teste de estabilidade em temperatura acelerada e tempo real:

[00124] Os testes de estabilidade acelerada a 45°C e 37°C são usados para classificar diferentes formulações. As formulações principais são monitoradas no teste de estabilidade a longo prazo e tempo real a 27oC, quando é desejado. No ponto de tempo designado, 3 amostras de cada formulação foram recuperadas e o título de cada antígeno foi medido por uma cultura de célula baseada em ensaio de titulação e informado como uma dose infecciosa de cultura de tecido médio (TCID50) e/ou como uma dose infecciosa de anticorpo 50% fluorescente (FAID50).

Métodos Analíticos:

[00125] Potência CPI: Diluições de amostras de vírus são inoculadas em células de rim de cão (DK). Após 4 - 6 dias, monocamadas são fixadas e tingidas com antissoro de CPI conjugado-fluoresceína e o título de vírus é calculado pelo Spearman-Karber Method [Cunnigham, C.H. A Laboratory Guide in Virology, 7a. edição, Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN. (1973); Kaplan, M.M. e Koprowski, H., Laboratory Techniques in Rabies, World Health Organization, Suiça, (1973)].

[00126] Potência VCC: Diluições de amostras de vírus foram inoculadas em células Vero. Após 5 - 7 dias, monocamadas são observadas para efeito citopático e o título do vírus é calculado pelo Spearman-Karber Method, como citado acima.

[00127] Potência CAV2: Diluições de amostras de vírus foram inoculadas em células DK. Após 7 dias, monocamadas são observadas quanto a efeito citopático e o título do vírus é calculado pelo Spearman-Karber Method, como citado acima.

[00128] Potência CPV: Diluições de amostras de vírus foram inoculadas em células DK. Após 3 dias, as monocamadas foram manchadas com antissoro CPV conjugado-fluoresceína e o título de vírus é calculado pelo Spearan-Karber Method, como citado acima.

[00129] Análise de umidade e térmica da vacina secada: A umidade da vacina secada por congelamento em frascos ou em grânulos foi determinada usando-se o tradicional método gravimétrico de forno a vácuo ou o método Karl-Fischer. O teor de umidade residual (RMC) das amostras secadas- congelamento foi constatado variar de 0,5% a 3% (p/p)]. As temperaturas de transição vítrea dos grânulos ou tortas secadas-congelamento em frascos foram determinadas em um instrumento de calorimetria de varredura diferencial (DSC). A menos que de outro modo citado, o RMC é provido como uma percentagem (p/p) nas formulações secadas por congelamento.

EXEMPLO 1 PREPARAÇÃO DE ESTABILIZADORES

[00130] A concentração alvo final (p/p) de cada componente da vacina seca final de cada formulação é mostrada nas Tabelas 1a e 2a. A concentração final de cada componente da mistura de vacina de cada formulação é mostrada nas Tabelas 1b e 2b. Para vacina secada como grânulos (por exemplo, lioesferas/esferons) em uma bandeja plástica, o volume de cada dose de vacina é de 100 μl ou 250 mL. Para vacinas secadas como uma torta em um frasco de vidro, o volume da dose é de 250 μL, ou 500 μL ou 1000 μL. Para estabilizadores em vacinas secas mostradas na Tabela 1a e 2a, todas as unidades de concentração são em peso por peso (p/p), exceto que a o peso da vacina de dose total é em mg. Para estabilizadores de misturas de vacina mostradas na Tabela 1b e 2b, a concentração para o açúcar e a proteína são em percentagem em peso por volume (p/v), a concentração para aminoácidos, cátions e tampões é molar (M) ou milimolar (mM), a concentração para ectoína e hidroxiectoína são peso por volume (p/v). Todas concentrações mostradas nas Tabelas 1b e 2b são a concentração final da mistura de vacina com antígenos de vírus. A L-arginina das formulações SP33 e SP34 é o sal de fosfato ou acetato, respectivamente. Todas outras formulações de arginina são sal de cloreto. O pH é o pH final da mistura de vacina com os antígenos de vírus. Todos os tampões da formulação têm uma concentração final de 10 mM. KPO4 é tampão de fosfato de potássio compreendendo fosfato de potássio monobásico e dibásico com o pH alvo de 7,2. Os estabilizadores listados nas Tabelas 1b e 2b são completamente misturados com a apropriada quantidade de água, em seguida os antígenos de vírus são adicionados e completamente misturados antes de a subsequente mistura de vacina ser distribuída, congelada e secada por congelamento dentro de grânulos ou frascos.

EXEMPLO 2 CORRELAÇÃO DE ESTABILIDADE A 27°C COM ESTUDOS A 37°C E 45oC

[00131] O teste de estabilidade acelerada em elevada temperatura é usado para selecionar diferentes estabilizadores. Temperaturas elevadas de 45°C e 37°C são usadas para teste de estabilidade acelerada nestes estudos. O teste de estabilidade a longo prazo em tempo real é realizado a 27°C. Para investigar se o teste de estabilidade acelerada a 45°C e 37°C pode ser usado para classificar diferentes estabilizadores ou formulações, o perfil de estabilidade de pelo menos três formulações para cada vírus a 45oC, 37°C e 27°C foi comparado (Tabela 3). A estabilidade relativa de vírus em diferentes formulações é classificada com base no título do vírus em cada ponto do tempo e também na tendência total de perda de título. Classificação similar é usada para as mesmas formulações em diferentes temperaturas. Como visto na Tabela 3, há uma estreita correlação entre teste de estabilidade acelerada e em tempo real entre todas 3 temperaturas. O desempenho de estabilidade relativa a 45oC, 37°C e 27°C é sempre consistente para todos quatro vírus em diferentes formulações. Para a maioria das formulações, a classificação é consistente entre todas três temperaturas. Portanto, os dados indicam que 45°C e 37°C podem ser um método de seleção de formulação acelerada confiável, particularmente para distinguir a melhor e a pior das formulações do grupo. Para algumas formulações com perfis de estabilidade muito similares em temperaturas elevadas de 45°C e 37°C não é tão fácil de predizer qual dará melhor estabilidade a 27°C (tempo real). Na seleção de formulação para DHPPi (VCC, CAV2, CPV e CPI), teste de estabilidade acelerada a 45°C e 37°C é usado para selecionar diferentes estabilizadores e excipientes, para identificar as formulações principais. As formulações principais podem então ser confirmadas com teste de estabilidade em tempo real a longo prazo a 27oC, quando desejado.

EXEMPLO 3 PROCESSO DE SECAGEM PARA VÍRUS DE DIFERENTES FORMULAÇÕES

[00132] Após os estabilizadores e antígenos de vírus serem misturados completamente, a temperatura de transição vítrea (Tg) principal da mistura de vacina foi medida em um calorímetro de varredura diferencial (Perkin Elmer). Todas as formulações das Tabelas 1 e 2 têm uma Tg principal mais elevada do que -40oC. Com base nestes resultados, o ciclo de secagem nas Tabelas 4 e 5 é usado para secar os grânulos de vacina congelados e o líquido dentro dos frascos, respectivamente.

[00133] Para preparar vacinas em grânulos secos, os grânulos de vacina congelados com 100 μL por grânulo são primeiro preparados gotejando-se a mistura de vacina em poços das placas de aço inoxidável pré- esfriadas (-110°C a -130°C). Os grânulos congelados foram coletados em uma bandeja e armazenados a -80°C até secarem no liofilizador. Imediatamente antes da secagem por congelamento dos grânulos de vacina, a prateleira do secador por congelamento é pré-resfriado a -20°C e os grânulos de vacina das bandejas são rapidamente carregados na prateleira. Após secagem por congelamento com um ciclo de secagem mostrado na Tabela 4, o vácuo é liberado usando argônio seco ou gás nitrogênio seco. As bandejas de grânulos secos são vedadas em bolsas de lâmina metálica com argônio ou nitrogênio seco.

[00134] Para preparar a vacina como tortas dentro de frascos, a mistura de vacina foi distribuída em frascos de vidro de 2,2 cc a 250 μL por frasco. O frasco enchido foi então tampado e transferido para a prateleira pré-esfriada a 4°C dentro do secador-congelamento. O ciclo de secagem da Tabela 5 foi usado para secar por congelamento as vacinas dentro dos frascos. Após secagem por congelamento, o vácuo foi liberado e os frascos foram enchidos com gás de argônio ou nitrogênio seco. Em seguida os frascos foram totalmente vedados com uma tampa de borracha e então ainda cobertos com um plissador.

EXEMPLO 4 RESULTADOS DA ESTABILIDADE DE VCC, CAV2, CPI e CPV

[00135] Para vírus secados em grânulos, os grânulos secados por congelamento com antígenos são empacotados em recipientes em um porta- luvas com nitrogênio seco [< 1,0% Humidade Relativa (RH)] e então a estabilidade testada em diferentes temperaturas. Para amostras secadas como uma torta dentro de frascos, o frasco selado é colocado em uma caixa de armazenagem e então testado em estabilidade em incubadores em diferentes temperaturas. Em diferentes pontos do tempo, as amostras são recuperadas do incubador e a potência de cada vacina é titulada usando-se a cultura de células com base em ensaios de titulação.

[00136] Em cada ponto do tempo, pelo menos três frascos de mesma formulação foram recuperados e reconstituídos com 1 mL PBS por frasco para um ensaio de potência. A potência dos vírus foi determinada usando-se cultura de células baseada em metodologia TCID50 e/ou FAID50. A seleção de formulação é realizada etapa por etapa em diferentes estudos. Cada estudo inclui pelo menos uma formulação de linha de referência para comparar com outros estudos. Dentro de cada estudo, diferentes formulações foram obtidas com um ou mais “+” e então classificadas com base em dados de estabilidade relativa em múltiplos pontos do tempo. Quanto maior o número de +’s, melhor é a estabilidade relativa do vírus testado na amostra.

[00137] Para a maioria das formulações SPxx, a estabilidade física dos grânulos (por exemplo, liosferas/esferons) são aceitáveis sem mudanças na aparência dos grânulos ou tortas durante armazenagem de longo-termo, de modo que nenhuma classificação de estabilidade física é listada. Para as formulações SPCPVxx, a estabilidade física variou, dependendo dos componentes da formulação. A estabilidade física da vacina secada foi classificada por Tg e inspecionando-se a aparência física.

[00138] A Tabela 6 mostra a estabilidade dos quatro vírus a 27°C em diferentes formulações e sua vida em prateleira projetada a 27oC. Nestes testes, o título de entrada do antígeno alvo [Log10 (TCID50)] para VCC, CPI, CAV2 e CPV foram 7,0, 7,0, 4,0 e 5,0, respectivamente. O título mínimo de vencimento para cada antígeno foi estabelecido a 4,7, 5,0, 3,3 e 4,5 para VCC, CPI, CAV2 e CPV, respectivamente. A vida em prateleira estimada para o vírus DHPPi em diferentes formulações é calculada pela tendência de mudança de título em múltiplos pontos do tempo durante estudos de estabilidade. A vida em prateleira estimada para CPI é baseada no título mínimo no vencimento que é 5,0 e a entrada de antígeno para CPI é 0,5 log mais elevada. Em outras palavras, diversas formulações principais mostraram melhorada estabilidade a 45°C e 37°C através das formulações listadas na Tabela 6. Estas formulações principais pode ser retestadas por teste de estabilidade em tempo real a longo prazo a 27oC. Os dados mostrados na Tabela 6 indicam que, utilizando-se as atuais especificações de produção da vacina, a formulação SP10 minimamente pode prover 18 meses ou mais de vida em prateleira a 27°C para VCC, CAV2 e CPI (com a entrada de antígeno CPI 0,5 log mais elevada).

[00139] A Tabela 7 mostra diversas formulações principais identificadas usando-se o teste de estabilidade acelerada a 45oC. Vírus VCC, CAV2, CPI e CPV são misturados nestas formulações e então secados por congelamento em grânulos. Os grânulos foram vedados em frascos com nitrogênio seco e então colocados em teste de estabilidade a 45oC. Similarmente, a classificação de estabilidade é baseada no título em cada ponto do tempo e a taxa de mudança de título ao longo do curso do tempo. Como mostrado na Tabela 7, as formulações SP43 e SP44 proveem estabilidade significativamente melhor para VCC e CPI do que SP10. Há mais do que uma melhora de meio log nas semanas 1, 2 e 4 para tanto VCC como CPI em SP44 em relação à de SP10. Similarmente, SP44 também provê estabilidade significativamente melhor para CAV2 do que PARA SP10. As melhorias de estabilidade para a formulação SP44, relativas a SP10 podem ser extrapoladas para produzir uma vacina VCC, CAV2 e CPI (vacina DHPi) que tem uma vida em prateleira de 24 meses ou maior a 27oC, quando os dados obtidos pelos estudos acelerados a 45°C para SP44 são comparados com aqueles obtidos a 27°C para SP10.

[00140] Os efeitos dos estabilizadores ou excipientes sobre a estabilidade do vírus foram completamente avaliados durante a seleção de formulação de VCC, CPI, CAV2 e CPV. Diversos exemplos de classificação são listados na Tabela 8-13.

[00141] O efeito do tampão e pH na estabilidade do vírus é mostrado na Tabela 8. No estudo descrito na Tabela 8, as vacinas foram secadas por congelamento como tortas em frascos. Todos quatro vírus foram misturados nas formulações como na tabela, colocadas dentro de frascos de vidro e então secadas por congelamento em um liofilizador, como descrito nos métodos empregando o ciclo de secagem mostrado na Tabela 5. Exceto quanto à diferença no tampão [tampão de fosfato de potássio (KPO4), histidina, tampão de bis-tris propano (BTP) e MOPS ácido (3-(N-morfolino) propanossulfônico] e o pH listado, todas as formulações deste estudo contêm 4% de manitol, 5% de sacarose, 0,8% de gelatina, 1,0% NZ amina e 2mM MgSO4. Todas as formulações deste estudo também contêm 10mM tampão com um pH final listado na tabela. Os dados de estabilidade a 45°C e 37°C para cada vírus são usados para classificar as formulações.

[00142] Os dados providos na Tabela 8 indicam que VCC, CPI e CAV2 têm uma mais elevada estabilidade em pH menor (6,5) do que em pH neutro ou mais elevado, enquanto que CPV tem uma mais elevada estabilidade em pH neutro a mais elevado (7,6). VCC e CPI são mais estáveis em KPO4 ou histidina do que os outros dois tampões testados, enquanto que a estabilidade de CAV2 e CPV parece ser menor, dependente do tampão usado.

[00143] O efeito da concentração e combinação do açúcar na estabilidade dos vírus foi investigado como mostrado nas Tabelas 9a e 9b. As concentrações de açúcar são listadas na Tabela 9a e a estabilidade dos vírus nestas formulações a 45°C e 37°C é listada na Tabela 9b. Neste estudo, todas as formulações têm a mesma entrada de antígeno de massa de vírus e os vírus destas formulações foram secados por congelamento em grânulos. A classificação de estabilidade relativa é baseada nos dados de estabilidade tato em 45°C como 37°C e em múltiplos pontos do tempo para cada vírus nas diferentes formulações. Os dados das Tabelas 9a e 9b sugerem que a estabilidade de VCC, CPI e CAV2 tem uma forte dependência da concentração de açúcar, com mais elevada estabilidade de vírus em açúcar de mais elevada concentração, na faixa de 4 - 30%. Os dados também sugerem que a combinação de sacarose e trealose (Suc + TrH) parecem funcionar melhor do que sacarose ou trealose sozinhas.

[00144] O efeito da concentração de L-arginina na estabilidade dos vírus também foi investigado (Tabela 10). As formulações SP02B, SP26 e SP27 diferem em somente na concentração cloridrato de L-arginina [para alguns pontos de dados os dados não são disponíveis, devido à invalidade do ensaio (n/a)]. Com base nos dados obtidos a 45°C e 37oC, a estabilidade de VCC, CPI e CAV2 parece depender da concentração de arginina, com mais elevadas concentrações de arginina sendo mais estável (Tabela 10).

[00145] O efeito de diferentes sais de arginina ou concentrações de arginina, em combinação com ácido glutâmico, foi investigado ainda (Tabelas 11a e 11b). A Tabela 11a mostra a concentração de sal de arginina, e a concentração de ácido glutâmico em cada formulação e o correspondente início de Tg da vacina secada. Todas as formulações são iguais, exceto as diferenças acima mencionadas em arginina e ácido glutâmico. A L-arginina foi ajustada a pH 7,2 com diferentes ácidos, para produzir os diferentes sais de arginina. A Tg inicial é a temperatura de transição vítrea inicial dos grânulos de vacina secados por congelamento da formulação. A Tg inicial é determinada por calorimetria de varredura diferencial e é a média de pelo menos 3 réplicas. Os dados de estabilidade a 45°C e 37°C das formulações listadas na Tabela 11a são mostrados na Tabela 11b. A estabilidade relativa é também classificada e listada a Tabela 11b. Como mostrado nas Tabelas 11a e 11b, diferentes sais de L-arginina podem ter diferentes efeitos de estabilidade. Embora o fosfato de arginina na formulação SP33 forneça uma Tg muito mais elevada, a estabilidade de todos 3 vírus diminuiu em relação aos outros sais de arginina. Combinando-se cloreto de arginina 0,15 M com ácido glutâmico de sódio monobásico 0,15 M na formulação SP35, ligeiramente melhorou a estabilidade de todos três vírus em relação àquela encontrada em SP10.

[00146] Ectoína e hidroxiectoína são compostos naturais, encontrados em micro-organismos halofílicos. Ambas são solutos compatíveis, que servem como uma substância protetora atuando como um osmólito e, assim, ajudam os organismos a sobreviverem a extrema tensão osmótica, conferindo resistência em relação a tensão de sal e temperatura. Tanto ectoína como hidroxiectoína mostraram ser estabilizadores potentes de proteínas, bem como muitos outros biológicos. Portanto, seu efeito estabilizante sobre a estabilidade de VCC, CPI e CAV2 foi testado. As formulações SP39 e SP40 são idênticas à formulação SP10, exceto que, em adição, elas contêm ectoína ou hidroxiectoína, respectivamente (Tabela 13). Os dados de estabilidade em três temperaturas de armazenagem foram usados para avaliar seus efeitos estabilizantes. A mistura de vacina contendo estas 3 frações de vírus foram secadas por congelamento usando-se o mesmo ciclo de secagem.

[00147] A classificação de estabilidade é baseada nos dados de estabilidade das 3 temperaturas (a 45oC, 37°C e 27oC). Os dados de estabilidade e a classificação de estabilidade da Tabela 13 indicam que tanto ectoína como hidroxiectoína podem melhorar a estabilidade de VCC e CPI a 37°C e 27oC, embora os efeitos estabilizantes a 45°C não é tão significante. O efeito estabilizante da ectoína e hidroxiectoína em CAV2 é difícil de determinar, devido a sua baixa curva de degradação.

EXEMPLO 5 RESULTADOS DE ESTABILIDADE DE CPV SECADO POR CONGELAMENTO

[00148] A estabilidade do CPV monovalente, em diferentes formulações, também foi avaliada. Embora o CPV possa ser incluído junto com os outros três vírus caninos em uma formulação estável em temperatura ambiente, por exemplo, SPCPV-02 e SPCPV-03, as formulações podem prover em torno de 18 meses de vida em prateleira a 27°C para CPV, dos quatro diferentes vírus caninos testados, CPV difere mais com respeito a sua ótima estabilidade em temperatura ambiente.

[00149] Por conseguinte, o CPV tem uma diferente preferência em relação aos açúcares do que VCC, CPI ou CAV2, por exemplo, sendo mais estável com um álcool de açúcar, tal como sorbitol, do que um açúcar redutor. Entretanto, mesmo na presença de sorbitol, a estabilidade física dos grânulos ou tortas secados por congelamento pode às vezes resultar em contração ou colapso dos grânulos secados durante a armazenagem. Portanto, tanto a estabilidade da potência como a estabilidade física das formulações de CPV secadas foram monitoradas durante a seleção de formulação. Notavelmente, a avaliação das formulações de vacina CPV monovalente provou ser um estudo modelo para obter-se um produto de vacina que equilibra a estabilidade da potência do vírus com a estabilidade física do produto seco.

[00150] A Tabela 14 mostra os dados de estabilidade de CPV a 45oC, 37°C e 27°C em cinco diferentes formulações. CPV monovalente é misturado nestas formulações e então secado por congelamento como grânulos de tamanho de 100 μL. Todas as formulações deste estudo continham 10mM KPO4 a pH 7,2 como tampão e 2% de Dextrano 70k e 2% de Glicina como estabilizadores de volume. A concentração de sorbitol (p/v) de cada formulação é mostrada na tabela. Todas as formulações também continham proteínas estabilizadoras “GN” (Gelatina e NZ-Amina). 1xGN é: 0,8% de Gelatina e 1,0% NZ Amina; enquanto que 2,5x GN é: 2,5% Gelatina e 2,5% NZ Amina. A classificação de estabilidade da potência baseada na mudança do título do vírus a 45oC, 37°C e 27oC. A classificação de estabilidade física é baseada na temperatura de transição vítrea (Tg) e aparência da estrutura física dos grânulos secados por congelamento, após secagem por congelamento e durante o estudo de estabilidade. A Tg mais elevada e uma mais forte tendência para manter a estrutura física dos grânulos produzem uma mais elevada classificação da estabilidade física.

[00151] Os dados de estabilidade da Tabela 14 indicam que uma concentração mais elevada do sorbitol beneficia a estabilidade da potência CPV, porém diminui a estabilidade física das vacinas; enquanto que uma mais elevada concentração de proteína é benéfica para a estabilidade física. Além disso, a inclusão de L-arginina não teve efeitos negativos sobre a estabilidade do CPV.

[00152] O efeito do dextrano em diferentes concentrações de sorbitol foi ainda avaliado e um estudo resumido na Tabela 15. Todas as formulações da Tabela 15 contêm 2% de glicina, 2,5% de gelatina, 2,5% NZ Amina e 10 mM de tampão KPO4 em pH 7,2. Adicionalmente, todas as formulações contêm sorbitol e dextrano 70k. O CPV monovalente é misturado nestas formulações e então secado por congelamento como grânulos de 100 μL de tamanho. A potência e a estabilidade física destas formulações são classificadas similarmente como no estudo da Tabela15. Os dados da Tabela 15 indicam que a mais elevada a concentração de Dextrano 70k é benéfica para a estabilidade física dos grânulos de CPV secadas por congelamento, porém prejudica a estabilidade da potência a 6%. No ínterim, mais elevada concentração de sorbitol é benéfica para a estabilidade da potência, porém necessita concentração média de dextrano 70k para manter sua estrutura. Os dados deste estudo sugerem que uma combinação ótima de sorbitol e dextrano 70k é requerida para uma ótima vacina de CPV secada por congelamento, tendo tanto elevada potência como elevada estabilidade física.

EXEMPLO 6 EFEITOS DE FORMATO DE SECAGEM DIFERENTE SOBRE A ESTABILIDADE DO VÍRUS

[00153] Para investigar se as vacinas secadas em diferentes formatos têm diferentes perfis de estabilidade, os vírus da mesma formulação foram secados como uma torta em um frasco ou como grânulos em uma bandeja e então sua estabilidade foi comparada. A Tabela 16 mostra os resultados do teste de estabilidade de VCC, CAV2 e CPI nos grânulos de SP02B e em uma torta de FDIV-03 (SP02B e FDIV-03 são realmente da mesma formulação). Como visto na Tabela 16, a estabilidade de VCC, CPI e CAV2 em um frasco foi equivalente (ou ligeiramente melhor que) àquela observada nos grânulos. Os dados deste estudo sugerem que as formulações ótimas, identificadas em grânulos, podem também ser usadas para as vacinas de vírus secadas como tortas em frascos. TABELA 1a Estabilizadores e Excipientes (p/p) nos Produtos de Vacina Secada Contendo VCC, CAV2, CPV e CPI

• A entrada do antígeno é em torno de 2% (p/p) e da RMC é em torno de 2% (p/p) na vacina secada por congelamento. • O peso da dose de vacina seca é o peso de uma quantidade de dose de vacina quando secada de mistura de vacinas ou de 100 μL ou de 250 μL, usando as correspondentes formulações da Tabela 1b abaixo. • L-arginina (L-Arg) em SP33 é fosfato de arginina e L-arginina em SP34 é arginina acética. • Em ambos SP35 e SP36, L-arginina é cloreto de arginina e L-Glu é ácido glutâmico de sódio. • SP39 contém ectoína e SP40 contém hidroxiectoína como outros estabilizadores (Outros Etabil.). • SP43 e SP44 contêm histidina como o tampão na mistura de vacina, todas as outras formulações contêm fosfato de potássio (KPO4) como tampão. Tabela 1b Formulação de Mistura para VCC, CPI, CAV2 e CPV secados por congelamento

• As unidades para a quantidade final de cada estabilizador na vacina são listadas no topo de cada categoria. P/v é peso por volume. • KPO4 é tampão de fosfato de potássio. O pH e o pH final da mistura de vacina quando os antígenos/vírus são incluídos. • Para L-Arg, as formulações SP33 e SP34 contêm fosfato e o sal de ácido acético de L-arginina, respectivamente. Todas as outras L-Arg listadas na tabela são o sal de cloreto. Tabela 2a Estabilizadores e Excipientes (p/p) nos produtos de Vacina Secados por Congelamento Contendo CPV

• A entrada do antígeno é em torno de 1% (p/p) e da RMC é em torno de 2% (p/p) na formulação secada por congelamento da vacina. • O peso da dose da vacina seca é o peso de uma quantidade de dose de vacina quando secada de mistura de vacina ou de 100 μL ou de 250 μL, usando as formulações correspondentes da Tabela 2b abaixo. • L-Arg é cloreto de arginina; Gli é glicina. Tabela 2b Formulação de Mistura para CPV Secado por Congelamento

• As unidades para a quantidade final de cada estabilizador na vacina são listadas no topo de cada categoria. P/v é peso por volume. • KPO4 é tampão de fosfato de potássio. • O pH é o pH final da mistura de vacina quando os antígenos/vírus são incluídos. Tabela 3 Correlação de Teste de Estabilidade Acelerado (45°C e 37oC) e Tempo Real (a 27oC) para Seleção de Formulação

• n/a indica que os dados estão faltando devido a erros de ensaio ou porque as amostras não foram testadas. • “+” é usado para classificar as formulações com um número maior de “+” indicando melhor estabilidade. • O ponto do tempo é expresso como a combinação de dia (D), semana (sem) ou mês (m) e duração. Por exemplo, D0 é dia 0, sem1 é semana 1 e m6 é mês 6. Tabela 4 Ciclos de Secagem por Congelamento para Vacinas de Vacinas de Grânulos Congelados

N/A: não se aplica. Tabela 5 Ciclo de Secagem por Congelamento para Vacina em Frasco

N/A: não se aplica Tabela 6 Vida em Prateleira Estimada de VCC, CPI, CAV2 E CPV a 27°C em Diferentes Formulações

Tabela 7 Diversas Formulações Principais Identificadas Usando-se Teste de Estabilidade Acelerada 45°C

Tabela 8 Efeitos do Tampão e pH sobre a Estabilidade do Vírus

Tabela 9a Teor de Oligossacarídeo Não Redutor e Oligossacarídeo Não Redutor Total de Formulações de Misturas Usadas na Tabela 9b

Tabela 9b Efeitos da Concentração de açúcar na Estabilidade de VCC, CPI e CAV2 secados por congelamento

n/a: ponto de dados não disponível Tabela 10 Efeitos da Concentração de L-Arginina da Mistura na Estabilidade do Vírus

n/a: ponto de dados não disponível Tabela 11a Tg Inicial de Grânulos Secados por Congelamento com Diferentes Sais de Arginina em Combinação com Ácido Glutâmico Formulação Estabilizadores Tg inicial ( C ) Arginina Ácido Glutâmico

Tabela 11b Efeitos de Diferentes Sais de Arginina e Ácido Glutâmico na Estabilidade de VCC, CAV2 e CPI

Tabela 12 Efeito de Manitol e Glicina como Estabilizadores para Vacina de 4 Vias

• D0 é o título do vírus pós liofilização e sem2 é o título do vírus após armazenagem a 45°C por 2 semanas • A diferença entre as Formulações IB1-02, IB1-06 e IB1-10 é o estabilizador de volume. IB1-02 contém 4% Manitol, IB1-06 contém 2% Glicina, enquanto que IB1-10 não contém estabilizador de volume. Tabela 13 Efeitos de Ectoína and Hidroxiectoína na Estabilidade do Vírus

TABELA 14 Efeitos do Sorbitol, Proteína e Arginina sobre a Potência CPV e Estabilidade Física da Vacina Seca

• Título do vírus em Pré-Lio é o título do vírus na mistura de vacina antes da secagem por congelamento (liofilização). • 1xGN é 0,8% (p/v) Gelatina e 1,0% (p/v) NZ Amina. 2,5xGn é 2,5% (p/v) Gelatina e 2,5% (p/v) NZ amino. Tabela 15 Efeitos do Sorbitol e Dextrano na Estabilidade CPV

• O dextrano usado tem um peso molecular de 70k. • A classificação de estabilidade física é baseada na estrutura física dos grânulos após secagem por congelamento, que foi determinada em diferentes tempos durante a armazenagem a 45oC. Tabela 16 Efeitos de Formatos de Secagem Diferente sobre a Estabilidade do Vírus

n/a, os dados de título para este ponto de tempo não estão disponíveis devido a invalidação do ensaio.

Claims

1. Formulação seca de uma vacina, caracterizada pelo fato de que compreende um vírus vivo atenuado, 30% a 80% (p/p) de um oligossacarídeo não redutor, 5% a 40% (p/p) de um estabilizador de aminoácido, 2% a 20% (p/p) de um estabilizador de proteína, 2% a 25% (p/p) de um estabilizador de volume e um tampão tendo um pH de 6,0 a 8,0; em que antes de ser seca a vacina foi tratada por um processo selecionado do grupo consistindo em aplicá-la a uma membrana, congelá-la em grânulos, congelá-la em frascos, secá-la por pulverização, secá-la por congelamento por pulverização.

2. Formulação seca de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor é de 0,05 a 0,40.

3. Formulação seca de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o vírus vivo atenuado é um vírus vivo atenuado selecionado do grupo consistindo em um vírus da cinomose, um adenovírus, um vírus da parainfluenza, um vetor de vírus recombinante que codifica e expressa um antígeno heterólogo e qualquer combinação dos mesmos.

4. Formulação seca de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo fato de que o vírus vivo atenuado é um vírus canino vivo atenuado, selecionado do grupo consistindo em um vírus da cinomose canina (VCC), um adenovírus canino tipo 2 (CAV2), um vírus da parainfluenza canina (CPI), um vetor de vírus da parainfluenza canina recombinante (rCPI), que codifica e expressa um antígeno heterólogo e qualquer combinação dos mesmos.

5. Formulação seca de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente parvovírus canino (CPV) e 2% a 5% (p/p) de sorbitol.

6. Formulação seca de acordo com as reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o estabilizador de aminoácido é arginina.

7. Formulação seca de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente 0,02% a 1% (p/p) de um sal de um cátion divalente, selecionado do grupo consistindo em Mg++, Ca++ e Zn++.

8. Formulação seca de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que antes de ser seca a vacina foi tratada por um processo selecionado do grupo consistindo em aplicá-la a uma membrana, congelá-la em grânulos, congelá-la em frascos, secá-la por pulverização, secá- la por congelamento por pulverização e induzi-la a espumar.

9. Formulação seca de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o oligossacarídeo não redutor é uma combinação de 20% a 80% (p/p) de sacarose e 18% a 66% de trealose, o estabilizador de volume é 5% a 17% (p/p) de manitol, o estabilizador de aminoácido é 9% a 34% (p/p); em que o estabilizador de proteína compreende 2% a 5% (p/p) de gelatina e 2% a 6% (p/p) de um hidrolisado proteolítico de caseína integral; e em que a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor é de 0,08 a 0,37.

10. Método para fabricação de uma formulação seca de uma vacina estável em temperatura ambiente, caracterizado pelo fato de que compreende: a. preparar uma formulação de vacina combinando uma quantidade terapeuticamente eficaz de um vírus canino vivo atenuado com 8% a 30% (p/v) de um oligossacarídeo não redutor, 1% a 6% p/v de um estabilizador de volume, 0,1 M a 0,5 M de um estabilizador de aminoácido, 0,9% a 10% (p/v) de um estabilizador de proteína e um tampão tendo um pH de 6,0 a 8,0; em que a relação do estabilizador de volume para o oligossacarídeo não redutor é de 0,05 a 0,40; e b. secar a formulação de vacina da etapa a. sob vácuo, para fabricar uma formulação seca estável em temperatura ambiente como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Vacina, caracterizado pelo fato de que compreende uma formulação seca de uma vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 compreendendo um parvovírus vivo atenuado, 10% a 80% (p/p) de um álcool de açúcar, 10% a 70% (p/p) de um estabilizador de volume, 4% a 50% (p/p) de um estabilizador de proteína e um tampão tendo um pH de 6,8 a 8,0, e um veículo líquido farmaceuticamente aceitável.

12. Vacina de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que, na formulação seca compreendendo um parvovírus vivo atenuado, o álcool de açúcar é selecionado do grupo consistindo em sorbitol, manitol, xilitol, maltitol e combinações dos mesmos, em que o estabilizador de volume é selecionado do grupo consistindo em dextrano, maltodextrina, polivinilpirrolidona, hidroxietilo de amido, glicina, manitol ou combinações dos mesmos, em que o estabilizador de proteína é selecionado do grupo consistindo em gelatina, um hidrolisado proteolítico de caseína integral ou uma combinação dos mesmos.