ES2639397T3 - Composición vítrea seca que comprende un material bioactivo - Google Patents

Composición vítrea seca que comprende un material bioactivo Download PDF

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January Scarbrough
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Abstract

Un método para preparar una composición seca estable que comprende un material bioactivo, un agente formador de matriz y un agente formador de cristales, comprendiendo dicho método: (a) combinar el material bioactivo, el agente formador de matriz y el agente formador de cristales en una solución; (b) congelar instantáneamente la suspensión de la etapa (a) en nitrógeno líquido para formar una composición amorfa en perlas, hebras o gotitas; (c) secado primario de las partículas congeladas purgadas de la etapa (b) bajo vacío a una presión entre 2000 y 10000 mTORR y a una temperatura por encima del punto de congelación de las partículas; y (d) efectuar un secado secundario de las partículas secadas primariamente de la etapa (c) bajo presión a vacío completo y a una temperatura que va de 30 a 60ºC.

Description

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DESCRIPCION
Composicion vftrea seca que comprende un material bioactivo Antecedentes de la invencion Campo de la invencion
La presente invencion se relaciona con la estabilizacion y proteccion de materiales biologicos durante almacenamiento y condiciones de uso agresivas, y mas particularmente, la invencion se relaciona con la incorporacion de materiales bioactivos y biologicos incluyendo bacterias vivas en una formulacion protectora de una matriz vftrea amorfa.
Tecnica relacionada
La liofilizacion ha sido el metodo mas comun de conservar sustancias biologicas sensibles tales como bacterias vivas o muertas y virus y protemas, mientras que otros metodos tales como secado por aspersion, secado por aspersion fluidizada y desecacion en general no son adecuadas. Las altas temperaturas de secado utilizadas en estos metodos dan como resultado un dano significativo del material bioactivo mismo. Ademas, pueden no secar suficientemente el material hasta la humedad residual espedfica o actividad de agua requeridos para la estabilidad del producto y asf puede requerirse otra etapa adicional de secado por otros medios. Un proceso de liofilizacion convencional involucra ftpicamente la congelacion de la solucion que contiene el material bioactivo, y liofilizar el biomaterial congelado bajo vacfo completo mientras permanece congelado. Las bajas temperaturas de este proceso de liofilizacion hacen disminuir la reaccion de degradacion del material bioactivo y minimiza la perdida de actividad en la forma seca final. Frecuentemente el proceso de liofilizacion da como resultado una perdida significativa de actividad y dano al material bioactivo debido a la formacion de cristales de hielo durante el proceso de secado lento. Adicionalmente, la etapa de congelacion en si misma, si no se hace correctamente, puede desnaturalizar o inactivar el material bioactivo. El dano causado por la formacion de una estructura de cristales de hielo puede ser evitado, hasta cierto grado, mediante la adicion de agentes crioprotectores a la solucion bioactiva (Morgan et al., 2006). Tales agentes protectores son agentes qrnmicos altamente solubles que se agregan a una formulacion para proteger las membranas y protemas celulares durante la congelacion y para potenciar la estabilidad durante el almacenamiento. Estabilizadores comunes como bacterias y virus vivos incluyen azucares superiores tales como sacarosa, glicerol o sorbitol, a altas concentraciones con el material celular o bioactivo (Morgan et al., 2006; Capela et al., 2006). Sin embargo, tales agentes protectores pueden no penetrar adecuadamente la celula para proteger los componentes activos dentro del volumen intracelular lo cual puede llevar a una inestabilidad durante el almacenamiento de las sustancias liofilizadas. Por esta razon, los biomateriales membranosos tales como virus, bacterias y celulas no sobreviven bien en el proceso de liofilizacion. Por lo tanto, sigue siendo un desafto significativo desarrollar un proceso de secado y una formulacion optimos que minimicen las perdidas por secado a la vez que se alcanza una estabilidad de almacenamiento adecuado de material seco.
Algunos de los problemas asociados con la liofilizacion, han sido resueltos utilizando una combinacion de ciertas formulaciones y secado al vacfo en un estado vftreo, particularmente en cristales de azucar (Patente de los Estados Unidos 6,190,701). Los materiales bioactivos estabilizados secos son protegidos en una matriz vftrea contra ambientes hostiles tales como altas temperaturas y humedad. En general, la estabilizacion por la formacion de cristales es iniciada concentrando la solucion de azucar que contiene una molecula bioactiva para formar un jarabe sobresaturado. La eliminacion posterior del agua progresivamente solidifica el jarabe, el cual eventualmente se convierte en un cristal de azucar solido con un contenido de agua residual bajo. La difusion qrnmica es despreciable en el cristal y por lo tanto las reacciones qrnmicas virtualmente cesan. Puesto que la desnaturalizacion o danos en la membrana son cambios qrnmicos, no pueden ocurrir en el cristal y el material bioactivo es estabilizado y protegido. Muchos cristales fallan en estabilizarse debido a que reaccionan con el material bioactivo durante el almacenamiento. Se presentan problemas obvios con los azucares reductores, los cuales pueden formar buenos cristales ffsicos, pero luego sus grupos aldetftdo atacan los grupos amino sobre el material bioactivo en una reaccion de Maillard ftpica, mientras que los azucares no reactivos dan productos estables, que no requieren refrigeracion en absoluto.
Puesto que los azucares son inherentemente higroscopicos, la eliminacion de agua y el secado final del jarabe sobresaturado se hace extremadamente diffcil. Esta desventaja fue abordada inicialmente por (Annear 1962) quien desarrollo una formulacion que contema bacterias en una solucion de azucar y aminoacidos y un proceso de secado al vacm que involucra ebullicion y formacion de espuma del jarabe concentrado. Roser et al. (Patente de los Estados Unidos 6,964,771) divulga un concepto similar de secado por formacion de espuma que incluye una etapa de concentracion evaporando el conjunto del solvente seguida por ebullicion y espumacion del jarabe concentrado bajo vacfo. Para mitigar la oxidacion y el dano por desnaturalizacion que puede presentarse durante la etapa de ebullicion, Bronshtein (Patentes de los Estados Unidos 5,766,520, 7,153,472) introdujeron una formula protectora mejorada que contema carbohidratos y surfactantes. El secado de la solucion protectora tambien involucraba un proceso paso a paso de concentracion bajo un vacfo moderado antes de la aplicacion de un vacm fuerte para producir una ebullicion espumosa del agua restante para formar espuma estable y seca. Para obviar la etapa de
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ebullicion, Busson y Schroeder (Patente de los Estados Unidos No. 6,534,087) han introducido un proceso de secado en estado Uquido de una formulacion adecuada para materiales bioactivos sensibles y utilizando un horno de vado bajo una presion de vado muy moderada por encima de 30 Torr. Despues de alcanzar un cierto nivel de secado sin hervir el material, se aplico calor por encima de 20°C y el material secado fue recolectado despues de solo unas pocas horas.
Este tipo de proceso de secado, en el cual la solucion bioactiva es mantenida en estado lfquido durante el proceso de secado completo, tiene la ventaja de un secado mas rapido debido a la evaporacion del lfquido durante la ebullicion y el area superficial incrementada presentada por las superficies espumosas. Sin embargo, la ebullicion y el espumado requieren la aplicacion de una cantidad significativa de calor para proveer la erupcion necesaria de la solucion. Tal proceso de secado no es bien adaptado para secar materiales biologicos sensibles, tales como virus, celulas o bacterias viables porque, el calor aplicado acelera la degradacion enzimatica (por ejemplo, proteolisis) y oxidacion qmmica (por ejemplo, oxidacion y ataque por radicales libres), los cuales pueden destruir la actividad o viabilidad del material biologico.
El proceso de secado descrito mas arriba tambien esta limitado en su capacidad de ser escalado a un proceso industrial grande. El evitar la congelacion requiere que el proceso sea llevado a cabo a un nivel de vado bajo (> 7 TORR) que en los ciclos de procesos de liofilizacion o liofilizacion por aspersion convencionales. La desventaja mas significativa de los procesos anteriores es la incapacidad para controlar y limitar la expansion de la espuma dentro del recipiente, bandeja o vial. La erupcion incontrolable y frecuentemente la formacion excesiva de espuma hace practicamente imposible desarrollar un proceso a escala industrial. La naturaleza de la erupcion y espumado de la etapa de ebullicion da como resultado que una porcion de material sea esparcida sobre las paredes del recipiente y hacia la camara de secado. Para suavizar la erupcion durante la ebullicion, Bronshtein (Patentes de los Estados Unidos numeros 6,884,866, 6,306,345) ha propuesto camaras especiales y un protocolo de aplicacion de temperatura/presion controladas que reduce el sobrecalentamiento hasta un nivel aceptable. Otra metodologfa para contener la erupcion y la espumacion excesiva esta descrita en la Publicacion de Patente de los Estados Unidos No. 2008/0229609, en el cual la solucion bioactiva es encerrada en un contenedor o bolsa cubierto con membranas respirables. Una vez mas, estos protocolos son diffciles de implementar a nivel industrial, requieren equipo especial y son diffciles de reproducir confiablemente con diferentes formulaciones.
El proceso de espuma seca, como es conocido en la tecnica, no esta particularmente bien adaptado para la conservacion de materiales biologicos membranosos, tales como liposomas, virus, o celulas y bacterias viables. Las membranas lipfdicas evitan frecuentemente la penetracion de los agentes protectores en volumenes encerrados o evitan la eliminacion adecuada de agua desde el volumen encerrado. Sin la penetracion adecuada de los agentes protectores, los procesos enzimaticos, tales como la proteolisis, y los procesos qmmicos, tales como la oxidacion y los ataques por radicales libres, pueden destruir la actividad o viabilidad del material biologico membranoso. Los fluidos hipoosmoticos dentro de volumenes encerrados en la membrana pueden promover la inestabilidad del material biologico. Truong-le, Vu (Patente de los Estados Unidos No. 7,381,425) describe un proceso de liofilizacion adecuado para materiales bioactivos membranosos. Las composiciones de la invencion incluyen un poliol y un material bioactivo membranoso. El proceso de secado comienza enfriando la formulacion hasta una temperatura de aproximadamente la temperatura de transicion de fase de las membranas lipfdicas, reduciendo la presion sobre la formulacion para formar una espuma estable, congelar la espuma, y luego sublimar el agua desde la espuma congelada para proveer una composicion en espuma seca liofilizada. Pueden emplearse condiciones de secado secundarias para secar adicionalmente la espuma.
Entre otras composiciones bioactivas descritas en la tecnica anterior, la GB-A-1232057 describe una composicion finamente pulverizada que contiene leche en polvo desnatada la cual se granula para mejorar su capacidad de reconstitucion con lfquidos acuosos manteniendo la composicion en la forma de un lecho fluidizado, e introducir vapor en contacto con la contracorriente del lecho para mantener gasificado el lecho. La composicion puede incluir azucares, vitaminas, minerales, protemas, grasas, agentes voluminizantes tales como metilcelulosa, glutamato de mono sodio y colorantes. La US-A-2004/241313 ensena una composicion alimenticia proteinacea que comprende protema, eritritol, jarabe de maltitol, glicerol, inulina y maltodextrina, y un proceso para preparar la composicion alimenticia proteinacea. La US-A-5262187 esta relacionada con una mezcla seca baja en grasa, masa lista para usar y una composicion horneada compuesta de una base de ingredientes de granos de cereales endulzados con un sistema mimetico de grasa de polidextrosa, material celulosico, un solido lacteo no graso o sustituto, emulsificante, almidon alimenticio modificado, y una mezcla de goma de xantano inicial y goma guar o de algarrobo, preferiblemente con lecitina y concentrado de protema de suero. La composicion horneada es humeda, tierna, grumosa con buena sensacion bucal, pero preferiblemente contiene un tercio menos de calonas que una composicion similar con contenido completo de grasa. La USA-2007/031534 se relaciona con un alimento para mascotas que contiene aminoacidos o sales de los mismos, en vez de materiales protemicos crudos con baja alerginicidad, seleccionados de patata, patata dulce, arroz, millo cola de zorro, millo de establo, kaoliang, mafz, guisantes, levadura de cervecena, y levadura de panadena.
Sigue existiendo una necesidad por una formulacion protectora adecuada que pueda ser secada en estado vttreo sin ebullicion ni excesiva espumacion. Hay una necesidad particularmente para una formulacion efectiva en costes y un proceso de secado escalable que tambien sea adecuado para aplicaciones por fuera de la industria farmaceutica,
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tales como las industrias alimentaria y agncola. Se requieren formulaciones protectoras y procesos de secado moderados para proveer un secado adecuado sin exposicion a altas temperatures. Se requiere de una composicion que pueda proteger tales materiales biologicos en almacenamiento bajo condiciones de alta temperature y humedad. La presente invencion proporciona una solucion a todos estos retos tal como se describe a continuacion. El proceso de deshidratacion de la presente invencion es muy suave y no expone al agente activo a ebullicion o espumacion y por lo tanto es ventajoso con respecto a las tecnicas de liofilizacion y secado en espuma convencionales que sometenan la muestra a una o ambas de estas tensiones.
Resumen de la invencion
La presente invencion incluye composiciones y metodos de secado para conservar materiales biologicos sensibles, tales como peptidos, protemas, enzimas, hormonas, vitaminas, carotenoides, minerales, farmacos, antibioticos, microbicidas, fungicidas, herbicidas, insecticidas, espermicidas, acidos nucleicos, anticuerpos, vacunas, bacterias (probioticas u otras), virus y/o suspensiones celulares en almacenamiento. Los metodos de secado proveen un proceso para secar una formulacion que comprende los materiales bioactivos, un agente formador de matriz, y un agente formador de cristales. La formulacion se prepara dispersando todos los componentes solidos y los materiales bioactivos en una solucion. La solucion es congelada instantaneamente por medios conocidos en la tecnica tales como nitrogeno lfquido o hielo seco para formar una composicion amorfa en pequenas perlas, hebras o gotitas. Las partmulas congeladas pueden ser almacenadas en un congelador profundo (entre -30°C y -80°C) hasta el secado, o son colocadas inmediatamente sobre bandejas en un estado amorfo congelado para secado en lfquido en un liofilizador convencional. El metodo de secado es iniciado mediante una purga corta y una etapa de estabilizacion de la estructura de las partmulas congeladas bajo una presion de vacm de menos de < 2000 mTORR seguida por una etapa de secado primaria bajo mas de mayor de 2000 mTORR de presion de vacfo y a una temperatura deseada. Durante la etapa secundaria y final de secado de material amorfo vttreo, se aplican una presion de vacfo completa y temperatura elevada, para alcanzar un nivel deseable de actividad de agua de material seco.
En una realizacion, la formulacion comprende cantidades suficientes de agentes formadores de matriz, en la cual se integra el material bioactivo. Ejemplos de un agente de matriz adecuado incluyen, pero no se limitan, acetato ftalato de celulosa (CAP), carboximetilcelulosa, pectina, alginato de sodio, sales de acido algmico, hidroxilpropilmetilcelulosa (HPMC), metilcelulosa, carragenano, Goma guar, goma de acacia, goma xantano, goma de algarrobo, quitosano y derivados de quitosano, colageno, acido poliglicolico, almidones y almidones modificados, ciclodextrinas y oligosacaridos (inulina, maltodextrinas, dextranos, etc.); y combinaciones de los mismos. En una realizacion particular, el agente formador de matriz preferido es alginato de sodio. Preferiblemente, la formulacion comprende, en porcentaje en peso de la materia seca total, 0.1-20% y mas preferiblemente 1-12%.
En una realizacion adicional, el agente formador de matriz comprende una mezcla de alginato de sodio y oligosacaridos en una relacion en peso de 1:1-10, mas preferiblemente 1:1-5 de alginato de sodio/oligosacaridos.
En aun otra realizacion de la presente invencion, el agente formador de matriz es entrecruzado con iones metalicos divalentes para formar un hidrogel firme. La formulacion de hidrogel entrecruzada es formada atomizando o extrudiendo la suspension en un bano que contiene solucion de iones metalicos divalentes o agregando iones metalicos divalentes directamente a la suspension y permitiendo que la formulacion se endurezca para formar un hidrogel. La formulacion de un hidrogel es congelada entonces de forma instantanea y secada de acuerdo con los metodos de secado de la invencion.
En aun otra realizacion, la formulacion comprende cantidades significativas de agentes formadores de cristales, en los cuales estan embebidos los microorganismos. Ejemplos de un agente adecuado incluyen pero no se limitan a protemas tales como albumina de huevo, clara de huevo, gelatina, inmunoglobulina, protema de soja aislada, protema de trigo, protema de guisante, protema de algodon, leche en polvo desnatada, caseinato, protema de suero y cualquier protema hidrolizada; carbohidratos incluyendo monosacaridos (por ejemplo, galactosa, D-manosa, sorbosa, etc.), disacaridos (por ejemplo, lactosa, trehalosa, sacarosa, etc.), un aminoacido tal como lisina, glutamato, glicina, alanina, arginina o histidina. Asf como aminoacidos hidrofobos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etc.); una metilamina tal como betama; una sal excipiente tal como sulfato de magnesio; un poliol tal como alcoholes tritudricos de azucar superiores, (por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol); propilenglicol; polietilenglicol; pluronicos; surfactantes; y combinaciones de los mismos.
En una realizacion preferida, el agente formador de cristal comprende una mezcla de un disacarido y una protema hidrolizada. En una realizacion particular, el agente formador de cristales preferidos es una mezcla de trehalosa y protema hidrolizada. Preferiblemente, la formulacion comprende, en porcentaje en peso de la materia seca total, 1090% de trehalosa y 0.1-30% de protema hidrolizada, mas preferiblemente 20-80% de trehalosa y 0.1-20% de protema hidrolizada, y lo mas preferiblemente 40-80% de trehalosa y 0.1-20% de protema hidrolizada.
El metodo de la invencion incluye tfpicamente mezclar en una solucion los materiales bioactivos (por ejemplo, peptidos, protemas, enzimas, hormonas, vitaminas, carotenoides, minerales, farmacos, antibioticos, microbicidas, fungicidas, herbicidas, insecticidas, espermicidas, acidos nucleicos, anticuerpos, vacunas, bacterias, virus y/o suspensiones celulares), al menos un agente formador de matriz y al menos dos agentes formadores de cristales en
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una suspension homogenea, con congelacion instantanea de la suspension por atomizacion, goteo o extrusion en un bano de nitrogeno Kquido. La recoleccion de las perlas, microperlas, hebras o gotitas del bano de nitrogeno Ifquido y secado en un estado lfquido en un liofilizador, o almacenamiento alternativo en un congelador profundo (entre -30°C y -80°C) hasta el secado.
En una variacion de la presente invencion, la cantidad del agente formador de matriz en la formulacion se ajusta para alcanzar una viscosidad y densidad de formulacion deseada que permite un secado primario eficiente a la vez que evita la ebullicion y la espumacion excesiva que ocurren tipicamente durante la etapa de secado en lfquido primaria. Una densidad deseada de la formulacion lfquida puede alcanzarse por medios conocidos en el arte, por ejemplo, banar o inyectar gas tal como aire, nitrogeno, dioxido de carbono, argon, etc. Preferiblemente, se inyecta nitrogeno en la formacion de suspension viscosa bajo mezcla para formar una suspension porosa o cremosa estable antes de la etapa de congelacion instantanea.
De acuerdo con la invencion, el proceso de secado involucra tres etapas principales; 1. Etapa de purga corta y estabilizacion de la estructura de las partfculas congeladas bajo una presion de vado de menos de 2000 mTORR, 2. Etapa de secado lfquido primaria bajo presion de vado de mas de 2000 mTORR y a una temperatura deseada, 3. Etapa de secado secundaria y final del material vttreo bajo presion de vado completa y temperatura elevada durante un tiempo suficiente para reducir la actividad de agua de la formulacion secada a 0.3 Aw o menos.
En realizaciones preferidas de los metodos de secado, el material bioactivo es mezclado en una solucion que incluye un agente formador de matriz y un agente formador de cristales. En una realizacion particular, el material bioactivo comprende bacterias vivas (por ejemplo, bacterias probioticas). Ejemplos de microorganismos adecuados incluyen, pero no se limitan a, levaduras tales como Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia yTorulopsis, mohos tales como Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium y Torulopsis, y bacterias tales como los generos Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuriaw, Staphylococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus y Lactobacillus. Ejemplos espedficos de microorganismos probioticos adecuados estanan representados por las siguientes especies e incluyen todos los biotipos de cultivo dentro de esas especies: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentus, B. licheniformis, B. mesentericus, B. pumilus, B. subtilis, B. natto, Bacteroides amylophilus, Bac. capillosus, Bac. ruminocola, Bac. suis, Bifidobacterium adolescents, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudolongum, B. thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacetylactis, E faecium, E. intermedius, E. lactis, E. muntdi, E. thermophilus, Escherichia coli, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarius, L. amylovorus, L. crispatus, L. brevis, L. case 4 L. curvatus, L. cellobiosus, L. delbrueckii ss. bulgaricus, L farciminis, L. fermentum, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. johnsonii, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarius, Leuconostoc mesenteroides, P. cereviseae (damnosus), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop. shermanii, Saccharomyces cereviseae, Staphylococcus carnosus, Staph. xylosus, Streptococcus infantarius, Strep. salivarius ss. thermophilus, Strep. Thermophilus y Strep. lactis.
En metodos preferidos, la formulacion es mezclada a temperatura ambiente o ligeramente calentada para ayudar en solubilizacion de los materiales en la solucion viscosa (por ejemplo, de 20°C a 40°C). Despues de mezclar hasta homogeneidad, la suspension viscosa es luego congelada instantaneamente atomizando, sumergiendo o extrudiendo en nitrogeno lfquido. Las partfculas congeladas son recolectadas desde el bano en nitrogeno lfquido y son secadas inmediatamente o almacenadas alternativamente en congelacion profunda para secado posterior. Tfpicamente, la suspension que contiene el material bioactivo es congelado instantaneamente hasta entre -30°C a - 180°C, mas preferiblemente la formulacion es congelada instantaneamente en nitrogeno lfquido.
En una realizacion preferida, las partfculas congeladas instantaneamente son secadas inmediatamente o de una u otra manera almacenadas en un congelador profundo, preferiblemente a -80°C, hasta el secado. Las partfculas congeladas son cargadas entonces sobre bandejas y transferidas inmediatamente a una camara de secado al vado donde son secadas de acuerdo con la presente invencion. Preferiblemente, el secado es iniciado por sometimiento a las partfculas congeladas bajo presion de vado entre 0 y 2000 mTORR. Las partfculas congeladas son desgasificadas y su estructura y volumen se dejan desarrollar y estabilizar durante un penodo corto de tiempo. Tfpicamente, el penodo de tiempo deseable para someter la partfcula congelada a presion de vado alta es no mayor de 30 minutos, mas preferiblemente el penodo de tiempo esta entre 1 y 20 minutos. Despues de la corta desgasificacion inicial y estabilizacion de la estructura de las partfculas congeladas, el vado es ajustado a entre 2000 y 10,000 mTORR y se aplica calor para descongelar las partfculas a una temperatura por encima de su punto de congelacion. Tfpicamente, el vado se ajusta a entre 2000 y 4000 mTORR y la temperatura de partfcula se incrementa a entre -5°C y + 5°C. Bajo estas condiciones de secado primarias, las partfculas primarias son descongeladas rapidamente y suavemente mantienen su forma original a la vez que comienza una deshidratacion acelerada. El secado secundario subsecuente es establecido despues de eliminar aproximadamente 60-90% del agua libre, se aplica una presion de vado maxima y una temperatura de suministro de calor a la formulacion se eleva desde 30°C hasta 60°C. Para maximizar la estabilidad del producto final, la formulacion es secada preferiblemente durante un tiempo suficiente para reducir la actividad de agua de la formulacion a Aw = 0.3 o menos. En una realizacion preferida de la invencion, el secado secundario comprende la eliminacion del agua enlazada a una presion de menos de 1000 mTORR.
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La formulacion secada puede ser utilizada directamente como una escama, o triturada en un polvo y tamizada hasta un tamano de partfcula promedio que va desde aproximadamente 10 pm hasta aproximadamente 1000 pm. La formulacion puede ser suministrada directamente a un animal, incluyendo al hombre, como un polvo concentrado, un Ifquido reconstituido (por ejemplo, una bebida), o puede ser incorporado bien sea en forma de escamas o polvo a un producto alimenticio o de pienso existente.
Breve descripcion de las figuras
Figura 1. Observaciones visuales y microscopicas de diferentes composiciones secadas que contienen diversas matrices y agentes formadores de cristales como perlas solidas congeladas de acuerdo con el metodo de la presente invencion.
Figura 2. El efecto de la forma de cultivo de L. rhamnosus como perlas frescas, congeladas o cultivos en polvo seco sobre sus recuentos de CFU iniciales en una composicion seca.
Figura 3. El efecto de la temperatura de congelacion de una composicion que contiene L. rhamnosus como perlas solidas congeladas en nitrogeno lfquido o en congelacion profunda a -80°C y como una suspension viscosa no congelada a +4°C sobre los recuentos de CFU bacterianos iniciales en la composicion seca. Los resultados muestran solamente el efecto de la temperatura de congelacion de la suspension sin etapa adicional de purga antes del secado.
Figura 4. El efecto de la temperatura de congelacion de una composicion que contiene Bifidobacterium animalis Bb12 como perlas solidas congeladas en nitrogeno lfquido y como una suspension viscosa no congelada a + 4°C sobre los recuentos bacterianos de CFU iniciales en la composicion seca. Los resultados muestran solamente el efecto de la temperatura de congelacion de la suspension sin etapa adicional de purga antes del secado.
Figura 5. El efecto de la duracion de la purga bajo vacfo de perlas solidas congeladas sobre los recuentos de CFU iniciales de L. rhamnosus en una composicion seca.
Figura 6. Perfil de secado en un liofilizador de la composicion de acuerdo con el metodo de la invencion.
Figura 7. Perdida por proceso y secado de L. rhamnosus en composiciones y metodos de secado de la invencion.
Figura 8. Tendencias de estabilidad de bacterias probioticas secas, composicion de L. rhamnosus en almacenamiento a 40°C y 33% de humedad relativa.
Descripcion detallada de la invencion
Definiciones
Debe entenderse que la terminologfa usada aqu tiene el proposito de describir realizaciones particulares unicamente.
Tal como se utiliza en esta especificacion y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "uno", "una", y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Asf, por ejemplo, la referencia a "una protema" incluye una protema singular o combinacion de dos o mas protemas; una referencia a "enzimas", "vitaminas", "bacterias", etc., incluye el singular o mezclas de varias, y similares.
"Material bioactivo", "composicion bioactiva" o "formulacion bioactiva" se refiere a preparaciones, las cuales estan en tal forma que permiten que la actividad biologica de los ingredientes bioactivos sea ineqmvocamente efectiva.
"Agente formador de matriz" se refiere a compuestos o materiales que se agregan a la formulacion para incrementar la viscosidad y/o la densidad de la formulacion humeda o para formar un hidrogel. Ejemplos de un agente formador de matriz adecuado incluyen, pero no se limitan a derivados de celulosa solubles en agua tales como metilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxietilcelulosa e hipromelosa; alginatos, galactomanano, goma de gelano, tragacanto, incluyendo cualquier derivado de estos, acetato ftalato de celulosa (CAP), carboximetilcelulosa, pectina, alginato de sodio, sales de acido algmico, hidroxilpropilmetilcelulosa (HPMC), metilcelulosa, carragenano, goma guar, goma de acacia, goma xantano, goma de algarrobo, quitosano y derivados de quitosano, colageno, acido poliglicolico, almidones y almidones modificados, ciclodextrinas y oligosacaridos (inulina, maltodextrinas, dextranos, etc.) y combinaciones de los mismos.
"Agente formador de cristales" o "agente formador de cristales de azucar" se refiere en general a compuestos o materiales que son facilmente solubles en una solucion y que no se espesan o polimerizan por contacto con agua. Estos agentes son agregados para asegurar o incrementar la estabilidad del material bioactivo durante el proceso de
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secado y posteriormente, o para la estabilidad en almacenamiento a largo plazo del producto pulverizado seco. Los agentes formadores de cristales utiles pueden ser monomericos, oligomericos y polimericos.
De acuerdo con una de las realizaciones preferidas, los agentes formadores de cristales son un sacarido. Un sacarido, o carbohidrato, se define como un compuesto predominantemente compuesto de carbono, hidrogeno y oxfgeno. Sacaridos utiles incluyen azucares reductores y no reductores y alcohol azucares, oligosacaridos, polisacaridos solubles en agua y derivados de los mismos. Los sacaridos preferidos de acuerdo con la invencion incluyen glucosa, fructosa, lactosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, celobiosa, galactosa, maltotriosa, rafinosa, dextrina, dextrano, inulina, manitol, sorbitol, xilitol. Sacaridos particularmente preferidos son glucosa y trehalosa.
Otros agentes formadores de cristales utiles pueden ser seleccionados de otras clases qmmicas, tales como aminoacidos solubles en agua, peptidos o protemas y protema hidrolizada. Por ejemplo, lisina, glicina, alanina, arginina o histidina, asf como aminoacidos hidrofobos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etc.); una metilamina tal como betama. Protemas utiles incluyen gelatina, albumina de huevo, clara de huevo, protema de suero, caseinato, inmunoglobulinas, protema de soja, protema de guisante, protema de algodon u otras protemas alimenticias, lacteas o vegetales.
"Protemas hidrolizadas" se refiere en general a protemas bien sea de una fuente animal, lactea o vegetal que han sido escindidas por hidrolisis o digestion enzimatica en fragmentos peptfdicos mas cortos y/o aminoacidos. Protemas hidrolizadas utiles son las sometidas a un proceso de hidrolisis extensiva que reduce el peso molecular del 99% de las protemas nativas a menos de 50,000 Dalton, preferible a menos de 10,000 Dalton.
Temperaturas o condiciones "ambiente" son aquellas que se dan en cualquier momento en un ambiente dado. Tfpicamente, la temperatura ambiente es 22-25°C, la presion atmosferica ambiente y la humedad ambiente son medidas facilmente y variaran dependiendo de la epoca del ano, tiempo y condiciones climaticas, altitud, etc.
"Purga" o "desgasificacion" en el contexto de la presente invencion se refiere a la liberacion de un gas desde una formulacion solida o lfquida en donde la presion parcial del gas es mayor que la presion aplicada. Esto no es la ebullicion de una solucion en forma lfquida, y puede presentarse frecuentemente a presiones por encima de una presion en la que hana ebullicion una solucion.
"Ebullicion" se refiere a la transicion de fase rapida de lfquido a gas que tiene lugar cuando la temperatura de un lfquido esta por encima de su temperatura de ebullicion. La temperatura de ebullicion es la temperatura a la cual la presion de vapor de un lfquido es igual a la presion aplicada. La ebullicion puede ser particularmente vigorosa cuando se agrega calor a un lfquido que ya esta en su punto de ebullicion.
"Actividad de agua" o "Aw" en el contexto de las composiciones de formulacion secas, se refiere a la disponibilidad de agua y representa el estado de energfa del agua en un sistema. Se define como la presion de vapor de agua por encima de una muestra dividida por la del agua pura a la misma temperatura. El agua destilada pura tiene una actividad de agua de exactamente uno o Aw = 1.0.
"Humedad Relativa" o "RH" en el contexto de la estabilidad al almacenamiento se refiere a la cantidad de vapor de agua en el aire a una temperatura dada. La humedad relativa es usualmente menor que la requerida para saturar el aire y se expresa en porcentaje de saturacion de humedad.
“Seco” y variaciones del mismo se refieren a un estado ffsico que es liofilizado, deshidratado o anhidro, esto es, sustancialmente carente de lfquido. El secado incluye, por ejemplo, secado por aspersion, secado en lecho fluidizado, liofilizacion y secado al vacm.
“Liofilizar" o "liofilizacion" se refiere a la preparacion de una composicion en forma seca por congelacion y deshidratacion rapida en el estado congelado (denominado algunas veces sublimacion). Este proceso puede tener lugar bajo vacm a una presion suficiente para mantener el producto congelado, preferiblemente inferior a aproximadamente <2000 mTORR.
"Secado primario" o "secado en lfquido", con respecto a los procesos descritos aqrn, se refiere al secado por deshidratacion que tiene lugar desde el momento de la descongelacion de las partmulas congeladas hasta el punto en donde comienza el secado secundario. Tfpicamente, el volumen de secado primario tiene lugar por evaporacion extensiva, mientras que la temperatura del producto permanece significativamente inferior a las temperaturas de la fuente de calor. Este proceso puede tener lugar bajo vacm a una presion suficiente para mantener el producto congelado, preferiblemente por encima de aproximadamente 2000 mTORR.
"Secado secundario” con respecto a los procesos descritos aqrn, se refiere a una etapa de secado que tiene lugar a temperaturas por encima de las temperaturas de congelacion de la formulacion y cerca a la temperatura de la fuente de calor. Este proceso puede tener lugar bajo vacm a una presion suficiente para reducir la actividad de agua de una formulacion, preferiblemente menos de aproximadamente <1000 mTORR. En un proceso de secado de formulacion tfpico, una segunda etapa de secado reduce la actividad de agua de la formulacion hasta un Aw de 0.3 o menos.
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"Formacion de espuma" se refiere a un procedimiento para secar agentes biologicos sensibles haciendo ebullicion bajo vado bajo condiciones en las que los agentes biologicos retienen la actividad o viabilidad durante penodos extendidos de tiempo a temperaturas ambiente y superiores. El procedimiento espedfico para la formacion de una estructura porosa mecanicamente estable procede en dos etapas: (1) Secado en Espuma Primario y ebullicion bajo vado (2) Secado/Vitrificacion en estabilidad, y estan divulgados en la Patente de Estados Unidos Numero 5, 766, 520 de Bronshtein.
Una formulacion o composicion "estable" es aquella en la cual el material biologicamente activo en la misma retiene esencialmente su estabilidad ffsica, estabilidad qmmica y/o estabilidad biologica por almacenamiento. La estabilidad puede medirse a condiciones de temperatura y humedad seleccionadas durante un penodo de tiempo seleccionado. Puede utilizarse el analisis de tendencia para estimar una vida util esperada antes de que el material sea puesto en almacenamiento realmente durante ese penodo de tiempo. Para bacterias vivas, por ejemplo, la estabilidad se define como el tiempo que tarda en perderse 1 log de CFU/g de formulacion seca bajo condiciones predefinidas de temperatura, humedad y penodo de tiempo.
"Viabilidad" con respecto a bacterias se refiere a la capacidad para formar una colonia (CFU o Unidad Formadora de Colonias) sobre un medio nutritivo apropiado para el crecimiento de las bacterias. La viabilidad, con respecto a virus, se refiere a la capacidad de infectar y reproducirse en una celula huesped adecuada, dando como resultado la formacion de una placa sobre un tapiz de celulas huesped.
Las composiciones y metodos de la presente invencion resuelven el problema de proveer procesos de secado efectivos en costes e industrialmente escalables para formulaciones que contienen materiales bioactivos sensibles, tales como peptidos, protemas, enzimas, hormonas, vitaminas, carotenoides, minerales, farmacos, antibioticos, microbicidas, fungicidas, herbicidas, insecticidas, espermicidas, acidos nucleicos, anticuerpos, vacunas, bacterias, suspensiones de virus y/o celulas, con un tiempo de vida significativamente extendido en estado seco.
La invencion provee una composicion que comprende un material bioactivo y una matriz y agentes formadores de cristales en una mezcla en solucion y un metodo de secado que comprende congelacion instantanea de dicha composicion en nitrogeno ffquido para formar una estructura solida amorfa en la forma de gotitas, hebras, perlas o microperlas y purgar las parffculas congeladas bajo alto vado seguido por la estabilizacion del material bioactivo en una formacion de cristal de azucar liofilizando o evaporando la humedad bajo un regimen de presion reducida a la vez que se suministra calor a la composicion.
La mayor parte de la perdida de viabilidad de los microorganismos durante los procesos de secado puede atribuirse a una combinacion de formacion de cristales de hielo, altas tensiones osmoticas y oxidativas, fuerzas de cizallamiento y liberacion de energfa durante las cavitaciones de burbujas asociadas con la "ebullicion" y espumacion de la solucion bajo baja presion y alta temperatura de secado. La presente invencion evita tales efectos negativos y provee composiciones y metodos de secado con una minima perdida lo que da como resultado un material bioactivo protegido en una matriz de cristales de azucar bajo condiciones agresivas de almacenamiento y manipulacion despues del mismo.
Composiciones de la invencion
La presente invencion incluye composiciones de un material bioactivo, un agente formador de matriz y agentes formadores de cristales en una solucion viscosa. Se encontro que las formulaciones de la invencion son inherentemente diferentes en su estructura ffsica y funcion de las formulaciones no viscosas o concentradas que fueron secadas con o sin congelacion instantanea y purga. Por ejemplo, las formulaciones de la tecnica anterior fueron inicialmente "espumadas" llevando a ebullicion para facilitar el secado efectivo. La etapa de espumado dio como resultado en general una ebullicion y erupcion extensiva de la solucion lo que tiene una consecuencia inevitable del secado en un estado ffquido y como resultado, solo puede alcanzarse una capacidad de carga muy baja de un material en un vial o un recipiente (vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,534,087, en la que el espesor del producto espumado final es menor de 2 mm).
Las composiciones y metodos de secado de la presente invencion evitan la ebullicion y la espumacion extensiva de la formulacion permitiendo por lo tanto una carga mucho mayor de material por area de secado y, como resultado, puede ser escalado facilmente a la produccion de cantidades grandes de material sin el uso de recipientes, bandejas o equipos espedficamente disenados.
Las bacterias probioticas han demostrado beneficiarse particularmente de las formulaciones y metodos de secado de la presente invencion. La formulacion se prepara de acuerdo con las composiciones y metodos de la invencion incluyendo la mezcla de cultivos frescos, congelados o secos de bacterias probioticas con al menos un agente formador de matriz y al menos dos agentes formadores de cristales, congelacion instantanea de la formulacion viscosa en nitrogeno ffquido para formar una estructura amorfa de gotitas, hebras o perlas solidas congeladas. Para el secado primario, se aplica suficiente presion de vapor para purgar y estabilizar la estructura de las parffculas congeladas y luego las parffculas congeladas son liofilizadas o evaporadas bajo presion de vado reducida y
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temperatura incrementada por encima de la temperatura de congelacion de la formulacion. El mantenimiento de la temperatura de la formulacion por encima del punto de congelacion puede lograrse por conduccion de calor desde la formulacion, y/o por perdida de calor latente debido a la evaporacion del agua. Para completar el proceso de secado y reducir adicionalmente la actividad de agua de la formulacion, puede aplicarse una etapa de secado secundaria, a una presion de vapor superior de 1000 mTORR e inferior y a una temperatura elevada de hasta 70°C, para proveer una composicion final con actividad de agua con un Aw de 0.3 o inferior. Tal composicion puede permanecer estable en condiciones de almacenamiento de 40°C y 33% de HR durante 30 dfas o mas, como se muestra en la Figura 8.
Preparacion de las Composiciones
Los materiales que se van a mezclar en una solucion con los agentes bioactivos preferidos para la preparacion de composiciones en polvo seco o de la invencion, incluyen al menos un agente formador de matriz y al menos dos agentes formadores de cristales. Tales materiales, cuando se mezclan con el material bioactivo preferido, forman perlas, microperlas, hebras o gotitas en nitrogeno ftquido y pueden ser liofilizados o deshidratados eficientemente en un estado vftreo amorfo de acuerdo con metodos de la invencion y para proveer grandes cantidades de composicion seca estable para almacenamiento y administracion de dicho material bioactivo (veanse las Figuras 1A y B para observaciones visuales y microscopicas, y actividad del agua (Aw) de diferentes formulaciones despues del secado). El agente formador de matriz provee estabilidad estructural a la formulacion, perfil de secado mejorado y/o beneficios ffsicos y qmmicos protectores para los materiales bioactivos. El agente formador de matriz tambien provee viscosidad por espesamiento para la formulacion y mejor control sobre las propiedades de formulacion bajo presion al vacfo y resistencia estructural incrementada a las composiciones de la formulacion seca de la invencion (vease Figura 1B, imagenes 4, 4b, 4c para la estructura vftrea y sequedad de la formulacion particular). El agente formador de matriz incluye una mezcla de polisacaridos y oligosacaridos. Los polisacaridos preferidos, particularmente para organismos vivos, son gomas solubles en agua, debido a su caractenstica distintiva para formar gel viscoso a temperaturas moderadas. Tambien se encontro que las gomas a cierta concentracion estabilizan efectivamente la formulacion y facilitan la formacion de una estructura vftrea amorfa y potencian el perfil de secado bajo vacfo (vease Figura 1A - imagenes 3a, 3b, 3c, 4 y Figura 1B - 4c y Figura 6).
De manera notable y al observar las imagenes de la Figura 1A en combinacion con los resultados presentados a continuacion en la Tabla 1, es evidente que las muestras 3b, 3c, 4, 5 y 6 fueron todas secadas suficientemente para proveer alguna porosidad en las estructuras vftreas amorfas.
Tabla 1
Inspeccion visual de las diversas composiciones secas
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Sequedad
Sin Secar Sin Secar Sin Secar Seco Seco Seco Seco Seco
Porosidad
Ninguno Ninguno Ninguno Presente Present e Presente Ninguno Parcial
Aw
0.847 0.923 0.916 0.216 0.183 0.376 0.171 0.112
Estructura de Cristal
Ninguno Ninguno Ninguno Parcial Parcial Presente Parcial Parcial
Los agentes formadores de cristales de la invencion pueden incluir diversos azucares, azucares no reductores, alcoholes de azucar, aminoacidos, protemas, protemas hidrolizadas y peptidos. El compuesto formador de cristal es preferiblemente uno que no cristalice y/o desestabilice el material biologicamente activo en la formulacion a temperaturas de congelacion (por ejemplo, inferior a -20°C). Por ejemplo, el material bioactivo puede ser integrado ffsicamente en estructuras cristalinas de azucar amorfo tales como sacarosa o trehalosa para promover la retencion de la estructura molecular a traves de el proceso de secado e impartir rigidez estructural a la matriz amorfa en el estado seco. El agente formador de cristales reemplaza la perdida de agua de hidratacion durante el secado, para evitar dano a las membranas celulares y desnaturalizacion de enzimas (vease la revision de Crowe et al., 1998). Otras funciones del agente formador de cristal pueden incluir proteger el material bioactivo de la exposicion a luz, oxfgeno, agentes oxidantes y humedad nocivos. La mayona de los agentes formadores de cristales pueden ser disueltos facilmente en una solucion en cantidades que vanan desde aproximadamente 0.1 por ciento en peso hasta aproximadamente 80 por ciento en peso. Es beneficioso incluir dos o mas diferentes agentes formadores de cristal para inhibir la formacion de cristales y potenciar la estabilidad del material bioactivo secado en condiciones de almacenamiento durante penodos extendidos de tiempo (vease el efecto de la protema de azucares y protemas en la Figura 1A - imagenes 4, 5 y 6).
Las formulaciones presecadas incluyen una cantidad sustancial de solidos totales (constituyentes menos el solvente, tal como agua). Una porcion principal de los solidos totales consiste de el material bioactivo, los agentes formadores de matriz y los agentes formadores de cristales. Por ejemplo, el material bioactivo esta presente en la formulacion en
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una concentracion que vana de aproximadamente 5-60 por ciento en peso, el agente formador de matriz de 1-20 por ciento en peso, y el agente formador de vidrio de aproximadamente 5-80 por ciento en peso. En otro ejemplo, el agente formador de matriz puede estar presente en la formulacion en una concentracion que vana desde aproximadamente 0.5 -10 por ciento en peso, y el agente formador de cristal desde 10- 50 por ciento en peso. Preferiblemente, la formulacion humeda debena tener un contenido de solidos entre 5% y 80%; mas preferiblemente entre 30% y 60%. La viscosidad de las formulaciones de la invencion es tipicamente mayor que 1000 centipoises (cP). Mas preferiblemente, la viscosidad mayor de 5,000 cP; y lo mas preferiblemente mayor de 10,000 cP. La densidad de las formulaciones de la invencion esta preferiblemente entre 0.9 y 1.2 g/ml.
Metodos para preparar formulaciones secas estables
Los metodos para preparar formulaciones secas estables que contienen materiales bioactivos incluyen: (1) preparacion de una formulacion mezclando el material bioactivo con una matriz y agentes de formacion de cristales en una solucion, (2) congelacion instantanea de la formulacion para formar partfculas congeladas solidas, (3) someter la partfcula congelada a presion a alto vado durante un tiempo corto para purgar las partfculas y estabilizar su estructura, (4) eliminacion del agua por liofilizacion y/o evaporacion de la humedad bajo presion reducida a la vez que se suministra calor a la formulacion a una temperatura por encima de la temperatura de congelacion de la formulacion, preferiblemente mayor de -10°C, (5) reduccion adicional de la actividad de agua de la formulacion a menos de 0.3 Aw bajo vado completo y temperatura elevada.
En una realizacion, por ejemplo, las formulaciones de la invencion incluyen un material bioactivo formulado en una solucion o suspension que contiene una matriz y agentes formadores de cristales. El agente formador de matriz y/o una alta concentracion de agentes formadores de cristales son disueltos y sanitizados en solucion acuosa caliente con agitacion antes de enfriar y mezclar con el material bioactivo. El material bioactivo, tal como virus o bacterias cultivados, se concentra y separa del medio de cultivo por centrifugacion o filtracion antes de la resuspension en la formulacion.
En una realizacion de la presente invencion, la totalidad del agua en la formulacion es provista en el ftquido del organismo vivo concentrado y la suspension de organismo vivo se mantiene a una temperatura ligeramente por encima de la temperatura ambiente. Los componentes secos son mezclados entre sf y luego agregados lentamente a la suspension tibia (25°C a 40°C) del organismo vivo. La suspension de la formulacion es agitada suavemente en un mezclador planetario hasta que todos los componentes sean dispersados completamente y se obtenga una suspension uniforme.
La solucion viscosa es entonces congelada instantaneamente por atomizacion, goteo o extrusion en un bano de nitrogeno ftquido para formar pequenas gotitas, perlas o hebras solidas. Las partfculas de solido congelado pueden ser almacenadas en un congelador profundo entre -30°C y -80°C hasta secado o colocadas inmediatamente sobre bandejas y liofilizadas o secadas de acuerdo con los metodos de la invencion. Las partfculas congeladas solidas son purgadas en un tiempo corto ftpicamente entre 1 y 20 minutos, bajo vado suficiente (por ejemplo, por debajo de <2000 mTORR). Las partfculas permanecen en una forma congelada solida a una temperatura por debajo de -20°C durante la etapa de purga. Despues de la etapa de purga inicial la presion de vado es incrementada hasta entre 2000 y 10,000 mTORR y puede proveerse calor permitiendo que la temperatura de la formulacion se incremente rapidamente a entre -5°C y +5°C y las partfculas comienzan a descongelarse. Una vez que la temperatura de la formulacion alcanza la temperatura deseada, se ajusta el calor para mantener esa temperatura y avanza la primera etapa de secado. En esta etapa, la formulacion ya esta descongelada y tiene lugar la evaporacion acelerada de agua sin ebullicion o espumado.
Los metodos ftpicos en la tecnica anterior involucran espumado y/o esparcimiento extenso y ebullicion violenta lo que puede ser nocivo para los materiales biologicos sensibles y producir dificultades para escalamiento industrial a una capacidad de carga elevada (vease, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 6,534,087, en donde la presion de vado aplicada da como resultado una ebullicion violenta y espumacion), mientras que las composiciones y metodos presentes evitan cualquier ebullicion o espumacion excesiva de la formulacion a la vez que se alcanza una rata de secado significativamente mas rapida y permite una alta capacidad de carga de la formulacion. Adicionalmente, una desgasificacion completa y eficiente de las suspensiones ftquidas viscosas es diftcil y puede requerir un periodo de tiempo extendido. Estos obstaculos fueron todos resueltos en la presente invencion utilizando una composicion adecuada que permite un secado de ftquido primario efectivo que forma una formacion vftrea amorfa sin ninguna ebullicion y espumacion excesiva. Sorprendentemente y de forma importante esto fue logrado principalmente por congelacion instantanea de una composicion adecuada y a traves de la introduccion de una etapa de purga corta antes del inicio de la etapa de secado de ftquido primaria. La carga de partfculas congeladas solidas sobre una bandeja en oposicion a un jarabe en suspension o viscoso permiten una capacidad de carga mucho mas alta por area de secado sobre las bandejas que la obtenida de acuerdo con la tecnica anterior. Despues de que se termina la etapa de secado en ftquido primaria, la formulacion vftrea amorfa estabilizada es mantenida a temperaturas de secado secundarias elevadas (entre 20°C y 70°C) y presiones de vado de menos de 1000 mTORR para reducir adicionalmente la actividad de agua de la formulacion en un tiempo muy corto.
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Otra realizacion de la invencion provee metodos para preparar composiciones en formulacion de hidrogel para conservacion de materiales bioactivos. Por ejemplo, una formulacion que contiene un material bioactivo y una matriz y agentes formadores de cristales se mezclan en una solucion y se entrecruzan para formar partmulas de hidrogel firmes atomizando o extrudiendo en un bano que contiene iones metalicos divalentes o agregando iones metalicos divalentes directamente en la suspension y deshaciendo las laminas de hidrogel endurecidas en pequenas hebras o piezas. Las partmulas en hidrogel son secadas entonces de acuerdo con los metodos de secado de la invencion como se describio mas arriba.
En una realizacion particular de la invencion, por ejemplo, la formulacion incluye bacterias probioticas vivas en una solucion de 1-4% de alginato de sodio y 10-40% de trehalosa. Se agregan protemas y particularmente protemas hidrolizadas, tales como casema, suero, guisante, soja o semilla de algodon a la formulacion a 5-10% para potenciar el proceso de secado y la formacion de una estructura estable vftrea amorfa de la formulacion (vease Figura 1A, imagenes 4, 5 y 6). El cultivo probiotico puede ser fresco, congelado o ya secado en la forma de polvo seco (vease la Figura 2 para los recuentos de CFU de diferentes formas de cultivo de las bacterias probioticas en la formulacion seca). La solucion es mezclada a una temperatura ligeramente superior a la temperatura ambiente (tfpicamente entre 25°C -37°C) hasta que todos los componentes sean completamente disueltos. La suspension de la formulacion es atomizada, extrudida o pasada por nitrogeno ftquido para formar pequenas gotitas o perlas que luego son retiradas del nitrogeno ftquido, empacadas en bolsas y pueden ser almacenadas en un congelador profundo a -80°C hasta el secado.
Un metodo de secado ftpico de bacterias probioticas vivas incluye: esparcir las perlas congeladas solidas sobre bandejas en una capa uniforme a una capacidad de carga entre 100-1000 g/pie cuadrado y las bandejas son colocadas inmediatamente en un liofilizador. Se aplica presion de vado entonces a aproximadamente 1000 mTORR y dependiendo del tamano del liofilizador y del tipo de fuente de calor, la temperatura del estante se ajusta a +20°C o a una temperatura suficiente para mantener las partmulas a aproximadamente a -20°C. Las perlas congeladas solidas se dejan purgar durante aproximadamente 5-30 minutos y el vado se ajusta a entre 2000 y 10,000 mTORR y la transferencia de calor se incrementa para elevar la temperatura de la formulacion a entre -5°C y +5°C. Estas condiciones de temperatura y presion de vado se mantienen durante la etapa primaria de secado en ftquido la cual puede durar desde unas pocas horas y hasta 24 horas dependiendo de la carga de la bandeja, preferiblemente desde aproximadamente 3 hasta 10 horas. En algun punto durante el proceso de secado primario, la rata de evaporacion del solvente se hace mas lenta y la temperatura de la formulacion comienza a incrementarse debido al suministro superfluo de calor en la camara de secado. Este punto indica el final de la etapa de secado primaria. A medida que el solvente es extrafdo de la formulacion, los agentes formadores de cristales en la solucion se concentran y se hacen mas espesos hasta que se detiene el flujo como ftquido y forma una estructura amorfa y/o vftrea estable.
Se sigue entonces una etapa de secado secundaria a vado completo y temperatura de la formulacion entre 30°C y 50°C. El proposito de la etapa de secado secundaria es eliminar la humedad atrapada o unida y proveer una composicion que sea estable en almacenamiento durante un periodo de tiempo extendido a temperaturas ambientes. La etapa de secado secundaria puede durar varias horas y su punto final se alcanza cuando la formulacion esta completamente seca y su actividad de agua es inferior a 0.3 Aw.
Los metodos de secado de la invencion dan como resultado un material biologicamente activo que esta incorporado dentro de una matriz vftrea amorfa, evitando por lo tanto el desplegamiento de protemas y haciendo significativamente mas lentas las interacciones moleculares o la reactividad cruzada, debido a una movilidad sustancialmente reducida del compuesto y otras moleculas dentro de la composicion vftrea amorfa. En tanto el solido amorfo esta a una temperatura por debajo de su temperatura de transicion vftrea y la humedad residual permanezca relativamente baja (esto es, por debajo de Aw de 0.3), el material bioactivo permanece relativamente estable (vease Figura 8). Debena anotarse que alcanzar un estado vftreo no es un prerrequisito para una estabilidad a largo plazo puesto que algunos de los ingredientes bioactivos pueden comportarse mejor en un estado mas cristalino.
Preparacion de polvo seco
La formulacion seca puede ser utilizada en bloque, cortada en formas y tamanos deseados, o triturada y molida en un polvo de flujo libre que provea un procesamiento corriente abajo como aglomeracion en humedo o seco, granulacion, formacion de tabletas, compactacion, formacion de pella o mezclada en productos alimenticios o piensos o cualquier otra clase de proceso de suministros. Los procesos para triturar, moler, romper o pulverizar son bien conocidos en el arte. Por ejemplo, un molino de martillos, un molino de aire, un molino de impacto, un molino de chorro, un molino de pasador, un molino Wiley o un dispositivo de molienda similar pueden ser utilizados. El tamano de partmula preferido de las partmulas molidas es menor de aproximadamente 1000 pm y preferiblemente menor de 500 pm.
Las composiciones y metodos descritos aqrn conservan la actividad biologica del material biologico activo incorporado. Por ejemplo, las composiciones son probadas en cuanto a su estabilidad sometiendolas a temperatura elevada (por ejemplo, 40°C) y alta humedad (por ejemplo 33% de RH) y midiendo la actividad biologica de las formulaciones. Como un ejemplo para bacterias probioticas vivas, los resultados de estos estudios demuestran que
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las bacterias formuladas en estas formulaciones son estables durante al menos 20 d^as (vease Figura 8). La estabilidad esta definida como el tiempo para una perdida de potencia de 1 log CFU/g. Tales formulaciones son estables incluso cuando se utilizan altas concentraciones del material biologicamente activo. Asf, estas formulaciones son ventajosas en cuanto pueden ser enviadas y almacenadas a temperaturas en o por encima de la temperatura ambiente durante largos penodos de tiempo.
Ejemplos
Ejemplo 1
Preparacion de una sustancia probiotica seca y estable Formulacion Basica
75 g de trehalosa (Cargill Minneapolis, MN) y 22 g de casema extensamente hidrolizada (Marcor, Carlstadt, NJ) fueron mezclados uniformemente con 3 g de alginato de sodio (ISP Corp., Wayne, NJ) en forma seca. Un concentrado fresco de Lactobacillus acidophilus (100 ml que contema al menos 10% de solidos, directo de la recoleccion de la fermentacion) fue agregado en un mezclador y se mantuvo a 35°C. La mezcla seca de la goma, el azucar y la protema hidrolizada fue agregada lentamente al cultivo probiotico y la mezcla se llevo a cabo a 35°C durante 10 minutos. La suspension viscosa fue transferida entonces a un recipiente que tema un fondo perforado y se dejo gotear sobre un bano que contema nitrogeno. Las perlas fueron retiradas entonces del nitrogeno lfquido e inmediatamente transferidas al secado.
Secado de las perlas congeladas de la formulacion basica
Las perlas congeladas fueron esparcidas homogeneamente sobre una bandeja a una capacidad de carga de 100 g/pie cuadrado e inmediatamente colocadas sobre un estante en un liofilizador (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). Se aplico entonces presion de vacm a 1000 mTORR y las perlas congeladas solidas fueron dejadas en purga durante 10 minutos. El vado se ajusto entonces a 2700 mTORR y la temperatura de los estantes se elevo a +30°C. Esta temperatura y presion de vado fueron mantenidas durante 3 horas. Se siguio entonces una etapa de secado secundaria a vado completo (150-200 mTORR) y la temperatura del estante se elevo a 30°C durante 2 horas adicionales. La formulacion fue secada completamente y su actividad de agua fue medida mediante un instrumento Hygropalm Aw1 (Rotonic Instrument Corp., Huntington, Ny) a Aw = 0.23.
Ejemplo 2
Composicion seca estable que contiene bacterias probioticas de Lactobacillus rhamnosus LGG.
Se descongelo Lactobacillus rhamnosus LGG (500 g de concentrado congelado de una fuente comercial) a 37°C en un mezclador planetario de doble camisa (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA). Se mezclaron homogeneamente dos agentes formadores de cristales: Trehalosa (387 g, Cargill Minneapolis, MN) y casema extensamente hidrolizada (83 g, Marcor, Carlstadt, NJ) en forma seca con dos agentes formadores de matriz; alginato de sodio (15 g, ISP Corp., Wayne, NJ) e inulina instantanea (25 g, Cargill Minneapolis, MN). La mezcla seca fue agregada lentamente a las bacterias probioticas descongeladas y la mezcla se llevo a cabo a 40 RPM y 37°C durante 10 minutos. La viscosidad de la suspension fue ajustada a 12,000 Cp mediante la adicion de 50-200 ml de agua. La suspension fue transferida entonces a un recipiente que tema un fondo perforado y se dejo gotear sobre un recipiente que contema nitrogeno lfquido. Las perlas fueron retiradas entonces del nitrogeno lfquido, colocadas en una bolsa laminada de aluminio sellada y almacenados en un congelador profundo a -80°C durante varias semanas.
Para el secado, las perlas congeladas fueron esparcidas homogeneamente sobre bandejas en una capacidad de carga que variaba desde 100 hasta 500 g/pie cuadrado y las bandejas fueron colocadas en estantenas en un liofilizador (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, Ny). La presion de vado fue aplicada a 1000 mTorr y la temperatura de los estantes ajustada a +20°C. Las perlas congeladas solidas se dejaron en purga durante un penodo de tiempo que variaba de 1 a 30 minutos. La etapa de purga fue seguida por una etapa de secado primaria despues de ajustar la presion de vado a 2700 mTORR y la temperatura del estante elevada a +30°C. Esta temperatura y la presion de vado fueron mantenidas durante 12 horas. Se siguio entonces una etapa de secado secundaria a vado completo (150-200 mTORR) y la temperatura del estante se mantuvo a 30°C durante 4 horas adicionales. La formulacion fue secada completamente y su actividad de agua se midio a 0.23 Aw. La Figura 6 muestra el perfil de secado de la formulacion probiotica.
Las perdidas de viabilidad despues de la congelacion de la suspension a diferentes temperaturas (+ 4°C, -80°C y - 180°C) y despues del proceso de secado incluyendo la preparacion de las perlas congeladas, y el secado en un liofilizador, se presentan en la Figura 3, 4 y 7. Las perdidas de viabilidad para el proceso completo fueron en general inferiores a <1 log dependiendo del tipo de cultivo bacteriano (cultivos congelados o secos) y de la temperatura de la suspension viscosa. Los resultados muestran que la congelacion instantanea de las bacterias probioticas en nitrogeno lfquido (-180°C) fue un proceso menos nocivo que el congelamiento a -80°C.
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Las Figuras 5 y 8 muestran el efecto de diversos penodos de tiempo de purga que variaba de 0 min (sin purga) a 30 min sobre recuentos iniciales de las bacterias probioticas en la composicion seca y una estabilidad de almacenamiento bajo condiciones de almacenamiento aceleradas de 40°C y 33% de RH. Los resultados sugieren que un tiempo de purga mas largo mejora en general el recuento inicial de bacterias en la formulacion seca pero no tiene efectos sobre la estabilidad del almacenamiento de la formulacion probiotica.
Ejemplo 3
Trehalosa (752 g, Cargill Minneapolis, MN), protema de guisante extensamente hidrolizada (167 g, Marcor, Carlstadt, NJ), alginato de sodio (30 g, ISP Corp., Wayne, NJ) e inulina instantanea (50 g, Cargill Minneapolis, MN) fueron mezclados homogeneamente en forma seca. La mezcla seca fue agregada lentamente a 1000 ml de agua desionizada caliente a 80°C en un mezclador planetario de doble camisa (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc., Savannah, GA) y la mezcla se llevo a cabo a 40 RPM durante 10 minutos. La temperatura de mezcla fue reducida a 37°C y se agregaron lentamente 100 g de polvo seco de Lactobacillus rhamnosus LGG obtenido de una fuente comercial y la mezcla continuo durante 20 minutos. La suspension fue extrudida entonces a traves de una aguja con orificio de 2 mm hacia un bano que contema nitrogeno lfquido. Las hebras/perlas fueron retiradas entonces del nitrogeno lfquido y colocadas en bolsas de aluminio laminadas selladas y almacenadas en un congelador profundo a -80°C durante varias semanas. Para el secado, las hebras/perlas congeladas fueron esparcidas homogeneamente sobre bandejas a una capacidad de carga que variaba de 100 a 500 g/pie cuadrado y las bandejas fueron colocadas en estantes en un liofilizador (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) y secadas como se describe en el Ejemplo 2. Todas las formulaciones fueron retenidas contenidas dentro de la bandeja y no se observo esparcimiento ni espumacion en todos los niveles de carga. La formulacion fue secada completamente incluso a la capacidad de carga mas alta y la actividad de agua medida a 0.26 Aw y menos para todas las muestras.
Ejemplo 4
Preparacion de una formulacion de hidrogel que contiene bacterias probioticas Bifidobacterium lactis (Bb12):
Se prepara una suspension probiotica concentrada de Bifidobacterium lactis (Bb12) de acuerdo con el Ejemplo 1. A la formulacion basica, se agregan 0.5 g de fosfato de calcio dibasico, seguido por 0.5 g de gluconolactona. La suspension fue dejada endurecer a temperatura ambiente durante las 2 horas siguientes para formar un hidrogel solido. El gel firme fue seccionado en hebras delgadas y largas, utilizando un cortador/rallador comercialmente disponible. Las hebras delgadas fueron congeladas instantaneamente en nitrogeno lfquido y cargadas sobre una bandeja a una capacidad de carga de 700 g/pie cuadrado y colocadas en un liofilizador para secado como se describe en el Ejemplo 2. La actividad de agua (Aw) de la formulacion fue de 0.05 (Medida mediante un HygroPalm Aw1, Rotonic Huntington, NY). La formulacion seca fue triturada adicionalmente hasta un polvo fino utilizando un equipo de molienda de martillo y tamizada a traves de mallas de 50-250 micrones.
Ejemplo 5
Composicion libre de alergenos que contiene bacterias probioticas Lactobacillus acidophilus.
Trehalosa (752 g, Cargill Minneapolis, MN), protema de guisante extensamente hidrolizada (167 g, Marcor, Carlstadt, NJ), alginato de sodio (30 g, ISP Corp., Wayne, NJ) e inulina instantanea (50 g, Cargill Minneapolis, MN) fueron mezclados homogeneamente en forma seca. La mezcla seca fue esterilizada agregando la lentamente a 1000 ml de agua desionizada caliente a 80°C en un mezclador planetario de doble camisa (DPM, 1qt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA) y la mezcla se llevo a cabo a 40 RPM durante 10 minutos hasta que se formo una suspension suave y clara. La temperatura de la mezcla se redujo a 37°C y se agregaron lentamente 1000 g de perlas congeladas que conteman Lactobacillus acidophilus obtenidas de una fuente comercial y la mezcla continuo durante 10 minutos. La suspension fue extrudida entonces a traves de una aguja con orificio de 2 mm en un bano que contema nitrogeno lfquido. Las hebras/perlas fueron entonces retiradas del nitrogeno lfquido, colocadas en bolsas de aluminio laminado selladas y almacenadas en un congelador profundo a -80°C durante varias semanas. Para el secado, las hebras/perlas congeladas fueron esparcidas homogeneamente sobre bandejas a una capacidad de carga de 1000 g/pie cuadrado y las bandejas fueron colocadas en estantes en un liofilizador (Modelo 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) y secadas como se describe en el Ejemplo 2. El recuento inicial de CFU de las bacterias probioticas en la composicion seca fue de 10.53 logs/g, y la perdida de viabilidad despues de 42 dfas de almacenamiento bajo condiciones de almacenamiento acelerado de 40°C y 33% de RH fue de 0.69 log CFU/g.
Ejemplo 6
Una formula infantil que contiene la formulacion seca de la presente invencion:
Una formulacion seca estable que contema Lactobacillus GG (Valio Corp., Finlandia) fue preparada de acuerdo con el Ejemplo 2 seguido por tamizaje en dos grupos de tamano de partmula (por encima de 50 pm y por debajo de 150 pm). Se preparo una formula infantil mezclando 99.9 g de Nutramigen (Mead Johnson, Evansville, IL) con 0.1 g de
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Ejemplo 7
Un suplemento probiotico que contiene la formulacion seca estable de la presente invencion:
Una composicion seca estable que contiene Lactobacillus acidophilus es formulada en formas de dosificacion oral, tales como tabletas, capsuletas o capsulas. Se preparan tabletas con sabor naranja que conteman 99.9 g de un agente de compresion (dextrosa) y 0.1 g de las partfculas de formulacion seca en el rango de tamano entre 50 pm y 150 pm por compresion directa sobre una maquina rotatoria utilizando una herramienta concava estandar redonda de 1/2". El producto final contiene aproximadamente 108 cfu/dosis unitaria. La dureza de las tabletas esta en el rango de 8-10 kp y los tiempos de desintegracion son de aproximadamente 20 segundos. Las tabletas comprimidas son empacadas en botellas HDPE de 180 cc de 100 tabletas cada una y expuestas a temperatura/humedad controlada de 40°C/33% RH. El producto es sometido a pruebas de estabilidad microbiologica mensualmente durante un periodo de 12 meses o hasta que se observa una reduccion en el recuento de ensayo por debajo de 1 x 106/dosis unitaria.
Ejemplo 8
Una bebida funcional que contiene la formulacion seca estable de la presente invencion:
Se prepara una mezcla seca que contiene (% en peso) 71% de sacarosa, 14% de maltodextrina, 10% de inulina, 2% de dextrosa, 1% de acido cftrico anhidro, 0.3% de goma acacia, 0.3% de sabores, 0.3% de fosfato de tricalcio y 0.1% de partfculas de formulacion probiotica seca (L. acidophilus) en el rango de tamano entre 50 pm y 250 pm. El producto final contiene aproximadamente 109 cfu/dosis unitaria (30 g de mezcla seca). El producto es empacado en pequenas bolsas de lamina de aluminio (30 g de dosis unitaria/bolsa) para beber por agitacion entre 340 ml de agua. La estabilidad de las bacterias probioticas en la mezcla seca para bebida es sometida a una prueba de estabilidad microbiologica mensual durante un penodo de 12 meses o hasta que se observa una reduccion en el recuento de ensayo por debajo de 1 x 107/dosis unitaria.
Ejemplo 9
Preparacion de alimento probiotico para mascotas:
Un alimento para mascotas en pellas comercialmente disponible es secado en un horno de conversion hasta una actividad de agua de 0.1, y luego se recubre con la formulacion seca probiotica estable preparada como se describe en el ejemplo 3. Las pellas secas son asperjadas con aproximadamente 5% de una barrera a la humedad basada en grasa (una mezcla de 40% de grasa de pollo, 40% de manteca de cacao y 20% de cera de abeja), se mezcla en un tambor de rotacion con la formulacion en polvo seco (usualmente 0.1-0.5% del alimento para mascotas total que provee una dosificacion de 108 CFU/g) y finalmente se asperjo con un recubrimiento adicional de la barrera para humedad basada en grasa. La cantidad total de recubrimiento es aproximadamente 15% (del alimento para mascotas). El tiempo de recubrimiento es de aproximadamente 30 minutos.
Ejemplo 10
Preparacion de alimento para peces con varios microorganismos probioticos:
Se prepara un pienso en pellas para peces de acuerdo con la presente invencion con una mezcla de varios probioticos. Se prepara una formulacion probiotica seca estable que contiene una mezcla de L. rhamnosus, L. acidophilus y Bifidobacterium lactis como se describe en el Ejemplo 1. Un pienso iniciador disponible comercialmente para salmon (Zeigler Bros., Gardners, PA) es secado primero en un horno de conveccion hasta una de agua de 0.1, y luego se recubre con la formulacion probiotica en un tambor rotatorio. Las pellas (1000 g) son asperjadas primero con aproximadamente 5% en peso de barrera para la humedad basada en grasa (una mezcla de 40% de aceite de pescado, 40% de manteca de cacao y 20% de cera de abejas) y luego se mezcla con 1 g de la formulacion probiotica seca estable (para alcanzar una dosificacion de 107 cfu/g de pienso) y finalmente se asperja con un recubrimiento adicional de la barrera para la humedad basada en grasa. La cantidad total de recubrimiento es aproximadamente 10% (del pienso para peces).
Ejemplo 11
Polvo seco estable que contiene una enzima:
Se prepara una formula en hidrogel que contiene 40 por ciento en peso de Savinasa (Novozymes, Dinamarca) mezclando 600 g de la formulacion descrita en el Ejemplo 4 y 400 g de savinasa en 1000 g de solucion acuosa. La formulacion en hidrogel triturada es congelada instantaneamente en nitrogeno lfquido y secada en un horno al vacfo
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a una temperatura de secado de la formulacion de 50°C. Para determinar la carga y la estabilidad en almacenamiento de la formula seca: una muestra seca es pesada con exactitud (<100 mg) en un tubo de microcentnfuga. Se agregan 200 jl de dimetilsulfoxido (DMSO). La formulacion es disuelta en el regulador de DMSO por vortex. A esta muestra, se agregan 0.8 ml de una solucion que contiene naoh 0.05 n, sds al 0.5% y acido dtrico 0.075 m (sal trisodica). Los tubos son sometidos a sonicacion durante 10 minutos a 45°c, seguida por una de breve centrifugacion a 5,000 rpm durante 10 minutos. Se toman alfcuotas de la solucion clara de dmso/naoh/sds/citrato en pozos de una microplaca y se analizan en cuanto al contenido de protema utilizando el metodo de ensayo de bradford. La estabilidad en almacenamiento de la formulacion estable de enzimas es significativamente superior que una enzima seca sin la formulacion de la presente invencion.
Ejemplo 12
Polvo seco estable que contiene vitamina a:
Una formulacion que contema 30 por ciento en peso de vitamina a se prepara mezclando 320 g de inulina instantanea, 320 g de maltodextrina de-1 (tate & lyle, londres, reino unido), 50 g de carboximetilcelulosa de sodio (ashland aqualon functional ingredients, wilmington, de),10 g de ascorbato de sodio y 300 g de vitamina a cristalina (basf corp., florham park, nj) en 1000 g de agua. La formulacion humeda es secada por aspersion en un secador por aspersion mobile-minor (gea process engineering inc., columbia md), a temperaturas de entrada y salida de 180°c y 80°c, respectivamente, o congelada instantaneamente en nitrogeno lfquido, luego esparcidas sobre bandejas con una capacidad de carga de 1,000 g/pie cuadrado y se seco como se describio en el ejemplo 2. La composicion de vitamina a es estable (> 80%) a 40°c y 75% de rh durante 3 meses.
Ejemplo 13
Preparacion de carotenos en una formulacion protegida que tiene biodisponibilidad potenciada:
Una formulacion que protege y potencia la biodisponibilidad de carotenos que de otra manera estanan sujetos a oxidacion por otros ingredientes es un pienso durante el almacenamiento o despues de alimentar un organismo se prepara de acuerdo con la formulacion y el metodo de la presente invencion. Una formulacion que contiene 6 g de quitosano soluble en agua (lsk biopartners, inc. Salt lake city, utah) se disuelve en 200 g de agua. A esta solucion se agregan 90 g de astaxantina natural (naturosetm, cyanotech corp., kailua-kona, hi) y la suspension se atomiza o extrude en un bano que contiene 5% de tripolifosfato de sodio. Las micropartfculas o hebras en hidrogel se dejan endurecer a temperatura ambiente durante 4 horas. Las partfculas son retiradas del bano de entrecruzamiento, lavadas con agua y mezcladas con una mezcla seca de 90 g de sacarosa y 10 g de casema extensamente hidrolizada. Las partfculas cargadas de azucar/protema son congeladas instantaneamente y se colocan inmediatamente sobre bandejas a 500 g/ pie cuadrado y liofilizadas en un liofilizador hasta que la actividad de agua se reduzca a menos de 0.3. La formulacion seca es molida posteriormente hasta la distribucion de tamano deseada y empacada.
Ejemplo 14
Preparacion de un cebo para especies invasivas
Un cebo en pellas para especies invasivas espedficamente buscadas se prepara de acuerdo con la presente invencion. Se preparan 200 g de una formulacion que contiene un pesticida como se describe en el ejemplo 1 y se agregan a 200 g de agua. A esta solucion se agregan 90 g de rotenona y 0.5 g de fosfato de calcio dibasico, seguido de 0.5 g de gluconolactona. La suspension se deja endurecer a temperatura ambiente durante 2 horas. El gel firme es seccionado en trozos delgados y largos a traves de un cortador/rallador. Las hebras delgadas son cargadas sobre una bandeja y colocadas sobre un liofilizador. La temperatura del estante se fija a -30°c y la formulacion se deja liofilizar antes de que se aplique vacfo completo y la temperatura del estante se eleve a +60°c para secado durante la noche. La formulacion seca es triturada hasta la distribucion de tamano apropiado para la especificacion de tamano del cebo para la especie espedfica objetivo.
Ejemplo 15
Preparacion de un pesticida protegido en una formulacion insoluble en agua:
Con la formulacion y el metodo de la presente invencion se prepara una formulacion granular protegida de un pesticida que de otra manera estana sometida a descomposicion por otros ingredientes en una formulacion durante el almacenamiento o despues de la aplicacion en el ambiente. Una formulacion que contiene 6 g de pectina y 102 g de sacarosa se agrega a 200 g de agua. A esta solucion se agregan 90 g de una formulacion seca de un pesticida sensible y una mezcla que contiene 1.5 g de fosfato de calcio dibasico y 0.5 g de cloruro de calcio, seguido por 0.85 g de gluconolactona. La suspension se deja endurecer a temperatura ambiente durante 4 horas, y luego se secciona en hebras delgadas, largas a traves de un cortador/rallador. Las hebras delgadas son cargadas sobre bandejas y
5
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15
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55
secadas en un liofilizador hasta alcanzar una actividad de agua de 0.1. La formulacion seca es molida posteriormente hasta la distribucion de tamano deseada, y empacada.
Ejemplo 16
Preparacion de una formulacion probiotica para plantas protegida:
Un agente de control biologico tal como rhizobacteria es preparado en una composicion seca de acuerdo con el ejemplo 4. La efectividad de la composicion de rhizobacteria seca es evaluada sobre lechugas cultivadas bajo condiciones gnotobioticas. Se inoculan dosis de 100 mg de la composicion seca de rhizobacteria por planta en macetas con arena y se plantan con brotes de lechuga pregerminados (24 horas). Se aplica una dosis de nutrientes de 5 ml de solucion de hoagland esterilizada a las plantas en la maceta. Las macetas son dispuestas al azar en una camara de crecimiento mantenida a 28°c con fotoperiodo de 12 horas. Durante intervalos de cada 7 dfas despues de la inoculacion, las plantas y la arena adherida son retiradas cuidadosamente de las macetas. Las rafces son lavadas en regulador de fosfato esteril (ph 7.0) y se registra la medicion de la longitud de la rafz.
Referencia
Las siguientes referencias y todas las referencias citadas aqrn se incorporan aqrn como referencia para todos los propositos.
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Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
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    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para preparar una composicion seca estable que comprende un material bioactivo, un agente formador de matriz y un agente formador de cristales, comprendiendo dicho metodo:
    (a) combinar el material bioactivo, el agente formador de matriz y el agente formador de cristales en una solucion;
    (b) congelar instantaneamente la suspension de la etapa (a) en nitrogeno lfquido para formar una composicion amorfa en perlas, hebras o gotitas;
    (c) secado primario de las partmulas congeladas purgadas de la etapa (b) bajo vacm a una presion entre 2000 y 10000 mTORR y a una temperatura por encima del punto de congelacion de las partmulas; y
    (d) efectuar un secado secundario de las partmulas secadas primariamente de la etapa (c) bajo presion a vacm completo y a una temperatura que va de 30 a 60°C.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1 el cual incluye adicionalmente la etapa, entre las etapas (b) y (c), de purgar las partmulas congeladas solidas de la etapa (b) bajo vacm a una presion de menos de 2000 mTORR;
  3. 3. El metodo de la reivindicacion 2, en donde la purga se lleva a cabo bajo presion de vacm de menos de 2000 mTORR por no mas de 30 minutos.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que la composicion tiene una actividad de agua de Aw - 0.3 o menos.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, que comprende adicionalmente cortar, triturar, moler o respectivamente pulverizar la composicion en un polvo de flujo libre que tiene un tamano de partmula de menos de aproximadamente 1000 pm.
  6. 6. El metodo de la reivindicacion 1 o 2, que comprende adicionalmente mezclar la composicion con un componente seleccionado del grupo que consiste de una formula infantil, bebidas funcionales y alimento para mascotas.
  7. 7. Una composicion seca que comprende un material bioactivo, al menos un agente formador de matriz y al menos dos agentes formadores de cristales, en la que la formulacion comprende opcionalmente solidos totales que vanan de aproximadamente 30 por ciento en peso hasta aproximadamente 70 por ciento en peso, y/o el agente formador de matriz esta presente opcionalmente en la formulacion en una cantidad que vana desde aproximadamente 1 por ciento en peso hasta aproximadamente 20 por ciento en peso y/o el agente formador de cristales esta presente opcionalmente en la formulacion en una cantidad que vana desde aproximadamente 1 por ciento en peso hasta aproximadamente 80 por ciento en peso, en la que dicha formulacion es preparada de acuerdo con el metodo de la reivindicacion 1 o 2.
  8. 8. La composicion de la reivindicacion 7, en la que la composicion es una composicion vftrea seca.
  9. 9. La composicion de la reivindicacion 7, en la que el material bioactivo comprende una celula, un microbio, un virus, un cultivo celular, una bacteria, una bacteria probiotica, una bacteria probiotica de plantas y suelo, una levadura, una protema, una protema recombinante, una enzima, un peptido, una hormona, una vacuna, un farmaco, un antibiotico, una vitamina, un carotenoide, un mineral, un microbiocida, un fungicida, un herbicida, un insecticida o un espermicida.
  10. 10. La composicion de la reivindicacion 7, en la que el agente formador de matriz es un polisacarido seleccionado del grupo consistente de: acetato ftalato de celulosa (CAP), carboximetilcelulosa, pectina, alginato de sodio, sales de acido algmico, hidroxilpropilmetilcelulosa HPMC), metilcelulosa, carragenano, goma guar, goma acacia, goma xantano, goma de algarrobo, quitosano y derivados de quitosano, almidones y almidones modificados, ciclodextrinas, inulina, maltodextrinas, dextranos y combinaciones de los mismos.
  11. 11. La composicion de la reivindicacion 7, en la que el agente formador de cristales es facilmente soluble en una solucion, no se espesa ni polimeriza por contacto con agua y no forma cristales durante el secado.
  12. 12. La composicion de la reivindicacion 7, en la que los agentes formadores de cristales son seleccionados del grupo consistente de protemas, tales como albumina de suero humano y bovino, albumina de huevo, gelatina, inmunoglobulinas, protema de soja aislada, protema de trigo, leche en polvo desnatada, caseinato, protema de suero, protema de guisantes y cualquier hidrolizado de protemas; carbohidratos incluyendo monosacaridos (galactosa, D-manosa, sorbosa, etc.), disacaridos incluyendo lactosa, trehalosa, sacarosa, etc.; un aminoacido tal como lisina, glutamato de monosodio, glicina, alanina, arginina o histidina, asf como aminoacidos hidrofobos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etc.); una metilamina tal como betama; un poliol tal como alcoholes trilmdricos o de azucar superiores, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, manitol e isomaltol;
    propilenglicol; polietilenglicol; surfactantes tales como esteres de azucar de acidos grasos y fosfoUpidos tales como lecitina; y combinaciones de los mismos.
  13. 13. La composicion de la reivindicacion 7 para la administracion a animales y plantas en forma de un lfquido 5 reconstituido o de un polvo triturado incorporado en un producto alimenticio o pienso.
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