BR112012018839B1 - composição vítrea seca compreendendo um material bioativo - Google Patents

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Abstract

"composição vítrea seca compreendendo um material bioativo". a presente invenção se refere a formulações e métodos para estabilizar e proteger de materiais biológicos durante condições de uso e duras de armazenamento, em que as formulações se referem a materiais bioativos incrustados e biológicos, incluindo bactérias vivas, em uma matriz protetora.

Description

“COMPOSIÇÃO VÍTREA SECA COMPREENDENDO UM MATERIAL BIOATIVO”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDO RELACIONADO
Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório US N°: 61/299.315 depositado no escritório de Marcas e Patentes dos Estados Unidos em 28 de janeiro de 2010, cujo conteúdo é pelo presente documento incorporado por referência no presente documento para todos os propósitos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Campo da invenção
A presente invenção se refere a estabilização e proteção de materiais biológicos durante condições de uso e duras de armazenamento, e mais particularmente, a invenção se refere à incrustação materiais bioativos e biológicos incluindo bactérias vivas em uma formulação protetora de uma matriz vítrea amorfa.
Técnica Relacionada
A secagem por congelamento tem sido tradicionalmente o método mais comum de conservação de substâncias biológicas sensíveis tais como bactérias vivas ou mortas e vírus e proteínas, enquanto que outros métodos tais como secagem por pulverização, secagem por pulverização fluidizada e dessecação não são geralmente adequados. As altas temperaturas de secagem usadas nestes métodos têm como resultado dano significativo ao material bioativo por si mesmo. Além disso, podem não secar suficientemente o material aos requisitos de umidade residual específica ou atividade de água para a estabilidade do produto, e assim uma etapa de secagem adicional por outros meios, pode ser requerida. Um processo de secagem por congelamento convencional tipicamente envolve congelar a solução contendo o material bioativo, e liofilizar o biomaterial congelado sob vácuo completo ao mesmo tempo em que permanece congelado. As baixas temperaturas do processo de secagem por congelamento diminuem a reação de degradação do material bioativo e minimizam a perda de atividade na forma seca final. Com freqüência o processo de secagem por congelamento tem como resultado uma perda significativa de atividade e dano ao material bioativo
2/34 devido à formação de cristais de gelo durante o processo de secagem lenta. Além disso, a etapa de congelamento por si mesma, se não for feita corretamente, pode desnaturar ou inativar o material bioativo. O dano causado pela formação de uma estrutura de cristais de gelo pode ser contornado, a um certo grau, pela adição de agentes crioprotetores à solução bioativa (Morgan el al., 2006). Tais agentes protetores são produtos químicos altamente solúveis que são adicionados a uma formulação para proteger membranas celulares e proteínas durante o congelamento e para aumentar a estabilidade durante o armazenamento. Estabilizantes comuns para bactérias vivas e vírus incluem açúcares superiores tais como sacarose, glicerol, ou sorbitol, a altas concentrações com o material celular ou bioativo (Morgan el al., 2006; Capela et al., 2006). No entanto, tais agentes protetores podem não penetrar adequadamente na célula para proteger componentes ativos dentro do volume intracelular que pode levar a instabilidade após o armazenamento das substâncias secas por congelamento. Por esta razão, biomateriais membranosos tais como vírus, bactérias, e células não sobrevivem bem em processo de secagem por congelamento. Portanto, um desafio significativo permanece para desenvolver um processo de secagem ótimo e formulação que minimiza as perdas de secagem ao mesmo tempo em que alcança estabilidade de armazenamento adequada do material seco.
Alguns dos problemas associados à secagem por congelamento foram resolvidos usando uma combinação de certas formulações e secagem a vácuo em um estado vítreo, particularmente vidros de açúcar (Pat. US 6.190.701). Os materiais bioativos estabilizados secos são protegidos em uma matriz vítrea contra ambientes hostis tais como altas temperaturas e umidade. Geralmente, a estabilização por formação de vidro é iniciada por meio da concentração da solução de açúcar contendo uma molécula bioativa para formar xarope supersaturado. Remoção de água adicional progressivamente solidifica o xarope, que eventualmente se torna um vidro de açúcar sólido em baixo conteúdo de água residual. A difusão química é negligenciável em vidro e, portanto as reações químicas virtualmente cessam. Uma vez que desnaturação ou danos de membrana são mudanças químicas, não podem ocorrer no vidro e o material bioativo é estabilizado e protegido. Muitos vidros falham em estabilizar porque reagem com o material bioativo durante o armazenamento. Problemas óbvios ocorrem
3/34 com a redução de açúcares, que podem formar bons vidros físicos, mas então os seus grupos aldeído atacam grupos amino no bioativo em uma reação de Maillard típica, enquanto que açúcares não reativos dão produtos estáveis, que não requerem refrigeração de modo algum.
Uma vez que açúcares são inerentemente higroscópicos, a remoção de água e secagem final do xarope supersaturado se torna extremamente difícil. Este inconveniente foi tratado pela primeira vez por (Annear 1962) que desenvolveu uma formulação contendo bactérias em uma solução de açúcares e aminoácidos e um processo de secagem a vácuo que envolve ebulição e formação de espuma do xarope concentrado. Roser el al. (US. Pat 6.964.771) revelaram um conceito similar da secagem por formação de espuma que inclui uma etapa de concentração pela evaporação da massa do solvente seguido por ebulição e espumagem o xarope concentrado sob vácuo. Para mitigar o dano por oxidação e desnaturação que pode ocorrer durante a etapa de ebulição, Bronshtein (Patentes US 5.766.520, 7.153.472) introduziu uma fórmula protetora melhorada contendo carboidratos e surfactantes. A secagem da solução protetora também envolveu um processo etapa a etapa de concentração sob um vácuo moderado antes da aplicação de um vácuo forte para causar ebulição espumosa da água restante para formar espuma estável seca. Para contornar a etapa de ebulição, Busson e Schroeder (Pat. US N° 6.534.087) introduziram um processo de secagem em estado líquido de uma formulação adequada para materiais bioativos sensíveis e usando um forno a vácuo sob pressão de vácuo muito moderada acima de 30 Torr. Após alcançar um certo nível da secagem sem ebulição do material, calor foi aplicado a acima de 20 °C e o material seco foi colhido após somente umas poucas horas.
Este tipo de processo de secagem, em que a solução bioativa é mantida em um estado líquido durante todo o processo de secagem, tem a vantagem de secar mais rápido devido a evaporação do líquido durante ebulição e a área de superfície aumentada apresentada pelas superfícies de espumagem. No entanto, ebulição e espumagem requerem a entrada de uma quantidade significativa de calor para proporcionar a erupção necessária da solução. Tal processo de secagem não é bem adaptado para a secagem de biológicos sensíveis, tais como vírus viáveis, células ou
4/34 bactérias porque, o calor aplicado acelera degradação enzimática (por exemplo, proteólise), e oxidação química (por exemplo, oxidação e ataques de radical livre), que pode destruir a atividade ou viabilidade do material biológico.
O processo de secagem descrito acima é também limitado na sua capacidade de ser escalado a um maior processo industrial. A evitação do congelamento requer que o processo seja conduzido a um nível mais baixo de vácuo (>7 TORR) que em ciclos de secagem por congelamento ou processo de secagem por congelamento por pulverização convencionais. A desvantagem mais significativa dos processos acima é a incapacidade de controlar e limitar a expansão da espuma dentro do recipiente, bandeja ou vial. A erupção incontrolável e formação de espuma com freqüência excessiva torna praticamente impossível desenvolver um processo em escala industrial. A erupção e natureza da espumagem da etapa de ebulição têm como resultado uma porção de material sendo entrançada nas paredes do recipiente e na câmara de secagem. Para suavizar a erupção durante a ebulição, Bronshtein (Patentes US 6.884.866, 6.306.345) propôs câmaras especiais e um protocolo de aplicação de temperatura/pressão controlada que reduz o sobreaquecimento a um nível aceitável. Outra abordagem para conter a erupção e espumagem excessiva é descrita no Pedido de Pat. US N° 2008/0229609, em que a solução bioativa é encerrada em um container ou uma bolsa coberta com membranas respiráveis. Mais uma vez, estes protocolos são difíceis de implementar a nível industrial, requerem equipamento especial e são difíceis de reproduzir de maneira confiável com formulações diferentes.
O processo de espuma seca, como é conhecido na técnica, não é particularmente bem adaptado para a conservação de materiais biológicos membranosos, tais como lipossomas, vírus ou células viáveis e bactérias. Membranas lipídicas com freqüência previnem a penetração dos agentes protetores em volumes encerrados ou previnem remoção adequada de água do volume encenado. Sem penetração adequada de agentes protetores, processos enzimáticos, tais como proteólise, e processos químicos, tais como oxidação e ataques por radical livre, podem destruir a atividade ou viabilidade do material biológico membranoso. Fluidos hiposmóticos que permanecem dentro de volumes encerrados de membrana podem promover a instabilidade do material biológico. Truong-le, Vu (Pat. US 7.381.425) descreve um processo de secagem por
5/34 congelamento adequado para bioativos membranosos. As composições da invenção incluem um poliol e um material bioativo membranoso. O processo de secagem começa pelo resfriamento da formulação a uma temperatura de cerca de uma temperatura de transição de fase das membranas lipídicas, redução da pressão sobre a formulação para formar espuma estável, congelamento da espuma, e então sublimação da água a partir da espuma congelada para proporcionar uma composição de espuma seca liofílizada. Condições de secagem secundária podem ser empregadas para secar adicional mente a espuma.
Uma necessidade permanece de uma formulação protetora adequada que pode ser seca em estado vítreo sem ebulição e espumagem excessiva. Existe uma necessidade particularmente de uma formulação econômica e processo de secagem escalável que é também adequado para aplicações fora da indústria farmacêutica tal como indústrias de alimentos e da agricultura. Formulações protetoras e processos de secagem suaves são requeridos para proporcionar secagem adequada sem exposição a altas temperaturas. Uma composição é necessária a qual possa proteger tais materiais biológicos em armazenamento sob alta temperatura e condições de umidade. A presente invenção proporciona uma solução a todos estes desafios como é descrito a seguir. O processo de desidratação da presente invenção é muito suave e não expõe o agente ativo a ebulição ou espumagem e é, portanto vantajoso sobre as técnicas de secagem por congelamento convencional e secagem por espuma que submetería a amostra a um ou ambos estes stresses.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção inclui composições e métodos de secagem para conservar materiais bioativos sensíveis, tais como peptídeos, proteínas, enzimas, hormônios, vitaminas, carotenóides, minerais, fármacos, antibióticos, microbiocidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, espermicidas, ácidos nucleicos, anticorpos, vacinas, bactérias (probióticas ou de outro modo), vírus e/ou suspensões de células em armazenamento. Os métodos de secagem proporcionam um processo para a secagem de uma formulação compreendendo os materiais bioativos, um agente de formação de matriz, e um agente de formação de vidro. A formulação é preparada pela dispersão de todos os
6/34 componentes sólidos e os materiais bioativos em uma solução. A solução é congelada rapidamente por meios conhecidos na técnica tais como nitrogênio líquido ou gelo seco para formar uma composição amorfa em contas pequenas, fios ou gotículas. As partículas congeladas podem ser armazenadas em um congelador (entre -30 °C e - 80 °C) até a secagem ou imediatamente colocadas em bandejas em um estado amorfo congelado para a secagem de líquido em um convencional liofilizador. O método de secagem é iniciado por uma etapa de estabilização de estrutura e purga curta das partículas congeladas sob uma pressão de vácuo de menos de <2000 mTORR seguido por uma etapa de secagem primária sob mais de >2000 mTORR de pressão de vácuo e a uma temperatura desejada. Durante a etapa de secagem secundária e final do material amorfo vítreo, uma pressão de vácuo completo e temperatura elevada são aplicadas, para alcançar uma atividade de água final desejável do material seco.
Em uma modalidade, a formulação compreende quantidades suficientes de agentes de formação de matriz, em que o material bioativo é incrustado. Exemplos de um agente de matriz adequado incluem, mas não são limitados a, ftalato acetato de celulose (CAP), carboxi-metil-celulose, pectina, alginato de sódio, sais de ácido algínico, hidroxil propil metil celulose (HPMC), metil celulose, carragenana, goma guar, goma acácia, goma xantana, goma alfarroba, quitosana e derivados de quitosana, colágeno, ácido poliglicólico, amidos e amidos modificados, ciclodextrinas e oligossacarídeos (inulina, maltodextrinas, dextranas, etc.); e combinações dos mesmos. Em uma modalidade particular, o agente de formação de matriz preferido é alginato de sódio. Preferivelmente, a formulação compreende, em porcentagem em peso de matéria seca total, 0,1-20 % e mais preferivelmente 1-12 %.
Em uma modalidade adicional, o agente de formação de matriz compreende uma mistura de alginato de sódio e oligossacarídeos em uma razão em peso de 1:1-10, mais preferivelmente 1:1- 5 de alginato de sódio/oligossacarídeos.
Em ainda outra modalidade da presente invenção, o agente de formação de matriz é reticulado com íons de metais divalentes para formar um hidrogel firme. A formulação de hidrogel reticulado é formada pela atomização ou extrusão da pasta em um banho contendo solução de íons de metal divalente ou adicionando íons de metal divalente diretamente na pasta e permitindo que a formulação endureça e forme um
7/34 hidrogel. A formulação de hidrogel é então congelada rapidamente e seca de acordo com os métodos de secagem da invenção.
Em ainda outra modalidade, a formulação compreende quantidades significativas de agentes de formação de vidro, em que os microorganismos são incrustados. Exemplos de um agente adequado incluem, mas não são limitados a proteínas tais como albúmen de ovo, clara de ovo, gelatina, imunoglobulina, proteína de soja isolada, proteína de trigo, proteína de ervilha, proteína de semente de algodão, leite desnatado em pó, caseinato, proteína do soro do leite e qualquer proteína hidrolisada; carboidratos incluindo monossacarídeos (por exemplo, galactose, D-manose, sorbose, etc.), dissacarídeos (por exemplo, lactose, trealose, sacarose, etc.), um aminoácido tal como lisina, glutamato, glicina, alanina, arginina ou histidina, bem como aminoácidos hidrofóbicos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etc.); uma metilamina tal como betaína; um sal excipiente tal como sulfato de magnésio; um poliol tal como trihídrico ou álcoois de açúcar superiores, (por exemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, e manitol); propileno glicol; polietileno glicol; plurônicos; surfactantes; e combinações dos mesmos.
Em uma modalidade preferida; o agente de formação de vidro compreende uma mistura de um dissacarídeo e uma proteína hidrolisada. Em uma modalidade particular, o agente de formação de vidro preferido é uma mistura de trealose e proteína hidrolisada. Preferivelmente, a formulação compreende, em porcentagem em peso de matéria seca total, 10-90 % de trealose e 0,1-30 % de proteína hidrolisada, mais preferivelmente 20-80 % de trealose e 0,1-20 % de proteína hidrolisada, e mais preferivelmente 40-80 % de trealose e 0,1-20 % de proteína hidrolisada.
O método da invenção tipicamente inclui misturar em uma solução materiais bioativos (por exemplo, peptídeos, proteínas, enzimas, hormônios, vitaminas, carotenóides, minerais, fármacos, antibióticos, microbiocidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, espermicidas, ácidos nucleicos, anticorpos, vacinas, bactérias, vírus e/ou suspensões de células), pelo menos um agente de formação de matriz, e pelo menos dois agentes de formação de vidro em uma pasta homogênea, congelar rapidamente a pasta por atomizaçao, gotejamento ou extrusão em nitrogênio líquido banho. Coletar as contas, microcontas, fios ou gotículas do banho de nitrogênio líquido e secagem em um
8/34 estado líquido em um liofilizador, ou alternativamente armazenando as mesmas em um congelador (entre -30 °C e -80 °C) até a secagem.
Em uma variação da presente invenção, a quantidade do agente de formação de matriz na formulação é ajustada para alcançar uma viscosidade e densidade de formulação desejada que permita uma secagem primária eficiente ao mesmo tempo em que evita a ebulição e espumagem excessiva que ocorrem tipicamente durante a etapa de secagem primária de líquido. Uma densidade desejada da formulação líquida pode ser alcançada por quaisquer meios conhecidos na técnica, por exemplo, batimento ou injeção de gás tal como ar, nitrogênio, dióxido de carbono, argônio etc. Preferivelmente, nitrogênio é injetado na formulação de pasta viscosa sob mistura para formar pasta cremosa ou porosa estável antes da etapa de congelamento rápido.
De acordo com a invenção, o processo de secagem envolve três etapas principais; 1. Etapa de estabilização de estrutura e purga curta das partículas congeladas sob uma pressão de vácuo de menos de <2000 mTORR, 2. Etapa de secagem primária de líquido sob pressão de vácuo de mais than >2000 mTORR e a uma temperatura desejada, 3. Etapa de secagem secundária e final do material vítreo sob pressão de vácuo completo e temperatura elevada por um tempo suficiente para reduzir a atividade dc água da formulação seca a 0,3 Aw ou menos.
Em modalidades preferidas dos métodos de secagem, o material bioativo é misturado em uma solução incluindo um agente de formação de matriz e um agente de formação de vidro. Em uma modalidade particular, o material bioativo compreende bactérias vivas (por exemplo, bactérias probiótica). Exemplos de microorganismos adequados incluem, mas não são limitados a, leveduras tais como Saccharomyces, Debaromyces, Candida, Pichia e Torulopsis, mofos tais como Aspergillus, Rhizopus, Mucor, Penicillium e Torulopsis e bactérias tais como os gêneros Bifidobacterium, Clostridium, Fusobacterium, Melissococcus, Propionibacterium, Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, Kocuriaw, Staphilococcus, Peptostrepococcus, Bacillus, Pediococcus, Micrococcus, Leuconostoc, Weissella, Aerococcus, Oenococcus e Lactobacillus. Exemplos específicos de microorganismos probióticos adequados seriam representados pelas seguintes espécies e incluem todos os biotipos de cultura dentro daquelas espécies: Aspergillus niger, A. oryzae, Bacillus coagulans, B. lentus, B.
9/34 licheniformis, B. mesentericus, B. pumilus, B. suhtilis, B. natto, Bacteroides amilophilus, Bac. capillosus, Bac. ruminocola, Bac. suis, Bifidobacterium adolescentis, B. animalis, B. breve, B. bifidum, B. infantis, B. lactis, B. longum, B. pseudoIongum, B. thermophilum, Candida pintolepesii, Clostridium butyricum, Enterococcus cremoris, E. diacetilactis, E faecium, E. intermedius, E. lactis, E. muntdi, E. thermophilus, Escherichia coli, Kluyveromyces fragilis, Lactobacillus acidophilus, L. alimentarias, L. amilovorus, L. crispatus, L. brevis, L. case 4 L. curvatus, L. cellobiosus, L. delbrueckii ss. bulgaricus, L farciminis, L. fermentam, L. gasseri, L. helveticus, L. lactis, L. plantarum, L. johnsonii, L. reuteri, L. rhamnosus, L. sakei, L. salivarias, Leuconostoc mesenteroides, P. cereviseae ( damnosus ), Pediococcus acidilactici, P. pentosaceus, Propionibacterium freudenreichii, Prop, shermanii, Saccharomyces cereviseae, Staphilococcus carnosus, Staph, xilosus, Streptococcus infantarius, Strep, salivarias ss. thermophilus, Strep. Thermophilus e Strep, lactis.
Em métodos preferidos, a formulação é misturada a temperatura ambiente ou ligeiramente aquecida para assistir na solubilização dos materiais em solução viscosa (por exemplo, desde 20 °C até 40 °C). Após misturar até a homogeneidade, a pasta viscosa é então congelada rapidamente por atomização, gotejamento, ou extrusão em nitrogênio líquido. As partículas congeladas são colhidas do banho de nitrogênio líquido e são i medi atamente secas ou alternativamente armazenadas em um congelador para posterior secagem. Tipicamente, a pasta contendo o bioativo é congelada rapidamente a entre -30 °C a -180 °C, mais preferivelmente a formulação é congelada rapidamente em nitrogênio líquido.
Em uma modalidade preferida, as partículas congeladas rapidamente são imediatamente secas ou de outro modo armazenadas em um congelador, preferivelmente a -80 °C, até a secagem. As partículas congeladas são então carregadas em bandejas e imediatamente transferidas a uma câmara de secagem a vácuo onde são secas de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, a secagem é iniciada submetendo as partículas congeladas sob pressão de vácuo entre 0 e 2000 mTORR. As partículas congeladas são desgaseificadas e a sua estrutura e volume permitidos que se desenvolvam e estabilizem por um curto período de tempo. Tipicamente, o período de tempo desejável para submeter a partícula congelada a alta pressão de vácuo não é mais
10/34 de 30 minutos, mais preferivelmente o período de tempo é entre 1 e 20 min. Após a desgaseificação inicial curta e estabilização de estrutura das partículas congeladas o vácuo é ajustado a entre 2000 e 10.000 mTORR e calor aplicado para descongelar as partículas a uma temperatura acima do seu ponto de congelamento. Tipicamente, o vácuo é ajustado a entre 2000 e 4000 mTORR e a temperatura de partícula é aumentada a entre -5 °C e +5 °C. Sob estas condições de secagem primária preferidas as partículas congeladas são rapidamente descongeladas e mantêm frouxamente a sua forma original enquanto uma desidratação acelerada se inicia. A subsequente secagem secundária é estabelecida após remover cerca de 60-90 % da água livre, uma pressão de vácuo máxima é aplicada e calor que fornece temperatura à formulação é elevado a desde 30 °C até 60 °C. Para maximizar a estabilidade do produto final, a formulação é preferivelmente scca por um tempo suficiente para reduzir a atividade de água da formulação a Aw ~ 0,3 ou menos. Em uma modalidade preferida da invenção, a secagem secundária compreende a remoção de água ligada a uma pressão de menos de 1000 mTORR.
A formulação seca pode ser usada diretamente como um floco, ou moída em um pó e peneirada a um tamanho de partícula médio desde aproximadamente 10 pm até aproximadamente 1000 pm. A formulação pode ser administrada diretamente a um animal, incluindo o homem, como um pó concentrado, como um líquido reconstituído, (por exemplo, bebida), ou pode ser incorporada em forma de floco ou pó em um produto alimentício ou de ração animal existente.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
Figura 1. Observações visuais e microscópicas de diferentes composições secas contendo várias matrizes e agentes de formação de vidro como conta sólida congelada de acordo com o método da presente invenção.
Figura 2. O efeito da forma de cultura de L. rhamnosus como contas frescas, congeladas ou culturas de pó seco nas suas contagens de UFC inicial em uma composição seca.
Figura 3. O efeito de temperatura de congelamento de uma composição contendo L. rhamnosus como contas sólidas congeladas em nitrogênio líquido ou
11/34 congelador a -80 °C e como pasta viscosa não congelada a +4 °C nas contagens de UFC inicial bacteriana na composição seca. Os resultados mostram somente o efeito de temperatura de congelamento da pasta com nenhuma etapa adicional de purga antes da secagem.
Figura 4. O efeito de temperatura de congelamento de uma composição contendo Bifidobacterium animalis Bbl2 como contas sólidas congeladas em nitrogênio líquido e como pasta viscosa não congelada a +4 °C nas contagens de UFC inicial bacteriana na composição seca. Os resultados mostram somente o efeito de temperatura de congelamento da pasta com nenhuma etapa adicional de purga antes da secagem.
Figura 5. O efeito de duração da purga sob vácuo de contas sólidas congeladas em contagens de UFC inicial de L rhamnosus em uma composição seca.
Figura 6. Perfil de secagem em um liofílizador da composição de acordo com o método da invenção.
Figura 7. Processo e perdas de secagem de L. rhamnosus em composições e métodos de secagem da invenção.
Figura 8. Tendências de estabilidade de bactérias probióticas secas, composição de L. rhamnosus em armazenamento a 40 °C e 33 % de umidade relativa.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
DEFINIÇÕES
E para ser entendido que a terminologia usada no presente documento é para o propósito de descrição de modalidades particulares somente, e não é pretendido que seja limitativo.
Como usado neste relatório descritivo e as reivindicações anexas, as formas em singular um, uma e a/o incluem referências ao plural a não ser que o conteúdo claramente dite de outro modo. Assim, por exemplo, referência a uma proteína inclui proteína singular ou uma combinação de duas ou mais proteínas; referência a enzima, vitamina, bactéria, etc., inclui singular ou misturas de diversos, e similares.
Material bioativo, composição bioativa, ou formulação bioativa se refere a preparações, que são em tal uma forma como para permitir a atividade biológica dos ingredientes bioativos para serem inequivocamente efetiva.
12/34
Agente de formação de matriz se refere a compostos ou materiais que são adicionados à formulação para aumentar a viscosidade e ou a densidade da formulação úmida ou para formar um hidrogel. Exemplos de um agente de formação de matriz adequado incluem, mas não são limitados a derivados de celulose solúveis em água tais como metilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxietilcelulose, e hipromelose; alginatos, galactomanana, goma gelana, tragacanto, incluindo quaisquer derivados destes, ftalato acetato de celulose (CAP), carboxi-metil-celulose, pectina, alginato de sódio, sais de ácido algínico, hidroxil propil metil celulose (HPMC), metil celulose, carragenana, goma guar, goma acácia, goma xantana, goma alfarroba, quitosana e derivados de quitosana, colágeno, ácido poliglicólico, amidos e amidos modificados, ciclodextrinas e oligossacarídeos (inulina, maltodextrinas, dextranas, etc.) e combinações dos mesmos.
Agente de formação de vidro ou sugar agente de formação de vidro geralmente se refere a compostos ou materiais que são prontamente solúveis em uma solução e não espessam ou polimerizam após o contato com água. Estes agentes são adicionados para assegurar ou aumentar a estabilidade do material bioativo durante o processo de secagem e depois disso, ou para estabilidade de armazenamento a longo prazo do produto em pó seco. Agentes de formação de vidro úteis podem ser monoméricos, oligoméricos ou poliméricos.
De acordo com uma das modalidades preferidas, os agentes de formação de vidro é um sacarídeo. Um sacarídeo, ou carboidrato, é definido como um composto predominantemente composto de carbono, hidrogênio, e oxigênio. Sacarídeos úteis incluem açúcares redutores e não redutores e álcoois de açúcar, oligossacarídeos, polissacarídeos solúveis em água e derivados dos mesmos. Sacarídeos preferidos de acordo com a invenção incluem glucose, frutose, lactose, sacarose, trealose, maltose, celobiose, galactose, maltotriose, rafinose, dextrina, dextrana, inulina, manitol, sorbitol, xilitol. Sacarídeos particularmente preferidos são glucose e trealose.
Outros agentes de formação de vidro úteis podem ser selecionados a partir de outras classes químicas, tais como aminoácidos solúveis em água, peptídeos ou proteínas e proteína hidrolisada. Por exemplo, lisina, glicina, alanina, arginina ou histidina, bem como aminoácidos hidrofóbicos (triptofano, tirosina, leucina, fenilalanina, etc); uma metilamina tal como betaína. Proteínas úteis incluem gelatinas,
13/34 albumina de ovo, clara de ovo, proteína do soro do leite, caseinato, imunoglobulinas, proteína de soja, proteína de ervilha, proteína de semente de algodão ou outras proteínas alimentícias, lácteas ou vegetais.
Proteínas hidrolisadas geral mente se referem a proteínas de fonte animal, láctea ou de planta que foram degradadas por hidrólise enzimática ou digestão em fragmentos de peptídeo mais curtos e/ou aminoácidos. Proteínas hidrolisadas úteis são aquelas submetidas a um processo de hidrólise extenso que reduz o peso molecular de 99 % das proteínas nativas a menos de 50.000 Dalton, preferível a menos de 10.000 Dalton.
Condições ou temperaturas ambientes ambientais são aquelas em qualquer dado tempo em um dado ambiente. Tipicamente, temperatura ambiente ambiental é 2225 °C, pressão atmosférica ambiental, e umidade ambiental são prontamente medidas e variarão dependendo do tempo de ano, clima e condições climáticas, altitude, etc.
Purga ou D es gaseificação no contexto da presente invenção se refere à liberação de um gás de uma formulação sólida ou formulação líquida em que a pressão parcial do gás é maior que a pressão aplicada. Isto não é a ebulição de solução na forma líquida, e pode com freqüência ocorrer a pressões acima de uma pressão que fervería uma solução.
Ebulição se refere à transição rápida de fase de líquido a gás que ocorre quando a temperatura de um líquido está acima da sua temperatura de ebulição. A temperatura de ebulição é a temperatura na qual a pressão de vapor de um líquido é igual à pressão aplicada. Ebulição pode ser particularmente vigorosa quando o calor é adicionado a um líquido que já está no seu ponto de ebulição.
Atividade de água ou ’’Aw’’, no contexto de composições de formulação seca, se refere à disponibilidade de água e representa o status de energia da água em um sistema. E definido como a pressão de vapor de água acima de uma amostra dividido por essa da água pura na mesma temperatura. Agua destilada pura tem uma atividade de água de exatamente um ou Aw - 1,0.
Umidade relativa ou RH no contexto de estabilidade de armazenamento se refere à quantidade de vapor de água no ar a uma dada temperatura. Umidade relativa é usualmente menor que essa requerida para saturar o ar e expresso em porcentagem de
14/34 umidade de saturação.
Seco e variações do mesmo se referem a um estado físico que é liofílizado, desidratado ou anidro, isto é, líquido substancial mente em falta. A secagem inclui, por exemplo, secagem por pulverização, secagem em leito fluidizado, liofilização, e secagem a vácuo.
Liofilizar ou Secagem por congelamento se refere à preparação de uma composição na forma seca por congelamento rápido e desidratação no estado congelado (algumas vezes denominado como sublimação). Este processo pode ocorrer sob vácuo a uma pressão suficiente para manter o produto congelado, preferivelmente abaixo de aproximadamente <2000 mTORR.
Secagem primária ou Secagem de líquido, com relação a processos descritos no presente documento, se refere à secagem por desidratação que ocorre desde o tempo de descongelamento das partículas congeladas até o ponto onde começa a secagem secundária. Tipicamente, a massa de secagem primária ocorre por evaporação extensa, enquanto a temperatura de produto permanecia significativamente abaixo das temperaturas da fonte de calor. Este processo pode ocorrer sob vácuo a uma pressão suficiente para manter o produto descongelado, preferivelmente acima de aproximadamente >2000 mTORR.
Secagem secundária, com relação a processos descritos no presente documento, se refere a uma etapa de secagem que ocorre a temperaturas acima das temperaturas de congelamento da formulação e próximas à temperatura da fonte de calor. Este processo pode ocorrer sob vácuo a uma pressão suficiente para reduzir a atividade de água de uma formulação, preferivelmente menos de aproximadamente <1000 mTORR. Em um processo de secagem de formulação típico, uma etapa de secagem secundária reduz a atividade de água da formulação a um Aw de 0,3 ou menos.
Formação de espuma se refere a um procedimento para biológicos sensíveis à secagem por ebulição sob vácuo sob condições em que os biológicos retêm atividade ou viabilidade por extensos períodos de tempo a temperaturas ambientais e superiores. O procedimento específico para a formação de uma estrutura porosa mecanicamente estável procede em duas etapas; (1) Espuma - Secagem Primária e por ebulição sob um vácuo (2) Secagem/Vitrificação de Estabilidade, e são revelados na Patente US N°
15/34
5.766.520 a Bronshtein.
Uma formulação ou composição estável é uma em que o material biologicamente ativo na mesma retém essencialmente a sua estabilidade física, estabilidade química, e/ou atividade biológica após o armazenamento. A estabilidade pode ser medida a uma temperatura selecionada e condições de umidade para um período de tempo selecionado. Análise de tendência pode ser usada para estimar uma vida útil esperada antes que um material tenha estado realmente em armazenamento por esse período de tempo. Para as bactérias vivas, por exemplo, a estabilidade é definida como o tempo leva para perder 1 log de UFC/g de formulação seca sob condições predefmidas de temperatura, umidade e período de tempo.
Viabilidade com relação a bactérias, se refere à capacidade de formar uma colônia (UFC ou Unidade Formadora de Colônia) em um meio nutriente apropriado para o crescimento das bactérias. Viabilidade, com relação a vírus, se refere à capacidade e infectar e reproduzir em uma célula hospedeira adequada, tendo como resultado a formação de uma placa em um camada de células hospedeiras.
As composições e métodos da presente invenção resolvem o problema de proporcionar um processo de secagem econômico e industrialmente escalável para formulações contendo materiais bioativos sensíveis, tais como peptídeos, proteínas, enzimas, hormônios, vitaminas, carotenóides, minerais, fármacos, antibióticos, microbiocidas, fungicidas, herbicidas, inseticidas, espermicidas, ácidos nucleicos, anticorpos, vacinas, bactérias, vírus e/ou suspensões de células, com um significativamente tempo de vida estendido no estado seco.
A invenção proporciona uma composição compreendendo um material bioativo e matriz e agentes de formação de vidro em uma solução mistura e um método de secagem compreendendo congelar rapidamente dita composição em nitrogênio líquido para formar uma estrutura sólida amorfa em uma forma de gotículas, fios, contas ou microcontas e purgar as partículas congeladas sob alto vácuo seguido por estabilização do material bioativo em uma formação de vidro de açúcar por liofilização ou evaporação da umidade sob um regime de pressão reduzida ao mesmo tempo que fornece calor à composição.
A maior parte da perda de viabilidade de microorganismo durante os processos
16/34 de secagem pode ser atribuída a uma combinação de formação de cristal de gelo, altos stresses osmóticos e oxidativos, forças de cisalhamento e liberação de energia durante cavitações de bolhas associada à ebulição” e espumagem da solução sob baixa pressão de secagem e alta temperatura. A presente invenção evita tais efeitos negativos e proporciona composições e métodos de secagem com uma perda mínima e que tem como resultado um material bioativo protegido em matriz de vidro de açúcar sob condições de armazenamento duras e de manuseio após isso.
COMPOSIÇÕES DA INVENÇÃO
A presente invenção inclui composições de um material bioativo, um agente de formação de matriz e agentes de formação de vidro em uma solução viscosa. Foi descoberto que as formulações da invenção são inerentemente diferentes na sua estrutura física e função das formulações não viscosas ou concentradas que foram secas com ou sem congelamento rápido e purga. Por exemplo, formulações da técnica anterior foram inicialmente espumadas” por ebulição para facilitar a secagem efetiva. A etapa de espumagem geralmente resultou em uma ebulição extensiva e erupção da solução que é uma consequência inevitável da secagem em um estado líquido e como um resultado, somente uma capacidade de carga muito baixa de material em um vial ou um recipiente pode ser alcançada (ver, por exemplo, Pat. US N° 6.534.087, em que a espessura do produto espumado final é menor que 2 mm).
As composições e métodos de secagem da presente invenção evitam ebulição e espumagem extensiva da formulação deste modo possibilitando carga muito maior de material por área de secagem e, como um resultado, pode ser facilmente escalado até a produção de grandes quantidades de material sem o uso de recipientes especificamente desenhados, bandejas ou equipamento.
Bactérias probióticas mostraram serem beneficiadas particularmente a partir das formulações e métodos de secagem da presente invenção. A formulação é preparada de acordo com as composições e métodos da invenção incluindo misturar frescas, congeladas ou culturas secas de bactérias probióticas com pelo menos um agente de formação de matriz e pelo menos dois agentes de formação de vidro, congelar rapidamente a formulação viscosa em nitrogênio líquido para formar uma estrutura
17/34 amorfa de congeladas sólido gotículas, fíos ou contas. Para a secagem primária, suficiente pressão de vácuo é aplicada para purgar e estabilizar a estrutura das partículas congeladas e então as partículas congeladas são liofílizadas ou evaporadas sob pressão reduzida de vácuo e temperatura aumentada acima da temperatura de congelamento da formulação. Manter a temperatura da formulação acima do ponto de congelamento pode ser conseguido pela condução de calor para longe da formulação, e/ou pela perda de calor latente devido a evaporação de água. Para completar o processo de secagem e reduzir adicionalmente a atividade de água da formulação, uma etapa de secagem secundária pode ser aplicada, a pressão de vácuo mais alta que 1000 mTORR e inferior e a temperatura elevada até 70 °C, para proporcionar uma composição final com atividade de água com um Aw de 0,3 ou menos. Tal composição pode permanecer estável em condições de armazenamento de 40° C e 33 %RH por 30 dias ou mais, como mostrado na Figura 8.
Preparação das composições
Os materiais, a ser misturados em uma solução com o bioativo preferido para a preparação de composições em pó seco de acordo com a invenção, incluem pelo menos um agente de formação de matriz e pelo menos dois agentes de formação de vidro. Tais materiais, quando misturados com o material bioativo preferido formam contas, microcontas, fios ou gotículas em nitrogênio líquido e podem ser efícientemente liofílizados ou desidratados em um estado vítreo amorfo de acordo com métodos da invenção e para proporcionar grandes quantidades de composições secas estáveis para armazenamento e administração de dito material bioativo (ver Figuras 1 A & B para observações visuais e microscópicas e atividade de água (Aw) de diferentes formulações após secagem). O agente de formação de matriz proporciona estabilidade estrutural à formulação, perfil melhorado de secagem e/ou benefícios protetores físicos e químicos aos materiais bioativos. O agente de formação de matriz também proporciona espessamento da viscosidade à formulação e melhor controle sobre as propriedades da formulação sob pressão de vácuo e resistência estrutural aumentada às composições de formulação seca da invenção (ver Figura 1 B- Imagens 4, 4b, 4c para a estrutura vítrea e secura dessa formulação particular). O agente de formação de matriz inclui uma mistura de polissacarídeos e oligossacarídeos. OS polissacarídeos preferidos,
18/34 particularmente para organismos vivos, são gomas solúveis em água, por causa da sua característica distintiva para formar gel viscoso a temperaturas moderadas. Gomas a certa concentração também estabilizam efotivamente a formulação e facilitam a formação de uma estrutura vítrea amorfa e melhoram o perfil de secagem sob vácuo 5 (ver Figura IA - imagens 3a, 3b, 3c, 4, e Figura IB - 4c e Figura 6).
De maneira notável vendo as imagens da Figura 1A em combinação com os resultados indicados a seguir na Tabela 1, é evidente que as amostras 3b, 3c, 4, 5, e 6 foram todas suficientemente secas para proporcionar alguma porosidade nas estruturas vítreas amorfas.
Tabela 1
Inspecção Visual das Várias Composições Secas
1 2 3a 3b 3c 4 [5 6
Secura Não Seca Não Seca Não Scca Seca iSeca Seca ;Scca Scca
........ Porosidade Nenhuma Nenhuma Nenhuma Presente Presente Presente Nenhuma Parcial
Aw 0,847 .0,923 0.916 0.216 0,183 0.376 Ό.17Ι 0,112
Bstrutura de Vidro Nenhuma Nenhuma Nenhuma Parcial =Parcial Presente Parcial Parcial
Agentes de formação de vidro da invenção podem incluir vários açúcares, açúcares não redutores, álcoois de açúcar, aminoácidos, proteínas, proteínas 15 hidrolisadas e peptídeos. O composto de formação de vidro é preferivelmente um que não cristaliza e/ou desestabiliza o material biologicamente ativo na formulação a temperaturas de congelamento (por exemplo, inferior a -20 °C). Por exemplo, material bioativo pode ser fisicamente incrustado em estruturas de vidro de açúcar amorfa tais como sacarose ou trealose para promover a retenção de estrutura molecular ao longo do 20 processo de secagem e transmitir rigidez estrutural à matriz amorfa no estado seco. O agente de formação de vidro substitui água de hidratação perdida durante a secagem, para prevenir dano a membranas celulares e desnaturação de enzimas (ver revisão por Crowe et al., 1998). Outras funções do agente de formação de vidro podem incluir proteger o material bioativo da exposição a luz prejudicial, oxigênio, agentes oxidativos 25 e umidade. Mais agentes de formação de vidro precisam ser prontamente dissolvidos em uma solução em quantidades que variam desde aproximadamente 0,1 por cento em peso
19/34 até aproximadamente 80 por cento em peso. É benéfico incluir dois ou mais agentes de formação de vidro diferentes para inibir a formação de cristais e melhorar a estabilidade da formulação bioativa de material seco em condições de armazenamento por períodos de tempo estendidos (ver o efeito de mistura de açúcares e proteínas na Figura IA imagens 4, 5 e 6).
As formulações pré-secas incluem uma quantidade substancial de sólidos totais (constituintes menos o solvente, tal como água). Uma maior porção dos sólidos totais consiste no material bioativo, os agentes de formação de matriz e os agentes de formação de vidro. Por exemplo, o material bioativo está presente na formulação em uma concentração que varia desde aproximadamente 5-60 por cento em peso, o agente de formação de matriz desde aproximadamente 1-20 por cento em peso, e o agente de formação de vidro desde aproximadamente 5-80 por cento em peso. Em outro exemplo, o agente de formação de matriz pode estar presente na formulação em uma concentração que varia desde aproximadamente 0,5-10 por cento em peso, e o agente de formação de vidro desde aproximadamente 10-50 por cento em peso. Preferivelmente, a formulação úmida deve ter conteúdo de sólidos entre aproximadamente 5 % e 80 %; mais preferivelmente entre 30 % e 60 %. A viscosidade de formulações da invenção é tipicamente maior que 1000 centipoises (cP); mais preferivelmente, maior que 5.000 cP; e mais preferivelmente maior que 10.000 cP. A densidade das formulações da invenção é preferivelmente entre 0,9 e 1,2 g/ml.
MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES SECAS ESTÁVEIS
Métodos para preparar formulações secas estáveis contendo materiais bioativos incluem; (1) preparação de uma formulação misturando o material bioativo com matriz e agentes de formação de vidro em uma solução, (2) congelar rapidamente a formulação para formar partícula congelada sólidas, (3) submeter a partícula congelada a alta pressão de vácuo por um curto tempo para purgar as partículas e estabilizar a sua estrutura, (4) remover água por liofilização e/ou evaporação da umidade sob pressão reduzida ao mesmo tempo que fornece calor à formulação a uma temperatura acima da temperatura de congelamento da formulação, preferivelmente superior a -10 °C, (5) reduzir adicionalmente a atividade de água da formulação até menos de 0,3 Aw sob
20/34 vácuo completo e temperatura elevada.
Em uma modalidade, por exemplo, as formulações da invenção incluem um material bioativo formulado em uma solução ou suspensão contendo uma matriz e agentes de formação de vidro. O agente de formação de matriz e/ou alta concentração de agentes de formação de vidro são dissolvidos e desinfetados em solução aquosa quente com agitação antes do resfriamento e mistura com o material bioativo. O material bioativo, tal como vírus ou bactéria cultivada, é concentrado e separado dos meios de cultura por centrifugação ou fíltração antes de re-suspensão na formulação.
Em uma modalidade da presente invenção, a totalidade da água na formulação é proporcionada no líquido do organismo vivo concentrado e a suspensão de organismo vivo é mantida a uma temperatura ligeiramente acima de temperatura ambiente. Os componentes secos são misturados juntos e então lentamente adicionados à suspensão morna (25 °C a 40 °C) do organismo vivo. A suspensão de formulação é gentilmente agitada em um misturador planetário até todos os componentes estarem completamente dispersos e uma pasta uniforme ser obtida.
A solução viscosa é então congelada rapidamente por atomização, gotejamento ou extrusão em banho de nitrogênio líquido para formar pequenas gotículas sólidas fios ou contas. As partículas sólidas congeladas podem ser armazenadas em um congelador entre -30 °C e -80 °C até a secagem ou imediatamente colocadas em bandejas e liofílizadas ou secas de acordo com os métodos da invenção. A partícula congelada sólida é purgada por um curto tempo, tipicamente entre 1 e 20 minutos, sob suficiente vácuo (por exemplo, abaixo de <2000 mTORR). Geralmente as partículas permanecem em uma forma sólida congelada a uma temperatura abaixo de -20 °C durante a etapa de purga. Após a etapa de purga inicial a pressão de vácuo é aumentada a entre 2000 e 10.000 mTORR e calor pode ser proporcionado permitindo que a temperatura de formulação aumente rapidamente a entre -5 °C e +5 °C e as partículas comecem a descongelar. Uma vez que a temperatura de formulação atinja a temperatura desejada, o calor é ajustado para manter essa temperatura e a etapa de secagem primária é progredida. Nesta etapa a formulação já está descongelada e evaporação acelerada de água ocorre sem qualquer ebulição ou espumagem.
Métodos típicos na técnica anterior envolvem espumagem extensiva e/ou
21/34 salpicos e ebulição violenta que podem ser prejudiciais a biológicos sensíveis e tornam difíceis o aumento a escala industrial a alta capacidade de carga (ver, por exemplo, Pat. US N° 6.534.087, onde a pressão aplicada de vácuo têm como resultado ebulição violenta e espumagem), enquanto que as presentes composições e métodos evitam qualquer ebulição ou espumagem excessiva da formulação ao mesmo tempo em que alcança uma taxa de secagem significativamente mais rápida e possibilita uma alta capacidade de carga da formulação. Adicionalmente, uma desgaseificação completa e eficiente de pastas líquidas viscosas é difícil e pode requerer um período de tempo estendido. Estes obstáculos foram todos resolvidos na presente invenção usando uma composição adequada que permite uma efetiva secagem primária de líquido que forma uma formação vítrea amorfa sem qualquer ebulição e espumagem excessiva. De maneira surpreendente e importante isto foi principalmente alcançado congelando rapidamente uma composição adequada e através da introdução de uma etapa de purga curta antes do começo da etapa de secagem primária de líquido. A carga de partículas congeladas sólidas em uma bandeja em oposição a pasta ou xarope viscoso permite muito maior capacidade de carga por área de secagem em bandejas que foi permitida de acordo com a técnica anterior. Após o estágio de secagem primária de líquido ser completado, a formulação vítrea amorfa estabilizada é mantida a elevadas temperaturas de secagem secundária (entre 20 °C e 70 °C) e pressões de vácuo de menos de 1000 mTORR para reduzir adicionalmente a atividade de água da formulação em um tempo muito curto.
Outra modalidade da invenção proporciona métodos para preparar composições de formulação de hidrogel para conservação de materiais bioativos. Por exemplo, uma formulação contendo um material bioativo e matriz e agentes de formação de vidro são misturado em uma solução e reticulado para formar partículas de hidrogel firme por atomização ou extrusão em um banho contendo íons de metal divalente ou adicionando íons de metal divalente diretamente na pasta e triturando a placa de hidrogel endurecido a pequenos fios ou peças. As partículas de hidrogel são então secas de acordo com os métodos de secagem da invenção como descrito acima.
Em uma modalidade particular da invenção, por exemplo, a formulação inclui bactérias vivas probióticas em uma solução de 1-4 % de alginato de sódio e 10-40 % de
22/34 trealose. Proteínas e particularmente proteínas hidrolisadas, tais como caseína, soro de leite, ervilha, soja ou semente de algodão são adicionadas à formulação a 5-10 % para aumentar o processo de secagem e a formação de uma estrutura de formulação vítrea amorfa estável (ver Figura. IA, imagens 4, 5 e 6). A cultura probiótica pode ser fresca, congelada ou já seca em uma forma de pó seco (ver Figura 2 para as contagens de UFC de diferentes formas de cultura de bactérias probióticas na formulação seca) A solução é misturada a uma temperatura ligeiramente acima da temperatura ambiente (tipicamente entre 25 °C -37 °C) até todos os componentes estarem completamente dissolvidos. A pasta de formulação é atomizada, extrudada ou gotejada em nitrogênio líquido para formar pequenas gotículas ou contas que são então removidas do nitrogênio líquido, empacotadas em bolsas e podem ser armazenadas em um congelador a -80 °C até a secagem.
Um método típico de secagem de bactérias vivas probiótica inclui; espalhar as contas congeladas sólidas em bandejas em uma camada uniforme a uma capacidade de carga entre 100-1000 g/sq ft e as bandejas são imediatamente colocadas em um liofilizador. A pressão de vácuo é então aplicada a aproximadamente 1000 mTORR e dependendo do tamanho do liofdizador e tipo de fonte de calor, a temperatura de prateleira ajustada até +20 °C ou a uma temperatura suficiente para manter as partículas a aproximadamente -20 °C. As contas congeladas sólidas são deixadas para que purguem por aproximadamente 5-30 minutos e vácuo ajustado a entre 2000 e 10.000 mTORR e transferência calor aumentada para elevar a temperatura de formulação a entre -5 °C e +5 °C. Estas condições de temperatura e pressão de vácuo são mantidas durante a etapa de secagem primária de líquido que pode durar de umas poucas horas e até 24 horas dependendo da carga da bandeja, preferivelmente desde aproximadamente 3 a 10 horas. Em algum ponto durante o processo de secagem primária, a taxa de evaporação de solvente desacelera e a temperatura de formulação começa a aumentar devido ao fornecimento supérfluo de calor na câmara de secagem. Este ponto indica o fim da etapa de secagem primária. Como o solvente é dirigido para fora da formulação, os agentes de formação de vidro na solução se tornam concentrados e mais espessos até parar de fluir como um líquido e formar uma estrutura vítrea amorfa e/ou estável.
Uma etapa de secagem secundária é então seguida a vácuo completo e
23/34 temperatura de formulação entre 30 °C e 50 °C. O propósito da etapa de secagem secundária é remover a umidade restante aprisionada ou ligada e proporcionar uma composição que é estável em armazenamento por um período de tempo estendido a temperaturas ambientais. A etapa de secagem secundária pode durar diversas horas e o seu ponto final é quando a formulação está completamente seca e a sua atividade de água inferior a 0,3 Aw.
Os métodos de secagem da invenção tem como resultado um material biologicamente ativo que é encerrado dentro de uma matriz vítrea amorfa, deste modo prevenindo o desdobramento de proteínas e significativamente desacelerando interações moleculares ou reatividade cruzada, devido à mobilidade enormemente reduzida do composto e outras moléculas dentro da composição vítrea amorfa. Contanto que o sólido amorfo esteja a uma temperatura abaixo da sua temperatura de transição de vidro e a umidade residual permaneça relativamente baixa (isto é, abaixo de Aw de 0,3), o material bioativo permanece relativamente estável (ver Figura 8). Deve ser notado que alcançar um estado vítreo não é um pré-requisito para estabilidade a longo prazo como alguns ingredientes bioativos podem sair melhor em um estado mais cristalino.
Preparação de Pó Seco
A formulação seca pode ser usada en bloc, cortada em formas e tamanhos desejados, ou esmagada e triturada em um pó de fluxo livre que proporciona fácil processamento a jusante como aglomeração úmida ou seca, granulação, formação de comprimidos, compactação, peletização ou misturada em produtos alimentícios ou de ração animal ou qualquer outro tipo de processo de administração. Processos para esmagar, triturar, moer ou pulverizar são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um moinho de martelo, um moinho de ar, um moinho de impacto, um moinho de jato, um moinho de pino, um moinho de Wiley, ou dispositivo de moagem similar pode ser usado. O tamanho de partícula preferido das partículas trituradas é menor que aproximadamente 1000 pm e preferivelmente menos de 500 pm.
As composições e métodos descritos no presente documento conservam a atividade biológica do material biologicamente ativo encerrado. Por exemplo, as composições são testadas para estabilidade submetendo as mesmas a temperatura
24/34 elevada (por exemplo, 40 °C) e alta umidade (por exemplo, 33 %RH) e medindo a atividade biológica das formulações. Como um exemplo para bactérias vivas probiótica, os resultados destes estudos demonstram que as bactérias formuladas nestas formulações são estáveis por pelo menos 20 dias (ver Figura 8). Estabilidade é definida como tempo por um log UFC/g de perda de potência. Tais formulações são estáveis mesmo quando altas concentrações do material biologicamente ativo são usadas. Assim, estas formulações são vantajosas em que podem ser remetidas e armazenadas a temperaturas a ou acima da temperatura ambiente por longos períodos de tempo.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustrar, mas não limitar a invenção reivindicada.
EXEMPLO 1
Preparação de substância probiótica seca e estável
Formulação básica g de trealose (Cargill Minneapolis, MN) e 22 g de caseína extensivamente hidrolisada (M arc or, Carlstadt, NJ) foram uni forme mente misturadas com 3 g de alginato de sódio (ISP Corp., Wayne, NJ) na forma seca. Concentrado fresco de Lactobacillus acidophilus (100 ml contendo pelo menos 10 % de sólidos, direto de colheita de fermentação) foi adicionado em um misturador e mantido a 35 °C. A mistura seca da goma, açúcar e proteína hidrolisada foi lentamente adicionada à cultura probiótica e a mistura foi levada a cabo a 35 °C por 10 minutos. A pasta viscosa foi então transferida a um recipiente que tem um fundo perfurado e deixada gotear em um banho contendo nitrogênio. As contas foram então removidas do nitrogênio líquido e imediatamente transferidas para secagem.
Secagem das contas congeladas da formulação básica
As contas congeladas foram uniformemente espalhadas em uma bandeja a uma capacidade de carga de 100 g/sq ft e imediatamente colocadas em uma prateleira em um liofilizador (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A pressão de vácuo foi então aplicada a 1000 mTORR e as contas congeladas sólidas foram deixadas para que
25/34 purguem por 10 minutos. Vácuo foi então ajustado a 2700 mTORR e temperatura de prateleira elevada a +30 °C. Estas temperatura e pressão de vácuo foram mantidas por 3 horas. Uma etapa de secagem secundária foi então seguida a vácuo completo (150-200 mTORR) e temperatura de prateleira elevada a 30 °C por 2 horas adicionais. A formulação foi completamente seca e a sua atividade de água medida por um instrumento Hygropalm Awl (Rotonic Instrument Corp., Huntington, NY.) a Aw = 0,23.
EXEMPLO 2
Composição seca estável contendo bactérias probióticas Lactobacillus rhamnosus LGG.
Lactobacillus rhamnosus LGG (500 g de concentrado congelado desde uma fonte comercial) foi descongelado a 37 °C em um misturador planetário duplo encamisado (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,). Dois agentes de formação de vidro; trealose (387 g, Cargill Minneapolis, MN) e caseína extensivamente hidrolisada (83 g, Marcor, Carlstadt, NJ) foram homogeneamente misturados na forma seca com dois agentes de formação de matriz; alginato de sódio (15 g, ISP Corp., Wayne, NJ) e Inulina instantânea (25 g, Cargill Minneapolis, MN). A mistura seca foi lentamente adicionada às bactérias probióticas descongeladas e a mistura foi levada a cabo a 40 RPM e 37 °C por 10 minutos. A viscosidade da pasta foi ajustada a 12.000 Cp pela adição de 50-200 ml de água. A pasta foi então transferida a um recipiente que tem um fundo perfurado e deixada gotear em um recipiente contendo nitrogênio líquido. As contas foram então removidas do nitrogênio líquido, colocadas em bolsa laminada de alumínio vedada e armazenadas em um congelador a -80 °C por diversas semanas.
Para a secagem, as contas congeladas foram uniformemente espalhadas em bandejas a uma capacidade de carga que varia desde 100 até 500 g/sq ft e as bandejas colocadas em prateleiras em um liofílizador (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY). A pressão de vácuo foi aplicada a 1000 mTorr e a temperatura de prateleira ajustada a 120 °C. As contas congeladas sólidas foram deixadas para que purguem por um período de tempo que varia desde 1 a 30 minutos. A etapa de purga foi seguida por uma etapa de secagem primária após ajuste da pressão de vácuo a 2700 mTORR e temperatura de prateleira elevada a +30 °C. Estas temperatura e pressão de vácuo foram mantidas por
26/34 horas. Uma etapa de secagem secundária foi então seguida a vácuo completo (150200 mTORR) e temperatura de prateleira mantida a 30 °C por 4 horas adicionais. A formulação foi completamente seca e a sua atividade de água medida a 0,23 Aw. A Figura 6 mostra o perfil de secagem da formulação probiótica.
As perdas de viabilidade após congelar a pasta a temperaturas diferentes (+4 °C, - 80 °C e -180 °C) e após o processo de secagem incluindo preparação de contas congeladas, e secagem em um liofilizador são apresentadas na Figura 3, 4 e 7. As perdas de viabilidade por todo o processo foram geralmente inferior a <1 log dependendo do tipo de cultura bacteriana (culturas congeladas ou secas) e da temperatura de congelamento da pasta viscosa. Os resultados mostram que congelar rapidamente as bactérias probióticas em nitrogênio líquido (-180 °C) foi um processo que menos prejudicial que o congelamento a -80 °C.
As Figuras 5 & 8 mostram o efeito de várias períodos de tempo de purga que varia desde 0 min (sem purga) até 30 min nas contagens iniciais de bactérias probióticas na composição seca e na estabilidade de armazenamento sob condições de armazenamento aceleradas de 40 °C e 33 %RH. Os resultados sugerem que um tempo de purga mais longo geralmente melhora a contagem bacteriana inicial na formulação seca, mas não tem efeito sobre estabilidade de armazenamento da formulação probiótica.
EXEMPLO 3
Trealose (752 g, Cargill Minneapolis, MN), proteína de ervilha hidrolisada extensivamente (167 g, Marcor, Carlstadt, NJ), alginato de sódio (30 g, ISP Corp., Wayne, NJ) e Inulina instantânea 50 g, Cargill Minneapolis, MN) foram homogeneamente misturados na forma seca. A mistura seca foi lentamente adicionada a 1000 ml de água deionizada quente a 80 °C em um misturador planetário duplo encamisado (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,) e a mistura foi levada a cabo a 40 RPM por 10 minutos. A mistura temperatura foi reduzida até 37 °C e 100 g de pó seco de Lactobacillus rhamnosus LGG obtido de uma fonte comercial foi lentamente adicionado e a mistura continuou por 20 minutos. A pasta foi então extrudada através de uma agulha com orifício de 2 mm em um banho contendo nitrogênio líquido. Os
27/34 /fios/contas foram então removidos do nitrogênio líquido colocados em bolsa laminada de alumínio vedada e armazenados em um congelador a -80 °C por diversas semanas. Para a secagem, os fios/contas congelados foram uniformemente espalhados em bandejas a uma capacidade de carga que varia desde 100 até 500 g/sq ft e as bandejas foram colocadas em prateleiras em um liofilizador (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) e secas como descrito no Exemplo 2. Todas as formulações foram satisfatoriamente retidas dentro da bandeja e não foi observado salpicos ou espumagem em todos níveis de carregamento. A formulação foi completamente seca inclusive na maior capacidade de carga e atividade de água medido a 0,26 Aw e menor para todas as amostras.
EXEMPLO 4
Preparação de uma formulação de hidrogel contendo bactérias probióticas Bifidobacterium lactis (Bbl2):
Pasta probiótica concentrada de Bifidobacterium lactis (Bbl2) é preparada de acordo com o Exemplo 1. A formulação básica, 0,5 g de fosfato de cálcio dibásico é adicionado, seguido por 0,5 g de gluconolactona. A pasta foi deixada para endurecer a temperatura ambiente ao longo das seguintes 2 horas para formar um hidrogel sólido. O gel firme foi fatiado a fios longos e finos, usando um fatiador/retalhadora comercialmente disponível. Os fios finos são congelados rapidamente em nitrogênio líquido e carregados em uma bandeja a uma capacidade de carga de 700g/sq ft e colocadas em um liofilizador para a secagem como descrito no Exemplo 2. A atividade de água (Aw) da formulação foi 0,05 (Medido por HygroPalm Awl, Rotonic Huntington, NY). A formulação seca foi moída adicionalmente a pó fino usando equipamento de moagem de martelo padrão e peneirada através de telas de 50-250 micron.
EXEMPLO 5
Composição livre de alérgenos contendo bactérias probióticas Lactobacillus acidophilus.
Trealose (752 g, Cargill Minneapolis, MN), proteína de ervilha extensivamente
28/34 hidrolisada (167g, Marcor, Carlstadt, NJ), alginato de sódio (30 g, ISP Corp., Wayne, NJ) e Inulina instantânea 50 g, Cargill Minneapolis, MN) foram homogeneamente misturados na forma seca. A mistura seca foi esterilizada adicionando lentamente a 1000 ml água desionizada quente a 80 °C em um misturador planetário duplo encamisado (DPM, Iqt, Ross Engineering, Inc. Savannah, GA,) e a mistura foi levada a cabo a 40 RPM por 10 minutos até uma pasta suave e clara ser formada. A mistura temperatura foi reduzida até 37 °C e 1000 g de contas congeladas contendo Lactobacillus acidophilus obtidas de uma fonte comercial foram lentamente adicionados e a mistura continuou por 10 minutos. A pasta foi então extrudada através de uma agulha com orifício de 2 mm em um banho contendo nitrogênio líquido. Os /fios/contas foram então removidos do nitrogênio líquido colocados em bolsa laminada de alumínio vedada e armazenados em um congelador a -80 °C por diversas semanas. Para a secagem, os fios/contas congeladas foram uniformemente espalhadas em bandejas a uma capacidade de carga de 1000 g/sq ft e as bandejas colocadas em prateleiras em um liofilizador (Model 25 SRC, Virtis, Gardiner, NY) e secas como descrito no Exemplo 2. As contagens de UFC iniciais das bactérias probióticas na composição seca foi 10,53 logs/g, e perda de viabilidade após 42 dias armazenamento sob condições de armazenamento aceleradas de 40 °C e 33 %RH foi 0,69 log UFC/g.
EXEMPLO 6
Uma fórmula infantil contendo a formulação seca da presente invenção:
Uma formulação seca estável contendo Lactobacillus GG (Valio Corp, Finland) foi preparada de acordo com o Exemplo 2 seguido por peneiramento em dois grupos de tamanho de partícula (acima de 50 pm e abaixo de 150 pm). Uma fórmula infantil foi preparada misturando 99,9 g de Nutramigen (Mead Johnson; Evansville, IL) com 0,1 g das partículas de formulação seca no intervalo de tamanho entre 50 pm e 150 pm). O produto final contém aproximadamente 108 ufc de Lactobacillus GG por 100 g fórmula infantil.
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EXEMPLO 7
Um suplemento probiótico contendo a formulação seca estável da presente invenção:
Uma composição seca estável contendo Lactobacillus acidophilus é formulada em formas farmacêuticas orais, tais como comprimidos, comprimidos oblongos, ou cápsulas. Comprimidos sabor laranja contendo 99,9 g de um agente de compressão (dextrose) e 0,1 g de partículas de formulação seca no intervalo de tamanho entre 50 pm e 150 pm são preparados por compressão direta em uma máquina giratória usando uma ferramenta côncava redonda de 1/2” padrão. O produto final contém aproximadamente 108 ufc/dose unitária. A dureza dos comprimidos está no intervalo de 8-10 kp e os tempos de desintegração são de aproximadamente 20 segundos. Os comprimidos comprimidos são empacotados em garrafas de HDPE de 180 cc de 100 comprimidos cada e expostos a temperatura/umidade controlada de 40 °C/33 %RH. O produto é submetido a teste de estabilidade microbiológica mensalmente ao longo de um período de 12 meses ou até uma redução na contagem de ensaio abaixo de 1 x 106/ dose unitária ser observada.
EXEMPLO 8
Uma bebida funcional contendo a formulação seca estável da presente invenção:
Uma mistura seca contendo (% em peso) 71 % sacarose, 14 % de maltodextrina, 10 % de inulina, 2 % dextrose, 1 % ácido cítrico anidro, 0,3 % de goma acácia, 0,3 % de aromas, 0,3 % fosfato de tricálcio e 0,1 % de partículas de formulação probiótica seca (Z. acidophilus) no intervalo de tamanho entre 50 pm e 250 pm é preparada. O produto final contém aproximadamente 109 ufc/dose unitária (30 g de mistura seca). O produto é empacotado em pequenas bolsas laminadas de alumínio (30 g de dose unitária/bolsa) para beber agitando em 340 mil de água. A estabilidade das bactérias probióticas na mistura seca de bebida é submetida a teste de estabilidade microbiológica mensalmente ao longo de um período de 12 meses ou até uma redução na contagem de ensaio abaixo de 1 x 107/ dose unitária ser observada.
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EXEMPLO 9
Preparação de ração animal probiótica:
Uma ração animal comercialmente disponível peletizada para cachorros é seca em um forno de convecção a uma atividade de água de 0,1, e então revestida com a formulação probiótica seca estável preparada como descrito no Exemplo 3. Os pellets secos são pulverizados com aproximadamente 5 % de barreira de umidade à base de gordura (uma mistura de 40 % de gordura de galinha, 40 % de manteiga de cacau e 20 % de cera de abelha), misturados em um misturador basculante com a formulação em pó seco (usualmente 0,1-0,5 % de ração animal total que proporciona uma dosagem de 108 UFC/g), e finalmente pulverizada com revestimento adicional da barreira de umidade à base de gordura. A quantidade total de revestimento é aproximadamente 15 % (da ração animal). O tempo de revestimento é aproximadamente 30 min.
EXEMPLO 10
Preparação de alimento para peixes com diversos microorganismos probióticos:
Alimento para peixes peletizado de acordo com a presente invenção é preparado com uma mistura de diversos probióticos. Uma formulação probiótica estável seca contendo uma mistura de L. rhamnosus, L. acidophilus e Bifidobacterium lactis é preparada como descrito no Exemplo 1. Um alimento de partida para salmão comercialmente disponível (Zeigler Bros., Gardners, PA) é primeiro seco em um forno de convecção a uma atividade de água de 0,1, e então revestido com a formulação de probióticos em um misturador basculante. Os pellets (1000 g) são primeiro pulverizados com aproximadamente 5 % em peso de barreira de umidade à base de gordura (uma mistura de 40 % de óleo de peixe, 40 % de manteiga de cacau e 20 % de cera de abelha), então misturados com 1 g da formulação estável seca probiótica (para conseguir uma dosagem de 107 ufc/g de ração), e finalmente pulverizados com revestimento adicional da barreira de umidade à base de gordura. A quantidade total de revestimento é aproximadamente 10 % (do alimento para peixes).
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EXEMPLO 11
Pó seco estável contendo uma enzima:
Uma fórmula hidrogel contendo 40 por cento em peso de Savinase (Novozymes, Denmark) é preparada misturando 600 g da formulação descrita no Exemplo 4 e 400 g de savinase em 1000 g de solução em água. A formulação retalhada de hidrogel é congelada rapidamente em nitrogênio líquido e seca em um forno a vácuo a uma temperatura de secagem de formulação de 50 °C. Para a determinação de carga e estabilidade de armazenamento da fórmula seca: uma amostra seca é pesada precisamente (<100 mg) em um tubo de microcentrífuga. 200 μΐ de sulfóxido de dimetila (DMSO) são adicionados. A formulação é dissolvida no tampão DMSO por vórtex. A esta amostra, 0,8 ml de uma solução contendo 0,05 N NaOFI, 0,5 % de SDS e 0,075 M de ácido cítrico (sal trisódio) é adicionado. Os tubos são sonicados por 10 min a 45 °C, seguidos por uma centrifugação breve a 5.000 rpm por 10 min. Alíquotas da solução clara DMSO/NaOH/SDS/Citrato são tomadas em poços de uma microplaca e analisadas para conteúdo de proteína usando o método de ensaio de Bradford. A estabilidade de armazenamento da formulação de enzima estável é significativamente superior a uma enzima seca sem a formulação da presente invenção.
EXEMPLO 12
Pó seco Estável Contendo Vitamina A:
Uma formulação contendo 30 por cento em peso de Vitamina A é preparada misturando 320 g de Inulina instantânea, 320 g de maltodextrina DE-1 (Tate&Lile, Londres, UK), 50 g de carboximetilcelulose de sódio (Ashland Aquaion Functional Ingredients, Wilmington, DE), 10 g de ascorbato de sódio e 300 g de Vitamina A cristalino (BASF Corp., Florham Park, N.J) em 1000 g de água. A formulação úmida é seca por pulverização em um Mobile-Minor secador de pulverização (GEA Process Engineering Inc., Columbia MD) a temperatura de entrada e saída de 180 °C e 80 °C, respectivamente ou congelada rapidamente em nitrogênio líquido, então espalhada em bandejas a uma capacidade de carga de 1000 g/sq ft e seca como descrito no Exemplo 2. A composição de vitamina-A é estável (>80 %) a 40 °C e 75 % RH por 3 meses.
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EXEMPLO 13
Preparação de carotenos em uma formulação protegida que tem biodisponibilidade melhorada:
Uma formulação que protege e melhora a biodisponibilidade de carotenos que seria de outro modo submetida a oxidação por outros ingredientes em uma ração durante o armazenamento ou após a alimentação de um organismo ser preparada de acordo com a formulação e o método da presente invenção. Uma formulação contendo 6 g de quitosana solúvel em água (LSK BioPartners, Inc. Salt Lake City, Utah) é dissolvida em 200 g água. A esta solução é adicionado 90 g de astaxantina natural (Naturose™, Cyanotech Corp., Kailua-Kona, HI) e a pasta é atomizada ou extrudada em um banho contendo 5 % de tripoli fosfato de sódio. As mi cropartí cuias em hidrogel ou fios são deixadas para endurecer a temperatura ambiente ao longo de 4 horas. As partículas são removidas do banho de reticulação, lavadas com água e misturadas com uma mistura seca de 90 g de sacarose e 10 g de caseína extensivamente hidrolisada. As partículas carregadas de açúcar/proteína são congeladas rapidamente e imediatamente colocadas em bandejas a 500 g/sq ft e liofilizadas em um liofilizador até atividade de água reduzida até menos de 0,3. A formulação seca é triturada adicionalmente à distribuição de tamanho desejada e empacotada.
EXEMPLO 14
Preparação de Iscas de Espécies Invasivas
A isca peletizada para espécies invasivas especificamente alvo é preparada de acordo com a presente invenção. 200 g de uma formulação contendo um pesticida como descrito no Exemplo 1 são preparados e adicionados a 200 gm de água. A esta solução é adicionado 90 gm de Rotenona e 0,5 gm de fosfato de cálcio dibásico, seguido por 0,5 gm de gluconolactona. A pasta é deixada para endurecer a temperatura ambiente ao longo de 2 horas. O gel firme é fatiado a fios longos e finos através de um fatiador/retalhadora. Os fios finos são carregados em uma bandeja e colocados em um liofilizador. Temperatura de prateleira é ajustada a -30 °C e a formulação deixada congelar antes de vácuo completo ser aplicado e temperatura de prateleira se elevou a +60 °C por secagem durante a noite. A formulação seca é moída à distribuição de
33/34 tamanho apropriado para a especificação de tamanho de isca para as espécies alvo específicas.
EXEMPLO 15
Preparação de um pesticida protegido em uma formulação insolúvel em água:
Uma formulação granular protegida de um pesticida que seria de outro modo submetida a decomposição por outros ingredientes em uma formulação durante o armazenamento ou após a aplicação no ambiente ser preparada com a formulação e o método da presente invenção. Uma formulação contendo 6 g de pectina e 102 g sacarose é adicionada a 200 g de água. A esta solução é adicionado 90 g de uma formulação seca de um pesticida sensível e uma mistura contendo 1,5 g de fosfato de cálcio dibásico e 0,5 g de cloreto de cálcio, seguido por 0,85 g de gluconolactona. A pasta é deixada para endurecer a temperatura ambiente ao longo de 4 horas, e então fatiada a fios longos e finos através de um fatíador/retalhadora. Os fios finos são carregados em bandejas e secos em um liofilizador para alcançar uma atividade de água de 0,1. A formulação seca é triturada ainda à distribuição de tamanho desejado e empacotada.
EXEMPLO 16
Preparação de uma formulação probiótica vegetal protegida:
Um agente de controle biológico tal como Rhizohacteria é preparado em composição seca de acordo com o Exemplo 4. A eficácia da composição seca de Rhizohacteria é avaliada no crescimento de alface sob condições gnotobióticas. Doses de 100 mg de composição seca de Rhizohacteria por planta são inoculadas em jarras com areia e plantadas com mudas de alface pré-germinadas (24 h). Uma dose nutriente de 5 ml de solução de Hoagland esterilizada é aplicada às plantas na jarra. As jarras são dispostas randomicamente em câmara de crescimento mantida a 28 °C com 12 h de fotoperíodo. Durante cada 7 dias de intervalo após inoculação, plantas e areia de aderência são cuidadosamente removidas das jarras. As raízes são lavadas em tampão fosfato estéril (pH 7,0), e a medição de comprimento de raiz é registrada.
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REFERÊNCIAS
As seguintes referências e todas as referências citadas no presente documento são pelo presente documento incorporadas por referência no presente documento para todos os propósitos.
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Claims (15)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para preparar uma composição em pó seca sem ebulição ou formação de espuma, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende:
    a) combinar um material bioativo, um agente de formação de matriz e dois agentes de formação de vidro em um solvente aquoso para formar uma pasta viscosa;
    b) congelar rapidamente a pasta em nitrogênio líquido para formar partículas congeladas sólidas, sob a forma de contas, gotículas ou fios;
    c) secagem primária das partículas congeladas por evaporação sob uma pressão superior a 267 Pa (2000 mTorr) e sob uma temperatura entre -5°C e +5°C, assim mantendo a temperatura das partículas acima do ponto de congelação das partículas congeladas, pelo que é formada uma formulação seca; e
    d) secagem secundária da formulação seca a vácuo e a uma temperatura entre 20°C e 70°C durante um tempo suficiente para reduzir a atividade de água da formulação seca a 0,3 Aw ou inferior, pelo que a composição vítrea seca é preparada.
  2. 2. Método de preparação de composição de acordo com a reivindicação 1, o dito método caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a purga das partículas congeladas antes da secagem primária das partículas congeladas.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pressão total sobre as partículas congeladas na etapa de secagem primária é entre 267 Pa e 533 Pa (2.000 mTORR e 4.000 mTORR).
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pressão total sobre as partículas congeladas na etapa de secagem primária é entre 267 Pa e 1333 Pa (2.000 mTORR e 10.000 mTORR).
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda cortar, triturar, moer ou pulverizar a composição num pó de fluxo livre.
    Petição 870190088715, de 09/09/2019, pág. 4/7
    2/3
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o tamanho de partícula do pó é inferior a 1000 μm.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a administração da composição a um animal ou planta como um líquido reconstituído ou como um pó triturado num alimento ou produto alimentar.
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda (a) misturar a composição com um componente selecionado do grupo que consiste em fórmula infantil, bebidas funcionais e alimentos para animais de estimação; e (b) administrar a mistura da etapa (a) a um lactente humano, um adulto humano, um animal ou uma planta.
  9. 9. Composição seca, vítrea preparada pelo método da reivindicação 1 sem ebulição ou formação de espuma, caracterizada pelo fato de que compreende um material bioativo, pelo menos um agente formador de matriz e pelo menos dois agentes formadores de vidro.
  10. 10. Composição da reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que que a composição compreende sólidos totais na faixa de 30 por cento em peso a 70 por cento em peso.
  11. 11. Composição da reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que que o material bioativo compreende uma célula, um micróbio, um vírus, uma cultura celular, uma bactéria, uma bactéria probiótica, uma bactéria probiótica de solo e planta, uma levedura, uma proteína, uma proteína recombinante, uma enzima, um peptídeo, uma hormona, uma vacina, um fármaco, um antibiótico, uma vitamina, um carotenóide, um mineral, um microbicida, um fungicida, um herbicida, um inseticida ou um espermicida.
    Petição 870190088715, de 09/09/2019, pág. 5/7
    3/3
  12. 12. Composição da reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que que o agente formador de matriz é selecionado do grupo que consiste em: acetoftalato de celulose (CAP), carboximetilcelulose, pectina, alginato de sódio, sais de ácido algínico, hidroxil propil metil celulose (HPMC ), metilcelulose, carragenina, goma de guár, goma arábica, goma xantana, goma de alfarroba, quitosana e derivados de quitosana, amidos e amidos modificados, ciclodextrinas, inulina, maltodextrinas, dextranos e suas combinações.
  13. 13. Composição da reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que que o agente formador de matriz está presente na composição em uma quantidade variando de 1% em peso a 20% em peso.
  14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que cada um dos agentes formadores de vidro é selecionado do grupo constituído por proteínas, carboidratos, aminoácidos, metilamina, poliol, propilenoglicol, polietilenoglicol, tensoativos, fosfolipídios e suas combinações.
  15. 15. Composição da reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que que os agentes formadores de vidro estão presentes na composição em uma quantidade que varia de 1% em peso a 80% em peso.
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