CN103333840B - 一种益生菌超低温冷冻工艺及其在益生菌制剂中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种益生菌超低温冷冻工艺、适合这种工艺的全盐冷冻保护剂配方及其制备的益生菌超低温冷冻颗粒。所述益生菌超低温冷冻工艺包括以下步骤：（1）配制发酵培养基；（2）培养益生菌；（3）离心处理；（4）配制保护剂；（5）添加保护剂；（6）速冻成型。本发明还提供了利用所述益生菌超低温冷冻颗粒制备的益生菌制剂及其制备方法。本发明所述益生菌超低温冷冻颗粒为益生菌冷冻菌株，其不需要干燥除水，具有冷冻速度快、活菌率高、复水性能好等优点。本发明所述益生菌超低温冷冻颗粒本身含水，能更快速的溶解于溶液中，并且可以避免常规低温冷冻干燥菌粉复水时对益生菌细胞的损伤，可以大大提高益生菌制剂的活菌含量水平。

Description

一种益生菌超低温冷冻工艺及其在益生菌制剂中的应用

技术领域

本发明属于益生菌制剂生产工艺领域，涉及一种便于益生菌二次加工的冷冻储存技术及其在益生菌制剂生产过程中的具体应用。

背景技术

益生菌制剂的制备过程中，尤其是当产品以颗粒或者片剂的形式出现时，往往涉及到对益生菌菌种的再加工。现有的益生菌菌种一般以冻干粉的形式存在，当对益生菌冻干粉再次加工的时候，不可避免的涉及到对冻干粉重新进行复水、湿润以及与其他物料搅拌、混合等工艺操作，当进行这些操作时，会对益生菌菌株的活性造成损害，不同程度的减少益生菌的活菌数。

因此，研发一种活菌率高、复水性能好的益生菌菌株，并进一步制备成具有特定功效的益生菌制剂，具有很大的市场前景和经济价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的益生菌超低温冷冻工艺及适合这种工艺的全盐冷冻保护剂配方，所述工艺为一种益生菌超低温冷冻颗粒（益生菌冷冻菌株）的制备方法。

本发明的另一目的是提供所述超低温冷冻工艺制备的益生菌超低温冷冻颗粒。所述益生菌超低温冷冻颗粒为益生菌冷冻菌株，其不需要干燥除水，具有冷冻速度快、活菌率高、复水性能好等优点。

本发明的再一目的是提供利用所述益生菌超低温冷冻颗粒制备的益生菌制剂及其制备方法。

本发明提供了一种益生菌超低温冷冻颗粒的制备方法，所述方法包括以下步骤：

（1）配制发酵培养基：以重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖1-2%、葡萄糖1-2%、蛋白胨0.5-2%、酵母膏1-5%、柠檬酸氢二铵0.2-1%、K₂HPO₄0.01-0.5%、无水乙酸钠0.1-0.5%、硫酸镁0.02-0.1%，余量为蒸馏水，调节pH为6.0-7.0，配好后灭菌，备用；

（2）培养益生菌：将益生菌菌株按照5-10%的接种量接入步骤（1）所得的培养基中，在温度30-40℃、转速40-100rpm下培养10-20小时，然后在10-20℃放置2-6小时，得到益生菌发酵液，备用；

（3）离心处理：将步骤（2）所得益生菌发酵液在4-10℃，流量为150ml-3000ml/min条件下，进行管道式离心，得到益生菌菌泥，备用；

（4）配制保护剂：以重量百分比计，保护剂中各组分的配比为磷酸氢二钾1-2%、磷酸二氢钾1-2%、半胱氨酸盐酸盐1-3%、甘油1-2%、乳清粉1-5%、余量为蒸馏水，配好后灭菌，备用；

（5）添加保护剂：将步骤（3）所得益生菌菌泥与步骤（4）所得保护剂按重量比1:1-3混合，搅拌均匀形成乳化液；

（6）速冻成型：将步骤（5）所得乳化液，按照500g/min的速度喷雾入-195℃液氮中速冻3min，形成均匀的低温小颗粒，得到益生菌超低温冷冻颗粒。

本发明所述益生菌超低温冷冻工艺还包括步骤（7）打捞保存：将步骤（6）形成的益生菌超低温冷冻颗粒装入无菌铝箔袋中，-20℃以下低温保存待用。

优选地，步骤（1）中发酵培养基各组分配比为乳糖1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母膏1%、柠檬酸氢二铵0.5%、K₂HPO₄0.1%、无水乙酸钠0.5%、硫酸镁0.05%，余量为蒸馏水，调节pH为6.5。

步骤（1）在灭菌条件为121℃湿热灭菌20min。

步骤（2）中，所述益生菌菌株为国家卫生部公布的可用于食品和保健品的益生菌菌株，包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌中的一种或多种，但不限于以上所述菌株。

优选地，步骤（2）为将益生菌菌株按照5%的接种量接入步骤（1）所得的培养基中，在温度37-40℃、转速50rpm下培养15-20小时，然后在10-15℃放置3小时，得到益生菌发酵液，备用。

优选地，步骤（3）为将步骤（2）所得益生菌发酵液在8-10℃，流量为1000ml/min条件下，进行管道式离心，离心转速为14000-16000rpm，得到益生菌菌泥，备用。

步骤（3）中，若需要益生菌菌株复配，可先将各菌株形成的菌泥按比例混合，然后按照步骤（4）-（6）方法制备复配的益生菌超低温冷冻颗粒。

步骤（3）中所述益生菌菌泥的得率为8-50g/L。

优选地，步骤（4）中保护剂中各组分的配比为磷酸氢二钾1.5%、磷酸二氢钾1.5%、半胱氨酸盐酸盐2%、甘油2%、乳清粉5%、余量为蒸馏水。

步骤（4）中，灭菌条件为115℃下灭菌20min。

优选地，步骤（5）中，将步骤（3）所得益生菌菌泥与步骤（4）所得保护剂按重量比1:3混合，搅拌均匀形成乳化液。

本发明还提供了所述超低温冷冻工艺制备的益生菌超低温冷冻颗粒。

本发明还提供了所述益生菌超低温冷冻颗粒在制备益生菌制剂中的应用。

本发明还提供了一种利用所述益生菌超低温冷冻颗粒制备的益生菌制剂。所述益生菌制剂为由高活菌数的益生菌菌株（即本发明所述益生菌超低温冷冻颗粒）单独或者与营养功能物质及其他辅料复配制备的益生菌制剂。

所述营养功能物质包括益生元、益生菌菌粉、膳食纤维、维生素、DHA、国家允许使用的营养强化剂等。

优选地，所述益生元为低聚果糖、低聚半乳糖、母乳低聚糖中的一种或者多种。

优选地，所述膳食纤维为菊粉、β-聚葡萄糖、果胶、抗性淀粉、半纤维素、纤维素中的一种或多种。

优选地，所述维生素为维生素A、D、E、K、B₁、B₂、B₁₂、C中的一种或多种。

优选地，所述益生菌制剂的剂型为颗粒型或者片剂型。

本发明还提供了一种利用所述益生菌超低温冷冻颗粒制备益生菌制剂的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）配制复配原料，其包括干物料和所述益生菌超低温冷冻颗粒，将所述干物料的各原料干燥、粉碎、过80目筛形成均匀的细粉；

（2）将干物料各原料的细粉混合均匀；

（3）将益生菌超低温冷冻颗粒从-20℃存储条件下取出，室温溶融重新形成菌悬液，菌悬液的质量不超过复配原料总质量的15%；

（4）将菌悬液与步骤（2）混匀的干物料混合均匀，制成湿软材；

（5）将湿软材制成湿颗粒；

（6）将湿颗粒在低于30℃真空条件下干燥至含水量低于5%，制成颗粒型产品或加工成片剂型产品。

步骤（1）中，所述干物料包含营养功能物质，如益生元、益生菌菌粉、膳食纤维、维生素、DHA中的一种或多种；还包含制粒或者制片过程中按照功能设计所需的辅料，如赋形剂、支撑剂、助流剂、崩解剂、调味剂或吸潮剂等。

所述干物料包括制粒或者制片所需的支撑剂或赋形剂如淀粉、乳糖、白砂糖等；还包括赋予颗粒或者片剂口味的甜味剂或者调味剂如：白糖、甜菊糖、木糖醇、赤藓糖醇、异麦芽糖醇、食用香精、甜橙粉和其他水果粉等；还包括使颗粒或片剂具备更好溶解性（崩解性）的崩解剂如羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、泡腾崩解剂等；还可包括帮助更好形成完善颗粒或者片剂形态的一些吸潮剂、助流剂或者其他功能的辅料如：硬脂酸镁、滑石粉、预胶化淀粉等；同时还包括赋予片剂或者颗粒剂特定功能的营养功能性物质，包括但不限于益生元、益生菌粉、膳食纤维、维生素、DHA、国家允许使用的营养强化剂中的一种或多种。

优选地，所述益生元为低聚果糖、低聚半乳糖、母乳低聚糖中的一种或者多种。

优选地，所述膳食纤维为菊粉、β-聚葡萄糖、果胶、抗性淀粉、半纤维素、纤维素中的一种或多种。

优选地，所述维生素为维生素A、D、E、K、B₁、B₂、B₁₂、C中的一种或多种。

步骤（3）中，因为益生菌超低温冷冻颗粒本身含水，室温溶融可形成菌悬液，将益生菌超低温冷冻颗粒溶融时，可以根据需要加入适量10%奶粉溶液或者生理盐水，室温溶解重新形成菌悬液。

步骤（5）中，将湿软材通过一次性制粒机或者旋转挤压制粒机制成湿颗粒。

本发明具有如下有益效果：

（1）保护剂是在低温冷冻过程中保护菌株不受伤害的必须措施。本发明所用保护剂为全盐配方，除了能够有效保护菌株冷冻过程中的活性以外，相较于一些有机含量较多的保护剂，对溶液的凝固点降低较小，可以让冷冻颗粒在相对较高的温度存储。本发明的益生菌超低温冷冻颗粒储存温度低于零下20℃即可以，而有机物含量较高的冻干或冷冻保护剂所生产的冷冻颗粒，储存条件必须低于零下40℃。

（2）本发明所述益生菌超低温冷冻工艺生产的益生菌超低温冷冻颗粒，省去了常规益生菌冻干粉生产所需要的干燥步骤，节省了生产成本，且由于瞬时冷冻，益生菌菌株的活力得到了更有效的保存。相对于各菌株的常规冷冻干燥工艺，采用瞬时超低温冷冻技术，活菌率可以提高2%-50%。

（3）所述益生菌超低温冷冻颗粒为益生菌冷冻菌株，其不需要干燥除水，具有冷冻速度快、活菌率高、复水性能好等优点。

（4）本发明所述益生菌制剂制备方法涉及益生菌超低温冷冻颗粒形成与益生菌超低温冷冻颗粒再加工两个步骤，本发明的优势在于第一步的益生菌超低温冷冻颗粒的产品形态和性质相对于常规冷冻干燥菌粉对再加工工艺的性能要求更接近，因此更易于在加工过程中保存益生菌的活力。

（5）本发明制得的益生菌制剂中的活菌率大于88%。相对于常规低温冷冻干燥菌粉，用益生菌超低温冷冻颗粒与其他原料复配制备益生菌颗粒剂和片剂的好处在于，益生菌超低温冷冻颗粒本身含水，能更快速的溶解于溶液中，并且可以避免常规低温冷冻干燥菌粉复水时对益生菌细胞的损伤，可以大大提高益生菌制剂的活菌含量水平。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌购自江阴新申奥生物科技有限公司；嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；长双岐杆菌购自上海润盈生物技术有限公司。

菊粉购自上海吉天食品有限公司、藻油粉（DHA）购自美国马泰克公司、甜橙粉购自天津真如果食品工业有限公司、滑石粉和硬脂酸镁购自郑州众信化工产品有限公司、β-聚葡萄糖购自上海博程膳食纤维发展有限公司、赤藓糖醇和甜菊糖购自上海甘源实业有限公司。

实施例1制备益生菌超低温冷冻颗粒

本实施例所述益生菌超低温冷冻颗粒的制备方法如下：

（1）配制发酵培养基：配置5L培养基，按重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖1%、葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母膏1%、柠檬酸氢二铵0.5%、K₂HPO₄0.1%、无水乙酸钠0.5%、硫酸镁0.02%，余量为蒸馏水，调节pH为6.5，配制好后，121℃灭菌20min，备用；

（2）培养益生菌：将保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、乳双歧杆菌分别按照5%的接种量接入上述培养基中，在温度37℃、转速50rpm条件下培养16小时，然后在15℃放置3小时，得益生菌发酵液，备用；

（3）离心处理：将步骤（2）所得益生菌发酵液在10℃，流量为2000ml/min条件下，进行管道式离心，离心转速为14000rpm，得益生菌菌泥，嗜热链球菌得菌泥12g/L，乳双歧杆菌得菌泥11g/L，保加利亚乳杆菌得菌泥8g/L；

（4）将嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌菌泥按重量比5:1复配形成发酵剂复合菌泥；乳双歧杆菌菌泥单独处理；

（5）配制保护剂：按重量百分比计，保护剂中各组分的配比为磷酸氢二钾1.5%、磷酸二氢钾1.5%、半胱氨酸盐酸盐2%、甘油2%、乳清粉5%、余量为蒸馏水,配制量24L，115℃下灭菌20min；

（6）添加保护剂：将步骤（4）所配的发酵剂复合菌泥、乳双歧杆菌菌泥分别与步骤（5）所配保护剂按照重量比1:3混合，搅拌均匀形成乳化液；

（7）速冻成型：将步骤（6）所得乳化液，以500g/min的速度喷雾入-195℃液氮中速冻3min，形成均匀的低温小颗粒，得到超低温冷冻发酵剂颗粒和乳双歧杆菌超低温冷冻颗粒；

（8）打捞保存：将步骤（7）形成的两种益生菌超低温冷冻颗粒分别装入无菌铝箔袋中，-20℃以下低温保存待用。

实施例2一种可直接口服的酸奶发酵剂颗粒

本实施例的一种可直接口服的酸奶发酵剂颗粒的制备方法包括如下步骤：

（1）配制10kg的复配原料，包括干物料和实施例1制备的两种益生菌超低温冷冻颗粒，干物料的组成为淀粉2kg、甜橙粉1kg、赤藓糖醇3kg、乳糖2kg、β-聚葡萄糖1kg，所有原材料过80目筛形成制粒用细粉；

（2）将上述干物料在混料机中混合均匀；

（3）在-20℃存储条件下，取出0.4kg实施例1制得的超低温冷冻发酵剂颗粒和0.6kg实施例1制得的双歧杆菌颗粒，室温溶融重新形成菌悬液，得到0.4kg超低温冷冻发酵剂颗粒的菌悬液和0.6kg乳双歧杆菌超低温冷冻颗粒的菌悬液；

（4）将步骤（3）溶融后的菌悬液与步骤（2）混合好的干物料混合，用湿法混料机，混合3min形成均匀的湿软材；

（5）将上述湿软材直接用旋转挤压制粒机制备成杆状湿颗粒，将此湿颗粒在30℃真空干燥为含水量低于5%的干颗粒，包装形成既可以直接吃又可以发酵酸奶的可即食酸奶发酵颗粒。

本实施例制备的可即食酸奶发酵剂颗粒，每克的酸奶发酵能力为1-3kg牛奶，总活菌含量大于60亿cfu/g,制备过程中的活菌率为95%。

实施例3制备益生菌超低温冷冻颗粒

本实施例所述益生菌超低温冷冻颗粒的制备方法如下：

（1）配制发酵培养基：配置5L培养基，按重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖2%、葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母膏2.5%、柠檬酸氢二铵1%、K₂HPO₄0.5%、无水乙酸钠0.1%、硫酸镁0.05%，余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH为6.5，配制好后121℃灭菌20min，备用；

（2）培养益生菌：将嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、鼠李糖乳杆菌分别按照5%的接种量接入上述培养基中，在温度37℃下培养16小时，搅拌转速为50rpm，然后在15℃放置5小时，得益生菌发酵液，备用；

（3）离心处理：将步骤（2）所得益生菌发酵液在8℃，流量为1000ml/min条件下，进行管道式离心，离心转速16000rpm，得益生菌菌泥，嗜热链球菌得菌泥12g/L，嗜酸乳杆菌菌泥10g/L，鼠李糖乳杆菌12g/L；

（4）将嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌菌泥按重量比5:1:1复配形成发酵剂复合菌泥；

（5）配制保护剂：按重量百分比计，保护剂中各组分的配比为磷酸氢二钾2%、磷酸二氢钾2%、半胱氨酸盐酸盐1%、甘油1.5%、乳清粉2.5%、余量为蒸馏水,配制量为48升，115℃下灭菌20min；

（6）添加保护剂：将步骤（4）所配的发酵剂复合菌泥与步骤（5）所配保护剂按照重量比1:2.5混合，搅拌均匀形成乳化液；

（7）速冻成型：将步骤（6）所得乳化液，以500g/min的速度喷雾入-195℃液氮中速冻3min，形成均匀的低温小颗粒，得到益生菌超低温冷冻颗粒；

（8）打捞保存：将步骤（7）形成的益生菌超低温冷冻颗粒分别装入无菌铝箔袋中，-20℃以下低温保存待用。

实施例4一种可直接口服的酸奶发酵剂片剂

本实施例的一种可直接口服的酸奶发酵剂片剂的制备方法包括如下步骤：

（1）配制复配原料，包括干物料和实施例3制备的益生菌超低温冷冻颗粒，干物料的组成为淀粉2kg、菊粉1kg、赤藓糖醇2.5kg、藻油粉（DHA）0.5kg、乳糖2kg、β-聚葡萄糖1kg，所有原材料过80目筛形成制粒用细粉；

（2）将上述干物料在混料机中混合均匀；

（3）从-20℃存储条件下，取出1kg实施例3制得的益生菌超低温冷冻颗粒，常温溶融重新形成菌悬液，得到1kg益生菌超低温冷冻颗粒的菌悬液；

（4）将步骤（3）溶融后的菌悬液与步骤（2）混合好的干物料混合，在一体式湿法制粒机中制成目数为20-30目的湿颗粒；

（5）将上述湿颗粒在30℃条件下真空干燥为含水量低于5%的干颗粒，得中间颗粒；

（6）以重量百分比计，将0.5%的硬脂酸镁、0.8%的滑石粉和98.7%中间颗粒混合均匀，压片得可即食酸奶发酵剂的片剂。

本实施例制得的片剂可以直接口服，每片重1g可以发酵1-3kg牛奶，每片的总活菌量大于50亿cfu/片，制备过程中的活菌存活率为88%。

实施例5制备益生菌超低温冷冻颗粒

本实施例所述益生菌超低温冷冻颗粒的制备方法如下：

（1）配制发酵培养基：配置5L培养基，按重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K₂HPO₄0.2%、无水乙酸钠0.2%、硫酸镁0.1%，余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH为6.5，配制好后在115℃条件下灭菌20min，备用；

（2）培养益生菌：将长双岐杆菌按照5%的接种量接入上述培养基中，在温度37℃下培养20小时，转速为50rpm，然后在15℃放置3小时，得益生菌发酵液，备用；

（3）离心处理：将步骤（2）所得益生菌发酵液在10℃，流量为2000ml/min条件下，进行管道式离心，离线转速为16000rpm，得益生菌菌泥10g/L，备用；

（4）配制保护剂：按重量百分比计，保护剂各组分的配比为磷酸氢二钾1%、磷酸二氢钾1%、半胱氨酸盐酸盐3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量为蒸馏水，115℃灭菌20分钟，待冷却后备用；

（5）将10g步骤（3）所得菌泥与20g步骤（4）所得保护剂混合均匀，形成乳化液，将乳化液用泵以500g/min的速度喷雾入-195℃液氮中速冻3min，形成均匀的低温小颗粒，得到益生菌超低温冷冻颗粒；

（6）打捞保存：将步骤（5）形成的益生菌超低温冷冻颗粒分别装入无菌铝箔袋中，-20℃以下低温保存待用。

实施例6一种含益生元和维生素强化的益生菌颗粒制剂

本实施例的一种含益生元和维生素强化的益生菌制剂的制备方法包括如下步骤：

（1）配制复配原料，包括干物料和实施例5制备的益生菌超低温冷冻颗粒，干物料的组成为淀粉0.5kg、菊粉3kg、赤藓糖醇3kg、低聚半乳糖3kg，维生素A70mg，维生素D0.7mg，维生素E3g，维生素B13g，维生素C25g，所有原材料过80目筛形成制粒用细粉；

（2）将上述干物料在混料机中混合均匀；

（3）从-20℃存储条件下，取出0.9kg实施例5制得的益生菌超低温冷冻颗粒，常温溶融重新形成菌悬液，得到0.9kg益生菌超低温冷冻颗粒的菌悬液；

（4）将步骤（3）溶融后的菌悬液与步骤（2）混合好的干物料混合，在一体式湿法制粒机中制备为雪花状30-50目的湿颗粒；

（5）将上述湿颗粒在30℃条件下真空干燥为含水量低于5%的干颗粒。

本实施例制备的益生菌颗粒制剂，不但可以补充肠道双歧杆菌，而且强化了益生元与益生菌的配合，更有利于维护肠道健康；特别强化了维生素补充，符合国家营养强化剂使用的相关规范，更有利于人体健康。

实施例7制备益生菌超低温冷冻颗粒

本实施例所述益生菌超低温冷冻颗粒的制备方法如下：

（1）配制发酵培养基：配置5L培养基，按重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K₂HPO₄0.2%、无水乙酸钠0.2%、硫酸镁0.1%，余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH为6.5，配制好后在115℃条件下灭菌20min，备用；

（2）培养益生菌：将保加利亚乳杆菌按照5%的接种量接入上述培养基中，在温度37℃下培养20小时，转速为50rpm，然后在15℃放置3小时，得益生菌发酵液，备用；

（3）离心处理：将步骤（2）所得益生菌发酵液在10℃，流量为2000ml/min条件下，进行管道式离心，离心转速为16000rpm，得益生菌菌泥9g/L，备用；

（4）配制保护剂：按重量百分比计，保护剂各组分的配比为磷酸氢二钾1%、磷酸二氢钾1%、半胱氨酸盐酸盐3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量为蒸馏水，115℃灭菌20min，待冷却后备用；

（5）将9g步骤（3）所得菌泥与27g步骤（4）所得保护剂混合均匀，形成乳化液，将乳化液用泵以500g/min的速度喷雾入-195℃液氮中速冻3min，形成均匀的低温小颗粒，得到益生菌超低温冷冻颗粒；

（6）打捞保存：将步骤（5）形成的益生菌超低温冷冻颗粒分别装入无菌铝箔袋中，-20℃以下低温保存待用。

实验例1对比测试采用超低温冷冻技术保存的保加利亚乳杆菌与采用常规真空冷冻干燥技术保存的保加利亚乳杆菌在活菌存活率方面的差异

本实验例对比实施例7制备的保加利亚乳杆菌超低温冷冻颗粒与常规真空冷冻干燥技术制备的保加利亚乳杆菌冻干菌粉在活菌存活率方面的差异，其中，常规真空冷冻干燥技术制备保加利亚乳杆菌冻干菌粉的实验方法如下：

（1）配制发酵培养基：配置5L培养基，按重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K₂HPO₄0.2%、无水乙酸钠0.2%、硫酸镁0.1%，余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH为6.5，配制好后在115℃条件下灭菌20min，备用；

（2）培养益生菌：将保加利亚乳杆菌按照5%的接种量接入上述培养基中，在温度37℃下培养20小时，转速为50rpm，然后在15℃放置3小时，得益生菌发酵液，备用；

（3）离心处理：将步骤（2）所得益生菌发酵液在10℃，流量为2000ml/min条件下，进行管道式离心，离线转速为16000rpm，得益生菌菌泥9g/L，备用；

（4）配制保护剂：按重量百分比计，保护剂各组分的配比为磷酸氢二钾1%、磷酸二氢钾1%、半胱氨酸盐酸盐3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量为蒸馏水，115℃灭菌20分钟，待冷却后备用；

（5）将9g步骤（3）所得菌泥与27g步骤（3）所得保护剂混合均匀，形成乳化液，将乳化液直接装盘放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,冻干条件为：速冻至-45℃，真空度维持在20～40pa，待观测到冻干菌泥上出现裂纹，升温至25℃，在25℃控温维持所述真空度继续干燥10小时，整个真空冷冻干燥过程耗时30小时。最终所得保加利亚乳杆菌冻干菌粉的含水量低于5%。

将上述离心后所得菌泥、实施例7制备的保加利亚乳杆菌超低温冷冻颗粒与常规真空冷冻干燥技术制备的保加利亚乳杆菌冻干菌粉按照GB4789.35所述方法比较二种方法对保加利亚乳杆菌存活率的影响。结果见下表1：

表1

由表1的实验结果可以看出，采用本发明所述超低温冷冻技术制得的保加利亚乳杆菌超低温冷冻颗粒，虽然降低了单位活菌量，但是总活菌比常规真空冷冻干燥技术制得的保加利亚乳杆菌冻干菌粉高出50%，减少了菌体的损失，降低了生产的成本。

还需指出的是，保护剂是在低温冷冻过程中保护菌株不受伤害的必须措施。本发明所用保护剂为全盐配方，除了能够有效保护菌株冷冻过程中的活性以外，相较于一些有机含量较多的保护剂，对溶液的凝固点降低较小，可以让冷冻颗粒在相对较高的温度存储。本发明的益生菌超低温冷冻颗粒储存温度低于零下20℃即可以，而有机物含量较高的冻干或冷冻保护剂所生产的冻干颗粒，储存条件必须低于零下40℃。

实验例2对比测试采用超低温冷冻技术制备的益生菌菌株与采用常规真空冷冻干燥技术制备的益生菌冻干菌粉采用同样工艺制备的益生菌制剂对菌株存活率的影响

本实验例对比了实施例5制备的长双歧杆菌超低温冷冻颗粒和采用常规真空冷冻干燥技术制备的长双歧杆菌冻干菌粉，按照实施例6所述的益生菌制剂制备工艺制得的益生菌制剂中的长双岐杆菌的存活率。其中，常规真空冷冻干燥技术制备长双岐杆菌冻干菌粉的实验方法如下：

（1）配制发酵培养基：配置5L培养基，按重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖1.5%、葡萄糖1.5%、蛋白胨0.5%、酵母膏5%、柠檬酸氢二铵0.2%、K₂HPO₄0.2%、无水乙酸钠0.2%、硫酸镁0.1%，余量为蒸馏水，用NaOH溶液调节pH为6.5，配制好后在115℃条件下灭菌20min，备用；

（2）培养益生菌：将长双岐杆菌按照5%的接种量接入上述培养基中，在温度37℃下培养20小时，转速为50rpm，然后在15℃放置3小时，得益生菌发酵液，备用；

（3）离心处理：将步骤（2）所得益生菌发酵液在10℃，流量为2000ml/min条件下，进行管道式离心，离线转速为16000rpm，得益生菌菌泥10g/L，备用；

（4）配制保护剂：按重量百分比计，保护剂各组分的配比为磷酸氢二钾1%、磷酸二氢钾1%、半胱氨酸盐酸盐3%、甘油1%、乳清粉2.5%、余量为蒸馏水，115℃灭菌20分钟，待冷却后备用；

（5）将10g步骤（3）所得菌泥与20g步骤（4）所得保护剂混合均匀，形成乳化液，将乳化液直接装盘放入真空冷冻干燥机中冷冻干燥,冻干条件为：速冻至-45℃，真空度维持在20～40pa，待观测到冻干菌泥上出现裂纹，升温至25℃，在25℃控温维持所述真空度继续干燥10小时，整个真空冷冻干燥过程耗时30小时。最终所得保加利亚乳杆菌冻干菌粉的含水量低于5%。

按照GB4789.35的方法测定实施例5制备的长双歧杆菌超低温冷冻颗粒和采用常规真空冷冻干燥技术制备的长双歧杆菌冻干菌粉的活菌含量，结果表明常规真空冷冻干燥技术制备的长双岐杆菌冻干菌粉的活菌含量为：1.5×10¹¹cfu/g；实施例5制备的长双歧杆菌超低温冷冻颗粒的活菌含量为：6×10¹⁰cfu/g。

制备益生菌制剂的方法如下：

（1）称取0.9kg长双歧杆菌超低温冷冻颗粒，直接常温溶融后得到0.9kg菌悬液，与实施例6步骤（2）所述干物料混合均匀形成湿软材；

（2）称取长双岐杆菌冻干菌粉0.36kg与实施例6步骤（2）所述干物料混合均匀，然后加入0.54kg生理盐水溶液混合均匀形成湿软材；

（3）将步骤（1）和步骤（2）制得的湿软材按照实施例6所述工艺制备长双岐杆菌的益生菌制剂，制备好的益生菌制剂按照GB4789.35所述方法测活菌含量，比较二种益生菌制剂中的长双岐杆菌的存活率。结果见下表2：

表2

由表2的实验结果可以看出，采用本发明所述超低温冷冻技术在制备颗粒型或者片剂型益生菌制剂的运用上，活菌率比常规真空冻干菌粉高了36%，能大大降低制备过程中的活菌损失，降低了生产的成本。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种益生菌超低温冷冻颗粒的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)配制发酵培养基：以重量百分比计，培养基中各组分配比为乳糖1-2％、葡萄糖1-2％、蛋白胨0.5-2％、酵母膏1-5％、柠檬酸氢二铵0.2-1％、K₂HPO₄ 0.01-0.5％、无水乙酸钠0.1-0.5％、硫酸镁0.02-0.1％，余量为蒸馏水，调节pH为6.0-7.0，配好后灭菌，备用；

(2)培养益生菌：将益生菌菌株按照5-10％的接种量接入步骤(1)所得的培养基中，在温度30-40℃、转速40-100rpm下培养10-20小时，然后在10-20℃放置2-6小时，得到益生菌发酵液，备用；

(3)离心处理：将步骤(2)所得益生菌发酵液在4-10℃，流量为150ml-3000ml/min条件下，进行管道式离心，得到益生菌菌泥，备用；

(4)配制保护剂：以重量百分比计，保护剂中各组分的配比为磷酸氢二钾1-2％、磷酸二氢钾1-2％、半胱氨酸盐酸盐1-3％、甘油1-2％、乳清粉1-5％、余量为蒸馏水，配好后灭菌，备用；

(5)添加保护剂：将步骤(3)所得益生菌菌泥与步骤(4)所得保护剂按重量比1:1-3混合，搅拌均匀形成乳化液；

(6)速冻成型：将步骤(5)所得乳化液，按照500g/min的速度喷雾入-195℃液氮中速冻3min，形成均匀的低温小颗粒，得到益生菌超低温冷冻颗粒。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述益生菌菌株包括保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、两歧双歧杆菌、乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述益生菌菌泥的得率为8-50g/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中保护剂中各组分的配比为磷酸氢二钾1.5％、磷酸二氢钾1.5％、半胱氨酸盐酸盐2％、甘油2％、乳清粉5％、余量为蒸馏水。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，将步骤(3)所得益生菌菌泥与步骤(4)所得保护剂按重量比1:3混合，搅拌均匀形成乳化液。

6.权利要求1-5任一项所述方法制备的益生菌超低温冷冻颗粒。

7.利用权利要求6所述益生菌超低温冷冻颗粒制备的益生菌制剂；所述益生菌制剂的剂型为颗粒型或者片剂型。

8.权利要求7所述益生菌制剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)配制复配原料，其包括干物料和所述益生菌超低温冷冻颗粒，将所述干物料的各原料干燥、粉碎、过80目筛形成均匀的细粉；

(2)将干物料各原料的细粉混合均匀；

(3)将益生菌超低温冷冻颗粒从-20℃存储条件下取出，室温溶融重新形成菌悬液，菌悬液的质量不超过复配原料总质量的15％；

(4)将菌悬液与步骤(2)混匀的干物料混合均匀，制成湿软材；

(5)将湿软材制成湿颗粒；

(6)将湿颗粒在低于30℃真空条件下干燥至含水量低于5％，制成颗粒型产品或加工成片剂型产品。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述干物料包含营养功能物质和辅料；所述营养功能物质为益生元、益生菌菌粉、膳食纤维、维生素、DHA中的一种或多种；所述辅料包含赋形剂、支撑剂、助流剂、崩解剂、调味剂或吸潮剂。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述益生元为低聚果糖、低聚半乳糖、母乳低聚糖中的一种或者多种；所述膳食纤维为菊粉、β-聚葡萄糖、果胶、抗性淀粉、半纤维素、纤维素中的一种或多种。