CN109419003A - 母乳低聚糖在制备食品或者药物中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及母乳低聚糖在制备食品或者药物中的用途，该食品或者药物用于促进动物肠道发育或免疫系统成熟。母乳低聚糖可以促进动物肠道发育或免疫系统成熟，降低感染疾病的风险。
Description
技术领域
本发明涉及食品或药品领域。具体地，本发明涉及母乳低聚糖在制备食品或者药物中的用途。
背景技术
新生儿时期是一个人类免疫系统经历最快速、最激烈发展的变化时期。新生儿由于免疫系统发育不成熟，具有较高感染疾病的风险。
因此，为了降低新生儿高患病率和感染后带来的高死亡率，
然而，如何提高新生儿的免疫力还需要进一步研究。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
作为新生儿主要的食物来源，母乳中含有较多的母乳低聚糖，有着促进肠道有益菌群增殖的作用。实验表明，母乳低聚糖对于新生机体的免疫系统存在着调节作用，但是母乳低聚糖是否可以促进动物肠道发育或免疫系统的成熟，仍有待研究。
本申请发明人通过对新生鼠每日灌胃母乳低聚糖，持续2周至新生鼠离乳，并进行正常饲喂至第六周性成熟阶段，研究母乳低聚糖对于新生机体肠道形态学及免疫系统的发育的生物学作用。发明人惊喜地发现，母乳低聚糖可以促进动物肠道发育或免疫系统成熟，对动物的肠道形态和免疫体系的构建具有调节作用，可以通过肠道菌群来对动物肠道结构、特异与非特异免疫响应进行调节，降低感染疾病的风险。
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
在本发明中，本发明提出了母乳低聚糖在制备食品或者药物中的用途。根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进动物肠道发育以及免疫系统成熟。根据本发明的实施例，母乳低聚糖可以促进动物肠道发育或免疫系统成熟，对动物的肠道形态和免疫体系的构建具有调节作用，可以通过肠道菌群来对动物肠道结构、特异与非特异免疫响应进行调节，降低感染疾病的风险。
根据本发明的实施例，上述用途还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。发明人发现，母乳低聚糖的食用/给药剂量会影响动物肠道发育和免疫系统成熟。进而，发明人经过大量实验得到上述较佳的剂量，由此，能够进一步促进动物肠道发育或免疫系统成熟，进一步调节动物的肠道形态和免疫体系构建，可以通过肠道菌群来对动物肠道结构、特异与非特异免疫响应进行调节。
需要说明的是，本发明所使用的剂量单位“mg/g.BW.day”是指每天针对每克动物所食用/给药的母乳低聚糖重量(mg)，如本发明中是指每天针对每克新生小鼠所食用/给药的母乳低聚糖重量(mg)。其中，本领域技术人员可以通过相应的换算公式，对不同动物所需的药物或食品剂量进行换算。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促使多形拟杆菌属的相对丰度增加，梭菌属、变形菌属及志贺菌属相对丰度降低，所述食品或者药物的剂量0.25～3.75mg/g.BW.day。发明人发现，食用/给药母乳低聚糖，可以有效地改善动物肠道菌群多样性，促进肠道菌群的平衡，减少潜在病原菌的黏附，从而促进动物肠道发育或免疫系统成熟，减少炎症的发生。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促使多形拟杆菌属的相对丰度增加，梭菌属、变形菌属及志贺菌属相对丰度降低，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，食用/给药母乳低聚糖，可以进一步改善动物肠道菌群多样性，促进肠道菌群的平衡，减少潜在病原菌的黏附，从而进一步促进动物肠道发育以及免疫系统成熟，减少炎症的发生。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进断乳时十二指肠绒毛高度的增加，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。肠绒毛是小肠组织结构中重要的组成部分，绒毛增大了肠黏膜的表面积，便于营养物质的吸收。通常，绒毛高度增加，代表着肠黏膜吸收面积增大，故绒毛高度一定程度上可用于评价肠道对于营养物质吸收能力的高低。有鉴于此，发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著促进十二指肠绒毛高度的增长。由此，能够有效地促进肠道发育。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进断乳时十二指肠绒毛高度的增加，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步促进十二指肠绒毛高度的增长。由此，能够进一步有效促进肠道发育。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于减缓十二指肠隐窝深度的增加，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。通常，隐窝深度增加，肠绒毛中成熟的细胞数量会减少，故可以进行营养物质消化吸收的面积较少，造成吸收能力的降低。小肠的隐窝深度能反映肠细胞生成的速率以及成熟细胞的多少，和肠道的吸收功能密切相关，隐窝的深度一定程度上代表了新生儿肠道成熟的程度。有鉴于此，发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著地降低肠道隐窝中细胞的增殖。由此，促进肠道细胞的成熟，增加肠道的屏障功能。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于减缓十二指肠隐窝深度的增加，所述食品或者药物的剂量为3.75mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著地降低肠道隐窝中细胞的增殖。由此，进一步促进肠道细胞的成熟，增加肠道的屏障功能。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于减缓空肠或回肠隐窝深度的增加，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著地降低肠道隐窝中细胞的增殖。由此，促进肠道细胞的成熟，增加肠道的屏障功能。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于减缓空肠或回肠隐窝深度的增加，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著地降低肠道隐窝中细胞的增殖。由此，进一步促进肠道细胞的成熟，增加肠道的屏障功能。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于提高十二指肠、回肠或空肠小肠绒毛高与隐窝深度的比值(V/C值)，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著地促进V/C比值的增加，从而有利于肠道消化能力增强，肠细胞生长加快，促进肠道发育。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进十二指肠、回肠或空肠小肠绒毛高与隐窝深度的比值(V/C值)，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著地促进V/C比值的增加，从而更加有利于肠道消化能力增强，肠细胞生长加快，促进肠道发育。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进断乳时巨噬细胞的吞噬能力，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。巨噬细胞是机体免疫系统中重要的免疫细胞，既具有较强的吞噬功能，也是主要的抗原呈递细胞。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著增强巨噬细胞的吞噬能力，从而有利于巨噬细胞在机体的非特异性和特异性免疫中发挥作用，促进免疫系统成熟。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进断乳时巨噬细胞的吞噬能力，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著增强巨噬细胞的吞噬能力，从而更加有利于巨噬细胞在机体的非特异性和特异性免疫中发挥作用，促进免疫系统成熟。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进SIgA的分泌以及增加血清IgA含量，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。通常，SIgA分泌量高低的变化可以在一定程度上表征机体肠道黏膜免疫的功能强弱；IgA免疫球蛋白含量的高低在一定程度上可以表征机体免疫功能的强弱。有鉴于此，发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著提高SIgA的分泌量，从而有利于机体肠道黏膜免疫的功能增强；同样地，能够显著增加血清中IgA免疫球蛋白的含量，从而有利于增强机体的免疫功能。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物用于促进SIgA的分泌以及增加血清IgA含量，所述食品或者药物的剂量为3.75mg/g.BW.day或1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著提高SIgA的分泌量，从而更加有利于机体肠道黏膜免疫的功能增强；同样地，能够进一步显著增加血清中IgA免疫球蛋白的含量，从而更加有利于增强机体的免疫功能。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物增加断乳时血清IgG含量，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。作为血清中免疫球蛋白的重要成分，IgG是唯一可以通过胎盘的抗体，对新生机体出生后抵抗外界感染有着很大作用。通常，IgG含量升高代表着新生机体对外界病原体免疫抵抗力越强。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著升高IgG的含量，从而有利于新生机体对外界病原体免疫抵抗力的增强，促进免疫系统成熟。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物增加断乳时血清IgG含量，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著升高IgG 的含量，从而更加有利于新生机体对外界病原体免疫抵抗力的增强，促进免疫系统成熟。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物降低血清IL-2、TNF-α、IFN-γ含量，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著降低血清IL-2、TNF-α、IFN-γ的含量，从而可以避免自身免疫病的产生，有利于免疫能力的提高，促进免疫系统的成熟。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物降低血清IL-2、TNF-α、IFN-γ含量，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著降低血清IL-2、TNF-α、IFN-γ的含量，从而可以进一步避免自身免疫病的产生，更加有利于免疫能力的提高，促进免疫系统的成熟。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物降低Th1型细胞因子数/Th2型细胞因子数，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。每个机体体内都存在着Th1和Th2的动态平衡，这样才能保证健康的生理功能及免疫响应。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够显著降低Th1型细胞因子数/Th2型细胞因子数，从而有利于Th1和Th2达到免疫平衡，保证健康的生理功能及免疫响应，促进免疫系统成熟。
根据本发明的实施例，所述食品或者药物降低Th1型细胞因子数/Th2型细胞因子数，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。发明人发现，在该剂量下，母乳低聚糖能够进一步显著降低Th1型细胞因子数/Th2型细胞因子数，从而更加有利于Th1和Th2达到免疫平衡，保证健康的生理功能及免疫响应，促进免疫系统成熟。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的实验时间段划分示意图；
图2是根据本发明实施例的技术路线示意图；
图3是根据本发明实施例的不同灌胃处理组十二指肠绒毛高度的变化示意图；
图4是根据本发明实施例的不同灌胃处理组空肠绒毛高度的变化示意图；
图5是根据本发明实施例的不同灌胃处理组回肠绒毛高度的变化示意图；
图6是根据本发明实施例的不同灌胃处理组十二指肠隐窝深度的变化示意图；
图7是根据本发明实施例的不同灌胃处理组空肠隐窝深度的变化示意图；
图8是根据本发明实施例的不同灌胃处理组回肠隐窝深度的变化示意图；
图9是根据本发明实施例的不同灌胃处理组十二指肠V/C比值的变化示意图；
图10是根据本发明实施例的不同灌胃处理组空肠V/C比值的变化示意图；
图11是根据本发明实施例的不同灌胃处理组回肠V/C比值的变化示意图；
图12是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第3周脏器指数的变化(mg/g)示意图；
图13是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第4周脏器指数的变化(mg/g)示意图；
图14是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第6周脏器指数的变化(mg/g)示意图；
图15是根据本发明实施例的不同灌胃处理组巨噬细胞吞噬率的变化示意图；
图16是根据本发明实施例的不同灌胃处理组脾脏淋巴细胞增殖能力的变化示意图；
图17是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清溶血素含量的变化示意图；
图18是根据本发明实施例的不同灌胃处理组肠组织SIgA含量的变化示意图；
图19是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IgG含量的变化示意图；
图20是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IgA含量的变化示意图；
图21是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IgM含量的变化示意图；
图22是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IgE含量的变化示意图；
图23是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IL－2含量的变化示意图；
图24是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清TNF－α含量的变化示意图；
图25是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IFN－γ含量的变化示意图；
图26是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IL-4含量的变化示意图；
图27是根据本发明实施例的不同灌胃处理组血清IL－10含量的变化示意图；
图28是根据本发明实施例的不同灌胃处理组机体免疫平衡的变化示意图；
图29是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第三周肠道菌群丰度及多样性示意图，其中0.01<P≤0.05标记为*，0.001<P≤0.01标记为**；
图30是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第四周肠道菌群丰度及多样性示意图，其中0.01<P≤0.05标记为*，0.001<P≤0.01标记为**；
图31是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第六周肠道菌群丰度及多样性示意图，其 中0.01<P≤0.05标记为*，0.001<P≤0.01标记为**；
图32是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第三周肠道菌群组成差异分析示意图；
图33是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第四周肠道菌群组成差异分析示意图；以及
图34是根据本发明实施例的不同灌胃处理组第六周肠道菌群组成差异分析示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明所使用的术语“动物”是哺乳动物。例如人、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠、鱼、鸟等。在某些实施方案中，所述动物是灵长类动物。在另外其他实施方案中，所述动物是人。
其中，术语“特异性免疫”是指新生儿出生后经过外界刺激和自身免疫系统的发育成熟而形成的免疫能力。在新生儿体内，负责特异性免疫的细胞主要包括针对细胞内微生物免疫的T细胞和主要对胞外病原体进行免疫响应并产生抗体的B细胞。特异性免疫主要针对的是识别外界病原侵略者并对其进行彻底的清除。
术语“母乳低聚糖”(Human Milk Oligosaccharides，HMO)是指由3～10个单糖通过糖苷键连接而成的碳水化合物，是母乳中含量排名位于脂肪和乳糖后的第三固体组成成分。母乳低聚糖的基本结构是由五个基本单糖组成，分别为：D－葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、 N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)、L-岩藻糖(Fuc)和N-乙酰神经氨酸(NeuAc或Neu5c)。基于相同的核心结构，根据不同母乳低聚糖所带单糖残基是否含有电荷，可将它们分为两大类：1)中性母乳低聚糖：即含有不带电荷的单糖残基(Glc，Gal和GlcNAc)，如2’-FL和 3’-FL；2)酸性母乳低聚糖：即含有带负电荷的单糖残基，N-乙酰神经氨酸(NeuAc)，如 3’-SL和6’-SL。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于促进动物肠道发育或免疫系统成熟的药物组合物，其包含母乳低聚糖作为活性成分。由此，利用该药物组合物能够促进动物肠道发育或免疫系统成熟。
根据本发明的一些实施例，包含本发明的药物组合物还可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。
其中，根据本发明的一些具体示例，适合药物配方的载体中赋形剂和稀释液可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟苯丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。
根据本发明的另一些实施例，本发明的药物组合物中还可以包括填充剂，抗凝血剂，润滑剂，保湿剂，芳香剂和防腐剂。
根据本发明的实施例，本发明的药物组合物能够促进动物肠道发育或免疫系统成熟，因而，本发明的药物组合物可以在促进动物肠道发育或免疫系统成熟被给药。
在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入动物。本发明的药物组合物可以通过任何常见的途径被给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括灌胃，腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以灌胃被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。
本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。
术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在肠道发育或免疫系统成熟缓慢或终止的治疗中，减少、预防、延缓、抑制或阻滞疾病或病症的任何症状的药物或化合物应当是治疗有效的。治疗有效量的药物或化合物不需要治愈疾病或病症，但将为疾病或病症提供治疗，使得个体的疾病或病症的发作被延缓、阻止或预防，或者疾病或病症的症状得以缓解，或者疾病或病症的期限被改变，或者例如疾病或病症变得不严重，或者加速康复。
术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病的治疗，包括： (a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述药物给予有需要的个体。
根据本发明的实施例，本发明的药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明的药物、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。
以下实施例中所用的实验材料与方法如下所述：
1.本发明技术路线及内容
(1)根据新生鼠生长阶段，将实验时间确定为从出生到第6周的性成熟时间，并根据新生鼠是否离乳分为出生后第0-2天、出生后3-8天(适应期)、第9-21天(干预期)、第 22-28天(离乳期)以及第29-42天(自由生长进食阶段)。本实验时间段划分如图1所示。
(2)通过观察不同肠段的小肠绒毛高度和隐窝深度来评价母乳低聚糖对于新生乳鼠肠道形态学发育的效果。
(3)通过测定新生乳鼠特异性免疫和非特异性免疫的指标来探究母乳低聚糖对于新生机体免疫系统可能影响的方面。
(4)通过测定新生乳鼠肠道菌群多样性及菌群组成的变化来探究母乳低聚糖对于肠道结构和免疫调节的可能机制。本研究技术路线如图2所示。
2.母乳低聚糖对新生乳鼠肠道形态的影响
2.1引言
为了研究母乳低聚糖对新生机体肠道形态的影响，我们选择通过动物实验来检测其摄入后对于机体肠道形态的影响。采用健康的新生Balb/c乳鼠为模型，通过为期2周的灌胃，探讨母乳低聚糖对于新生乳鼠肠道形态的影响，本实验对其不同肠段小肠绒毛高度、隐窝深度及两者比值三个指标进行评价。
2.2实验材料与方法
2.2.1实验仪器与设备
对新生乳鼠肠道形态检测所用主要实验仪器如表1所示。
表1肠道形态检测所用实验仪器
| 仪器名称 | 型号 | 生产厂家 |
| 显微镜 | IX71 | 日本奥林巴斯 |
| 切片机 | RM2016 | 上海徕卡仪器有限公司 |
| 包埋机 | JB-P5 | 武汉俊杰电子有限公司 |
| 高速离心机 | 3-18R | 恒诺仪器公司 |
| 真空冷冻干燥机 | LGJ-18 | 松源华兴 |
| 10kda滤膜 | VIVAFLOW 50 | Sartorius |
2.2.2实验材料与试剂配置
对新生乳鼠肠道形态检测所用主要实验试剂如表2所示。
表2肠道形态检测所用实验试剂
2.2.3动物分组及处理方法
SPF级Balb/c乳鼠，2日龄，不分雌雄和母鼠一同购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养条件为室温22±2摄氏度，相对湿度50±10％，12小时灯照/黑暗循环；离乳前，母鼠自由饮水和采食，新生乳鼠通过灌胃针经口灌胃；离乳后，停止灌胃新生乳鼠，使其自由饮水和采食，饲料采用标准动物繁殖饲料。
2日龄Balb/c乳鼠和其母鼠适应5天后，分成五组，依次为母乳对照组、母乳低聚糖高剂量组(HMO高剂量组)、母乳低聚糖中剂量组(HMO中剂量组)、母乳低聚糖低剂量组(HMO低剂量组)、配方(奶)粉低聚糖组(GOS/FOS组)，新生乳鼠分组情况、每组只数及灌胃剂量分配如表3所示。从出生后第8天开始对新生乳鼠进行经口灌胃，此时新生乳鼠和母鼠同笼；灌胃时间持续14天，于出生后第22天停止灌胃，并将新生乳鼠和母鼠分开，即新生乳鼠离乳；离乳后，新生乳鼠自由采食、饮水，并于第42天进行断颈处死和解剖，即新生乳鼠性成熟时间为全实验实验终点。
表3新生乳鼠实验分组与处理
对新生乳鼠的灌胃物质为母乳低聚糖粗提物，所设剂量基于新生儿每日摄奶量(1L)、新生儿体重(4～6kg)以及初乳、常乳、末乳中母乳低聚糖的浓度(分别为15g/L、4g/L、1g/L)换算而得。GOS/FOS组的浓度参考市售配方奶粉中低聚糖的添加量，GOS/FOS组灌胃成分为低聚半乳糖：低聚果糖(m:m＝9:1)。
2.2.4母乳低聚糖的提取
母乳低聚糖提取原料为志愿者妈妈母乳混合样，提取步骤如下：
(1)将200mL母乳进行离心，条件为4摄氏度，12000rpm，30min，离心后弃去脂肪层；加入800mL氯仿甲醇溶液(体积比2:1)，反复颠倒后进行离心，条件为4摄氏度， 6000rpm，30min，离心后将上清液转移至新的离心杯中；
(2)加入1L无水乙醇，反复颠倒后静置4摄氏度过夜，过夜后离心，条件为4摄氏度，12000rpm，30min，并将上清液转移至新的烧杯中，使用10kda滤膜将上清液进行过滤；
(3)将滤液倒入冻干板，冻干48h；冻干结束后样品于-20摄氏度进行保存；
(4)使用液相色谱进行母乳低聚糖的制备，液相色谱条件如表4所示。
表4母乳低聚糖提取的液相色谱条件
(5)除去7～22min这一段时间的馏分，回收并合并其他时间段馏分，进行再一次冻干后即为母乳低聚糖提取物。
通过MALDI-TOF-MS检测，粗提母乳低聚糖纯度为80％。
2.2.5实验指标测定方法
2.2.5.1肠段样本的制备
乳鼠断颈处死后，经75％酒精浸泡后小心去除腹部皮毛并使用高压灭菌后的手术剪及镊子剪开腹腔，截取从胃末端到结肠末端作为乳鼠肠道。进行长度测量后，按照十二指肠(距离幽门0.5cm处向下截取)、空肠(十二指肠和回肠截取后从剩下的小肠肠段中进行中间部分的截取)、回肠(盲肠前1cm处向上截取)进行1～2厘米的肠组织截取并放入组织固定液中浸泡24h；
2.2.5.2肠段绝对长度的测量及长度比的计算
将取出的肠道于生理盐水中清洗后平铺在解剖盘上，进行不同肠段长度的测量；量取胃末端幽门处至盲肠上端的长度，作为小肠长度(单位：cm)；量取盲肠末端至结肠末端，作为大肠长度(单位：cm)；将两个长度加和作为肠道总长度(单位：cm)。不同肠段的长度比即为相应肠段长度与肠道总长度的比值。
2.2.5.3苏木精伊红染色(HE染色)
(1)取材与固定
取乳鼠不同肠段组织投入预先配好的多聚甲醛固定液中，使组织、细胞的蛋白质变性凝固，防止细胞死后进行自溶或相关细菌的分解，更好的保持细胞原油的形态与结构。
(2)脱水透明
使用PBS进行清洗，每次15分钟共两次，采用酒精作脱水剂，第一次为在30％乙醇中浸泡30分钟，第二次为在70％乙醇中浸泡，酒精的浓度由低到高使样本逐渐脱去水分。再将样本块浸泡于溶于酒精和石蜡的透明剂二甲苯中，用二甲苯替换出样本块中的乙醇并进行后续的浸蜡包埋。
(3)浸蜡包埋
将已透明的样本块置于已溶化的石蜡中，并放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋。
(4)切片与贴片
将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成约5微米的薄片。切下的薄片放到加热的水中烫平后贴于载玻片，并于45摄氏度恒温箱中烘干。
(5)脱蜡染色
采用苏木精(Hematoxylin，H)这种碱性染料，将细胞核及细胞内核糖体染成蓝紫色；采用伊红(Eosin，E)这种酸性染料能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。在进行HE染色的过程时，先将放入到蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色5 分钟。用自来水冲洗5～10分钟后用盐酸乙醇分化1分钟；再次用自来水冲洗10分钟；放入75％、80％及90％酒精中脱水各2分钟后，放入酒精伊红染色液染色1分钟。。
(6)脱水透明及封固
染色后的切片在95％和100％乙醇中各浸泡2分钟，之后在二甲苯中脱乙醇并使用中性树脂进行封固纯。
2.2.5.4绒毛高度及隐窝深度的测量
将HE染色后的切片至于显微镜下进行观察，以肠道绒毛的顶部到肠道隐窝上部的垂直距离作为该肠道绒毛的高度(单位：μm)，将从隐窝上部到隐窝底部的垂直距离作为该肠道绒毛的隐窝深度(单位：μm)；将肠道绒毛高度记做V(villus的简称)，将肠道隐窝深度记做C(crypt的简称)，使用两者的比值v/c进行肠道形态学的评价，每组计数5张HE 染色切片，每张HE染色切片至少计数30根小肠绒毛。
2.2.6数据统计分析
结果均以“均值±标准差”表示，用SPSS21.0软件进行数据分析。以单因素方差分析法比较组之间的差异，随后进行Duncan检验，用P<0.05时是为存在显著性差异；图或表中以a、b、c等不同字母表示组之间的显著性差异(P<0.05)。
3.母乳低聚糖对新生乳鼠免疫系统发育的影响
3.1引言
为了研究母乳低聚糖的免疫调节功能，本实验采用健康的新生Balb/c乳鼠为模型来探究母乳低聚糖对于新生乳鼠非特异性和特异性免疫系统的影响，对前者的检测指标包括其对免疫器官的脏器指数以及巨噬细胞的吞噬率；对后者的检测指标包括血清溶血素含量、脾脏淋巴细胞增殖能力、血清免疫球蛋白含量及细胞因子的分泌等。
3.2实验材料与方法
3.2.1实验仪器与设备
对新生乳鼠免疫系统相关指标的测定所用实验仪器如表5所示。
表5免疫指标检测实验所用仪器
| 仪器名称 | 型号 | 生产厂家 |
| 分析天平 | Acc微升ab | 德国赛多利斯 |
| 台式离心机 | TDL－5-A | 上海安亭科学仪器厂 |
| 载玻片 | CAT.NO.7103 | SAIL BRAND |
| 酶标仪 | Bio-rad Model 680 | 美国Bio-rad公司 |
| CO2培养箱 | MCO-15AC | SANYO公司 |
| 生物显微镜 | IX71 | 日本奥林巴斯 |
| 高压灭菌锅 | ZDX35BI | 上海申安医疗器械厂 |
| 紫外分光光度计 | UV－2100 | 优尼柯仪器有限公司 |
| pH计 | DELTA320 | 瑞士梅特勒公司 |
| 超净工作台 | DK－98-112KW | 天津泰斯特仪器公司 |
3.2.2实验材料与试剂配置
对新生乳鼠免疫系统相关指标的测定所用实验仪器如表6所示。
表6免疫指标检测实验所用试剂
| 试剂名称 | 来源 |
| RPMI－1640 | Gibco公司 |
| 青霉素 | Amresco公司 |
| 链霉素 | Amresco公司 |
| 刀豆球蛋白(conA) | Sigma公司 |
| Giemsa染料 | Sigma公司 |
| 胎牛血清 | PAA公司 |
| CCK8 | 碧云天公司 |
| 氯化钾 | 北京化工厂 |
| 碳酸氢钠 | 北京化工厂 |
| 十二水合磷酸氢二钠 | 北京化工厂 |
| 磷酸二氢钾 | 北京化工厂 |
| 氯化钠 | 北京化工厂 |
| 盐酸 | 北京化工厂 |
| 鸡红细胞 | 北京博尔西公司 |
| 96孔细胞培养板 | Costar公司 |
| D－Hanks液 | 上海君瑞生物技术有限公司 |
| 阿氏液 | 北京吉美生物技术有限公司 |
| 绵羊红细胞 | 北京博尔西公司 |
| 补体 | 北京博尔西公司 |
| 甲醇 | 北京化工厂 |
| 通用型组织固定液 | 武汉谷歌生物科技有限公司 |
| 动物繁殖饲料 | 北京华阜康生物科技股份有限公司 |
| 低聚半乳糖 | 源叶生物有限公司 |
| 低聚果糖 | 源叶生物有限公司 |
3.2.3动物分组及处理方法
SPF级Balb/c乳鼠，2日龄，不分雌雄和母鼠一同购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养条件为室温22±2摄氏度，相对湿度50±10％，12小时灯照/黑暗循环；离乳前，母鼠自由饮水和采食，新生乳鼠通过灌胃针经口灌胃；离乳后，停止灌胃新生乳鼠，使其自由饮水和采食，饲料采用标准动物繁殖饲料。
2日龄Balb/c乳鼠和其母鼠适应5天后，分成五组，依次为母乳对照组、母乳低聚糖高剂量组(HMO高剂量组)、母乳低聚糖中剂量组(HMO中剂量组)、母乳低聚糖低剂量组(HMO低剂量组)、配方奶粉低聚糖组(GOS/FOS组)，新生乳鼠分组情况、每组只数及灌胃剂量分配如表7所示。从出生后第8天开始对新生乳鼠进行经口灌胃，此时新生乳鼠和母鼠同笼；灌胃时间持续14天，于出生后第22天停止灌胃，并将新生乳鼠和母鼠分开，即新生乳鼠离乳；离乳后，新生乳鼠自由采食、饮水，并于第42天进行断颈处死和解剖，即新生乳鼠性成熟时间为全实验实验终点。
表7新生乳鼠实验分组与处理
| 组别 | 只数(单位：只) | 灌胃物质及剂量 |
| 母乳对照组 | 10 | 蒸馏水 |
| HMO高剂量组 | 10 | 3.75mg/g.BW.day |
| HMO中剂量组 | 10 | 1mg/g.BW.day |
| HMO低剂量组 | 10 | 0.25mg/g.BW.day |
| GOS/FOS组 | 10 | 1mg/g.BW.day |
对新生乳鼠的灌胃物质为母乳低聚糖粗提物，所设剂量基于新生儿每日摄奶量(1L)、新生儿体重(4～6kg)以及初乳、常乳、末乳中母乳低聚糖的浓度(分别为15g/L、4g/L、1g/L)换算而得。GOS/FOS组的浓度参考市售配方奶粉中低聚糖的添加量，GOS/FOS组灌胃成分为低聚半乳糖：低聚果糖(m:m＝9:1)。
3.2.4实验指标测定方法
3.2.4.1脏器样本的制备
乳鼠断颈处死后，经75％酒精浸泡后小心去除腹部皮毛并剪开腹腔，使用高压灭菌后的手术剪及镊子将不同脏器取出，在生理盐水中清洗后用滤纸吸干水，于天平上对脏器的质量进行称量(单位：mg)，称量后将脏器用锡纸包好后放入液氮中，最终转移至－80摄氏度冰箱中保存。
每只新生鼠的脏器指数通过如下方法计算：脏器指数＝脏器重量(mg)/总体重(g)
3.2.4.2血清样本的制备
乳鼠断颈处死前摘取眼球进行取血。将血液样品室温下静置2～4h后于4摄氏度温度下过夜。样本以2000rpm，4摄氏度条件离心10min并收集上清液于离心管中，在-20摄氏度温度下保存。
3.2.4.3腹腔巨噬细胞悬液制备
乳鼠断颈处死后，在超静台中分离腹腔巨噬细胞液。方法如下：浸泡在75％酒精后拎出，小心剪去腹部皮毛，露出腹膜，使用无菌注射器向腹腔注射2mL含有5％胎牛血清的D－Hank液，注射后轻轻揉动腹部进行1分钟刺激，然后用注射器吸出腹腔液体(约2mL)，将淡黄色透明液体置于干净的离心管中，即得巨噬细胞悬液。
3.2.4.4巨噬细胞吞噬能力
采用Giemsa平板染色法进行巨噬细胞吞噬鸡红细胞的活性测定。进行实验前首先将鸡红细胞全血配制成1％(v/v)的细胞液。实验时，将1％鸡红细胞液和所得巨噬细胞悬液进行等体积的混合，吹打均匀后吸取500微升并滴加到单凹面的载玻片中央，使细胞液布满载玻片；将载玻片置于37摄氏度，5％CO2培养箱中孵育20分钟，使巨噬细胞完成对鸡红细胞的吞噬过程并黏附到载玻片上；孵育结束后用滴管吸取生理盐水沿倾斜玻片轻轻滴加，将没有贴壁的巨噬细胞和没有被吞噬的鸡红细胞冲走，晾干后滴加甲醇将细胞进行固定5 分钟；接着将用PBS稀释8倍后的Giemsa染液均匀的滴加到载玻片中央，染色15分钟后用蒸馏水将载玻片清洗干净并晾干；
在显微镜下，用Giemsa染液染色后的鸡红细胞细胞核成紫红色或者蓝紫色，腹腔巨噬细胞的胞浆成粉红色。每张载玻片计数100个巨噬细胞，吞噬率即为每100个巨噬细胞中对鸡红细胞进行吞噬作用的巨噬细胞数所占的百分比例。
3.2.4.5脾淋巴细胞悬液制备
在超净台中取出乳鼠脾脏，将其置于200目金属筛网上，金属筛网放在培养皿中，使用玻璃研磨棒轻轻的将脾脏进行研磨，一边研磨一边滴加2mL RPMI-1640使其通过200目筛网，使用1mL枪将悬浮液吸出置于离心管中，即得到脾脏的单细胞悬液。加入2mL无菌水震荡30s后静置，再加入2mL Hank液并用吸管吸出絮状沉淀物；在1000rpm条件下离心5min，除去上清液后加入1mL RPMI－1640并将沉淀吹打均匀，对细胞进行计数后将细胞浓度调整至2×105个/mL。
3.2.4.6脾淋巴细胞增殖能力测定
取96孔板，每孔加入100微升浓度为2×105个/mL的脾淋巴细胞悬液，以最终浓度为 5微克/毫升的conA进行刺激，对照孔只加入RPMI-1640完全培养基。每个样品设3个对照孔和3个样品孔。96孔板在37摄氏度，5％二氧化碳培养箱中培养68h后每孔加入10微升CCK8溶液，并于4h后使用酶标仪，在490nm波长下进行吸光值的测定。脾淋巴细胞增殖能力采用以下方式计算
增值率＝(ODa－ODc)/(OD－ODc)×100％
ODa：含有细胞悬液、CCK-8及conA孔的吸光值
ODc：仅含CCK-8孔的吸光值
OD：含细胞悬液及CCK-8孔的吸光值
3.2.4.7血清溶血素测定
首先将血清样本用生理盐水稀释100倍；取稀释后血清与200微升6％鸡红细胞混合，再与以1:20稀释的补体200微升在试管内混合；在进行正常实验组测定的同时设置正常对照组、补体对照组、血清对照组和鸡红细胞对照组，于37摄氏度孵育1小时后放入4摄氏度冰箱终止反应。在2000rpm条件下离心10分钟后取200微升上清液加入酶标微孔板，使用酶标仪并在540nm波长处进行OD值测定。
同时，取5％生理盐水与鸡红细胞液的混悬液0.2mL，用生理盐水稀释至2mL后和试验管共同进行孵育及后续步骤，使用酶标仪并在540nm波长处进行鸡红细胞半数溶血OD 值的测定。血清溶血素的计算采用如下公式：
血清溶血素＝样品OD值/鸡红细胞半数溶血OD值×稀释倍数。
3.2.4.8SIgA的测定
稀释好标准品后在96孔板中每孔加入抗体100微升并包被2小时；弃去液体并甩干，每孔加入稀释后的洗涤液300微升，振荡30秒后甩去洗涤液并用吸水纸拍干，重复3次；然后每孔加入封闭液200微升，轻轻晃动混匀并在室温条件下静置30分钟；弃去液体并甩干，每孔加入稀释后的洗涤液300微升，振荡30秒后甩去洗涤液并用吸水纸拍干，重复3 次；每孔加入包被液25微升、标准品50微升及样本25微升，轻轻晃动混匀；接着，每孔加入100微升HRP，轻轻晃动混匀后在室温静置60分钟；弃去液体并甩干，每孔加入稀释后的洗涤液300微升，振荡30秒后甩去洗涤液并用吸水纸拍干，重复3次；最后，每孔加入显色液100微升，轻轻摇动晃匀并显色15分钟；每孔加入终止液100微升来终止反应，此刻蓝色变为黄色；在加入终止液后15分钟内，将96孔板以空白孔调零，在450nm 波长处测定每孔的吸光值。
3.2.4.9免疫球蛋白及细胞因子的测定
采用ELISA试剂盒检测乳鼠血清中IgA、IgE、IgG、IgM这四类免疫球蛋白的含量。采用ELISA试剂盒检测乳鼠血清中IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α、IFN-γ这五类细胞因子的含量。
3.2.5数据统计及分析
结果均以均值±标准差表示，用SPSS21.0软件进行数据分析。以单因素方差分析法比较组之间的差异，随后进行Duncan检验，用P<0.05时是为存在显著性差异；图或表中以a、b、c等不同字母表示组之间的显著性差异(P<0.05)。
4.母乳低聚糖对于新生乳鼠肠道菌群的影响
4.1引言
为了研究母乳低聚糖对新生机体肠道菌群的影响，我们选择通过动物实验来探究其摄入后对于盲肠内容物中菌群的影响。采用健康的新生Balb/c乳鼠为模型，通过为期2周的灌胃，探讨母乳低聚糖对于新生乳鼠肠道菌群的影响，检测指标包括新生乳鼠不同时间点肠道菌群的α多样性及各菌群的相对丰度。
4.2实验材料和方法
4.2.1实验仪器与设备
对新生乳鼠肠道菌群测定中所用实验仪器如表8所示。
表8肠道菌群检测所用仪器
4.2.2实验材料与试剂配置
磷酸盐缓冲液(PBS)：称取8.0g的NaCl，2.9g Na2HPO4·12H2O，0.2g KCl和0.2gKH2PO4至800mL去离子水中充分搅拌，使用浓盐酸调节溶液pH至7.4并定容到1L。
Tris-EDTA:用1mol/L HCl将10mmol Tris的pH调至8.0，加入1mmol EDTA，用超纯水定容到1L后灭菌，条件为121℃，15min。
10％Tris-SDS：称取6.06g的Tris，吸取2.1ml浓盐酸于烧杯中，加入40mL水和40mL0.5M EDTA，调节pH值至9.0，定容至250mL后加入50ml 10％SDS，混匀即可。
氯仿/异戊醇(24:1，V/V)：将96mL氯仿和4mL异戊醇混合均匀后置于棕色瓶中待用。
3M乙酸钠：将40.8g的乙酸钠加入至20mL水中，采用冰醋酸调整其pH值至5.2，在100mL容量瓶进行定容并进行灭菌，条件为121℃，15min。
4.2.3动物分组及实验方法
SPF级Balb/c乳鼠，2日龄，不分雌雄和母鼠一同购于北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养条件为室温22±2摄氏度，相对湿度50±10％，12小时灯照/黑暗循环；离乳前，母鼠自由饮水和采食，新生乳鼠通过灌胃针经口灌胃；离乳后，停止灌胃新生乳鼠，使其自由饮水和采食，饲料采用标准动物繁殖饲料。
2日龄Balb/c乳鼠和其母鼠适应5天后，分成五组，依次为母乳对照组、母乳低聚糖高剂量组(HMO高剂量组)、母乳低聚糖中剂量组(HMO中剂量组)、母乳低聚糖低剂量组(HMO低剂量组)、配方奶粉低聚糖组(GOS/FOS组)，新生乳鼠分组情况、每组只数及灌胃剂量分配如表9所示。从出生后第8天开始对新生乳鼠进行经口灌胃，此时新生乳鼠和母鼠同笼；灌胃时间持续14天，于出生后第22天停止灌胃，并将新生乳鼠和母鼠分开，即新生乳鼠离乳；离乳后，新生乳鼠自由采食、饮水，并于第42天进行断颈处死和解剖，即新生乳鼠性成熟时间为全实验实验终点。
表9新生乳鼠实验分组与处理
| 组别 | 只数(单位：只) | 灌胃物质及剂量 |
| 母乳对照组 | 10 | 蒸馏水 |
| HMO高剂量组 | 10 | 3.75mg/g.BW.day |
| HMO中剂量组 | 10 | 1mg/g.BW.day |
| HMO低剂量组 | 10 | 0.25mg/g.BW.day |
| GOS/FOS组 | 10 | 1mg/g.BW.day |
对新生乳鼠的灌胃物质为母乳低聚糖粗提物，所设剂量基于新生儿每日摄奶量(1L)、新生儿体重(4～6kg)以及初乳、常乳、末乳中母乳低聚糖的浓度(分别为15g/L、4g/L、1g/L)换算而得。GOS/FOS组的浓度参考市售配方奶粉中低聚糖的添加量，GOS/FOS组灌胃成分为低聚半乳糖：低聚果糖(m:m＝9:1)。
4.2.4实验指标测定方法
4.2.4.1微生物DNA提取
将乳鼠断颈处死，剪开腹腔进行解剖，剪下乳鼠盲肠，使用盖玻片将盲肠内容物刮入到含RNA Later的离心管中，4摄氏度储存，进行实验前使用PBS将盲肠内容物进行清洗，离心条件为15000rpm，4摄氏度，15min，离心后弃去上清液，如此反复3次，并将最后一次清洗后样品振荡至匀浆状。
在管中加入0.3g玻璃珠，300μL Tris-SDS和500μL TE饱和酚并震荡后，在均质机中均质30s后离心，条件为15000rpm，4℃，5min；将上层悬浊液转移到新离心管中，并加入200μL Tris饱和酚和200μL氯仿/异戊醇，混匀后进行离心，条件为15000rpm，4℃，5min；将上层悬浊液转移到新的离心管中，并加入25μL 3M乙酸钠和300μL异丙醇，上下颠倒混匀后进行离心；离心后弃去上清液，并加入500μL 70％乙醇，上下颠倒混匀后进行离心，离心后弃去上清液，敞口于室温干燥15min；加入100μL TE缓冲液，5μL RNA酶，上下颠倒混匀后放于37℃恒温箱培养10min。DNA提取完毕后，配置浓度为1％琼脂糖凝胶，在120V电压下，电泳20min检验提取效果。若效果良好，则将样品保存在-20℃待用。
4.2.4.2高通量测序
高通量测序选择细菌的16S rRNA基因的V3-V4可变区序列，扩增片段长度大小在400-450bp之间，由北京美吉桑格生物医药科技有限公司通过IlluminaMiSeq测序平台完成测序。
4.2.4.3高通量上机测序流程
以提取并稀释后的基因组DNA为模板，在每个样本加上长度为8bp带有Barcode的标签序列。特异引物338F(5’–ACTCCTACGGGAGGCAGCAG–3’)和806R (5’–GGACTACNNGGGTATCTAAT–3’)，使用TransGe公司的TransStart Fastpfu DNA Polymerase和Fastpfu Buffer进行PCR，扩增16S rRNA的V3-V4区，确保扩增效率和准确性。扩增容量为20μL，包括4μL 5*Fastpfu Buffer和2μL 2.5mM dNTPs，引物(5μM) 各0.8μL，以及0.4μLFastpfu Polymerase和10ng模板DNA。每个样品做三次重复实验进行扩增。
扩增实验中PCR扩增条件为：95℃预变性3min，然后在95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，在该实验条件下进行27个循环，最后72℃延伸10min。扩增完毕后，使用2％浓度的琼脂糖凝胶进行效果的检测。在90-100V的电泳实验条件下核实扩增片段大小是否正确。
从2％琼脂糖凝胶中回收扩增子，依照AxyPrep DNAGel Extraction Kit说明书(Axygen Biosciences，Union City，CA，U.S.)进行纯化，再使用QuantiFluorTM－ST(Promega， U.S)进行定量。构建好的文库经过定量和文库检测，合格后，根据IlluminaMiseq测序平台数据进行双端(2*300bp)测序。
4.2.4.4高通量测序数据的处理
高通量测序数据庞大，需要对测序所得数据进行质控和分析，具体步骤如下：
(1)过滤数据：以50bp为标准，过滤序列尾部质量值20以下的碱基；如果窗口内所包含的平均质量值低于20，就从窗口开始截去后端碱基，并过滤质控后长度小于50bp的序列。同时，根据序列之间的重叠关系，根据最小重叠长度为10bp且允许的最大错配比率为0.2的前提，将成对的序列拼接成一条序列。
(2)数据分析：使用Usearch平台按照97％相似性对非重复序列(不含单序列)
进行可操作分类单元OTU(Operational Taxonomic Units)聚类分析；聚类过程中去除嵌合体，可得OTU的代表序列；通过使用silva(SSU115)16S核糖体RNA数据库进行分类学比对，算法为RDP Classifier，置信区间为70％，从而得到在各种分类水平上群落结构及组成的统计分析。
4.2.5数据统计及分析
数据分析平台为i-Sanger平台，本实验中通过多样性指数得到群落中物种丰富度和多样性的信息，再通过T检验来评估不同分组间多样性指数是否有显著性差异；利用R语言工具对群落分布进行作图。
实施例及实验结果与分析
实施例1肠段长度的变化
在整个实验过程中，新生乳鼠6周时肠段长度及肠段长度比如表10所示，其中小肠绝对长度和大肠绝对长度的单位为厘米(cm)。
表10不同灌胃处理组肠段长度的变化
由表10可知，灌胃母乳低聚糖后，乳鼠在大肠绝对长度、大肠长度比和小肠长度比三个指标上与对照组相比不存在显著性差异(P＞0.05)；在小肠绝对长度上出现了一定程度的下降，与对照组相比，灌胃高剂量组的乳鼠下降显著(P<0.05)，小肠绝对长度值为36.6±3.00cm；与配方粉组相比，灌胃高低剂量组的乳鼠下降显著(P<0.05)，小肠绝对长度值分别为36.6±3.00cm和38.5±1.92cm。
实施例2不同肠段绒毛高度的变化
肠绒毛是小肠组织结构中重要的组成部分，绒毛增大了肠黏膜的表面积，便于营养物质的吸收。通常，绒毛高度增加，代表着肠黏膜吸收面积增大，故绒毛高度一定程度上可用于评价肠道对于营养物质吸收能力的高低。在新生机体中，由于肠道发育的不成熟，将会影响机体生长和免疫等多方面的状态。有文献对不同月龄的大鼠进行了测定，得出肠道的结构变化是肠道功能发生改变的基础。
在本实验中，将新生乳鼠小肠分为十二指肠、空肠和回肠三段，并对其绒毛高度进行测量和评价。
由图3可知，在第21天，乳鼠在十二指肠绒毛高度上出现了一定程度的增加，与对照组相比，灌胃高中剂量的乳鼠增加显著(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃高中剂量的乳鼠增加显著(P<0.05)，十二指肠绒毛高度值分别为383.19±8.76cm和382.95±4.31cm；在第28天，与对照组相比，离乳后中低剂量的乳鼠增加显著(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后中低剂量的乳鼠增加显著(P<0.05)，十二指肠绒毛高度值分别为481.90±11.16cm和478.66±7.66cm；在第42天，与对照组相比，中低剂量组乳鼠的十二指肠绒毛高度没有显著的增加(P＞0.05)，高剂量组的乳鼠出现显著性降低(P<0.05)，十二指肠绒毛高度值为471.81±11.58cm，与配方粉组相比，母乳低聚糖灌胃的三个剂量组乳鼠在十二指肠绒毛高度上有显著的增加(P<0.05)。
实验表明，中剂量母乳低聚糖能显著促进十二指肠绒毛高度的增长(P<0.05)。
由图4可知，空肠绒毛高度随时间的增加而增加，但母乳低聚糖对空肠绒毛高度没有显著性影响(P＞0.05)。
由图5可知，回肠绒毛高度随着时间的增加而逐渐增加，但母乳低聚糖对回肠绒毛高度没有显著性影响(P＞0.05)。
实施例3不同肠段隐窝深度的变化
隐窝是肠细胞分裂的场所，隐窝中的肠细胞向上移动来替代绒毛顶部脱落的肠细胞。隐窝深度增加，肠绒毛中成熟的细胞数量会减少，故可以进行营养物质消化吸收的面积较少，造成吸收能力的降低。小肠的隐窝深度能反映肠细胞生成的速率以及成熟细胞的多少，和肠道的吸收功能密切相关；新生儿处于肠道发育不成熟的阶段，隐窝的深度一定程度上代表了新生儿肠道成熟的程度。母乳低聚糖能够显著的降低肠道隐窝中细胞的增殖，促进肠道细胞的成熟，这可以一定程度上增加肠道的屏障功能。
在本实验中，将小肠分为十二指肠、空肠和回肠三段，并分别对其隐窝深度进行测量和评价。
由图6可知，在第21天，乳鼠在十二指肠隐窝深度上出现了一定程度的增加，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组没有显著地降低(P＞0.05)，与配方粉组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组存在显著的降低(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组出现了一定程度的变化，离乳后高剂量组的乳鼠十二指肠隐窝深度显著降低(P<005)，与配方粉组相比，离乳后的高中剂量组乳鼠十二指肠隐窝深度显著降低(P<0.05)；在第42天，与对照组相比，中低剂量组的乳鼠十二指肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，高剂量组乳鼠十二指肠隐窝深度显著增加(P<0.05)，为162.60±5.84μm。
实验表明，高剂量母乳低聚糖可显著减缓离乳后十二指肠隐窝深度的增加(P<0.05)。
由图7可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的乳鼠在空肠隐窝深度上出现一定程度的增加，和对照组相比，高中剂量组的乳鼠空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，高中剂量组的乳鼠空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，空肠隐窝深度分别为59.46±5.05μm 和58.48±2.40μm；在第28天，与对照组相比，离乳后母乳低聚糖中剂量乳鼠空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后母乳低聚糖中剂量乳鼠空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，隐窝深度值为64.44±1.75cm；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖中剂量乳鼠空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，母乳低聚糖中剂量乳鼠空肠隐窝深度显著降低(P<0.05)，隐窝深度值为75.61±2.02cm。
实验表明，中剂量母乳低聚糖可显著减缓空肠隐窝深度的增加(P<0.05)。
由图8可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖三个剂量组的乳鼠回肠隐窝深度有一定程度的增加，与对照组相比，灌胃高中低三个剂量组乳鼠的回肠隐窝深度有显著增加(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃高中低三个剂量组乳鼠的回肠隐窝深度没有显著增加(P＞0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后高剂量组乳鼠的回肠隐窝深度有显著增加(P<0.05)，深度值为86.13±4.26μm，与配方粉组相比，离乳后中剂量组乳鼠的回肠隐窝深度显著降低 (P<0.05)，深度值为76.05±3.87μm；在第42天，与对照组相比，中低剂量组的乳鼠回肠隐窝深度存在显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，中低剂量组的乳鼠回肠隐窝深度存在显著降低(P<0.05)，深度值分别为86.84±3.92μm和87.17±6.46μm。
实验表明，中剂量母乳低聚糖可显著减缓离乳后回肠隐窝深度的增加(P<0.05)。
实施例4不同肠段V/C比值的变化
小肠绒毛高度(V)和隐窝深度(C)作为小肠形态学评价的重要指标，在一定程度上决定了小肠黏膜吸收营养物质的面积以及小肠内成熟肠细胞的多少，这两者构成了小肠的结构基础，也是决定小肠能否发挥正常消化和吸收功能的重要影响因素。绒毛高度的增加意味着肠黏膜表面积的增加，隐窝深度的降低意味着吸收细胞和分泌细胞的增多。有文献表明，V/C比值的增加，表明肠道消化能力增强，肠细胞生长较快；比值降低，表明肠黏膜受损或小肠绒毛刷状缘乳糖酶活性降低。
在本实验中，通过不同肠段V/C比值来对新生乳鼠肠道形态发育进行评价。
由图9可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的乳鼠，其十二指肠V/C值存在一定程度的下降，与对照组相比，灌胃低剂量母乳低聚糖的乳鼠十二指肠V/C值显著降低(P<0.05)，值为3.94±0.18，与配方粉组相比，高中剂量组的乳鼠十二指肠V/C值显著升高(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后中剂量乳鼠十二指肠V/C值显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后中剂量乳鼠十二指肠V/C值显著升高(P<0.05)，V/C值为4.48±0.15；在第42天，与对照组相比，中低剂量组乳鼠十二指肠V/C值显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，中低剂量组乳鼠十二指肠V/C值显著升高(P<0.05)，V/C值分别为3.27±0.16 和3.20±0.16。
实验表明，中剂量母乳低聚糖可显著提高十二指肠V/C值(P<0.05)，从而一定程度上促进新生机体发挥正常的肠道吸收功能。
由图10可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠在空肠V/C值上有一定程度的降低，与对照组相比，灌胃中剂量的乳鼠空肠V/C值显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，高中剂量租的乳鼠空肠V/C值显著升高(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后中剂量组的乳鼠空肠V/C值显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后中剂量组的乳鼠空肠V/C值显著升高(P<0.05)，V/C值为4.80±0.22；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖中剂量组的乳鼠空肠V/C值显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，母乳低聚糖中剂量组的乳鼠空肠V/C值显著升高(P<0.05)，V/C值为4.34±0.23。
实验表明，中剂量母乳低聚糖可显著提高空肠V/C值(P<0.05)，从而一定程度上促进新生机体发挥正常的肠道吸收功能。
由图11可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖三个剂量组的乳鼠在回肠V/C值上存在一定程度的降低，与对照组相比，灌胃高低剂量组的乳鼠回肠V/C值显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃中剂量组的乳鼠回肠V/C值显著升高(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后高剂量组的乳鼠回肠V/C值显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后中低剂量组的乳鼠回肠V/C值显著升高(P<0.05)；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖中低剂量组的乳鼠回肠V/C值显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，母乳低聚糖中低剂量组的乳鼠回肠V/C值显著升高(P<0.05)，V/C值分别为2.63±0.063和2.62±0.171。
实验表明，中剂量母乳低聚糖可显著提高离乳后回肠V/C值(P<0.05)，从而一定程度上促进新生机体发挥正常的肠道吸收功能。
实施例5体重的变化
整个实验中，动物饲养时间最大终点为42天，即为Balb/c乳鼠性成熟时间点；分别取灌胃干预开始时间(第8天)、离乳(第21天)及其后一周(第28天)、实验终点(第42 天)作为时间点进行乳鼠的断颈处死及体重的测定。全实验过程中乳鼠的体重变化如表11 所示。
由表11可知，在给予乳鼠母乳低聚糖和市售配方粉中低聚糖的灌胃后，各实验组的乳鼠体重和对照组相比，无显著性差异(P＞0.05)。
表11不同灌胃处理组体重的变化(单位：克)
实施例6脏器指数的变化
新生儿出生后，机体的各个器官都在不断的生长和发育，器官重量的变化在一定程度上可以反映新生机体的生长发育情况。脑的重量可以表征神经组织的变化；肝脏和肾脏作为最重要的机体代谢器官，脏器指数的变化可以反映机体代谢的能力；胸腺和脾脏作为重要的免疫器官，脏器指数的变化与机体体液免疫和细胞免疫的能力密切相关。胸腺作为重要的中枢免疫器官，是T细胞分化及成熟的场所，对于机体自身免疫耐受有着重要的作用；脾脏作为机体最大的免疫器官，对机体细胞免疫和体液免疫都有着重要的联系。
在整个实验中，我们对新生乳鼠的脏器指数进行不同时间点的监测，其数值高低在一定程度上可以反应出新生机体的器官发育程度，脏器指数值越大，表明新生机体相应的脏器功能发育的越好。选取实验灌胃干预开始时间(第8天)、离乳(第21天)及其后一周(第 28天)、实验终点(第42天)作为时间点进行乳鼠的断颈处死，并进行器官指数的测定，不同时间点脏器指数测定结果如图12、13及14。
如图12所示，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在脏器指数上出现了不同程度的改变，与对照组相比，灌胃三个母乳低聚糖剂量的乳鼠在肾脏指数、心脏指数、胸腺指数上没有显著性差异(P＞0.05)，三个剂量组的乳鼠肝脏指数和脾脏指数显著降低(P<0.05)，中剂量的乳鼠脑指数显著增加(P<0.05)，和配方粉组相比，灌胃高中母乳低聚糖剂量的乳鼠肾脏指数显著降低(P<0.05)，低剂量乳鼠在肝脏指数上显著降低(P<0.05)，在心脏指数和胸腺指数上没有显著性差异(P＞0.05)，高剂量组乳鼠在脑指数上显著降低(P<0.05)，高中剂量组乳鼠在脾脏指数上显著升高(P<0.05)；
如图13所示，在第28天，与对照组相比，离乳后三个母乳低聚糖剂量的乳鼠在肾脏指数、肝脏指数、心脏指数、脑指数和脾脏指数上显著降低(P<0.05)，中低剂量组的乳鼠在胸腺指数上显著降低(P<0.05)，与配方粉相比，离乳后三个母乳低聚糖剂量的乳鼠在肾脏指数、肝脏指数、心脏指数、胸腺指数和脾脏指数上没有显著性差异(P＞0.05)，高剂量组乳鼠在脑指数上显著升高(P<0.05)；
如图14所示，在第42天，与对照组相比，三个母乳低聚糖剂量的乳鼠在肾脏指数、心脏指数、胸腺指数脑指数和脾脏指数上没有显著性差异(P＞0.05)，中剂量组乳鼠在肝脏指数上显著增加(P<0.05)，与配方粉组相比，三个母乳低聚糖剂量的乳鼠在肾脏指数和胸腺指数上没有显著性差异(P＞0.05)，高低剂量组乳鼠在肝脏指数上显著降低(P<0.05)，高剂量组乳鼠在心脏指数上显著降低(P<0.05)，三个母乳低聚糖剂量的乳鼠在脑指数上显著增高(P<0.05)。
实施例7巨噬细胞吞噬能力的变化
巨噬细胞是机体免疫系统中重要的免疫细胞，既具有较强的吞噬功能，也是主要的抗原呈递细胞，在机体的非特异性和特异性免疫中发挥着至关重要的作用。新生儿单核细胞发育已经成熟，但由于辅助因子的缺乏，吞噬能力和抗原呈递能力均较差。
在本实验中，通过乳鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率，来对巨噬细胞的吞噬能力进行测定和评价。有关不同时间点新生乳鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的变化如图15所示。
由图15可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在巨噬细胞吞噬率上出现了一定程度的变化，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠巨噬细胞吞噬率没有显著升高(P＞0.05)，与配方粉组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠巨噬细胞吞噬率没有显著性差异(P＞0.05)；在第28天，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠巨噬细胞吞噬率显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠巨噬细胞吞噬率显著升高(P<0.05)，吞噬率分别为25.4±1.140％、26.67±2.066％和 25.5±1.643％；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠巨噬细胞吞噬率没有显著性差异(P＞0.05)，与配方粉组相比，母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠巨噬细胞吞噬率没有显著性差异(P＞0.05)。
实验表明，母乳低聚糖可显著提高吞噬细胞的吞噬能力(P<0.05)，但此促进作用只在离乳前后的较短时间内存在。
实施例8脾淋巴细胞增殖能力的变化
脾脏对于T细胞的细胞免疫调节有重要的作用，T细胞作为特异性免疫中细胞免疫的重要组成成分，在外来抗原侵入机体时，会通过自身的增殖分化来做出响应。本实验中，在对脾脏淋巴细胞增殖进行测定的时候，脾脏淋巴细胞会在在刀豆蛋白A(即conA)这种非特异性有丝分裂原的刺激下进行增殖，以在490nm波长下的吸光值来表示各实验处理组脾脏淋巴细胞含量的高低，计算所得增殖率越高代表着T细胞的活性越高，机体的免疫力越强，可用于评价机体的免疫状态。
在本实验中，有关不同时间点新生乳鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的变化如图16所示。
由图16可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上出现了不同程度的增加，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上显著增强(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上没有显著变化(P＞0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上显著增强(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上显著增强 (P<0.05)；在第42天，与对照组相比，高低剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上显著增强(P<0.05)，与配方粉组相比，低剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上显著增强 (P<0.05)，高剂量组乳鼠在脾脏淋巴细胞增殖能力上显著降低(P<0.05)。
实验表明，低剂量母乳低聚糖可显著促进离乳后脾脏淋巴细胞的增殖能力(P<0.05)。
实施例9血清溶血素的变化
血清溶血素可作为评价机体体液免疫功能高低的一项指标。在进行血清溶血素测定时，将绵羊红细胞作为一种抗原刺激B细胞增殖并分化为浆细胞，浆细胞成熟后会分泌与其相对应的抗体，即溶血素，并释放到体液中；在含有溶血素的血清中再次加入绵羊红细胞，由于补体的存在，绵羊红细胞溶血并释放血红蛋白，产生溶血现象，在540nm波长下对溶血溶血过程中血红蛋白释放量进行测定，可用来表示血清溶血素的含量。血清溶血素含量的增加可以直接作为机体免疫功能增强的表现。
在本实验中，有关不同时间点新生乳鼠血清溶血素的含量变化如图17所示。
由图17可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在血清溶血素含量上出现了不同程度的增加，与对照组相比，灌胃高中剂量组的乳鼠血清溶血素含量显著下降(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃高剂量组的乳鼠血清溶血素含量显著下降(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后三个剂量组的乳鼠血清溶血素含量没有显著增加(P＞ 0.05)，与配方粉组相比，离乳后三个剂量组的乳鼠血清溶血素含量没有显著增加(P＞0.05)；在第42天，与对照组相比，三个剂量组的乳鼠血清溶血素含量没有显著增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，三个剂量组的乳鼠血清溶血素含量没有显著增加(P＞0.05)。
实验表明，母乳低聚糖对血清溶血素的含量无显著影响(P＞0.05)。
实施例10肠组织分泌SIgA的变化
SIgA是黏膜免疫中最主要的抗体，是机体内含量较高的免疫球蛋白，主要以二聚体的形式存在于机体唾液、乳汁和呼吸道等外分泌液中。SIgA可以保护肠道黏膜免受肠道病原微生物以及有关毒素的侵袭。同时，SIgA能够影响肠道菌群的组成，起到促进肠上皮细胞对抗原的呈递作用从而影响肠道相关淋巴组织(GALT)中的未成熟树突状细胞。新生机体在出生后体内SIgA合成及分泌量较少，主要来源于母乳，也是母体赋予新生机体被动免疫的重要部分。SIgA分泌量高低的变化可以在一定程度上表征机体肠道黏膜免疫的功能强弱。在本实验中，通过测定不同时间点乳鼠小肠组织中SIgA的含量来对新生乳鼠机体的黏膜免疫情况进行评价。
在本实验中，有关不同时间点新生乳鼠肠组织中SIgA的含量变化如图18所示。
由图18可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的乳鼠在肠组织SIgA的分泌量上出现了一定程度的增加，与对照组相比，灌胃三个剂量组的乳鼠肠组织SIgA的分泌量没有显著性的增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，灌胃三个剂量组的乳鼠肠组织SIgA的分泌量没有显著性的增加(P＞0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后三个剂量组的乳鼠肠组织SIgA 的分泌量没有显著性的增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，离乳后低剂量组乳鼠肠组织SIgA 的分泌量有显著的减少(P<0.05)，含量为0.087±0.033μg/mg；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖中剂量组的乳鼠肠组织SIgA的分泌量有显著的增加(P<0.05)，含量为 0.124±0.038μg/mg，与配方粉组相比，母乳低聚糖高低剂量组的乳鼠肠组织SIgA的分泌量有显著的下降(P<0.05)，含量分别为0.099±0.039μg/mg和0.104±0.041μg/mg。
实验表明，高中剂量组母乳低聚糖可显著促进SIgA的分泌(P<0.05)，且在第21天离乳时能减缓SIgA分泌量的下降。
实施例11免疫球蛋白含量的变化
免疫球蛋白是免疫活性分子中的重要成员，也是免疫系统的重要组成部分。主要分为五类，即IgA、IgD、IgE、IgG、IgM；免疫球蛋白含量的高低在一定程度上可以表征机体免疫功能的强弱，由于IgD主要与感染和变态反应性疾病有关，在本实验中，将检测集中在另外四中免疫球蛋白，来对新生机体的免疫水平进行评价。
在本实验中，有关不同时间点新生乳鼠血清中四种免疫球蛋白含量的变化如图19、20、21、22所示。
作为血清中免疫球蛋白的重要成分，IgG是唯一可以通过胎盘的抗体，对新生机体出生后抵抗外界感染有着很大作用。IgG含量升高代表着新生机体对外界病原体免疫抵抗力越强。由图19可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠在血清IgG含量上出现了不同程度的增加，与对照组相比，灌胃三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清IgG含量有显著增加(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃中剂量组的乳鼠在血清IgG含量有显著降低 (P<0.05)，为2.63±0.14g/L；在第28天，与对照组相比，离乳后三个剂量的母乳低聚糖乳鼠在血清IgG含量没有有显著增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，离乳后三个剂量的母乳低聚糖乳鼠在血清IgG含量没有有显著增加(P＞0.05)；在第42天，与对照组相比，高剂量母乳低聚糖租的乳鼠血清IgG含量有显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，高剂量母乳低聚糖租的乳鼠血清IgG含量有显著降低(P<0.05)，为2.85±0.25g/L。
实验表明，母乳低聚糖可显著增加血清IgG的含量(P<0.05)，促进离乳前新生机体除母体来源外自身IgG的分泌。
IgA作为一种免疫球蛋白，在成熟机体血清中的含量仅次于IgG，主要存在于各种分泌液中。由图20可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠在血清IgA含量上出现了不同程度的变化，与对照组相比，灌胃三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清IgA含量没有显著增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，灌胃高剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgA含量有显著增加(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清IgA 含量没有显著增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，离乳后三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清 IgA含量有显著增加(P<0.05)；在第42天，与对照组相比，高中剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgA含量有显著增加(P<0.05)，与配方粉组相比，高中剂量母乳低聚糖的乳鼠血清 IgA含量有显著增加(P<0.05)，含量分别为1.66±0.023g/L和1.63±0.105g/L。
实验表明，高中剂量母乳低聚糖可显著增加血清IgA的含量(P<0.05)。
IgM是分子量较大的免疫球蛋白中，也是个体发育过程中最早产生的抗体。在中和病毒、溶解细菌和血细胞的时候，其作用效果远高于IgG。由图21可知，在第21天，与对照组相比，灌胃三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清IgM含量没有显著增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，灌胃三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清IgM含量没有显著增加(P＞0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后低剂量组乳鼠血清IgM含量有显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后低剂量组乳鼠血清IgM含量有显著降低(P<0.05)，含量为 0.32±0.009g/L；在第42天，与对照组相比，灌胃三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清IgM含量没有显著增加(P＞0.05)，与配方粉组相比，灌胃三个剂量的母乳低聚糖乳鼠血清IgM含量没有显著增加(P＞0.05)。
实验表明，母乳低聚糖对新生乳鼠血清IgM的含量无显著影响(P＞0.05)。
IgE主要与机体过敏性反应有关。由图22可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在血清IgE含量上出现了一定程度的升高，与对照组相比，灌胃高中剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgE含量显著下降(P<0.05)，灌胃低剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgE含量显著上升(P<0.05)，含量为13.59±0.38g/L，与配方粉组相比，灌胃三个剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgE含量显著上升(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后低剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgE含量显著上升(P<0.05)，含量为11.65±0.51g/L，与配方粉组相比，离乳后中低剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgE含量显著上升(P<0.05)；在第42天，与对照组相比，灌胃高剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgE含量显著下降(P<0.05)，含量为 7.94±0.45g/L，与配方粉组相比，灌胃中低剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IgE含量显著上升 (P<0.05)。
实验表明，母乳低聚糖可显著提高血清IgE的含量(P<0.05)，且和剂量呈现负相关。
实施例12Th1细胞因子
Th1细胞是由Th0细胞在以IL-12为主的细胞因子刺激下分化而成的免疫细胞，主要特征性分泌IL-2、TNF-α、IFN-γ三大细胞因子，Th1细胞参与T细胞的增殖、介导细胞免疫应答并参与调节细胞免疫。Th1型细胞因子表达的升高在一定程度上可诱导机体产生细胞性免疫应答，对机体产生保护作用，但在机体Th1型细胞因子表达的过量可能导致自身免疫病的产生。在本实验中，通过测定不同时间点乳鼠血清中Th1细胞所分泌的细胞因子含量来评价其免疫能力高低。
在本实验中，有关不同时间点新生乳鼠血清中Th1型细胞因子(即IL-2、TNF-α、IFN-γ) 的含量变化如图23、24、25所示。
由图23可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在血清IL-2含量上出现了一定程度的升高，与对照组相比，灌胃高剂量组的乳鼠在血清IL-2含量上显著降低 (P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃高剂量组的乳鼠在血清IL-2含量上显著降低(P<0.05)，含量为9.41±0.81pg/mL；在第28天，与对照组相比，离乳后中低灌胃高剂量组的乳鼠在血清IL-2含量上显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后三个剂量组的乳鼠在血清IL-2 含量上显著升高(P<0.05)；在第42天，与对照组相比，三个剂量组的乳鼠在血清IL-2含量上显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，中低剂量组的乳鼠在血清IL-2含量上显著升高(P<0.05)。
实验表明，母乳低聚糖能显著降低离乳后较长时间血清中IL-2含量(P<0.05)。
由图24可知，在第21天，灌胃三个剂量母乳低聚糖的乳鼠在血清TNF-α含量上出现一定程度的升高，与对照组相比，灌胃低剂量组乳鼠血清TNF-α含量显著升高(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃三个剂量母乳低聚糖的乳鼠血清TNF-α含量显著升高(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后中剂量组乳鼠血清TNF-α含量显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，离乳后低剂量组乳鼠血清TNF-α含量显著升高(P<0.05)，为 63.95±0.69pg/mL；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖三个剂量组的乳鼠血清TNF-α含量显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，母乳低聚糖三个剂量组的乳鼠血清TNF-α含量没有显著变化(P＞0.05)。
实验表明，母乳低聚糖能可显著降低离乳后血清TNF-α含量(P<0.05)。
由图25可知，在第21天，灌胃三个剂量母乳低聚糖的乳鼠在血清IFN-γ含量上出现一定程度的增加，与对照组相比，灌胃三个剂量母乳低聚糖的乳鼠血清中IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃三个剂量母乳低聚糖的乳鼠血清中IFN-γ含量显著升高(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后三个剂量母乳低聚糖的乳鼠血清中IFN-γ含量没有显著变化(P＞0.05)，与配方粉组相比，离乳后三个剂量母乳低聚糖的乳鼠血清中IFN-γ含量显著降低(P<0.05)；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖三个剂量组的乳鼠血清中IFN-γ含量显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，高低剂量组乳鼠血清中IFN-γ含量显著升高(P<0.05)。
实验表明，除离乳期外，母乳低聚糖能显著降低血清中IFN-γ含量(P<0.05)。
实施例13Th2细胞因子
Th2细胞主要进行的免疫反应为对抗细胞外病原体，特异性分泌的细胞因子为IL-4、 IL-6、IL-10。Th2细胞会参与机体B细胞的增殖及分化，以及参与到机体的体液免疫应答中。在刚出生的新生儿体内，Th细胞存在向Th2细胞分化的偏向，以防止母子免疫排斥反应，离乳后Th2细胞因子分泌的降低可以有助于机体免疫平衡的建立。在本实验中，通过测定不同时间点乳鼠血清中Th2细胞所分泌的细胞因子含量来评价其免疫能力高低。
在本实验中，有关不同时间点新生乳鼠血清中Th2型细胞因子(即IL-4、IL-10)的含量变化如图26、27所示。
由图26可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在血清IL-4含量上出现了一定程度的增加，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-4含量显著增加(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-4含量没有显著差异(P＞0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-4含量没有显著差异(P＞0.05)，与配方粉组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-4含量没有显著差异(P＞0.05)；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-4含量没有显著差异(P＞0.05)，与配方粉组相比，母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-4含量没有显著差异(P＞0.05)。
实验表明，在离乳前，因缺乏外界物质刺激，对照组在离乳前血清IL-4含量一直呈下降趋势，母乳低聚糖能显著促进离乳前IL-4的分泌(P<0.05)，但促进作用仅为短期功效，离乳后没有任何促进作用。
由图27可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在血清IL-10含量上出现了一定程度的变化，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-10含量显著增加(P<0.05)，与配方粉组相比，灌胃高剂量母乳低聚糖的乳鼠血清IL-10含量显著增加(P<0.05)；在第28天，与对照组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-10 含量没有显著差异(P＞0.05)，与配方粉组相比，离乳后母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-10含量没有显著差异(P＞0.05)；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠血清IL-10含量显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，高低剂量组乳鼠血清IL-10 含量显著增加(P<0.05)。
实验表明，母乳低聚糖可显著促进离乳前机体IL-10的分泌(P<0.05)。
实施例14Th1/Th2免疫平衡
每个机体体内都存在着Th1和Th2的动态平衡，这样才能保证健康的生理功能及免疫响应。在新生儿刚出生时，Th2占优势，便于母体对胎儿的识别以及妊娠的维持。
IFN-γ被称为促炎细胞因子，主要由Th1细胞和NK细胞产生，可以增强抗原递呈细胞与T细胞的作用，进而增强T细胞辅助抗体产生和辅助细胞毒T细胞产生的能力。IFN-γ具有清除细胞内细菌和病毒的作用，可调节细胞免疫功能，对IL-4、IL-10等Th2细胞产生的细胞因子和Th2细胞的增殖具有抑制作用。
IL-4也被称为抗炎细胞因子，主要由Th2细胞产生并作用于B细胞，可增强IgE介导的体液免疫。作为Th2特征性细胞因子，对IFN-γ等Th1细胞产生细胞因子的能力具有抑制作用，同时，也具有中和细胞外病原体和调节体液免疫的功能。
随着新生儿出生后逐渐暴露在外部坏境中，对各种抗原等存在着不同的免疫响应来维持健康的稳态。一般地，采用IFN-γ/IL-4的比值来衡量机体内Th1和Th2的免疫平衡。
在本实验中，有关不同时间点新生乳鼠血清中IFN-γ/IL-4的比值变化如图28所示。
由图28可知，在第21天，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠在Th1/Th2比值上出现了一定程度的增加，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠Th1/Th2比值显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，中剂量组乳鼠Th1/Th2比值显著升高(P<0.05)；在第 28天，与对照组相比，离乳后乳低聚糖的三个剂量组乳鼠Th1/Th2比值没有显著性差异(P ＞0.05)，与配方粉组相比，离乳后乳低聚糖的三个剂量组乳鼠Th1/Th2比值没有显著性差异(P＞0.05)；在第42天，与对照组相比，母乳低聚糖的三个剂量组乳鼠Th1/Th2比值显著降低(P<0.05)，与配方粉组相比，低剂量母乳低聚糖的乳鼠Th1/Th2比值显著升高 (P<0.05)。
实验表明，除离乳期外，母乳低聚糖可显著降低新生乳鼠机体Th1/Th2比值(P<0.05)，可能与母乳低聚糖可以显著降低机体IFN-γ的分泌有关，灌胃低剂量母乳低聚糖的乳鼠在6 周后免疫平衡状态相比于其他灌胃组，更接近对照组的免疫平衡状态。
实施例15母乳低聚糖对于肠道菌群α多样性的影响
本实验对新生乳鼠不同时间点肠道菌群多样性(α多样性)进行分析，分析结果可以反映新生乳鼠肠道内微生物群落的丰度和多样性。在本实验中，采用ace指数来表示菌群的丰度，其值越大表明菌群丰富度越高；采用shannon指数来表示菌群多样性，值越大表明菌落多样性越高。不同时间点结果如图29、30及31所示。
如图29所示，对不同灌胃处理组新生乳鼠盲肠内容物进行高通量测序分析其肠道菌群α多样性发现，在第21天，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠菌群丰富度和对照组没有显著性差异(P＞0.05)；与配方粉组相比，中剂量母乳低聚糖组乳鼠菌群丰富度极显著增多(0.001<P≤0.01)；在三个母乳低聚糖剂量组中，高剂量组乳鼠菌群丰富度显著低于中剂量组乳鼠(0.01<P≤0.05)。
同时，在第21天，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠菌群多样性没有显著性差异(P＞0.05)；与配方粉组相比，低剂量母乳低聚糖组乳鼠菌群多样性显著增多(0.01<P≤0.05)，高中剂量组没有显著性差异(P＞0.05)。配方粉组乳鼠菌群多样性显著降低(0.01<P≤0.05)。
如图30所示，对不同灌胃处理组新生乳鼠盲肠内容物进行高通量测序分析其肠道菌群α多样性发现，在第28天，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠菌群丰富度没有显著性差异(P＞0.05)；与配方粉组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠菌群丰富度没有显著性差异(P＞0.05)；在三个母乳低聚糖剂量组中，中剂量组乳鼠菌群丰富度显著高于高低剂量组乳鼠(0.01<P≤0.05)。
同时，在第28天，与对照组相比，低剂量组乳鼠菌群多样性极显著降低(0.001<P≤0.01)，高中剂量组没有显著性差异(P＞0.05)；与配方粉组相比，中剂量组乳鼠菌群多样性显著增加(0.01<P≤0.05)，高低剂量组没有显著性差异(P＞0.05)。配方粉组乳鼠菌群多样性显著降低(0.01<P≤0.05)。
如图31所示，对不同灌胃处理组新生乳鼠盲肠内容物进行高通量测序分析其肠道菌群α多样性发现，在第42天，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠菌群丰富度没有显著性差异(P＞0.05)；与配方粉组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠菌群丰富度没有显著性差异(P＞0.05)；在三个母乳低聚糖剂量组中，高剂量组乳鼠菌群丰富度显著高于中剂量组乳鼠(0.01<P≤0.05)。
同时，在第42天，与对照组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量的乳鼠菌群多样性降低，其中低剂量组乳鼠菌群多样性显著降低(0.01<P≤0.05)，高剂量组乳鼠菌群多样性极显著降低(0.001<P≤0.01)；与配方粉组相比，低剂量组乳鼠菌群多样性显著降低(0.01<P≤0.05)，高中剂量组没有显著性差异(P＞0.05)。
实验表明，在第42天，高剂量母乳低聚糖可提高新生乳鼠盲肠内容物菌群丰富度和多样性，后者有极显著性差异(0.001<P≤0.01)。
综上，母乳低聚糖对于新生乳鼠肠道菌群丰富度没有显著性影响(P＞0.05)，但会使离乳后新生乳鼠肠道菌群多样性降低。
实施例16母乳低聚糖对于肠道菌群组成的影响
新生机体肠道菌群的建立对于肠道的成熟和免疫的响应有着重要作用，并对日后机体的健康状态有一定的长期影响。本实验中，基于属水平对于新生机体肠道菌群组成进行分析，不同时间点结果如图32、33及34所示。
如图32所示，显示在新生乳鼠出生后21天属水平上，肠道菌群组成中相对丰度＞1％的各菌属差异。通过分析发现，对照组乳鼠肠道中拟杆菌属bacteroides和梭菌属lachnoclostridium为优势菌，相对丰度分别为34.64％和32.72％；与对照组相比，灌胃母乳低聚糖三个剂量组的乳鼠肠道中拟杆菌属bacteroides、肠球菌属enterococcus、norank_f_毛螺菌属norank_f_lachnospiraeae、大肠杆菌属志贺菌属escherichia-shigella、pep梭菌属 peptoclostridium、unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae和毛螺菌属NK4A136 lachnospiraeae_NK4A136_group相对丰度增多，而梭菌属lachnoclostridium、多形拟杆菌属 parabacteroides相对丰度减少；
配方粉组乳鼠肠道中拟杆菌属bacteroides和肠球菌属enterococcus为优势菌，相对丰度分别为49.55％和29.50％；与配方粉组相比，pep梭菌属peptoclostridium、变形菌属 parasutterella和毛螺菌属NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group相对丰度增多，而拟杆菌属bacteroides、肠球菌属enterococcus、肠杆菌属enterobacter相对丰度减少；并且，配方粉组乳鼠肠道菌群中缺少norank_f_毛螺菌属norank_f_lachnospiraeae、多形拟杆菌属 parabacteroides、norank_f_拟杆菌属S24-7norank_f_bacteroidales_S24-7_group和 unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae。
实验表明，在第21天，通过离乳前母乳低聚糖的干预可以增大新生乳鼠肠道内拟杆菌属bacteroides和毛螺菌属lachnospiraeae菌群的相对丰度，减少梭菌属lachnoclostridium、多形拟杆菌属parabacteroides菌群的相对丰度。
如图33所示，显示在新生乳鼠出生后28天属水平上，肠道菌群组成中相对丰度＞1％的各菌属差异。通过分析发现，对照组乳鼠肠道中梭菌属lachnoclostridium和拟杆菌属 bacteroides为优势菌，相对丰度分别为45.95％和32.42％；与对照组相比，低剂量组梭菌属 lachnoclostridium相对丰度增多而中高剂量组减少；中剂量组拟杆菌属bacteroides相对丰度减少而高低剂量组增多，中剂量组norank_f_拟杆菌属S24-7norank_f_bacteroidales_S24-7_group相对丰度增加而高低剂量减少，高剂量组变形菌parasutterella丰度增加而中低剂量减少，高剂量组志贺菌属escherichia-shigella相对丰度增加而中低剂量组基本没有，仅中剂量组普雷沃氏菌属_UCG-001prevotellacae_UCG-001相对丰度增加而高低剂量组不存在；并且，三个母乳低聚糖剂量组乳鼠肠道中多形拟杆菌属 parabacteroides相对丰度减少；灌胃母乳低聚糖后，三个剂量组乳鼠肠道中均出现嗜胆菌属 biophila；在高剂量组乳鼠肠道中出现肠球菌属enterococcus，相对丰度为10.34％；在中剂量乳鼠肠道中出现毛螺菌属_NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group、norank_f_毛螺菌属 norank_f_lachnospiraeae、unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae和罗氏菌属 roseburia，相对丰度分别为7.75％、6.48％、5.82％和1.81％。
配方粉组乳鼠肠道中梭菌属lachnoclostridium和拟杆菌属bacteroides为优势菌，相对丰度分别为49.07％和39.94％；与配方粉组相比，低剂量组梭菌属lachnoclostridium相对丰度增多而中高剂量组降低，高剂量组拟杆菌属bacteroides相对丰度增加而中低剂量组降低，中剂量组norank_f_拟杆菌属S24-7norank_f_bacteroidales_S24-7_group相对丰度增加而高低剂量减少，高剂量组变形菌属parasutterella相对丰度增加而中低剂量组减少，并且，三个母乳低聚糖剂量组乳鼠肠道中大肠杆菌志贺菌属escherichia-shigella相对丰度减少；灌胃母乳低聚糖后，三个剂量组乳鼠肠道中均出现嗜胆菌属bilophila；在高剂量组乳鼠肠道中出现肠球菌属enterococcus，相对丰度为10.34％；在中剂量乳鼠肠道中出现毛螺菌属 _NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group、norank_f_毛螺菌属norank_f_lachnospiraeae、unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae和罗氏菌属roseburia，相对丰度分别为 7.75％、6.48％、5.82％和1.81％。
实验表明，在第28天，通过离乳前母乳低聚糖的干预可以增大新生乳鼠肠道内拟杆菌属bacteroides菌群的相对丰度，减少多形拟杆菌属parabacteroides和志贺菌属escherichia-shigella菌群的相对丰度。并且，中剂量组乳鼠肠道菌群多样性增加，出现了嗜胆菌属bilophila、毛螺菌属_NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group、norank_f_毛螺菌属 norank_f_lachnospiraeae、unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae和罗氏菌属 roseburia。
如图34所示，显示在新生乳鼠出生后第42天属水平上，肠道菌群组成中相对丰度＞ 1％的各菌属差异。通过分析发现，对照组乳鼠肠道中毛螺菌属_NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group、norank_f_拟杆菌属 _S24-7norank_f_bacteroidales_S24-7_group和norank_f_毛螺菌属norank_f_lachnospiraeae为优势菌，相对丰度分别为21.03％、15.96％和16.92％；与对照组相比，三个剂量组乳鼠肠道中毛螺菌属_NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group相对丰度均降低，低剂量组降低最多，高剂量组norank_f_拟杆菌属_S24-7norank_f_bacteroidales_S24-7_group相对丰度增加而中低剂量组降低，高剂量组norank_f_毛螺菌属norank_f_lachnospiraeae相对丰度增加而中低剂量组降低，中低剂量组拟杆菌属bacteroides相对丰度增加而高剂量组降低，三个剂量组乳鼠肠道中梭菌属lachnoclostridium相对丰度均增加，低剂量组增加最多，高剂量组unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae相对丰度增加而中低剂量组降低，三个剂量组乳鼠肠道中罗氏菌属roseburia相对丰度均降低，低剂量组降低最多，三个剂量组乳鼠肠道中norank_f_瘤胃球菌属norank_f_ruminococcaceae相对丰度均降低，低剂量组降低最多，三个剂量组乳鼠肠道中乳酸菌属lactobacillus相对丰度均增加，高剂量组增加最多，三个剂量组乳鼠肠道中Alistipes菌属相对丰度均降低，低剂量组降低最多，中低剂量组多形拟杆菌属parabacteroides相对丰度均增加而高剂量组不存在此菌属。
配方粉组乳鼠肠道中毛螺菌属_NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group、norank_f_ 拟杆菌属_S24-7norank_f_bacteroidales_S24-7_group、norank_f_毛螺菌属norank_f_lachnospiraeae及unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae为优势菌，相对丰度分别为19.05％、17.06％、19.51％和10.18％；与配方粉组相比，三个剂量组乳鼠肠道中毛螺菌属_NK4A136lachnospiraeae_NK4A136_group相对丰度均降低，低剂量组降低最多，高剂量组norank_f_拟杆菌属_S24-7norank_f_bacteroidales_S24-7_group相对丰度增加而中低剂量组降低，三个剂量组norank_f_毛螺菌属norank_f_lachnospiraeae相对丰度均降低，中剂量降低最多，中低剂量组拟杆菌属bacteroides相对丰度增加而高剂量组降低，高剂量组乳鼠肠道中梭菌属lachnoclostridium相对丰度均增加而中低剂量组降低，高剂量组unclassified_f_毛螺菌属unclassified_f_lachnospiraeae相对丰度增加而中低剂量组降低，三个剂量组乳鼠肠道中罗氏菌属roseburia相对丰度均降低，低剂量组降低最多，高剂量组乳鼠肠道中norank_f_瘤胃球菌属norank_f_ruminococcaceae相对丰度均增加而中低剂量组降低，三个剂量组乳鼠肠道中乳酸菌属lactobacillus相对丰度均增加，高剂量组增加最多，三个剂量组乳鼠肠道中Alistipes菌属相对丰度均降低，低剂量组降低最多，并且，灌胃母乳低聚糖后新生乳鼠肠道出现多形拟杆菌属parabacteroides且中剂量组相对丰度最大。
实验表明，在第42天，通过离乳前母乳低聚糖的干预可以增大新生乳鼠肠道内乳酸菌属lactobacillus菌群的相对丰度，减少毛螺菌属lachnospiraeae、罗氏菌属roseburia和Alistipes 菌属菌群的相对丰度。并且，灌胃母乳低聚糖组乳鼠肠道菌群仍含有多形拟杆菌属 parabacteroides。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.母乳低聚糖在制备食品或者药物中的用途，所述食品或者药物用于促进动物肠道发育和/或免疫系统成熟。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于促使多形拟杆菌属的相对丰度增加，梭菌属、变形菌属及志贺菌属相对丰度降低，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于促进断乳时十二指肠绒毛高度的增加，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于减缓断乳时十二指肠隐窝深度的增加，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day，优选地，所述食品或者药物的剂量为3.75mg/g.BW.day；
任选地，所述食品或者药物用于减缓空肠或回肠隐窝深度的增加，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day，优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于提高十二指肠、回肠或空肠小肠绒毛高与隐窝深度的比值，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于促进断乳时巨噬细胞的吞噬能力，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于促进SIgA的分泌或增加血清IgA含量，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为3.75mg/g.BW.day或1mg/g.BW.day。
9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于增加断乳时血清IgG含量，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
10.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于降低血清IL-2、TNF-α、IFN-γ含量，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
11.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述食品或者药物用于降低Th1型细胞因子数/Th2型细胞因子数，所述食品或者药物的剂量为0.25～3.75mg/g.BW.day；
优选地，所述食品或者药物的剂量为1mg/g.BW.day。
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