MXPA03005465A - Compuestos probioticos derivados de la cepa ke01 de lactobacillus casei. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones probioticas que comprenden la cepa KEO1 del Lactobacillus casei que tiene el numero de acceso ATCC PTA-3945. Las composiciones probioticas descritas son utiles para inhibir las enfermedades patogenas entericas en animales y para mantener la salud del animal. Tambien se describen los metodos para elaborar y utilizar composiciones probioticas de la cepa KE01 del Lactobacillus casei como lo son los metodos para utilizar estas composiciones probioticas.

Description

COM PU ESTOS PROBIÓTICOS DERIVADOS DE LA C EPA KE01 DE LACTO BAC I LL US CAS EI " La presente solicitud reivind ica prioridad a la solicitud de patente provisional de E. U . 60/256528 presentada el 18 de Diciembre de 2000, cuyo contenido total se incorpora en la presente para referencia.

ANTEC EDENTES DE LA INVE NCIÓN La presente invención describe preparaciones probióticas del Lactobacillus casei. Específicamente, se describen preparaciones anti-infectivas, anti-diarréicas derivadas de una cepa recién caracterizada de Lactobacillus casei designada KE01 . También se describen los métodos relacionados para preparar los compuestos probióticos que utilizan la cepa KE01 de Lactobacillus casei y los métodos relacionados para utilizar las composiciones probióticas de KE01 .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La cepa probiótica de Lactobacillus casei recién reconocida descrita en la presente se ha designado KE01 . Anteriormente, a este mismo organismo se le había designado Lactobacillus casei KE99 (ver por ejemplo la solicitud provisional de E. U . número 60/256528 y A. S .

Naidu, X. Xie, D.A. Leumer, S. Harrison, M.J . Burrill y E.A. Fonda. 2001 .

Reduction of Sulfide, Ammonia Compounds and Adhesión Properties of Lactobacillus casei strain KE99 In Vitro. Curr. Microbiol. 43: En prensa. ) Las bacterias de ácido láctico (LAB) son microflora nativa del tracto gastrointestinal mamífero que desempeñan un papel importante en la microecolog ía del huésped y se les ha acreditado con una lista impresionante de propiedades terapéuticas y profilácticas. Estas propiedades terapéuticas y profilácticas incluyen, pero no se limitan a, el mantenimiento de la ecología microbiana de los efectos fisiológicos, inmuno-moduladores y antimicrobianos de los intestinos. Otros atributos asociados de LAB incluyen la liberación de enzima en el lumen intestinal que actúan de manera sinergistica con la adhesión de LAB para aliviar los síntomas de la mala absorción intestinal. Además, las enzimas de LAB ayudan a regular el pH intestinal lo cual da como resultado una degradación creciente de aminoácidos aromáticos. [Fuller, R. Probiotic foods - current use and future developments. IFI NR 3:23-26 (1993); Mltsuoka, T. Taxonomy and ecology of Bifidobacteria Microflora 3: 1 1 (1984); Gibson, G. R. et al., Probiotics and intestinal infections, pág . , 10-39. En R. Fuller (ed .) Probiotics 2: Applications and pract'ical aspects. Chapman and Hall, Londres, R. U . (1997); Naidu AS, et al. , Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB). Crit Rev Food Sci Nutr 39:3-1 26 (1999); Naidu A. S . , Clemens, R A. Probiotics, pág, 431 -462. En A. S. , Naidu (ed .), Natural Food Antimicrobial Systems. CRC Press, Boca Ratón, FL (2000)]. Las bacterias de ácido láctico han demostrado también la capacidad de reducir significativamente los compuestos con contenido de sulfuro y amoníaco en el desperdicio fecal de animales y consecuentemente reducir el olor y toxicidad asociados con excrementos de animales. Esta aplicación de LAB ex vivo se ha vuelto crecientemente más importante a medida que se expande la agroindustria y a medida que las comunidades continúan una invasión aparentemente sin fin en áreas rurales anteriormente no ocupadas. Por ejemplo, se ha demostrado que LAB eliminan los olores ofensivos y reducen la producción de sulfuro de hidrógeno asociada con el desperdicio de criaderos cuando los desperdicios de pollos de gallo joven y caparazón se combinan con una mezcla que contiene 15% de carbohidrato y LAB. Además, las composiciones de LAB han demostrado eficacia para disminuir el contenido de Escherichia coli y Salmonella de desperdicio de criaderos a niveles insignificantes. Además, el olor y la viscosidad de los desechos de aves de corral tales como desperdicio de procesamiento de pollos de engorda se reducen significativamente por la fermentación de ácido láctico mediado por L. acidophillus. Además, las preparaciones que contienen LAB han reportado acelerar la descomposición de carbohidratos duros de degradarse y disminuir la producción de amoníaco por bacterias cecales porcinas. Finalmente, la fermentación de ensilaje de L. casei FG1 y L. plantarum FG10 reduce significativamente los niveles de amoniaco al inhibir los organismos de división de urea. [Deshmukh, A.C . , Patterson, P. H. , Preservaron of hatchery wastes by lactic acid fermentation. 1 . Laboratory scale fermentation. Polut Sci 76: 1212-121 9 (1 997); Russell, S. M. et al. , Lactic acid fermentation of broiler processing waste: physical properties and chemical analyses. Poult Sci 71 :765-770 (1 992); Tibbets, G .W. et al. , Poultry offal ensiled with Lactobacillus acidophilus for growing and finishing swine diets. J Anim Sci 64: 1 82-190 (1 987); Sakata, T. et al. , Probiotic preparations dose-dependently increase net production rates of organic acids and decrease that of ammonia by pig cecal bacteria in batch culture. Dig Dis Sci 44: 1485-1493 ( 1 999); Cai, Y. et al . , Effect of applying lactic acid bacteria isolated from forage crops on fermentation characteristics, aerobio deterioraron of silage. J Dairy Sci 82:520-526 ( 1999); Modler, H .W. et al. , Bifidobacteria and bifidogenic factors. Can Inst Food Sci Tech 23:29-41 (1 990)] . Sin embargo, el mayor potencial para que LAB mejore la calidad de vida para el ser humano y los animales domésticos yace en las aplicaciones probióticas in vivo de LAB. Con objeto de que LAB exhiba efectos probióticos benéficos in vivo, los organismos deben sobreviven durante largos periodos de tiempo en el tracto gastrointestinal. Por lo tanto, es crítico que se seleccionen las cepas de LAB probióticas que posean cualidades que eviten su rápida eliminación por contracción intestinal. Las bacteria probióticas eficaces deben ser capaces de sobrevivir la condiciones gástricas y colonizar el intestino, al menos temporalmente, adhiriéndose al epitelio intestinal. Consecuentemente, las LAB que demuestran una capacidad acentuada de adherirse a las superficies mucosas, y que por lo tanto posean un mantenimiento bacterial mejorado y tiempos de residencia gastrointestinal prolongados, tienen una ventaja competitiva sobre las LAB que no la demuestran . [Salminen, S. Et al. , Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: succesful strains and future challenges. Antonie Van Leeuwenhoek 70.347-358 (1996); Conway, P. Selection criteria for probiotic microorganisms. Asia Pacific j clin Nutr 5: 10-14 (1996): Havenaar, R. et al . , Selection of strains for probiotic use, pág . 209-224. En R. Fuller (ed ), Probiotics, the scientific basis. Chapman y Hall, Londres, R.U. ( 1992)]. El lactobacilo puede colonizar exitosamente el tracto gastrointestinal mamífero a través de cierto número de mecanismos diferentes. Por ejemplo, algunas especies bacteriales se unen a diversas proteínas de matriz sub-epiteliales y receptores específicos en la mucosa intestinal . Otras especies pueden adherirse a las células intestinales mamíferas a través de mecanismos que involucran diferentes combinaciones de carbohidratos y factores proteínicos en las superficies de las bacterias y de las células eucarióticas huésped. Sin embargo, independientemente del(os) mecanismo(s) de unión, es la capacidad de las LAB de colonizar exitosamente el tracto gastrointestinal humano lo que le proporciona a las LAB cualidades probióticas. [Greene, J. D. , Klaenhammer, T. R. Factors involved in adherence of lactobacilli to human Caco-2 cells. Appl. Environ Microbiol 60:4487-4494 (1 994); Sarem, F. et al. , Comparison of the adherence of three Lactobacillus strains to Caco-2 and lnt-407 human intestinal cali lines. Lett Appl Microbiol 22:439-442 ( 1996); Naidu , A.S. et al . , Partióle agglutination assays for rapid detection of flbronectina, fibriogen , and collagen receptors on Staphylococcus aureus, J . Clin Microbiol 26: 1 549-1 554 (1988); Wadstróm, T. et al. , Surface properties of lactobacilli isolated from the small intestines of pigs. J Appl Bacteriol 62:51 3-520 ( 1987); Bernet, M. F. et al. , Lactobacillus acidophilus LA 1 binds to cultured human intestinal cell lines and inhibits cell attachment, invasión by entero-virulent bacteria. Gut 35:483-489 (1 994); Jin , L.Z. et al. , Effect of adherent Lactobacillus spp. on in vitro adherence of salmonellae to the intestinal epithelial cells of chicken. J Appl Bacteriol 81 :201 -206 (1 996); Reíd, G . et al., Influence of lactobacilli on the adhesión of Staphylococcus aureus and Candida albicans to fibers and epithelial cells. J I nd Microbiol 1 5:248-253 (1 995)]. Hablando en términos generales, las bacterias probióticas ejercen sus efectos benéficos al desplazar las bacterias entéricas patógenas invasivas o toxigénicas (patógenos entéricos) de la mucosa intestinal a través de un proceso de unión competitivo. Los patógenos entéricos tales como , pero que no se limitan a, Escherichia coli enteropatogénico (EPEC), E. coli enterotoxigénico (ETEC), Salmonella enteriditis, Yersina pseudotuberculosis y Listeria monocytogenes deben ser capaces de colonizar exitosamente el tracto gastrointestinal de un animal con objeto de ocasionar la enfermedad. Son variados los mecanismos que utilizan estos organismos para colonizar eficazmente el intestino. Por ejemplo, los factores adhesivos CFA/I o CFA/II que soportan ETEC se adhieren específicamente al borde del cepillo de las células Caco-2 intestinales humanas epiteliales polarizadas en cultivo. S. typhimurium y EPEC se adhieren al borde de cepillo de la células Caco-2 epiteliales intestinales humanas diferenciadas en cultivo, mientras que Y. pseudotuberculosis y L. monocytogenes se unen a la periferia de las células Caco-2 no diferenciadas.

Recientemente, las preparaciones de L. acidophilus muertas con calor han probado ser composiciones probióticas eficaces. Las preparaciones de L. acidophilus muertas con calor han demostrado desplazar patógenos entéricos conocidos del recubrim iento de la pared intestinal de un animal de prueba a manera dependiente de la dosis. Consecuentemente, los patógenos entéricos fueron incapaces de colonizar el tracto gastrointestinal de un animal para evitar así la enfermedad. Por ejemplo, se encontró que L. acidophilus (cepa de Lacteol®) inhibe esta adhesión de manera dependiente a la dosis de la cepa B41 de E. coli (ECB41 ). En otros experimentos, la cepa LB de L. acidophilus muerta con calor inhibió tanto la asociación como la invasión de células Caco-2 de patógenos entéricos. Aún en otro estudio, la cepa LB de L. acidophilus muerta con calor demostró inhibir completamente la adhesión de ETEC a las células Caco-2. [Fourniat, J . Et al. , Heat-killed Lactobacillus acidophilus Inhibits adhesión of Escherichia coli B41 to HeLa cells. Ann Rech Vet 23:361 -370 (1992); Chauviere, G. et al. , Comparative exclusión of diarrheagenic Escherichia coli (ETEC) from human enterocyte-like Caco-2 cells by heat-killed lactobacillus. FEMS mlcrobial lett 70:21 3-217 (1992)]. Coconnier, M. H . et al . , Inhibition of adhesión of enteroinvasive pathogens to human intestinal Caco-2 cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreases bacterial invasión. FEMS icrobiol Lett 1 10:299-305 ( 1993)] . Como se explicó con anterioridad, las composiciones probióticas se definen generalmente como complementos dietéticos microbianos que afectan benéficamente al huésped mejorando el balance microbiano intestinal. Los dos géneros principales de microorganismos comúnmente asociados con probióticos incluyen Lactobacillus sp y Bifidobacterla sp. Los efectos benéficos atribuidos a los probióticos incluyen una resistencia creciente a enfermedades infecciosas, sistemas inmunológicos más saludables, reducción en el síndrome del intestino irritado, reducciones en la presión arterial, colesterol de suero reducido, alergias más suaves y regresión tumoral. Sin embargo, en virtud de los recientes avances significativos y la publicación de evidencia experimental in vivo e in vitro limitada que soporte la eficacia de las composiciones probióticas, los principales estudios que reportan estos y otros beneficios dependen de evidencia de antídoto. Los ejemplos de publicaciones que dependen de datos de antidoto e in vitro limitados incluyen los números de Patente de Estados Unidos (USPAN) 3,957,974, 4,21 0,672, 4,314,995, 4,345,032, 4,579,734, 4,871 ,539, 4,879,238 y 5,292,362 (las patentes "Hata"). Las patentes Hata describen diversas subespecies de Lactobacillus spp y reportan efectos benéficos de tipo probiótico. Sin embargo, las patentes hata no describen o revelan una especie de Lactobacilo que se demuestre una ávida unión a las matrices sub-epiteliales y exclusión competitiva e interferencia microbiana con patógenos entéricos bacteriales. El número de patente de Estados Unidos 6,060,050 (la patente "050") describe una preparación que consiste en microorganismos probióticos distribuidos en una fécula que contiene el medio utilizado para proteger al organismo durante el almacenamiento, sirve para transportar el organismo al intestino grueso y proporciona un substrato que mejora el crecimiento. Sin embargo, la patente '050' no proporciona datos que demuestren directamente actividad probiótica contra los patógenos entéricos. El número de patente de Estados Unidos 5,965,128 (la "patente 128") describe el tratamiento de enfermedades entéricas ocasionadas por E. col i 0157:H7 (E. coli enterohemorrágico). Sin embargo, las composiciones probióticas de la patente ?28 incluyen solamente cepas no patógenas de E. coli, no se describen Lactobacillus sp. Consecuentemente, aunque los organismos entéricos no patógenos de la patente ?28 pueden brindarle al recipiente protección "de tipo probiótico" contra el E. coli enterohemorrágico, se encuentran ausentes otras cualidades benéficas asociadas con el Lactobacillus sp y Bifidobacteria sp. Los números de patente de Estados Unidos 4,839,281, 5,032,399 y 5,709,857 (la "patente 857") describe varias cepas de Lactobacillus acidophilus que se adhieren a las células mucosas intestinales. Además, la patente '857 describe una cepa de Lactobacillus acidophilus que inhibe el crecimiento de algunos patógenos entéricos. Sin embargo, la patente '857 no describe las cepas de L. casei que tienen las cualidades benéficas comprobadas asociadas con los cultivos de L. acidophilus de la patente '857. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas cepas de Lactobacillus sp. que exhiban actividades probióticas. Particularmente, existe la necesidad de más cepas de Lactobacillus sp. que tengan la capacidad comprobada de reducir enfermedades de patógenos entéricos y de incrementar la vitalidad y salud del animal.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Un objeto de la presente invención es proporcionar una cepa nueva de Lactobacillus sp que haya demostrado propiedades probióticas. Otro objeto de la presente invención es proporciona una cepa nueva de Lactobacillus spp que tenga actividad probiótica patógena anti-entérica. Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar una nueva cepa de Lactobacillus sp. que mantenga la salud y vitalidad del animal. Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar complementos dietéticos y preparaciones farmacéuticas elaboradas a partir de Lactobacillus sp. que hayan demostrado propiedades probióticas. La presente invención satisface estos y otros objetivos al proporcionar una cepa nueva de Lactobacillus casei designada KE01 que posee propiedades probióticas científicamente comprobadas que incluyen actividad patógena anti-entérica in vivo. Además, la presente invención proporciona complementos dietéticos y preparaciones farmacéuticas compuestas de la cepa KE01 de L. casei que se formulan en un complejo de azúcares compuesto de trehalosa y fructooligosacáridos que proporciona protección a largo plazo al organismo y le ayuda a mantener sus propiedades probióticas comprobadas. Existe la necesidad de nuevas formulaciones probióticas que pueden utilizarse para tratar y prevenir infecciones entérico-patógenas y que ayuden a mantener la salud y vitalidad de los humanos y el ganado. Recientemente, la Administración Federal de Drogas y Alimentos (FDA) ha intensificado su campaña contra la sobre-prescripción y abuso clínico de los antibióticos. El uso excesivo de antibióticos ha aumentado en el número de patógenos humanos y animales que son resistentes a antibióticos de primera linea dando como resultado un aumento en las infecciones que no responde a las terapias antimicrobianas convencionales. Además, el uso profiláctico de los antibióticos en el alimento de animales ha dado como resultado un aumento alarmante en las infecciones intestinales del ganado que dan como resultado un tamaño y peso reducidos del rebaño debido a la mala absorción de nutrientes. Consecuentemente, ha caído el número de animales saludables adecuado para el consumo humano, y aquellos que sobreviven lo suficiente para alcanzar el mercado tienen pesos significativamente inferiores y consecuentemente una calidad de carne reducida. Un medio para evitar la rápida dispersión de patógenos entéricos resistentes a la droga en seres humanos y ganado es reducir significativamente el uso de antibióticos. Sin embargo, es inevitable la dispersión de enfermedades comunicables incluyendo a las infecciones entéricas debido al sobre hacinamiento de granjas y ciudades.

Consecuentemente, antes de que pueda descontinuarse completamente el uso de antibióticos profilácticos debe estar disponible una alternativa antimicrobiana adecuada. Estudios recientes han indicado q ue el uso de comestibles y complementos dietéticos con contenido de cepas específicas de microorganismos probióticos puede ayudar a prevenir, y en muchos casos actualmente a curar, enfermedades patógenas entéricas. Sin embargo, muchas de las fórmulas probióticas comercializadas actualmente se basan en organismos que incluyen al Lactobacillus spp y Bifidobacteria sp (y otros géneros) que no se han sometido al escrutinio científico utilizando los métodos aprobados para evaluar la eficacia probiótica. Consecuentemente, demasiadas fórmulas "probióticas" actualmente disponibles carecen de actividad patógena anti-entérica in vivo comprobada. Además, muchas de las formulaciones probióticas clínicamente efectivas comercialmente disponibles no son estables después del almacenamiento y por lo tanto no suministran cantidades eficaces de bacterias probióticas viables al usuario. El presente inventor ha probado muchas preparaciones comercialmente disponibles y ha descubierto viabilidad microbiana debajo de las concentraciones declaradas y en muchos casos el presente inventor ha descubierto que estas preparaciones comerciales no contenían ninguna bacteria viable. El presente inventor ha desarrollado métodos para preparar y empaquetar una nueva cepa de L. casei, designada KE01 . Esta nueva cepa de L. casei provino originalmente de un producto diario tradicional asiático de tipo yogurt fermentado por el presente inventor.

Subsecuentemente, el presente inventor caracterizó el aislado y la cepa depositada con la Colección de Cultivo Tipo Americano (ATCC, MD, EUA). A la cepa KE01 de Lactobacillus casei se le ha dado el número depositario de ATCC . Además, el presente inventor ha desarrollado preparaciones que mantienen la viabilidad de L. casei KE01 de manera tal que una dosis clínicamente eficaz de microorganismos probióticos viables alcance al huésped. La presente invención proporciona una cepa de L. casei (KE01 ) que interfiere con la adherencia bacterial (interferencia microbiana) de patógenos entéricos tales como, pero que no se limitan a , E. coli enteropatogénico y enterotoxigénico, Helicobacter pylori , Campyiobacter jejuni, S. typhimurium, y S. enteriditis a una variedad de tipos celulares mam íferos. Además, el Lactobacilo de la presente invención puede excluir competitivamente (exclusión competitiva) estos, y otros patógenos bacteriales, de unirse a muchas células mamíferas. Las propiedades benéficas asociadas con la novedosa cepa de lactobacilo de la presente invención han dado como resultado complementos dietéticos probióticos mejorados que soportan la salud general de humanos y animales. Además, la presente invención puede utilizarse para proporcionar profilácticos, terapéuticos y paliativos (referidos colectivamente en la presente como "probióticos") para condiciones tales como, pero que no se limitan a, d iarrea de viajero, infecciones gastrointestinales, síndrome urómico hemolitico, y úlceras gástricas. Novedosas características y cualidades adicionales de esta nueva cepa KE01 de L. casei incluyen, pero no se limitan a, la capacidad de KE01 de L. casei de reducir las concentraciones de sulfuro por un factor que excede las 300 ppm a las 48 horas cuando se encuentran expuestas a un medio de crecimiento con un contenido de aproximadamente 2000 ppm de sulfuros y la demostración de una unión ávida a las matrices sub-epiteliales Incluyendo Bio-coat™ (Colágeno tipo-l , Colágeno tipo IV, laminina, y fibronectina), Matrigel™ y una monocapa de células Caco-2. Muy importantemente, se ha demostrado que una preparación reconstituida, seca por congelación, de L. casei de la presente invención separa eficazmente el E. coli adherente al colágeno. Los métodos utilizados para mantener la viabilidad del L. casei de la presente invención y preservar sus cualidades de desplazamiento de E. coli incluyen, pero no se limitan a, el uso de la trehalosa de azúcar y humedad y empaquetamiento de las composiciones finales en bolsitas de aluminio recubiertas con polímero (por ejemplo, Mylar®) a prueba de oxigeno. Estas y otras propiedades probióticas benéficas de la nueva cepa de Lactobacilo serán evidentes por la siguiente descripción de tallada, no limitante de la presente invención.

BREVE DESC RI PCI ÓN DE LAS FIG U RAS La Figura 1 representa la impresión dig ital genómica de la cepa KE01 de Lactobacillus casei en gel de agarosa al 1 % comparada con 12 diferentes cepas de tipo Lactobacilo con base en una prueba de ADN Polimórfico Amplificado Aleatoriamente (RAPD) . La Figura 2 representa el dendogramo filogónico deducido de la impresión digital genómica y la relevancia de la cepa KE01 de Lactobacilo con otras especies de cepas de tipo Lactobacilo. La Figura 3 representa la unión de la cepa KE01 de Lactobaclllus casei a los epitelios intestinales bovinos. La Figura 4 representa que la colonización formó una biopelicula en la mucosa epitelial intestinal bovina. La Figura 5 representa gráficamente la colonización intestinal acentuada y el desprendimiento fecal de lactobacilos y como resultado del complemento de la dieta del animal con la cepa KE01 de Lactobacillus casei de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. La Figura 6 representa gráficamente la reducción de cuentas colíformes fecales como resultado del complemento de la dieta del animal con la cepa KE01 de Lactobacillus casei de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. La Figura 7 representa gráficamente la reducción en productos de amoníaco en heces animales como resultado del complemento de la dieta del animal con la cepa KE01 de Lactobacillus casei de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención. La Figura 8 representa gráficamente la reducción en productos de sulfuro en heces animales como resultado del complemento de la dieta del animal con la cepa KE01 de Lactobacillus casei de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención.

La Figura 9 representa gráficamente el aumento en ganancias de peso en animales como resultado del complemento de la dieta del animal con la cepa KE01 de Lactobaciilus casei de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención , DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una modalidad de la presente invención es un complemento dietético que comprende aproximadamente de 10° a 1010 unidades de formación de colonias de lactobacilos viables por gramo. En otra modalidad de la presente invención, el complemento dietético comprende de aproximadamente 1 0s a 1 01 1 lactobacilos no viables por gramo. El lactobacilo de la presente invención es la cepa KE01 de Lactobaciilus casei que tiene el número de acceso de la Colección de Cultivos de Tipo Americano (ATCC) . Una unidad de formación de colonias (CFU) de la cepa KE01 de Lactobaciilus casei . es igual a una célula bacterial. Aunque generalmente, solo se utiliza cuando se refiere a bacterias viables, el término unidad de formación de colonias, o CFU se definirá también como una sola célula bacterial no viable cuando se refiere a modalidades de la presente invención compuestas de composiciones de lactobacilos no viables. En una modalidad de la presente invención, el complemento dietético comprende una cápsula de gelatina rellena con una composición de lactobacilo seca. En otra modalidad, el complemento dietético se encuentra en forma de preparación líquida. Aún en otra modalidad de la presente invención, el complemento dietético se encuentra en forma de supositorio anal o vaginal. Cuando se utiliza como supositorio, puede formarse en un bolo conveniente y puede contener lubricantes, estabilizadores, ceras y lo similar no tóxicos para facilitar la administración . En otra modalidad de la presente invención , el complemento dietético de lactobacilo puede estar compuesto de alimentos tales como, pero no se limita a, productos diarios, granos, panes, carnes, frutas, vegetales, arroz, y lo similar. La forma del complemento dietético de lactobacilo de la presente invención asume que no es importante y es no limitante. A lo largo de esta especificación, puede referirse a la presente invención como una composición probiótica, una composición con contenido de lactobacilo, un complemento dietético, un polvo seco por congelación o composición de lactobacilo. Todos estos términos anteriormente mencionados significan una composición , independientemente de la forma o de la presencia o ausencia de otros ingredientes, que contengan la cepa KE01 de Lactobacillus casei viable o no viable que tiene el número de acceso ATCC o su equivalente genérico como se determina utilizando los métodos detallados en la presente . En una modalidad de la presente invención, la composición de lactobacilos se seca por congelación utilizando los métodos convencionales conocidos por aquellos expertos en la materia de la ciencia de los alimentos. En otra modalidad, la composición de lactobacilos de la presente invención se seca al aire. En aún otra modalidad la composición de lactobacilos es una pasta. En aún otra modalidad , la composición de lactobacilos de la presente invención es un liquido. Las composiciones de lactobacilos de la presente invención pueden estar o pueden no estar compuestas con ingredientes adicionales. Por ejemplo, en una modalidad de la presente invención, la composición de lactobacilos se mezcla con un carbohidrato seleccionado a partir del grupo que consiste en trehalosa, glucosa, sacarosa, fructosa, maltosa y combinaciones de los mismos. El(los) carbohidrato(s) pueden comprender desde aproximadamente 50% hasta 98% de toda la composición. En otra modalidad , las proteínas tales como albúmina y/o suero pueden o no agregarse a las composiciones de lactobacilos de la presente invención . Las composiciones de lactobacilos de la presente invención pueden tomarse oralmente como un bolo en forma de cápsula de gelatina, tableta comprimida, o cápsula de gel. En otra modalidad, las composiciones de lactobacilos de la presente invención pueden tomarse oralmente en forma de una bebida líquida. La bebida liquida puede contener otros ingredientes tales como, pero que no se limitan a, acentuadores de sabor, edulcorantes, acentuadores de viscosidad y otros aditivos alimenticios. La presente invención puede tomarse también conjuntamente con otros alimentos sea separadamente o estar compuesta con ellos. En una modalidad de la presente invención, se proporciona un animal con una sola dosis q ue contiene aproximadamente 1 05 a 101 1 lactobacilos por gramo de la composición probiótica. La cantidad total consumida dependerá de las necesidades individuales del animal y el peso y talla del animal. La dosis preferida para cualquier aplicación dada puede determinarse por titulación. La titulación se lleva a cabo al preparar una serie de dosis de peso convencionales que contienen cada una desde aproximadamente 105 a 101 1 lactobacilos por gramo. Se administra una serie de dosis comenzando en 0.5 gramos y continuando hasta un punto terminal lógico determinado por la talla del animal y la forma de la dosis. La dosis apropiada se alcanza cuando se administra la cantidad mínima de composición de lactobacilos requerida para alcanzar los resultados deseados. La dosis apropiada es conocida también por aquellos expertos en la materia como una "cantidad eficaz" de las composiciones probióticas de la presente invención. Por ejemplo, si se desea reducir los síntomas asociados con el síndrome del intestino irritado en un animal, se administra diariamente una dosis medida como se describió con anterioridad , escalando la dosis cada día sucesivo en incrementos de 0.5 gramos hasta aminorar los síntomas. En una modalidad de la presente invención , la dosis preferida se encuentra entre aproximadamente 1 03 a 1 0? lactobacilos viables por kilogramo de peso corporal (el peso del recipiente animal) por día. Esto es igual a aproximadamente 10 billones viables de cepa KE01 de Lactobacillus casei por día para el humano adulto saludable promedio. Por extrapolación , es una cuestión sencilla la de calcular la dosis aproximada apropiada para cualquier animal de cualquier peso. Se comprende que este es un ejemplo no limitante q ue puede variarse conforme sea apropiado por los expertos en la materia para prescribir composiciones probióticas o utilizando el método de titulación proporcionado anteriormente. Las composiciones probióticas de la presente invención pueden administrarse a cualquier animal en necesidad del mismo incluyendo, pero sin limitarse a, mam íferos, aves, reptiles y peces. Las aplicaciones típicas incluyen administrar las composiciones probióticas de la presente invención a seres humanos, caballos, puercos (cerdos), vacas, ovejas, perros, gatos, conejos, pollos, pavos, faisanes, codornices, periquitos, loros, y otros animales silvestres y domésticos. Específicamente, las composiciones probióticas de la presente invención pueden utilizarse para inhibir o tratar enfermedades asociadas con patógenos entéricos cuando se le administran a un animal en necesidad de las mismas utilizando los métodos descritos en la presente especificación. Las enfermedades patógenas entéricas incluyen aquellas enfermedades ocasionadas por patógenos tales como la diarrea, síndrome del intestino irritado, y hemorragias intestinales. Los ejemplos de patógenos entéricos asociados con estas enfermedades incluyen, pero no se limitan a, Escherichia coli enteropatogónica (EPEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), Salmonella enteriditis, Yersina pseudotuberculosis y Listeria monocytogenes. El presente inventor teoriza, y no ofrece como limitante, que la inhibición y tratamiento de las enfermedades patógenas entéricas se llevan a cabo por la composición probiótica de la presente invención a través de un proceso de unión competitivo. Es decir, los lactobacilos probióticos de la presente invención compiten con patógenos entéricos para sitios de unión en la mucosa intestinal . Debido a que los lactobacilos probióticos de la presente invención tienen una mayor afinidad y avidez por estos sitios de unión que los patógenos entéricos, los lactobacilos probióticos de la presente invención desplazan los patógenos entéricos en el medio intestinal donde son limpiados inofensivamente de los intestinos por procesos metabólicos normales. Los ejemplos in vivo de esta unión competitiva descrita con anterioridad y su eficacia para inhibir y tratar enfermedades patógenas entéricas se proporciona en los ejemplos detallados a continuación y en las figuras acompañantes. La siguiente descripción técnica proporciona enseñanzas detalladas. En la Sección I , se le muestra al experto en la materia cómo aislar e identificar los lactobacilos probióticos, específicamente, el Lactobacilo probiótico de la presente invención, la cepa KE01 de Lactobacillus casei. En la Sección II se proporcionan ejemplos específicos que muestran cómo preparar las composiciones probióticas de la presente invención y la prueba que se llevó a cabo para validar científicamente las cualidades probióticas demostradas por las composiciones probióticas de la presente invención . Debe comprenderse que estos ejemplos detallados no se pretenden como limitantes.

I . Aislamiento y Caracterización de la cepa KE01 de Lactobacillus casei A. Aislamiento de las Bacterias Probióticas Candidatas Se aisló el organismo probiótico de la presente invención de un producto diario tradicional asiático de tipo yogurt fermentado. El proceso de examinación se limitó a productos diarios tradicionales asiáticos de tipo yogurt fermentado con al menos una historia de diez años de consumo humano seguro. El aislamiento de bacterias probióticas se llevó a cabo utilizando tres medios microbiológicos selectivos utilizando métodos conocidos por aquellos expertos en la materia de la m icrobiología. Los medios selectivos de lactobacilos incluyeron medio SL complementado con cisteína ai 0.05% , se seleccionaron Bifidobacterium spp. para utilizar un medio de caldo de levadura de phytone de tripticasa con contenido de antibióticos; y para Streptococcus spp. se aislaron utilizando un medio de cisteína de caldo de levadura de tripticasa. Los lactobacilos probióticos candidatos fueron negativos a la catalasa, homo-fermentables de glucosa, bacilos que no forman esporas positivas a Gram que demuestran un pH bajo, resistencia biliar y de ácido gástrico. La incapacidad de los aislados de lactobacilos de crecer a un pH de 9.0 acoplada a su capacidad de crecer en un medio con contenido de acetato sirvió para distinguirlos de Carnobacterium spp. Se clasificó un total de 81 aislados como lactobacilos probióticos candidatos con base en estos criterios y se caracterizaron adicionalmente con respecto a los siguientes criterios: i) resistencia a un bajo juicio pancreático; ¡i) capacidad de adherencia a las matrices sub-epiteliales tales como Biocoat™ Matrigel (Becton Dickinson, Bedford , MA) y a células epiteliales intestinales cultivadas (linea celular Caco-2); iii) su capacidad de excluir competitivamente el serotipo 0157: 1-1 de E. coli enterohemorrágico adherente a las matrices de colágeno; y iv) su capacidad de reducir los compuestos con contenido de amoníaco y sulfuro. Después de analizar los 81 lactobacilos probióticos candidatos, se identificaron dos cepas que tienen todas las características identificadas anteriormente. Estas cepas se designaron cepa KE97 y cepa KE99 (re-designada KE01). Finalmente, la tasa de crecimiento-multiplicación (tiempo de generación como se determina por la detección de la impedancia utilizando el Sistema Bactometro BioMerieux™ ), estabilidad de cepas en cultivo continuo, características de secado por congelación y resurrección, y se verificaron perfiles de aroma/sabor para cada cepa. El organismo de cepa KE01 de Lactobacillus casei aislado se mantiene en un cultivo substancialmente puro para su uso en la preparación de composiciones probióticas de la presente invención. Como se utiliza en la presente, "cultivo substancialmente puro" se refiere a un cultivo bacteriológico que da como resultado solamente un organismo ¡dentificable cuando se cultiva en medios de cultivo microbiológicos sólidos o semi-sólidos. Se comprende que puede haber presentes niveles extremadamente bajos de células derivadas de otras especies bacteriales; sin embargo, estas células son no viables, no cultivables o se encuentran debajo del umbral de detección utilizando técnicas microbiológicas clásicas no basadas en el genoma. El término "no basado en el genoma" pretende excluir tales métodos como la detección por PCR o métodos similares utilizados para detectar ADN o ARN microbiano.

Además, se comprende que en cualquier momento que se elaboran los polvos, pastas, geles, bolos u otras composiciones probióticas de la cepa KE01 de Lactobacillus casei (o puede ser referida simplemente como KE01 ), de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención descritas en la presente, la cepa KE01 de Lactobacillus casei se derivó de un cultivo substancialmente puro.

B. Impresión digital de ADN por prueba de ADN Polimórfico Amplificado Aleatorio (RAPD). El protocolo RAPD utiliza PCR para generar una impresión digital única para la identificación bacterial . El análisis por PCR puede realizarse de manera rápida y confiable. De acuerdo con lo anterior, se ha utilizado la prueba RAPD para identificación molecular e impresión digital de la cepa KE01 . A un total de 12 cepas de tipo Lactobacillus spp. de la colección ATCC se les tomó su impresión digital y comparó con la KE01 . Para la impresión digital de ADN se cultivaron todas las cepas de lactobacilo durante toda la noche en caldo de MRS (Difco). Las cepas de lactobacilo analizadas para impresiones digitales de ADN se listan en la Tabla 1 .

Tabla 1 Método de Extracción de ADN Se extrajo ADN de los lactobacilos que utilizan el Juego de Purificación de ADN Genómico Asistente (Promega, Wl, EUA). En resumen, se cosechó 1 mL de cultivo de caldo de MRS desarrollado 24 horas de cada lactobaciilus sp. por centrifugación, se resuspendieron las células en 50 mM de EDTA y se trató con 10 mg/mL de lisozima (Sigma, MO, EUA) a 37°C durante 60 minutos. Las células de lactobacilos se comprimieron por centrifugación y se eliminó el sobrenadante. Los comprimidos bacteriales se volvieron a suspender en la solución de lisis de núcleos y se incubó a 80°C durante 5 minutos. Se dejó enfriar la suspensión celular a temperatura ambiente y se mezcló la RNAsa en la solución. Se incubó la suspensión a 37"C durante 60 minutos. Después de la incubación, se agregó la solución de precipitación de proteína a la mezcla. La solución se mezcló en vórtices y se incubó en hielo durante 5 minutos. La mezcla se centrifugo durante 3 minutos a 15K*g, el sobrenadante se transfirió a un tubo fresco y se precipitó el ADN con alcohol ¡sopropílico. Se centrifugó el ADN y se aspiró el alcohol de isopropilo. El comprimido de ADN se enjuagó con etanol al 70% y se cosechó por centrifugación. Se eliminó el etanol y se dejó secar el comprimido. Se volvió a suspender el ADN en regulador de tris-EDTA.

Amplificación de PCR de ADN extraído Se utilizó un microlitro del ADN extraído en la reacciones de PCR, las cuales se llevaron a cabo en el ¡Cycler (Bio-Rad, CA, EUA) que utiliza una sola secuencia nucleótida arbitraria de acuerdo con Cocconcelli, et al. (1995). Se utilizó una solución de 2* PCR Premix Taq (Takara, Siga, Japón) para cada reacción. Cada reacción contuvo un volumen total de 50 µ?_, 1.25 unidades de Polimerasa de ADN Ex Taq de Takara, 1* Regulador, 200 µ? de Mezcla de dNTP (2.5 mM cada uno). La concentración final del imprimador fue de 4 µ?, y el imprimador utilizado para la amplificación fue de 5'-AgCAgCgTgg-3' (Operon Technologies, Inc., CA, EUA). Las mezclas de reacción con el ADN de plantilla se reciclaron a través del siguiente perfil de temperatura: 1 ciclo de 94°C durante 5 minutos; 40 ciclos de 94°C durante 1 minuto; 29°C durante 1 minuto; rampa hasta 72°C 1.5 minutos y se mantuvo a 72°C durante 1.5 minutos; 1 ciclo de 72°C durante 2 minutos; y se mantuvo a 4°C. [Cocconcelli, PS et al., Development of RAPD protocol for typing of strains of lactic acid bacteria and entercocci. Lett. Appl. Microbiol. 21:376-379 (1995)].

Electrofóresis de gel Los alícuotas de cada reacción amplificada de RAPD (1 0 µ?) se analizaron por electrofóresis de gel de agarosa al 1 % (peso/vol.)en regulador de Tris-borato-EDTA de acuerdo con Sambrook et al. (1989). Los geles se probaron durante 2 horas a 120 V sin enfriamiento. Se utilizó el marcador de peso molecular de ADN Hiperladder I (Bioline, Randolph, MA, EUA) como la norma. Después de la electrofóresis, el gel se tiñó con bromuro de etidio (5 µ?/???) durante 10 minutos, se enjuagó durante 5 minutos y se visualizó y analizó en un Fluor-S Multilmager (BioRad, CA, EUA). [Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , Maniatis, T. Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1989)]. La prueba RAPD que utiliza un solo imprimador 10-mero produjo distintos patrones de agrupación de intensidades variables y números de productos amplificados en gel de agarosa al 1 % con muestras de ADN de diversas cepas de referencia de lactobacilo y la cepa KE01 . Se observó la comparación de los diferentes fragmentos de especies en el gel al Lactobacillus sp. de referencia. El patrón de agrupación con documentación como se representa en la Figura 1 y la TABLA 2 sirve para identificar únicamente la cepa KE01 y proporcionó una biblioteca de impresión digital genómica. Con base en la impresión digital genómica se dedujo un dendograma como se muestra en la Figura 2. Se aplicó el Método de Grupo de Ward del Análisis Filogénico. Este método minimiza la suma de cuadrados de cualesquier dos grupos que puedan formarse en cada etapa, creando grupos de tamaños reducidos. Con base en el análisis filogénico, la cepa KE01 mostró una homolog ía al 1 3% con Lactobacillus helvaticus ATCC 15009 y una homolog ía al 55% con Lactobacillus casei sp. rhamnosus ATCC7469. Un cultivo puro de la cepa KE01 de Lactobacillus casei se depositó con la Colección de Cultivos Tipo Americano, Bethesda , MD, a la cual se le asignó el número ATCC Tabla 2 II. Ejemplos de la presente invención. La cepa KE01 de lactobacilos masivos como se utiliza en los siguientes Ejemplos se produjo masivamente utilizando procesos de fermentación convencionales como conocen aquellos expertos en la materia de la microbiología de fermentación. La cepa purificada de KE01 del Lactobacilo se utilizó después en la preparación de diversos sistemas de suministro que incluyen polvos finos, cápsulas de bolo, gel, y mezclas comestibles secas como se explica a continuación: EJEMPLO 1 Preparación de las Composiciones de Cepa KE01 de lactobacilos de la Presente Invención Preparación de KE01 seca por congelación en forma de polvo fino Un cultivo puro de lactobacilo KE01 (iniciador) almacenado congelado a -22°C, se revivió en un medio de caldo de fermentación con contenido de proteínas, vitaminas, minerales y fuente de carbohidratos. Se preparó un cultivo sembrado en un fermentador unido a un vaso de fermentación NBS 1500L. Se monitoreó la pureza microbiana en momentos definidos (mediante una fase logarítmica y un ciclo final) durante el proceso de fermentación. Se cosechó la masa microbiana en un separador desinfectado y la pasta aguada del concentrado celular se secó por congelación después de mezclarse con portadores que contienen una mezcla de dextrosa anhidro y trehalosa. Se utilizó leche pasteurizada desnatada baja en calorías Grado A seca por atomización como un crio-protector. El concentrado de KE01 seco por congelación se molió en polvo fino utilizando un equipo de molido desinfectado. Se aseguró la calidad del polvo de KE01 por pureza y viabilidad antes del uso.

Combinación de polvo de KE01 en mezclas: Todas las operaciones se realizan en un ambiente de temperatura (74-76°F) (23.3-24.4°C) y humedad (30-40%) controladas. Se introdujeron el polvo de KE01 (aproximadamente 1 01 1 CFU/g lactobacilos) y otros ingredientes listados en la composición a continuación mostrada en un sistema cerrado para la combinación. La dilución geométrica serial se realiza para asegurar una distribución homogénea de todos los componentes. La mezcla se realiza en un sistema de volteo de depósito de flujo de masa con geometría personalizada para asegurar la división del lecho y el flujo transversal. Una vez mezclados, los polvos se mantienen en el sistema cerrado hasta que se empaquetan en cubos de 5 Ib (2.27 kg). El polvo combinado se rellena en recipientes adecuados (cubos, paquetes de dosis unitaria, etc.) con propiedades de paquetes de absorción de humedad o de barrera de vapor inherentes, y se sella con una tapa hermética. Aquellos expertos en la materia deben comprender que el término "aproximadamente" se utiliza para proporcionar un elemento razonable de error inherente en materiales masivos de peso y fabricación. Como se utiliza en la presente "aproximadamente" incluirá un factor de error de desde 0.1 hasta 0.5% . Además, aquellos expertos en la materia deben comprender que la cantidad de materiales utilizados para formular una composición final deben totalizar 100% y no pueden exceder el 100% . Todos los porcentajes se dan sobre una base porcentual en peso. A manera de ejemplo, y no se pretende como limitante, en una modalidad de la presente invención la composición probiótica elaborada de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención comprende desde aproximadamente 1 hasta 5% de polvo de KE01 que tiene desde aproximadamente 105 hasta 101 1 CFU de KE01 por g y desde 95 hasta 99% de ingredientes inertes o activos seleccionados a partir del grupo que consiste en, pero que no se limita a, carbohidrato, Kpidos, polipéptidos ácidos grasos, fitoquímicos, y combinaciones de los mismos. Los carbohidratos que pueden utilizarse de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención incluyen monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, y polisacáridos tales como, pero que no se limitan a, trehalosa, maltosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, inulina, ribosa, dextrina de malta y lo similar. En una modalidad de la presente invención , el disacárido es dihidrato de trehalosa, el oligosacárido es fructo-oligosacárido y el polisacárido es dextrina de malta. Los lípidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, aceite de soya, aceite de oliva , aceite de grano de palma, aceite de maní, aceite de nuez, aceite de cañóla y lo similar. Los polipéptidos adecuados incluyen proteína de suero, albúmina de huevo, gelatina, proteínas de leche, y otras proteínas animales y vegetales. Finalmente, los fitoquímicos como se utilizan en la presente incluyen compuestos tales como polifenoles, saponinas, flavanoides, monoterpenos, sulfuros de alquilo, licopenos, carotenoides, poliacetilenos, silimarina, catequinas de glicirrizina y otros. En una modalidad de la presente invención, la cepa probiótica KE01 de Lactobacillus casei tiene el siguiente porcentaje en peso de ingredientes: Tabla 3. Combinación a manera de ejemplo.

Preparación de KE01 en Cápsulas de Bolo Se combinaron exhaustivamente polvo fino de KE01 seco por congelación (aproximadamente desde 105 hasta 1011 de CFU/g de lactobacilos), dihidrato de trehalosa (Grado Alimenticio) y Dextrosa (Grado Alimenticio) o Dextrina de Malta (Grain Processing Co., Muscatine, IA)) a 3%: 67%: 30%, respectivamente. La mezcla combinada se rellenó en cápsulas de gelatina. Se probó la calidad de las cápsulas de bolo de KE01 para pureza y viabilidad antes de su uso.

Tabla 4. Combinación de Bolo a manera de ejemplo Preparación de KE01 en forma de gel Se combinaron exhaustivamente polvo fino de KE01 seco por congelación (aproximadamente desde 105 hasta 1 011 de CFU/g de lactobacilos) con fructo-oligosacárido (Grado Farmacéutico) a una concentración de 2.5%. Se utilizó aceite de soya extrudido/expulsado no GMO (Organismo Genéticamente Modificado) como portador primario.

El gel se mezcla exhaustivamente, se recogieron muestras de la parte superior, intermedia, e inferior del lote utilizando una espátula esterilizada y se analizó la pureza y viabilidad del KE01 . El gel de KE01 se rellenó en tubos de 50/cc para su uso.

Tabla 5. Combinación de Gel a manera de ejemplo Polvo fino de KE01 3% Dihidrato de trehalosa (Cargill Foods, Blair, N E) 62% Fructooligosacárido (Biomatrix, M inneapolis , MN) 5% Dextrina de malta (Grain Processing Co. , Muscatine, IA) 30% Total 100% EJE PLO 2 Estudios de Adhesión Celular Se llevó a cabo una Prueba de Radio-Adhesión (RAA) in vitro para medir la unión de la cepa KE01 de lactobacilo, utilizando placas de 24 cavidades de Cell Environments™ (Becton Dickinston, Bedford, Mass.) con contenido de colágeno (Cn) tipo-I, Cn tipo-IV, laminina , o fibronectina y utilizando las monocapas celulares Caco-2.

Preparación de células de lactobacilos KE01 Se volvió a inocular una vacuna de 50 µ? de cultivo de KE01 durante toda la noche desarrollada bajo condiciones anaeróbicas en caldo de MRS (Difco) de lactobacilos Bacto® en 1 0 mi de caldo de MRS con contenido de 3H-timidina (20 pci). Las células de KE01 se desarrollaron bajo condiciones anaeróbicas a 37°C a fase exponencial (aproximadamente 7 horas) para permitir la captación óptima e incorporación de 3H-timidina en el ADN bacterial. Se cosechó 3H-timidina etiquetada con KE01 por centrifugación a 7, 500 * g , se enjuagó y se volvió a suspender en salmuera regulada con fosfato (PBS , pH de 7.2). La densidad celular bacterial se ajustó ópticamente a 107 lactobacilos/ml a 600 nm.

Prueba de Radio-Adhesión (RAA) Para pruebas de interacción de matriz sub-epitelial, se utilizaron placas de 24 cavidades Cell Environments® con contenido de colágeno (Cn) tipo I , Cn tipo IV, laminina, o fibronectina para probar la unión de KE01 . Los componentes de matriz se aplicaron como un recubrimiento ópticamente transparente, uniforme, que cubre un área superficial total de 1 .75 cm2. Se utilizó también la matriz Matrigel de Biocoat®, una membrana de basamento soluble extraída del tumor de ratón Engelbreth-Holm-Swarm, que cuando se reconstituye a temperatura ambiente, forma un gel , en los estudios de interacción . Se agregaron dos milímetros de suspensión de KE01 (2*1 07 de lactobacilos) a cada cavidad con contenido de capa de matriz y se incubó a temperatura ambiente. Después de una hora, la suspensión de KE01 se aspiró de las cavidades y se descartó. Se agregó un mililitro de tripsina tipo 1 ( 1 10 unidades de enzima; Sigma Chemicals, St. Louis, MO.) a cada cavidad y se dejó hidrolizar durante 30 minutos a temperatura ambiente para liberar la capas proteínica de matriz. El hidrosilado de tripsina se aspiró en un frasco de escintilación y se homogeneizó 1 mi adicional de cada cavidad (Scintigest™; Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) durante 1 0 minutos a temperatura ambiente. El homogenado se aspiró en el frasco de escintilación correspondiente. Un volumen de cóctel de escintilación de 10 mi (Gel ScintiSafe™ , Fisher Scientific) se distribuyó en el frasco y se mezcló exhaustivamente. Después del asentamiento y la clarificación de la mezcla, se midió la radioactividad utilizando un analizador de escintilación líquida (Tri-Carb 2100 TR®, Packard Inc.) Para pruebas de interacción celular eucarióticas, una línea celular del carcinoma de colon, Caco-2 , se desarrolló hasta la confluencia como monocapas, en placas de cultivo de tejido de 24 cavidades, d urante 72 horas en un incubador de C02 utilizando medio esencial mínimo de Eagle (complementado con 1% de aminoácidos no esenciales y 10% de suero de bovino fetal). Después de que se obtuvieron las monocapas completas, se enjuagó dos veces cada placas con salmuera regulada con fosfato (PBS, pH de 7.2). Se agregó un volumen de 2 mi (aproximadamente 2*107 bacterias) de suspensión de lactobacilos etiquetados con 3H-timidina a cada cavidad que contiene aproximadamente 105 de células de Caco-2. La proporción entre células Caco-2 y los lactobacilos se mantuvo en 1:200. Después de 1 hora de incubación a 37°C, la suspensión bacterial se aspiró y las cavidades se enjuagaron con PBS. Cada cavidad se trató con tripsina de tipo 1, el homogeneizador de tejidos y se midió la radioactividad como se describió con anterioridad. La unión se expresó como lactobacilos unidos por cm2 área de superficie biológica (para interacciones de proteínas de matriz sub-epitelial) o por célula (para interacciones de células Caco-2). La interacción de KE01 con diferentes capas de biomatriz se comparó también con las interacciones de tres cepas de referencia de ATCC, L. casei ATCC393, L. reuteri ATCC23272, y L. rhamnosus ATCC 7469 en la Tabla 6. Para determinar la importancia, se analizaron los datos de unión con un análisis factorial de 4*6 de varianza (SAS Inc., Raleigh, NC).

Tabla 6 KE01 demostró una unión ávida al colágeno tipo I, colágeno tipo IV, laminina y fibronectina y capas de Matrigel™ in vitro. La unión de KE01 a monocapas de células Caco-2 fue de aproximadamente 54% (108 lactobacilos/cólula). Todas las interacciones in vitro de KE01 con capas de matriz sub-epiteliales y monocapas de células Caco-2 fueron significativamente mayores que las cepas de referencia ATCC, L. casei ATCC393 (p<0.0001), L. reuteri ATCC23272 (p<0.0001), y L. rhamnosus ATCC7469 (p<0.0001).

EJEMPLO 3 Estudios de Interferencia de Adhesión Celular Patógena Entérica La eficacia de ??0 para inhibir la adhesión de patógenos entéricos (listados en la Tabla 7) a biomatrices y para separar los complejos de biomatrices-patógeno.

Tabla 7 Prueba de adhesión-separación Se volvieron a inocular una vacuna de 10 pm de cultivo durante toda la noche de E. coli 01 57:1-1/ desarrollados en caldo de soya tríptico (TSB) o los otros patógenos listados desarrollados en medios de caldo apropiados en 3 mi de TSB o medios apropiados correspondientes con contenido de 3H-timidina (20 µ c¡) . La unión de patógenos bacteriales a placas de Biocoat® con contenido de colágeno (Cn) tipo-l , Cn tipo-IV, laminina, fibronectina y superficies de matrigel se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1 . A estos complejos patógenos bacteriales de Biocoat® , se les agregó un volumen de 2 mi de suspensión de KE01 no etiquetado (2.0 * 107 lactobacilos/ml) a cada cavidad y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La suspensión de lactobacilos de KE01 se aspiró desde la cavidad. Después se realizaron las etapas de liberación de contenido en las cavidades y medición de radioactividad de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 2. La diferencia en los números celulares bacteriales en las cavidades de patógenos adherentes con y sin tratamiento de KE01 se expresó como valores de "separación Logio .

Prueba de Adhesión-Inhibición La unión de KE01 no etiquetado a placas de Biocoat® con contenido de colágeno (Cn) tipo-l, Cn tipo-IV, laminina, fibronectina, y superficies de matrigel se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 2. A estos complejos de Biocoat®-KE01 , se le agregó un volumen de 2 mi de E. coli etiquetado con 3H-timidina u otra suspensión patógena bacterial (2.0 * 107 bacterias/ml) a cada cavidad y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente y se aspiró la suspensión. Después se llevaron a cabo las etapas de liberación de contenido en las cavidades y medición de radioactividad de acuerdo con el protocolo descrito en el Ejemplo 2. Las cavidades de Biocoat® que no se trataron con KE01 sirvieron como controles de adhesión para E. coli u otros patógenos. La reducción en la unión de patógenos bacteriales a las biomatrices que se pre-trataron con KE01 se expresó como valores de 'inhibición Logio'. Los resultados de los efectos inhibidores y de separación de KE01 en las interacciones de E. coli 0157:H7 (cepa ATCC 43895) con las biomatrices y las superficies de Matrigel ™ Biocoat se muestran en la Tabla 8.

Tabla 8.

E01 demostró una unión ácida a todas las biosuperficies probadas, sin embargo, la interacción fue significativamente mayor con colágeno tipo I y Matrigel™ . KE01 ocasionó una inhibición de >3-log de unión de E. coli 01 57: H7 al colágeno tipo I y Matrigel ™ ; y una inhibición >2-log con colágeno tipo-IV, fibronectina e interacciones de laminina. La eficacia de separación de E. coli adherente por KE01 fue de magnitudes Log similares a los valores de inhibición. El espectro de eficacia de KE01 para inhibir la unión y para separar las bacterias adherentes se probó con varios patógenos entéricos listados en la Tabla 9.

Tabla 9 KE01 inhibió eficazmente las interacciones de enteropatógenos que oscilan de 2.8-log (con Enterococcus faecalis) a 4.2-log (con Salmonella enteriditis). Comparativamente , la eficacia de E01 para separarse enteropatógenos fue mayor a la oscilación de 3. 1 -log (con E . col i enterohemorrág ico ATCC43889) a 4.4-log (con E . coli enterohemorrágico ATCC43890) EJ EMPLO 4 La eficacia del polvo fi no de KE01 para separar patógenos entéricos ad herentes Se probó la eficacia de polvo fino de KE01 para separar patógenos entéricos adherentes en u n sistema celular que util iza monocapas de Caco-2. La prueba de ad hesión celu lar de Caco-2 para enteropatógenos se llevó a cabo como se describe para KE01 en el Ejemplo 2. La prueba de ad hesión-separación se l levó a cabo como se describe para las ca pas Biomatrix en el Ejemplo 3. Sin embargo, en los dos protocolos anteriormente mencionados se utilizó polvo de KE01 como una solución al 1% (1g de polvo fino suspendido y se sometió a remolinos en salmuera fisiológica de 100 mi, pH de 7.2). El tratamiento con salmuera fisiológica se utilizó como control y se sustrajo el valor como entorno mientras se interpreta el resultado. Los datos se muestran en la Tabla 10.

Tabla 10 Los perfiles de adhesión de células Caco-2 de enteropatógenos oscilaron desde 1.1*10e (15 bacterias por célula de Caco-2 con E. coli enterohemorrágico ATCC43888) hasta 6.7*106 (89 bacterias por célula de Caco-2 con Salmonella pullorum ATCC13036). KE01 ha disociado eficazmente los complejos enteropatógenos adherentes a células Caco-2 con una eficacia de separación que oscila desde 1.3-log (93.5%) hasta 3.1-log (99.9%) para E. coli ATCC43888 y Salmonella pullorum, respectivamente.

EJEMPLO 5 Demostración de la Capacidad de las Preparaciones de KE01 frescas v secas por congelación para adherirse y colonizar la mucosa epitelial del tracto Intestinal bovino Prueba de adhesión intestinal bovina Las muestras intestinales se obtuvieron de animales recién sacrificados y transportados al laboratorio en condiciones refrigeradas. Los intestinos se abrieron mediante corte y se enjuagó suavemente la mucosa epitelial del lumen para eliminar el desecho fecal. Se inocularon dos diferentes preparación de KE01 en una superficie mucosal de 1 pulgada2 (6.45 cm2), A) KE01 etiquetada con 3H-timidina descrita en el Ejemplo 2 (0.1 mi de vacuna con contenido de aproximadamente 107 lactobacilos); y B) mezcla de polvo de KE01 descrita en el Ejemplo 1 (suspendido homogéneamente en salmuera fisiológica y diluido, 0.1 mi de vacuna con contenido de aproximadamente 107 de lactobacilos). Después de 2 horas de incubación, se enjuagó suavemente el área de inoculación tres veces con salmuera fisiológica. La preparación de muestra A se examinó para la unión de KE01 . El área de inoculación se extirpó, digirió con homogeneizador de tejidos, se amplificó con líquido de escintilación y se midió la radioactividad de acuerdo con la prueba de Radio-Adhesión como se describe en el Ejemplo 2. ??0 demostró la unión ávida para la mucosa epitelial intestinal bovina, es decir, aproximadamente 2.5*10e lacto bacilos/pulgada2. Se evaluó la colonización de KE01 de la preparación de muestra B por microscopía de barrido electrónico (SEM). Se trataron los especímenes con Os04 al 2% durante 30-60 minutos y se enjuagó con agua. Se trataron los especímenes con 50%, 70% y 95% de etanol , cada uno durante 5 minutos, seguido de 2 enjuagues de 1 0 minutos con etanol al 100% . Después del secado a punto critico con dióxido de carbono líquido, se instalaron los especímenes y se recubrieron con bombardeo iónico de paladio de oro. Los especímenes de biopsia se examinaron utilizando un microscopio de barrido electrónico JEOL6300. Las observaciones microscópicas se muestran en las Figuras 3 y 4.

EJ EMPLO 6 Efectos probióticos in vivo de complementos alimenticios con contenido de KE01 administrados a cerditos, Demostración de colonización intestinal v desprendimiento fecal de KE01 ; capacidad de KE01 de disminuir el olor fecal porcino (reducción del contenido de sulfuro y amoníaco fecal); y contribución de KE01 a las ganancias en peso del animal Dosis de complemento alimenticio Las dosis de complemento alimenticio se prepararon en forma de gel como se describe en el Ejemplo 1 . En resumen, se combinó exhaustivamente el polvo fino de KE01 seco por congelación (aproximadamente desde 105 hasta 101 1 CFU/g de lactobacilos) con fructo-oligosacárido (FOS) a una concentración de 2.5%. Se utilizó un aceite de soya extrudido/expulsado no-GMO (Organismo Genéticamente Modificado) como un portador primario. El gel se mezcla exhaustivamente, las muestras se recogieron de la parte superior, intermedia, e inferior del lote utilizando una espátula esterilizada y se analizó la pureza y viabilidad del ??0 . El gel de ??0 se rellenó en tubos de 50/cc para su uso. También se prepararon las dosis de alimentación de control que contienen solo el portador, el portador combinado con células de KE01 y el portador combinado con células de KE01 y FOS.

Prueba de complemento alimenticio de animal El estudio incluyó un total de 20 cerdos (entre 6-8 semanas de edad) con un peso en el rango de 40-60 libras (18.1 -27.2 kg). Estos animales se dividieron en cuatro Grupos, comprendiendo cada uno 5 animales, clasificados como se explica a continuación: Grupo 1 (Control): Animales alimentados con 10cc de gel con contenido de portador primario solamente. Grupo 2: Animales alimentados diariamente con 1 0cc de gel solamente con contenido de FOS al 2.5% combinado con el portador primario. Grupo 3: Animales alimentados diariamente con 10cc de gel solamente con contenido de aproximadamente 1 01 0 cfu/cc de células de cepa KE01 , combinadas con el portador primario. Grupo 4: Animales alimentados diariamente con 1 0cc de gel con contenido de una combinación de 1 010 cfu/cc de células de cepa KE01 y FOS al 2.5%, combinados con el portador primario. Se separaron los animales por grupo y se alojaron en penns aislados y se alimentaron regularmente con dieta porcina rica en proteínas. Los cuatro grupos de animales se alimentaron diariamente con 1 0cc de su categoría respectiva de dosis de complemento dietético. El experimento se llevó a cabo durante 6 semanas. Se llevaron a cabo regularmente el análisis fecal y las mediciones de peso corporal cada semana a lo largo de la prueba de complemento dietético.

Colección de heces Se recogieron muestras fecales (aproximadamente 20 g por animal) en tubos de poliestireno estériles de 50cc. Las muestras se diluyeron a una proporción de p/v 1:1 en salmuera normal, se homogeneizaron exhaustivamente en un combinador de vórtice, y se centrifugaron a 2K *g durante 5 minutos. El sobrenadante se decantó cuidadosamente y se sometió a análisis microbiológico y químico. Las muestras fecales se recogieron un día antes de la prueba de complemento alimenticio actual para obtener una cuenta microbiológica base (coliformes fecales y lactobacilos fecales), y un nivel base de contenido de amoníaco fecal y sulfuro fecal.

Análisis microbiológico de heces La solución fecal (sobrenadante decantado 1:1 p/v) se diluyó serialmente 10 veces en salmuera normal. Las diluciones seleccionadas se colocaron en placas por duplicado o ágar de MRS (Difco) para las cuentas totales de lactobacilos, y en Ágar de MacConkey (DIfco) para la cuentas totales de coliformes, utilizando un dispositivo Autopíate® 4000 (Spiral Biotech, Nor ood, MA). La colocación en placas se llevó a cabo en una configuración de dilución logarítmica exponencial en el colocador de placas automático espiral. Las placas de ágar se incubaron a 37°C para el ágar de MacConkey y 32°C para ágar de MRS durante 24 a 48 horas, respectivamente. Las cuentas totales de colonias se estimaron utilizando un dispositivo de conteo Q infrarrojo automatizado (Spiral Biotech, Norwood, MA). Los datos se expresaron como bacterias por gramo de heces y se mostraron los resultados para la cuentas de lactobacilos en la Figura 5 y la cuentas de coliformes fecales en la Figura 6.

Las animales administrados con complementos dietéticos con contenido de ??0? y la combinación de KE01 más FOS mostró aproximadamente un incremento de 2.5-log en el desprendimiento fecal de lactobacilos en comparación con los grupos de control, indicando proliferación y colonización de la cepa KE01 en el tracto gastrointestinal porcino como se muestra en la Figura 5. Por otra parte, las cuentas coliformes fecales disminuyeron en aproximadamente 2.5-log en animales alimentados con KE01 y E01+FES en comparación con animales de control que indican la exclusión competitiva por la cepa de KE01 en los intestinos porcinos como se muestra en la Figura 6.

Análisis de sulfuro y amoníaco de heces Los niveles de sulfuro y amoníaco en las heces se midieron con electrodos de ion selectivo utilizando un medidor de pH/ion MP230 (Mettler Toledo, Columbus, Ohio). Para la estandarización de un electrodo de ion selectivo de sulfuro, se agregaron 75 mi de sulfuro diluido convencional (10 ppm) bajo agitación suave, a 25 mi de regulador de antioxidante de sulfuro. El potencial de electrodo (E-i) de la solución se midió utilizando un electrodo selectivo de plata DX232 combinado con un electrodo de referencia DX200. El E2 se midió separadamente con 75 mi de solución de sulfuro (100 ppm) y 25 mi de regulador antioxidante de sulfuro. Las diferencias entre y E2 constituyeron la pendiente para el electrodo de sulfuro. Para una medición sencilla, se mezclaron 100 mi de una solución de plata convencional (100 ppm) con 2 mi de regulador de bromuro de ISA (ajuste de resistencia iónica) y se midió el valor de EL Se midió el valor de E2 mezclando 10 mi de solución fecal a la solución anterior. La diferencia entre En y E2 se consideró ??. Con base en la pendiente convencional y ??, la concentración de sulfuro en las heces se calculó de acuerdo con el diagrama de proporción de concentración (Q) utilizando la ecuación, C= Ce * Q (C= conc. sulfuro en heces; Ce= conc. sulfuro conocido, es decir, 100 ppm convencional; y Q= proporción de concentración). Para la estandarización del electrodo de ion selectivo de amoniaco, se agregó 1 mi de solución convencional (1000 ppm) de amoníaco bajo agitación suave, a 100 mi de agua destilada pre-mezclada con 2 mi de regulador de pH/ISA de amoníaco (ajuste de resistencia iónica). El potencial de electrodo (?t) de la solución se midió utilizando el electrodo DX217 de amoniaco. Después se azuzó la solución con 10 mi de amoníaco convencional (1000 ppm) y se midió el cambio en el potencial de electrodo (E2). La diferencia entre E, y E2 constituyó la pendiente para el electrodo de amoníaco. Para la medición de muestra, se agregaron 10 mi de solución fecal, bajo agitación suave a 90 mi de agua destilada pre-mezclada con 2 mi de amoníaco de regulador de pH/ISA y se midió el E-i . La solución fecal se azuzó con amoníaco convencional y se midió el E2. La concentración de amoníaco en heces se calculó utilizando la ecuación como se definió con anterioridad. Los animales administrados con complemento alimenticio con contenido de KE01 y KE01 más DOS demostraron una marcada reducción de amoníaco en aproximadamente 35 ppm/gm y de sulfuro en aproximadamente 375 ppm/gm en comparación con el grupo de control de animales como se muestra en las Figuras 7 y 8. También las heces de animales alimentados con ??0 y KE01 más FOS son rancias debido a la producción de ácido láctico por los lactobacilos de KE01 probióticos proliferantes.

Mediciones de ganancia en peso corporal animal Se pesaron los animales una vez al día antes de la prueba actual de complemento alimenticio para obtener mediciones base de ganancias de peso corporal. Los pesos corporales de los animales de los cuatro grupos se midieron una vez a la semana en la prueba de alimentación de 6 semanas. En la conclusión del experimento, los animales alimentados con KE01 mostraron una ganancia de peso corporal de aproximadamente 28 Ibs (12.7 kg), y el grupo animal que recibió KE01 más FOS mostró una ganancia en peso corporal de 20 Ibs (9 kg) en comparación con el grupo de control de animales como se representa en la Figura 9.

I II . Conclusión En conclusión, debe comprenderse que las modalidades de la invención descritas en la presente son ilustrativas de los principios de la presente invención. Otras modificaciones que pueden emplearse se encuentran dentro del alcance de la invención . Consecuentemente, a manera de ejemplo, pero no de limitante, pueden utilizarse configuraciones alternas de la presente invención de acuerdo con las enseñanzas de la presente. De acuerdo con lo anterior, la presente invención no se limita a lo precisamente mostrado y descrito. Los términos "un" y "una" y "el" ("la") y referentes similares utilizados en el contexto para describir la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) deben interpretarse por cubrir tanto el singular como el plural, a menos que se indique de manera diferente o se contradiga claramente por el contexto. La recitación de rangos de valores en la presente pretenden meramente servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del rango. A menos que se indique de otra manera, cada valor individual se incorpora a la especificación como si se recitase individuamente en la presente. Todos los métodos descritos en la presente pueden llevarse a cabo en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente por el contexto. El uso de cualquiera de y todos los ejemplos, o lenguaje a manera de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente pretende solamente iluminar mejor la invención y no presenta una limitación al alcance de la invención de otra manera reivindicada. Ningún lenguaje en la especificación debe interpretarse como indicador de algún elemento no reivindicado esencial a la práctica de la invención. Los agrupamientos de modalidades o elementos alternos de la invención descritos en la presente no deben interpretarse como limitantes. Cada miembro de grupo puede ser referido como y reivindicarse individualmente o en cualquier combinación con otros miembros del grupo u otros elementos encontrados en la presente. Se anticipa que uno o más miembros de un grupo pueden incluirse en, o eliminarse de, un grupo por razones de conveniencia y/o patentabilidad. Cuando ocurre tal inclusión o eliminación, se considera en la presente que la especificación contiene el grupo como se modificó satisfaciendo asi la descripción escrita de todos los grupos Markush utilizados en las reivindicaciones anexas. Las modalidades preferidas de esta invención se describen en la presente, incluyendo el mejor modo conocido de los inventores para llevar a cabo la invención. Por supuesto, las variaciones de aquellas modalidades preferidas se volverán aparentes para aquellos expertos en la materia tras la lectura de la siguiente descripción. El inventor espera que los expertos en la materia empleen tales variaciones conforme sea apropiado, y que los inventores pretendan llevar a la práctica la invención de manera diferente a la descrita específicamente en la presente. De acuerdo con lo anterior, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia en cuestión recitada en las reivindicaciones anexas a la misma como se permite por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos anteriormente descritos en todas las posibles variaciones de las mismas se encuentra contemplada por la invención a menos que se indique de otra manera en la presente o se contradiga claramente por el contexto. Además, se han hecho numerosas referencias a patentes y publicaciones impresas a lo largo de esta especificación. Cada una de las referencias y publicaciones impresas citadas con anterioridad se incorporan individualmente en la presente invención para referencia.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1 . Una composición probiótica que comprende la cepa E01 de Lactobacillus casei que tiene el número de acceso ATCC PTA-3945, caracterizada porque dicha cepa KE01 de Lactobacillus casei se deriva de un cultivo substancialmente puro.

2. La composición probiótica según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende además ingredientes inertes o activos seleccionados a partir del grupo que consiste en carbohidratos, polipéptidos, lípidos, fitoqutmicos, y combinaciones de los mismos.

3. La composición probiótica según la reivindicación 2, caracterizada porque dicho carbohidrato se selecciona a partir del grupo que consiste en monosacáridos, disacáridos, oligosacáridos, polisacáridos y combinaciones de los mismos.

4. La composición probiótica según la reivindicación 3, caracterizada porque dicho carbohidrato se selecciona a partir del grupo que consiste en trehalosa, maltosa, sacarosa, dextrosa, lactosa, inulína, ribosa y combinaciones de las mismas.

5. La composición probiótica según la reivindicación 3, caracterizada porque dicho disacárido es dihiradrato de trehalosa.

6. La composición probiótica según la reivindicación 3, caracterizada porque dicho oligosacárido es fructo-oligosacárido.

7. La composición probiótica según la reivindicación 3, caracterizada porque dicho polisacárido es dextrina de malta .

8. La composición probiótica según la reivindicación 2, caracterizada porque dicho polipéptido se selecciona a partir del grupo que consiste en protelna de suero, albúmina de huevo, gelatina, leche, proteínas, y combinaciones de las mismas.

9. La composición probiótica según la reivindicación 2 caracterizada porque dicho Kpido se selecciona a partir del grupo que consiste en aceite de soya, aceite de olivo, aceite de grano de palma, aceite de maní, aceite de nuez, aceite de cañóla, y combinaciones de los mismos.

10. La composición probiótica según la reivindicación 2, caracterizada porque dicho fitoquímico se selecciona a partir del grupo q ue consiste en pollfenoles, saponinas, flavanoides, monoterpenos, sulfuros de alilo, licopenos, carotenoides, poliacetilenos, silimarina , catequinas de glícirrizina y combinaciones de los mismos. 1 1 . La composición probiótica según la reivindicación 1 , caracterizada porque comprende además trehalosa. 12. La composición probiótica según la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque comprende dextrina de malta. 13. La composición probiótica según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque comprende además fructo-oligosacáridos. 14. La composición probiótica según la reivindicación 1 3, caracterizada porque dicha cepa KE01 de Lactobacillus casei se encuentra presente en la cantidad de aproximadamente 1 05 a 101 1 unidades de formación de colonias (CFU) por gramo. 1 5. La composición probiótica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 caracterizada porque dicha composición probiótica es un bolo, gel o líquido que se le administra a un animal. 16. La composición probiótica según la reivindicación 1 5, caracterizada porque dicho animal se selecciona a partir del grupo que consiste en mamíferos, peces, aves, y reptiles. 17. La composición probiótica según la reivindicación 1 6, caracterizada porque dicho mam ífero se selecciona a partir del grupo que consiste en seres humanos, caballos, perros, gatos, conejos, ovejas, cerdos y vacas. 1 8. La composición probiótica según la reivindicación 16, caracterizada porque dicho pájaro se selecciona a partir del grupo que consiste en pollos, pavos, faisanes, codornices, periquitos y loros. 19. La composición probiótica según la reivindicación 1 5, caracterizada porque dicho bolo se selecciona a partir del grupo que consiste en cápsulas de gelatina, tabletas comprimidas, y cápsulas de gel. 20. El probiótico según la reivindicación 1 9, caracterizado porque dicho bolo se empaqueta en una bolsita de aluminio recubierta con polímero. 21 . Una composición probiótica caracterizada porque comprende: la cepa KE01 de Lactobacillus casei en polvo que tiene el número de acceso ATCC PTA-3945 en la cantidad desde aproximadamente 1 hasta 5 por ciento en peso; un disacárido desde aproximadamente 25 hasta 95 por ciento en peso; un oligosacárido desde aproximadamente 0 hasta 10 por ciento en peso; y un polisacárido desde aproximadamente 0 hasta 50 por ciento en peso. 22. La composición probiótica según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicha cepa KE01 de Lactobacillus casei en polvo que tiene el número de acceso ATCC PTA-3945 tiene aproximadamente 10° a 101 1 CFU por gramo y se encuentra presente en la cantidad de aproximadamente 3 por ciento en peso. 23. La composición probiótica según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicho sacárido se encuentra presente en la cantidad de aproximadamente 62 por ciento en peso. 24. La composición probiótica según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicho oligosacárido se encuentra presente en la cantidad de aproximadamente 5 por ciento en peso. 25. La composición probiótica según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicho polisacárido se encuentra presente en la cantidad de aproximadamente 30 por ciento en peso. 26. La composición probiótica según la reivindicación 21 , caracterizada porque dicho disacárido es trehalosa, dicho oligosacárido es fructo-oligosacárido y dicho polisacárido es dextrina de malta. 27. Una composición probiótica caracterizada porque comprende: aproximadamente 3 por ciento en peso de cepa KE01 de Lactobacillus casei en polvo que tiene el número de acceso ATCC PTA- 3945 que tiene aproximadamente 1 05 a 1 01 1 CFU por gramo; aproximadamente 62 por ciento en peso de trehalosa; aproximadamente 5 por ciento en peso de fructo-oligosacárido; y aproximadamente 30 por ciento en peso de dextrina de malta. 28. Un método para inhibir la enfermedad patógena entérica en una animal caracterizado porq ue comprende: administrar una cantidad eficaz de las composiciones probióticas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 , 1 1 , 12, 13, 20, o 26 a un animal en necesidad de las mismas. 29. El método según la reivindicación 28, caracterizado porque dicho patógeno entérico se selecciona a partir del grupo que consiste en Escherichia coli enteropatogénico (EPEC), E. coli enterotoxigénico (ETEC), Salmonella enteriditis, Yersina pseudotuberculosis y Listeria monocytogenes. 30. El método según la reivindicación 28, caracterizado porque dicho animal se selecciona a partir del grupo que consiste en mam íferos, peces, aves, y reptiles. 31 . El método según la reivindicación 30, caracterizado porque dicho animal se selecciona a partir del grupo que consiste en seres humanos, caballos, perros, gatos, conejos, ovejas, cerdos y vacas. 32. El método según la reivindicación 30, caracterizado porque dicha ave se selecciona a partir del grupo que consiste en pollos, pavos, faisanes, codornices, periquitos, y pericos. 33. El método según la reivindicación 28, caracterizado porque dicha etapa de administración comprende además una composición probiótica seleccionada a partir del grupo que consiste en cápsulas de gelatina, tabletas comprimidas, cápsulas de gelatina, alimentos y bebidas para animales.