JP5970483B2 - 胞子欠損B.テクサスポルス(B.texasporus)細胞、及び効率的且つ費用対効果の高い不活性化のための方法、及びその使用 - Google Patents
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Description
本願は、2011年3月1日出願の米国特許仮出願番号第61/447,703号の利益を主張し、その全体が参照によって組み込まれる。
PTA−5854の胞子形成能欠損変異体を単離する試みは、次のように行った。PTA−5854細胞を、EMSを用いて突然変異させた後、LB寒天上に播種した。約50,000のコロニーを、1時間75℃で、処理に対する感度についてスクリーニングし、42の温度感受性候補株を単離した。これらの初期の候補株を、コロニー精製し、熱感度について再試験した。PTA−5854株及び温度感度候補株を、液体LB培地中で、37℃で3日間増殖した。次に細胞を、100μLのアリコートとして滅菌マイクロチューブへ分注し、様々な温度(75、70、65、60、55、50又は37℃)で、異なる時間(5、15、30又は60分間)インキュベートした。処理した細胞をLB寒天上に播種し、播種効率を決定するために、一晩37℃でインキュベートした。熱ショック処理の後の生存率を、熱ショック無しでの37℃における播種効率で割った、熱ショック後の播種効率として計算した。
表1.B.テクサスポルス細胞(2日齢のL−ブロス培養として)の温度感受性
表2.B.テクサスポルス細胞(2日齢のL−ブロス培養物として)のストレス感受性
ウェルシュ菌(タイプA)の経口曝露によって引き起こされた壊死性腸炎の予防における、獣医グレードのBTペプチド(免疫調節性BTカチオンペプチドを含有する不活性化B.テクサスポルス細胞を含む)の影響を評価するために、壊死性腸炎病変及び/又は脂肪率は、曝露した鳥において得た。
表3.不活性化B.テクサスポルス細胞の経口投与を用いた、ブロイラーにおける壊死性腸炎の予防
2 病変スコアは、平均二乗誤差を含む治療サブセット*n=25の平均値によって表された。
3 死亡率は、陽性対照(対照飼料)と比較した発生率データにより表される(p<0.05)。
4 log10cfu/gは、治療サブセットの平均値により表される(n=10)。
A−B 一般的な上付き文字の内同じ列内の平均は、大きく異なる(p<0.05)。
孵化の日、ニワトリのヒナをサンダーソンファーム(ブライアン)から得て、無作為に実験群にわけ、清潔な松の削り屑の上の個々の床飼育檻へ配置した。全ての動物は、NRCガイドラインを満たし又は基準を超えている、市販の全粒小麦ベースのブロイラースターター飼料及び水を自由に摂取した。鳥は、1日目から24日目を通して、対照飼料又は24ppm又は48ppmの獣医グレードのBTペプチドを含む飼料のいずれかを給餌した。
0=肉眼病変はなく、正常な腸の外観。
1=薄壁又は砕けやすい、グレーの外観
2=薄壁、巣状壊死、灰色の外観、少量のガス生産。
3=薄壁、かなりのパッチの壊死、ガスが満たされた腸、血液の小さな斑点。
4=重度の広範な壊死、顕著な出血、腸内に満たされた大量のガス。
細胞がインビトロアッセイにより測定した場合、抗生物質活性を有するように見える天然のBTペプチドを運搬するにも関わらず、獣医グレードのBT(不活性化されたB.テクサスポルス細胞)は実際に非抗生物質である。しかしながら、in vitroアッセイは、人工的な結果を生成すると考えられる。BTは、in vivoでは抗生物質として作用せず、代わりにそれは動物の免疫システムを強化する/プライミングすると考えられており、有益な共生細菌のレベルは相対的に影響を受けないままである理由を説明しているが、有害な細菌のレベルは、BTペプチド又は細胞を用いて処置された動物において低減される。これはまた、96ppmで経口的に送達された獣医グレードのBT(不活性化細胞内)は、in vitroアッセイを使用して、BTセンシティブな有益である共生腸内細菌であるように考えられるものについて、in vivoでの影響がなかったことを説明する(実施例4を参照)。
この実験の目的は、アイメリア属最大曝露のストレス有り又は無しのブロイラーにおける、96ppmの高レベルで、獣医グレードBT(「BTペプチド」と呼ばれる、BTペプチドを含む不活性化されたブレビバチルス・テクサスポルス細胞)の供給の安全性を評価することであった。給餌試験は、2つの連続した別個の試験として実施した。
Ross508型ブロイラーは、商業的孵化場で約一ヶ月離れて2つの別々の日に孵化した。両方の試験において、66匹のオスのヒナをニワトリ小屋へ輸送した。ヒナを計量し、4又は5のグループでケージに入れた。鳥時間で到着後13日目に鳥を、それぞれ2つの檻を含む4部屋に移動し、それぞれの檻には、8羽を収容した。一つの対照群及び一つのBT群は、それぞれの部屋に存在していた。鳥を檻へ移した後、E.maximaオーシスト(対照の鳥のための飲料水)を、鳥の作物へチューブフィードした。
表4.処理あたりの鳥の量
表5.飼料組成物
飼料2=対照飼料+kgあたり0.096gのペプチドと同等で獣医グレードBT
回収した細菌DNAを定量的PCRにより分析し、異なる細菌群の量を算出することが可能になった。以下の細菌は、分析されたビフィドバクテリウム属、大腸菌、バチルス属菌、及びウェルシュ菌群クラスターIであった。DNAの決定のために、三重サンプルを使用し、新鮮な消化のグラムあたりの細菌の平均量を算出した。
曩の重量は全てのプールごとに2羽から測定した。曩は、第二の試験についてのみ秤量した。
アイメリア曝露は、大幅に対照鳥の成長を減少させた。しかしながら、BTペプチド補完食は、対照群と比較して、非曝露及びアイメリア曝露群の両方において鳥のいくらかの増加した成長を示した(図2)。20日目で、BTペプチド群の鳥は、少し重く感じられたが、統計学的有意差を見出すことはできなかった。20日目の非曝露鳥の重量は、第一及び第二の試験とは別に調べた場合、第二の試験における鳥の重量は、対照群と比較した場合、BTペプチド補完飼料により、有意に(p=0.026)増加した。
表6.死亡率(%)
本研究は、体重増加、サルモネラコロニー化及び白血球機能に対する効果のために、ブタの飼料添加物としての、獣医グレードのBT(不活性化B.テクサスポルス細胞)の使用の試験である。
実験の設計。離乳時(生後17〜21日)に、仔ブタを5個体のグループで、暖房のために熱ランプを備える檻へランダムに配置した。仔ブタに、水、及び国立研究評議会(1994)のガイドラインを満たす非薬用フェーズI飼料を自由摂取で与えた。離乳後0日、3日、5日及び7日に体重を記録した。ブタを4つの実験グループに配置した。それぞれ5匹のブタを含んだグループ1及び2は、それぞれ0ppm又は12ppm(反復1)又は24ppm(反復2、3)BTペプチドを含む、コントロールバランスの薬用ではないトウモロコシ及び大豆ミールベースの飼料を給餌した。グループ3及び4は、0又は12(又は24)ppmのBTペプチドを含む飼料を給餌されたが、これらのグループ中のブタは、ネズミチフス菌(ST)に曝露した。実験の間中、ブタにこれらの飼料を給餌した。BTペプチドは、予混合として不活性化したB.テクサスポルス細胞の形態で送達した。
以下に表したデータから、サルモネラ感染(24ppm)の存在下で行われたにも関わらず、対照食を与えたブタよりも、BTを給餌したブタは平均日増体重(ADG)がより優れていたようである。
表7、平均日増体重。反復3、24ppmBT。ポンドの値(ポンド)。個々のブタから離乳後、0に、3に、5に及び7日に収集した体重のデータは、各時点についてプールした。データは、平均体重増加+/−標準偏差を表す。
表8.毎日の直腸スワブデータ
表9.組織から単離されたサルモネラ
表10.ブタ白血球酸化バースト活性。ブタは、試験器官を通じて、それぞれの飼料を与えた(24ppmBT)。ブタは、離乳後3、5及び7日目に採血した。データは、2回の反復を表し、10匹のブタ/群からプールした。データは、平均+/−標準偏差として表した。RFU=反射蛍光単位(1,000における)。
Claims (11)
- MYG11(PTA−12310)、MYG107(PTA−12309)、MYG110(PTA−12308)およびMYG113(PTA−12307)からなる群から選択される、胞子形成能欠損株。
- 細胞を不活性化するためにB.ラテロスポールス細胞の培養を、十分なストレスへ供することを含む、請求項1に記載の胞子形成能欠損BTペプチド産生B.ラテロスポールス株を不活化させる、不活化方法。
- 前記ストレスが、飢餓、温度衝撃、脱水、pH変化、アルコール曝露、洗浄剤による処理、加圧処理、酵素的破壊、機械的な力、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 前記BTペプチド産生B.ラテロスポールス株の前記生存率を、1×10−8未満に低減することを含む、請求項2に記載の方法。
- 前記ストレスが、前記細胞を少なくとも5分間少なくとも50℃に加熱すること、前記細胞を凍結防止剤の非存在下で凍結すること、前記細胞を80%未満の水分含有量まで脱水すること、洗浄剤を添加すること、前記細胞を噴霧乾燥すること、機械的な力を印加すること、及びそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項3に記載の方法。
- 請求項1に記載の胞子形成能欠損BTペプチド産生B.ラテロスポールス株を含む、強化された動物用飼料又は飲料。
- 10質量%未満の水分含有量を有する、請求項1に記載の胞子形成能欠損BTペプチド産生B.ラテロスポールス株。
- 動物(ただし、ヒトを除く)の前記成長速度及び飼料要求率を改善するための方法であって、
動物へ請求項6に記載の強化された動物飼料又は飲料を投与することと、
前記胞子欠損BT−ペプチド産生B.ラテロスポールス株を含まない飼料又は飲料を受け取る動物と比較して、前記動物の前記体重増加又は飼料要求率を改善することとを含む、方法。 - 動物(ただし、ヒトを除く)の疾患の予防及び/又は治療のための、請求項1に記載の胞子形成能欠損株の、使用。
- 前記疾患の予防及び/又は治療が、前記動物における病原体の個体数を減らすことを含み、前記病原体が、アシネトバクター、バチルス、ボレリア、カンピロバクター、クロストリジウム、大腸菌、腸球菌、淋菌、口蹄疫ウイルス、ヘモフィルス、インフルエンザウイルス、マンヘミア、マイコプラズマ、マイコパスツレラ、シュードモナス、サルモネラ、ブドウ球菌及び連鎖球菌から成る群から選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記疾患が、大腸菌症、サルモネラ症、壊死性腸炎、コクシジウム症、インフルエンザ、口蹄疫、豚繁殖・呼吸障害症候群、ウシ輸送熱肺炎、尿トラック感染症、肥満/メタボリックシンドローム及び2型糖尿病から成る群から選択される、請求項9に記載の使用。
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