PL192776B1

PL192776B1 - Pasza dla koni, szczep Lactobacillus plantarum JI:1, gatunek Lactobacillus AC:3 i zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum JI:1

Info

Publication number: PL192776B1
Application number: PL339733A
Authority: PL
Inventors: Marie-Louise Johansson; Clas Lönner
Original assignee: Probi Ab
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-05
Publication date: 2006-12-29
Also published as: DE69828188T2; AU9469698A; AR015948A1; CA2304977C; PL339733A1; KR20010015694A; HK1030889A1; EP1019488B1; WO1999018188A1; CN1272877A; BR9812713A; US6537544B1; JP4277295B2; SE9703606D0; AU744609B2; CN1148440C; SE511025C2; ATE284951T1; KR100433300B1; CA2304977A1

Abstract

1. Pasza dla koni, znamienna tym, ze zawiera jeden lub wieksza liczbe szczepów Lactoba- cillus wyizolowanych z blony sluzowej zoladka lub jelit konia i wykazujacych zdolnosc kolonizacji jelit konia, przy czym te szczepy sa wybrane z grupy obejmujacej Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520 i gatunek Lactobacillus AC:3 DSM 12429. PL PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są pasza dla koni, szczep Lactobacillus plantarum JI:1, gatunek Lactobacillus AC:3 i zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum JI: 1.

Zaburzenia flory jelitowej u koni mogą spowodować zmniejszoną zdolność do wchłaniania czynników odżywczych zawartych w paszy, mniejsze wykorzystanie paszy, mniejszą odporność na zakażenia oraz na rozmaite zakażenia towarzyszące. Do innych objawów zaburzeń flory jelitowej należą zmieniona konsystencja wydalin, które mają zazwyczaj zmienioną woń, oraz brzydki wygląd sierści zwierząt. Dobrze wiadomo, że zaburzenia flory jelitowej występują przede wszystkim w sytuacjach stresowych, na przykład podczas długotrwałego transportu zwierząt lub zmiany dotychczasowego środowiska, po zbyt intensywnym treningu i zmianie paszy, ale również na skutek leczenia antybiotykami. Zaburzenia flory jelitowej występują również u źrebiąt, które po raz pierwszy w życiu muszą nabyć własną florę jelitową.

Ze zmianą flory bakteryjnej w jelitach wiąże się występowanie szeregu zaburzeń, jak zapalenie błony śluzowej jelit i wrzód żołądka oraz zakażenia bakteryjne wywołujące np. ostre zapalenie okrężnicy, takie jak zakażenie laseczkami, objawiające się biegunką i toksemią, a wywoływane między innymi przez Clostridium difficile, oraz ból kolkowy, jak choroba Baron-Gruffa wywoływana przez Clostridium perfringens.

Dla oceny stanu zdrowia koni, związanego z występowaniem zaburzeń flory jelitowej, od dawna wykorzystuje się oznaczanie obecności pałeczek jelitowych w wydalinach. Uważa się, że wysoka zawartość tych bakterii wskazuje, że jelita są w dobrym stanie, podczas gdy niską zawartość tych bakterii, a także wysoką zawartość gatunków Bacillus i Clostridium wiązano z występowaniem zaburzeń flory jelitowej. Uważa się również, że obecność pleśni i innych grzybów zaburza prawidłową florę jelitową. Ponadto uważa się, że spadek temperatury ciała poniżej 37°C wskazuje na istnienie zaburzeń w przewodzie żołądkowo-jelitowym. Prawidłowa temperatura ciała u koni wynosi 37,3 - 37,8°C.

Pałeczki kwasu mlekowego stanowią jedną z głównych grup mikroorganizmów stanowiących jelitową florę bakteryjną u zdrowych koni. Fujisawa i inni opisali w Bifidobacteria Microflora, tom 12(2), str. 87-90, 1993, izolację 286 szczepów pałeczek kwasu mlekowego z przewodu żołądkowo-jelitowego zdrowych koni. Większą część tych szczepów udało się zidentyfikować jako należące do gatunków L. salivarius, L. acidophilus i L. reuteri, przy czym dwa ostatnie gatunki występowały we wszystkich częściach przewodu żołądkowo-jelitowego, a L. salivarius nie wyizolowano z żołądka. Należy również pamiętać, że na mikroflorę bakteryjną wywiera wpływ rodzaj paszy, jaką karmiony jest koń.

Od dłuższego czasu stosuje się probiotyki, to znaczy różne podawane doustnie preparaty zawierające bakterie i drożdże, mając na celu poprawę stanu zdrowia ludzi i zwierząt w sytuacjach, w których występują zaburzenia flory jelitowej, co powoduje poprawę czynności jelit i poprawę ogólnego stanu zdrowia. Jako probiotyki powszechnie stosuje się różne szczepy bakterii wytwarzających kwas mlekowy, takie jak szczepy Lactobacillus i Streptococcus. Hipoteza leżąca u podstaw stosowania probiotyków głosi, że jeżeli do jelit zwierząt w stanie stresu lub choroby, to znaczy w sytuacjach gdy występuje zaburzenie flory jelitowej i zaznacza się przewaga bakterii patogennych, wprowadzi się odpowiednią ilość odpowiednich bakterii, ta przewaga bakterii patogennych zostanie zrównoważona. Aby zapobiec rozwojowi zaburzeń związanych z nieprawidłową florą jelitową konieczne jest utrzymywanie zdrowej flory bakteryjnej.

W Fox Vterinary Medicine, z sierpnia 1988, w pracy pt. Probiotlcs: Intestinal inoculants for production animals przedstawiono omówienie różnych dostępnych na rynku probiotyków, stosowanych podczas hodowli różnych zwierząt, zwłaszcza kurcząt, świń i cieląt.

Obecnie często karmi się konie, których wydaliny mają nieprawidłową woń, kwaśnym mlekiem lub jogurtem, co umożliwia zwalczenie zaburzeń flory bakteryjnej w żołądku i jelitach. Do dostępnych na rynku produktów przeznaczonych do stosowania u koni należą np. Bakteriebalans (Lantmannen, Szwecja) i Lactosat®hast (Ewos Sverige AB, Sodertalje), oba zawierające trzy różne szczepy bakterii wytwarzających kwas mlekowy, to znaczy Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus i Streptococcus faecium. Wspólną cechą tych środków jest to, że pałeczki kwasu mlekowego, zawarte w stosowanych produktach, są takie jak naturalne bakterie dominujące w sfermentowanym produkcie albo takie jak bakterie wyizolowane od człowieka.

Innym środkiem, stosowanym w leczeniu zaburzeń flory jelitowej u koni, jest ColiCure (VETTECH AB, Sztokholm), który zawiera oczyszczony i stabilizowany szczep Escherichia coli, pierwotnie wyizolowany od konia, w stężeniu >10⁹ żywych bakterii na mililitr. Taka sama zasada leży u podstaw

PL 192 776 B1 podawania „mieszanki”, to znaczy rozproszonych wydalin zdrowych koni, dla uzyskania szczepu, który pasuje do środowiska wewnątrzjelitowego i może się tam zagnieździć. Kontrowersyjne jest jednakże dodawanie bakterii z rodziny Enterobacteriaceae, np. E. coli, z uwagi na ich chorobotwórczość oraz obecność endotoksyn.

W EP 0 203 586 ujawniono środek przeznaczony do leczenia zaburzeń układu żołądkowojelitowego u zwierząt, zwłaszcza zaburzeń wywoływanych przez enterotoksyczne szczepy Escherichia coli, który to środek zawiera szczep Lactobacillus fermentum ATCC 53113 wyizolowany od świni. Uważa się, że korzyści związane ze stosowaniem nowego środka polegają na tym, że nie jest on patogenny, oraz że działa poprzez zapobieganie wiązaniu się wywołujących zakażenia organizmów z błoną śluzową jelit. Przedstawiono również przegląd różnych bakterii stosowanych w celu profilaktyki lub leczenia zaburzeń układu żołądkowo-jelitowego, które jednakże okazały się być jedynie częściowo skuteczne.

Uprzednio wykazano, że pewne szczepy Lactobacillus plantarum mają przez określony czas zdolność do kolonizacji układu jelitowego u ludzi. W EP 92916294.9 opisano pewne szczepy Lactobacillus, zwłaszcza L. plantarum 299 DSM 6595 oraz jego odmiany, mające zdolność do kolonizacji jelit oraz do pozostawania w jelitach przez co najmniej 11 dni po podaniu doustnym. Okazało się, że te szczepy wywierają korzystne działanie na różne zaburzenia jelitowej mikroflory bakteryjnej u ludzi.

Prawidłowa flora pałeczek kwasu mlekowego, występująca w jelitach zwierząt różnych gatunków jest różna i, mimo że te same gatunki Lactobacillus można znaleźć u dwóch różnych gatunków zwierząt, te bakterie zazwyczaj nie należą do tego samego szczepu tego gatunku. Poszczególne szczepy różnią się między sobą, co w istotny sposób wpływa na możliwość kolonizacji przez te organizmy nowego środowiska. Zatem, aby możliwe było leczenie zaburzeń układu żołądkowe-jelitowego u koni, istnieje zapotrzebowanie na bezpieczny, nietoksyczny produkt zawierający jeden lub większą liczbę szczepów bakterii mających zdolność kolonizacji jelit u koni.

Nieoczekiwanie stwierdzono, że dzięki zastosowaniu nowych szczepów Lactobacillus uzyskano paszę, która leczy wywoływane przez mikroorganizmy zaburzenia jelitowe lub im zapobiega.

Wynalazek dotyczy paszy dla koni, która cechuje się tym, że zawiera jeden lub większą liczbę szczepów Lactobacillus wyizolowanych z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i wykazujących zdolność kolonizacji jelit konia, przy czym te szczepy są wybrane z grupy obejmującej Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520 i gatunek Lactobacillus AC:3 DSM 12429.

Pasza według wynalazku to korzystnie pasza poddana fermentacji z użyciem szczepu Lactobacillus wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i wykazującego zdolność kolonizacji jelit konia, przy czym te szczepy są wybrane z grupy obejmującej Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520 i gatunek Lactobacillus AC:3 DSM 12429.

Pasza według wynalazku to korzystnie pasza, którą stanowi zboże, warzywa, pasza zielona lub siano.

Pasza według wynalazku korzystnie stanowi kleik owsiany poddany fermentacji z użyciem Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520 lub gatunku Lactobacillus AC:3 DSM 12429.

Pasza według wynalazku korzystnie stanowi paszę kiszoną.

Wynalazek dotyczy również nowego szczepu Lactobacillus plantarum JI:1, który został zdeponowany w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 21 kwietnia 1997 r. pod numerem DSM 11520.

Wynalazek dotyczy również nowego gatunku Lactobacillus AC:3, który został zdeponowany w Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 2 października 1998 r. pod numerem DSM 12429.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Lactobacillus plantarum JI:1 o numerze depozytu DSM 11520 wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelita konia i mającego zdolność kolonizacji jelit konia do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia zaburzeń flory jelitowej u konia.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Lactobacillus plantarum JI:1 o numerze depozytu DSM 11520 wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i mającego zdolność kolonizacji jelit u konia do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia nieżytu żołądka u konia.

Ponadto wynalazek dotyczy zastosowania szczepu Lactobacillus plantarum JI:1 o numerze depozytu DSM 11520 wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i mającego zdolność kolonizacji jelit u konia do wytwarzania leku do zmniejszania liczby bakterii gatunku Bacillus i laseczek beztlenowych redukujących siarczyny w jelitach konia.

PL 192 776 B1

Stosowane w tym opisie pojęcie „koń dotyczy organizmów rodzaju Equidae, to znaczy, oprócz koni, również osłów i zebr, u których skład flory jelitowej jest podobny.

Pasza według wynalazku korzystnie jest oparta na paszy na bazie ziaren zbóż lub paszy uzupełniającej, warzywach, paszy zielonej albo sianie.

Paszę według wynalazku korzystnie stanowi pasza kiszona na bazie paszy zielonej lub siana, poddanych fermentacji z użyciem jednego lub większej liczby szczepów Lactobacillus wyizolowanych od konia.

Okazało się, że opisane powyżej szczepy dobrze rosną na owsie i umożliwiają uzyskanie paszy o dobrym smaku, przeżywają przejście przez przewód żołądkowo-jelitowy konia oraz mają zdolność kolonizacji jelit konia. Przeprowadzone testy wykazały, że nowy szczep Lactobacillus plantarum JI:1 zmniejsza zawartość niepożądanych bakterii w jelitach konia, np. całkowitą liczbę bakterii Bacillus i całkowitą liczbę bakterii Clostridium, oraz wydaje się poprawiać odpowiedź immunologiczną konia.

Pasza według wynalazku może być paszą uzupełniającą lub paszą i może mieć postać stałą lub ciekłą. Pasza może być paszą opartą na ziarnie lub paszą uzupełniającą na bazie dowolnego rodzaju paszy, którą można poddać fermentacji z użyciem wybranych szczepów pałeczek kwasu mlekowego, np. na zbożach, jak owies, między innymi czarny owies, jęczmień, pszenica, żyto, sorgo lub kukurydza, lub innych warzywach, takich jak warzywa strączkowe, zwłaszcza soja, warzywa korzeniowe i kapusta, lub pasza zielona, jak trawa lub siano.

Korzystną paszą jest owies ze względu na wysoką zawartość witamin i minerałów, odpowiednio zbilansowany skład aminokwasów, zawartość polarnych lipidów oraz włókien. Ostatnio okazało się, że szereg odmian owsao wyższej zawartości tłuszczu może być odpowiednią paszą o dużej wydajności dla koni.

Paszę według wynalazku w korzystnej postaci można wytwarzać z owsa, jak opisano w publikacji międzynarodowego zgłoszenia patentowego WO 89/08405, dotyczącej wytwarzania środka odżywczego. Inne przykłady wytwarzania korzystnych pasz podano poniżej.

Paszę według wynalazku można podawać przed sytuacjami stresowymi lub w ich trakcie, np. podczas rozgrzewki przed wyścigiem, przed transportem zwierząt itp. koniom, u których w takich sytuacjach zwykle występuje biegunka; do poprawienia ogólnego stanu chudych koni, zwierząt bez apetytu oraz z nieprawidłową sierścią; do zwiększenia odporności koni na zakażenia, czyli wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej; podczas leczenia zwierząt antybiotykami dla zapobieżenia wystąpieniu zaburzeń flory jelitowej, jakie zwykle w takich przypadkach mają miejsce i powoduje wystąpienie biegunki, częstego powikłania leczenia antybiotykami; koniom, które mają wrzód żołądka; koniom, u których biegunka i nieprawidłowa woń wydalin może być skutkiem zakażenia Clostridium difficile lub innymi patogennymi mikroorganizmami.

Zawartość pałeczek kwasu mlekowego nie powinna być niższa niż 5·10⁸ CFU/g lub ml, a odpowiednia dawka dla dorosłych koni wynosi 2·10¹² CFU na dzień, co odpowiada około 2-4 litrom kleiku owsianego opisanego w poniższych przykładach lub około 100-200 ml zamrożonej hodowli, jak podano poniżej. W szczególnych sytuacjach można bez ryzyka stosować wyższą ilość bakterii. W przypadku podawania źrebiętom należy podawać mniejsze ilości.

Poniżej opisano doświadczenia przeprowadzone z użyciem badanych szczepów.

W celu wytworzenia nowego szczepu najpierw wyizolowano od konia reprezentatywne szczepy Lactobacillus, które zostały sklasyfikowane i zbadane, czy wykazują zdolność do wywoływania fermentacji owsa i odpowiednio szybkiego zmniejszania wartości pH, czy zapewniają otrzymanie produktu o odpowiednim smaku i zapachu, oraz na koniec przeprowadzono eksperymenty polegające na karmieniu koni dla oceny uzyskanych w ten sposób wyników.

Izolacja szczepów pałeczek kwasu mlekowego

Badano florę pałeczek kwasu mlekowego w przewodzie żołądkowo-jelitowym dziesięciu zdrowych koni, które zostały uśmiercone, poprzez pobranie biopsji 1-2 cm² błony śluzowej jelit w trzech różnych miejscach, to znaczy w dolnym żołądku (pylorus), w jelicie cienkim (ileum) oraz w jelicie grubym (colon). Pobrane próbki tkanki ostrożnie przemyto bezpośrednio jałowym roztworem do transportu (0,9 g NaCl, 0,1 g peptonu, 0,1 g Tween 80, 0,02 g cysteiny na litr) dla usunięcia zanieczyszczeń bakteryjnych w tych próbkach, które następnie utrzymywano w chłodzie podczas transportu do laboratorium. W laboratorium próbki umieszczano w łaźni ultradźwiękowej na okres pięciu minut, a następnie we wstrząsarce do probówek na dwie minuty dla uwolnienia bakterii z błony śluzowej jelit. Pobrano łącznie 51 próbek.

Identyfikacja flory pałeczek kwasu mlekowego w przewodzie żołądkowo-jelitowym konia

PL 192 776 B1

Z każdej próbki pobrano 1 lub 2 wyizolowane pałeczki kwasu mlekowego i określono zdolność do wywoływania fermentacji 49 różnych źródeł węgla, z zastosowaniem układu API 50 CH (API Systems S.A., Montalieu, Vercieu, Francja). Badanie to prowadzi zazwyczaj do uzyskania wzorców odpowiadających poszczególnym gatunkom, a uzyskane wyniki porównano z wynikami uzyskanymi dla 200 różnych, znanych szczepów Lactobacillus obejmujących wszystkie rodzaje szczepów wszystkich znanych pałeczek kwasu mlekowego. Uzyskano następujące wyniki.

Gatunek Wyizolowane organizmy (%)

L. salivarius 14

Organizmy podobne do L. salivarius 29

Organizmy podobne do L. reuteri 14

L. johnsonii 4

Organizmy podobne do L. johnsonii 10

L. plantarum 12

L. animalis 6

L. brevis 2

Organizmy podobne do L. vaccinostercus 2

L. murinus 2

L. species 4

Wybrane szczepy i ich właściwości

Następnie zbadano zdolność wyizolowanych bakterii do fermentacji kleiku owsianego, przygotowanego w następujący sposób.

18,5% wagowych mąki owsianej (MP-450, Kungsornen AB, Jarna) i 0,925% wagowych słodowej mączki jęczmiennej (MBF, Nord Malt AB, Soderhamn) zmieszano z wodą wodociągową i ogrzano do temperatury 95°C w trakcie powolnego mieszania. Po 30 minutach kleik ochłodzono do temperatury 37°C i poddano fermentacji z użyciem różnych szczepów przez okres 20 godzin, do uzyskania wartości pH poniżej 4. W szczególności badano szybkość spadku wartości pH, zapach i smak końcowego produktu. Najlepsze wyniki uzyskano w przypadku użycia wyizolowanych bakterii L. plantarum i organizmów podobnych do L. salivarius jako hodowli początkowych, a najgorsze wyniki uzyskano w przypadku użycia L. reuteri i organizmów podobnych do L. johnsonii.

Na podstawie przedstawionych powyżej wyników wybrano dwa szczepy. Fenotypy szczepów ustalono z użyciem API 50 CH, a ich genotypy ustalono drogą analizy metodami RAPD i REA jako odpowiednio Lactobacillus plantarum JI:1 i gatunek Lactobacillus AC:3. W tym procesie oczyszczone wyizolowane mikroorganizmy inkubowano przez noc w bulionie. Przed zaszczepieniem na pożywce API 50 CHL, hodowle przemyto raz 0,9% roztworem NaCl. Próbki badano po 2 i 7 dniach. Wyniki oceniano w skali od 0(fiolet) do 5 (żółty), a uzyskaną wartość 3-5 uważano za dodatnią.

Szczepy scharakteryzowano opisanymi poniżej metodami i przedstawiono wyniki na rysunku, na którym fig. 1 przedstawia fotografię żelu elektroforetycznego z uwidocznionymi szczepami w wyniku analizy metodą RAPD, a fig. 2 przedstawia fotografię żelu elektroforetycznego z uwidocznionymi szczepami w wyniku analizy metodą REA.

Ustalanie genotypu

Losowo wzmacniany polimorficzny DNA (RAPD)

RAPD to reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR), składająca się z powtarzających się cykli denaturacji matrycy, hybrydyzacji starterów oraz wydłużania starterów. Powoduje to wzmocnienie (amplifikację) pewnych fragmentów genomu.

Oczyszczone wyizolowane bakterie hodowano przez noc w pożywce Lactobacillus Carrying Medium (LMC, Efthymiou i Hansen, 1992), zawierającej 1% glukozy. Komórki zawarte w 100 ml hodowli oddzielano przez wirowanie i przemywano dwukrotnie 1ml jałowej wody destylowanej. Komórki zawieszano w 0,25 ml jałowej wody destylowanej, a następnie rozdrabniano przez energiczne wstrząsanie wraz z kulkami szklanymi (o średnicy 0,2 mm) z użyciem wstrząsarki IKAVibrax VKR (IKA Laortechnik Staufen, Niemcy) przy maksymalnej prędkości przez 30 minut w chłodzie. Szczątki rozpadłych komórek oddzielano przez wirowanie, po czym 1 ml supernatantu stosowano w PCR. PCR prowadzono w urządzeniu DNA Thermal Cycler 480 (Perkin Elmer, Norwalk, Stany Zjednoczone) z użyciem 9-merowego startera (ACGCGCCCT; Pharmacia Biotech, Szwecja) w stężeniu 8 mmol/l. Nukleotydy dodawano w stężeniu 0,2 mmol/Ikażdego dNTP (Perkin Elmer; Branchburg, NJ, Stany Zjednoczone). Stężenie polimerazy Taq wynosiło 50 U/ml (Boehringer Mannheim), a stężenie buforu wynosiło 100 U/ml (10 x bufor PCR; Boehringer Mannheim). Mieszaninę reakcyjną pokrywano olejem mineralnym

PL 192 776 B1 i poddawano następującym cyklom temperaturowym: 94°C, 45s; 30°C, 120s; 72°C, 60s przez pierwsze cztery cykle, a następnie: 94°C, 45s; 36°C, 30s; 72°C, 30s przez 26 cykli (etap wydłużania prowadzi się w każdym nowym cyklu o 1 sekundę dłużej). Proces PCR kończono w temperaturze 75°C przez 10 minut, po czym próbki chłodzono do temperatury 4°C.

Elektroforezę żelową wykonywano przez naniesienie 20 ml próbki na zanurzoną, poziomą płytkę żelu agarozowego, zawierającą 75 ml 1,5% agarozy (typu III: High EEO, Sigma, St. Louis, Stany Zjednoczone) o wymiarach 150 x 115 mm. Elektroforezę żelową prowadzono przez około 2,5 godziny przy 100 V w buforze do elektroforezy TB (89 mM kwas borowy, 89 mM Tris-OH, 2,5 mM EDTA, pH 8,3) bez chłodzenia. Jako wzorzec stosowano 0,5 mm marker masy cząsteczkowej DNA VI (Boehringer Mannheim Scandinavia, Bromma, Szwecja). Po elektroforezie żele barwiono bromkiem etydyny (3 mg ml^-1) przez 5 minut, a następnie przez 10 minut przemywano i uwidaczniano przy długości fali 302 nm z użyciem transiluminatora (UVP Inc., San Gabriel, Kalifornia, Stany Zjednoczone) i fotografowano.

Figura 1 przedstawia obraz uzyskany metodą RAPD, od lewej do prawej: L. plantarum JI:1, typowy szczep L. plantarum ATCC 149 17^T oraz marker. Widoczne jest, że obraz tego nowego szczepu według wynalazku różni się nieco od obrazu typowego szczepu. W podobny sposób różnił się proponowany szczep podobny do Lactobacillus salivarius AC:3 (według API) od typowego szczepu L. salivarius ssp. salivarium ATCC 11741 (dane nie pokazane).

Oczyszczanie chromosomalnego DNA

Przygotowanie i oczyszczanie chromosomalnego DNA prowadzono metodą opisaną w publikacji Stahl i inni, International Journal of Systematic Bacteriology 40: 189-193, 1990. Szczep hodowano przez noc w temperaturze 37°C w 100 ml bulionu z dodatkiem 1% glukozy, po czym bakterie zbierano i przemywano w TES (50 mM NaCl, 100 mM Tris, 70 mM EDTA sodowy, pH 8,0) i zawieszano w 3 ml TES + 25% (stosunek wagowo-objętościowy) sacharozy. Następnie dodano 2 ml TES + 25% sacharozy z dodatkiem 120 mg lizozymu (jakość VI, Sigma) i 140 U mutanolizyny (Sigma). Komórki inkubowano w temperaturze 42°C przez 2 godziny, po czym dodano 3 mg proteinazy K (jakość XI, Sigma) i zawiesinę inkubowano dalej w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po ochłodzeniu na lodzie dodano 1 ml roztworu 5% NaCl, 1 ml 20% siarczanu dodecylu i 11 ml TES i zawiesinę ostrożnie mieszano szklaną pałeczką i ogrzewano do temperatury 65°C. Lizat komórkowy wyekstrahowano jeden raz z użyciem fenolu-chloroformu (1:1) i jeden raz z użyciem alkoholu izoamylowego-chloroformu (1:24). Następnie strącono DNA z użyciem etanolu w temperaturze 20°C.

Następnie oczyszczono chromosomalny DNA i oddzielano od związanego kowalencyjnie zamkniętego kolistego DNA plazmidowego przez wirowanie w gradiencie gęstości z zastosowaniem gradientu CsCl z bromkiem etydyny, metodą opisaną w publikacji Bauer i Vinograd, Journal of Molecular Biology 33, 141-171, 1968. Stężenie DNA określano z użyciem fluorymetru (model TKO 100 Hoefer Scientific Instruments, San Francisco) i barwnika Hoechst 33258, zgodnie z zaleceniami producenta.

Analiza z użyciem endonukleazy restrykcyjnej (REA)

Porcje oczyszczonego chromosomalnego DNA o masie 0,75 mg trawiono oddzielnie w temperaturze 37°C przez 4 godziny z użyciem 10 U Hindlll, ClaIi EcoRI (Boehringer Mannheim). Elektroforezę żelową przeprowadzano z użyciem zanurzonych poziomych płytek żelu agarozowego, zawierających 150 ml 0,9% agarozy (ultrapure quality DNA, BioRad Laboratories), uformowanych w postaci płytek z żelu. Jako wzorce stosowano 0,2 mg markera DNA o wysokiej masie cząsteczkowej (BRL) wraz z 0,5 mg markera VI masy cząsteczkowej DNA (Boehringer Mannheim). Jako wewnętrzny wzorzec stosowano ponadto pHC 79, trawiony z użyciem EcoRI, dodawany do każdej studzienki. Najmniejsze zniekształcenie prążków i ich najwyższą ostrość osiągano przez dodanie próbki DNA w buforze ładującym Ficoll (2g Ficoll, 8 ml wody, 0,25% bromofenolu).

Fragmenty oddzielano na 0,9% żelach agarozowych w temperaturze 8,5°C i przy 40 V przez 18 godzin, a następnie barwiono przez 20 min bromkiem etydyny (2 mg/ml), przemywano wodą destylowaną i fotografowano. W ten sposób otrzymywano dobrze rozproszone i nieźle oddzielone prążki, aż do masy cząsteczkowej 1,2 x 10⁶, patrz fig. 2. Figura ta przedstawia uzyskany metodą REA obraz szczepów Lactobacillus plantarum J I : 1 , 299vi ATCC 149 17^T (typowy szczep) po kolejnym traktowaniu bakterii odpowiednio enzymami Ecco R1, Cla1i Hind III. Pierwsza i ostatnia ścieżka przedstawia marker. Szczep AC:3 analizowano z użyciem REA i stwierdzono, że różni się on od typowego szczepu Lactobacillus salivarius ssp. salivarius (dane nie pokazane).

PL 192 776 B1

Przykłady pasz

Wytwarzanie kleiku owsianego w skali przemysłowej

Zmieszano 318 kg mąki owsianej, 12,8 kg słodowej mączki jęczmiennej i 1682 litry wody, mieszaninę ogrzano do 88°C, przy czym początkowo temperaturę utrzymywano na poziomie 55°C przez 1 godzinę, a następnie 88°C przez 0,5 godziny. Następnie mieszaninę ochłodzono do temperatury

38°C, co trwało około 0,5 godziny. W tej temperaturze w 2000 litrów mieszaniny zaszczepiono hodowlę Lactobacillus plantarum Jl:1 w ilości 2 litrów, przy czym uzyskano stężenie 2·10⁷ CFU/ml. Całość mieszaniny inkubowano w 38°C przez 15-20 godzin, po którym to czasie wartość pH powinna zmniejszyć się do < 3,9. Sfermentowaną mieszaninę następnie ochłodzono do 6-8°C, a po zapakowaniu i przechowywaniu w chłodzie była ona gotowa do dystrybucji i sprzedaży.

Świeżo wytworzony produkt końcowy zawierał 1-2·10⁹ CFU/ml, a po przechowywaniu przez okres 1-2 miesięcy liczba bakterii zmniejszyła się do około 5·10⁸ CFU/ml.

Wartość odżywczą powyższego produktu podano w poniższej tabeli.

Wartość odżywcza	na 100 g	na 2 kg
Wartość energetyczna	240 kJ = 57 kcal	4780 kJ=1143 kcal
Białko	2,1 g	41,5 g
Włókna jadalne*	1,5 g	29 g
Tłuszcz**	1,1 g	23 g
Węglowodany	10 g	190 g
Witamina B1 (tiamina)	0,07 g	1,3 g

* według ASP i innych, J. Agric. Food Chem. 31: 476-482 ** według SBR, Nordisk Metodikkommitte for livsmedel No. 131, 1969.

W wyżej opisanym sposobie wytwarzania środka odżywczego dzięki dodaniu CaCO3 uzyskuje się nieco wyższą liczbę bakterii po nieco dłuższym procesie fermentacji (20-22 godziny).

Odpowiedni kleik owsiany otrzymuje się z użyciem jako hodowli początkowej bakterii gatunku LactobacillusAC:3.

Sfermentowana marchew

W celu wytworzenia porcji sfermentowanej marchwi, marchew (10 kg) przeciera się na grubej tarce lub w inny sposób dzieli na drobne kawałki. Gotuje się 5 litrów wody, a następnie pozostawia do ochłodzenia do temperatury 40°C. W tej temperaturze dodaje się Lactobacillus plantarum JI:1 (hodowla inicjująca 2·10¹¹ CFU, co odpowiada około 2 g zamrożonego suchego produktu lub 20 ml zamrożonej hodowli) oraz sól (100 g). Tartą marchew, gęsto ułożoną w jałowym pojemniku pokrywa się warstwą płynu zaszczepiającego. Pojemnik zamyka się, a następnie inkubuje w 24°C przez około 2 dni. Proces dojrzewania zachodzi w lodówce lub w chłodnej spiżarni i trwa około 3-4 tygodni. Sfermentowany produkt można następnie przechowywać w chłodzie przez okres około 1roku.

Produkt liofilizowany litr wody

200 g odtłuszczonego mleka w proszku g ekstraktu drożdżowego litr zawiesiny bakterii (5·10 CFU/ml)

Wymienione powyżej składniki miesza się i przenosi na jałowe płytki, które umieszcza się na półkach liofilizatora. Produkt zamraża się do temperatury około -40°C przed rozpoczęciem liofilizacji. Po około 3 dniach proces liofilizacji zostaje zakończony, a uzyskany produkt miele się na proszek, który następnie pakuje się do jałowych torebek w kontrolowanej atmosferze azotu. Jakość otrzymanego produktu nie zmienia się w okresie około 2 lat przechowywania w zamrażarce.

Hodowla zamrożona

Do 1 litra zamrożonej pożywki o składzie podanym poniżej dodaje się 1 litr zawiesiny bakterii

10 o zawartości bakterii wynoszącej 5·10¹⁰ CFU/ml.
diwodorofosforan potasu	0,36 g
wodorofosforan dipotasu	1,64 g
cytrynian trisodu	1,18 g
siarczan magnezu	0,5 g
gliceryna	240 g
woda destylowana	760 ml

Otrzymany produkt zamraża się w temperaturze -80°C w 200 ml butelkach. Wytwarzanie paszy kiszonej

PL 192 776 B1

Kiszenie paszy jest oparte na dwóch zasadach, to znaczy na obniżeniu wartości pH zielonej masy do 4,2 lub poniżej, oraz na usunięciu tlenu atmosferycznego. 50 g liofilizowanej hodowli Lactobacillus plantarum JI:1 miesza się z kilkoma litrami wody w celu rozpuszczenia proszku i następnie dodaje się jeszcze wody i kilka kilogramów melasy do uzyskania końcowej objętości 50 litrów. Po zwinięciu zielonej masy w bele i zapakowaniu w folię z tworzywa sztucznego, do masy dodaje się roztwór bakterii w ilości około 1 litra na 200 kg zielonej masy, za pomocą pompy dozującej, zamocowanej na sieczkarni lub prasie. Ważne jest uzyskanie równomiernego rozprowadzenia roztworu bakterii, tak aby bakterie wzrastały w całych belach. W przypadku gdy kiszonkę przygotowuje się w silosie, roztwór bakterii dodaje się za pomocą pompy dozującej poprzez wentylator silosu.

Badania in vivo na koniach

Podawanie L. plantarum JI:1 w kleiku owsianym

Badaniom poddano 10 kłusaków, przy czym pięciu z nich podawano 2 litry sfermentowanego kleiku owsianego codziennie przez osiem tygodni, a pozostałe pięć koni, które nie otrzymywały kleiku, stanowiły zwierzęta porównawcze. W sześciu różnych punktach czasowych pobierano wydaliny koni, bezpośrednio przed rozpoczęciem karmienia zwierząt kleikiem owsianym, po 1, 3, 6 i 8 tygodniach karmienia oraz w tydzień po momencie, w którym konie przestawały otrzymywać kleik owsiany. Drogą analizy mikrobiologicznej określano liczbę pałeczek kwasu mlekowego, bakterii Enterobacteriaceae i Bacillus. Badano również wartość pH pobranych próbek wydalin. Dodatkowo analizowano, jaką część flory pałeczek jelitowych stanowi L. plantarum JI:1.

Poza wykonaniem analizy mikrobiologicznej, w okresie prowadzenia badań przeprowadzano również subiektywną ocenę stanu koni. Do tej oceny należało badanie konsystencji i woni wydalin, ilości tkanki tłuszczowej u koni, połysku sierści oraz ogólnego stanu koni.

Uzyskane wyniki wskazują, że u dwóch koni w okresie karmienia znacznie wzrosła liczba pałeczek kwasu mlekowego. U obu tych koni zawartość pałeczek kwasu mlekowego była niska na początku badania. Z wydalin wszystkich koni, które otrzymywały sfermentowany kleik owsiany, wyizolowano bakterie L. plantarum JI:1. Liczba tych bakterii wynosiła od 1do 72% całkowitej flory pałeczek kwasu mlekowego. U trzech z czterech koni bakterie L. plantarum Jl:1 były nadal obecne w wydalinach w tydzień po zaprzestaniu karmienia kleikiem owsianym.

U czterech koni w okresie karmienia i w tydzień po zaprzestaniu karmienia znacząco zmniejszyła się zawartość bakterii gatunku Bacillus, podczas gdy nie obserwowano zmiany liczby bakterii Enterobacteriaceae ani wartości pH wydalin podczas trwania badań lub po ich zakończeniu.

Sfermentowany kleik owsiany był bardzo lubiany przez konie i stał się niemalże „smakołykiem”. Widoczne były również pewne oznaki zwiększonego apetytu u koni.

U jednego z koni, Luradej, numer rejestracyjny 90-4843, zanotowano występowanie nawracających zaburzeń układu żołądkowo-jelitowego. Wraz z pojawieniem się tych objawów obserwowano spadek temperatury ciała do wartości 36°C. Po stosowaniu sfermentowanego kleiku owsianego zawierającego bakterie Lactobacillus plantarum JI:1 przez dwa tygodnie, temperatura ciała po raz pierwszy od kilku miesięcy wzrosła u tego zwierzęcia do normalnego poziomu 37,5°C. Po ośmiu tygodniach zaprzestano stosowania kleiku owsianego, a po kolejnych 2-3 dniach temperatura ciała konia spadła ponownie do około 36°C. Po krótkiej przerwie konia ponownie zaczęto karmić kleikiem owsianym, wskutek czego znów temperatura ciała wzrosła do normalnego poziomu. Podobny wzorzec zachowania powtórzył się później jeszcze raz. Po dwóch latach codziennego stosowania opisanego kleiku owsianego koniowi Luradej podano koncentrat bakteryjny zawierający bakterie gatunku Lactobacillus AC:3 w tej samej ilości. W wyniku tego nastąpiła dodatkowa korzystna odpowiedzi w postaci poprawy stanu ogólnego zwierzęcia.

Podczas okresu badań jednego z koni leczono antybiotykiem o szerokim spektrum działania (Gentaject vet., 1,2 g dwa razy dziennie przez 7 dni). Podczas leczenia koni tym antybiotykiem zazwyczaj występują pewne działania niepożądane, np. długotrwałe zaburzenia układu żołądkowo-jelitowego. Wtym przypadku koń przez cały czas leczenia antybiotykiem, oraz dodatkowo przez szereg tygodni później, otrzymywał sfermentowany kleik owsiany, przy czym nie obserwowano występowania zaburzeń ani ze strony żołądka, ani jelit. Podobną obserwację poczyniono w przypadku innego konia i innego antybiotyku, również z pozytywnym wynikiem.

Kolonizacja przez L. plantarum JI:1 oraz jej wpływ na zawartość bakterii Enterobacteriaceae, Bacillus, Clostridium w wydalinach koni.

W tych badaniach stosowano również taki sam produkt, jaki stosowano w badaniach opisanych powyżej. Badaniom poddano łącznie 34 konie. Dwadzieścia sześć z nich umieszczono w sześciu różPL 192 776 B1 nych ośrodkach treningowych dla koni na południu Szwecji. Konie miały różne pochodzenie, część koni miała luźne wydaliny o nieprawidłowej woni i/lub ubogą tkankę tłuszczową oraz słaby połysk sierści. Konie karmiono różnymi rodzajami ziarna i różnymi paszami uzupełniającymi. Niektóre konie były również okresowo wypasane.

Konie karmiono 2 litrami sfermentowanego kleiku owsianego dziennie przez dwa miesiące, a w pewnych przypadkach przez trzy miesiące. Niewielką liczbę koni karmiono okresowo jedynie 1 litrem kleiku dziennie. Miało to miejsce na przykład wówczas, gdy niektóre konie wypasano i nie wykazywały one wówczas zainteresowania inną karmą niż trawa. Próbki wydalin pobierano bezpośrednio przed karmieniem koni sfermentowaną paszą oraz w momencie, gdy otrzymywały tę paszę przez 2-3 miesiące. Drogą analizy mikrobiologicznej określano całkowitą liczby pałeczek kwasu mlekowego, udział L. plantarum JI:1 w całkowitej liczbie pałeczek kwasu mlekowego, całkowitą liczbę Enterobacteriaceae, Bacillus i Clostridium, jak również liczbę B. cereus.

Poza wykonaniem analizy mikrobiologicznej, w okresie prowadzenia badań przeprowadzano również subiektywną ocenę stanu koni. Do oceny tej należało badanie konsystencji i woni wydalin, ilości tkanki tłuszczowej u koni, połysku sierści, aktywności zwierząt oraz apetytu.

Uzyskane wyniki wykazały, że również w tych badaniach znacząco wzrosła liczba pałeczek kwasu mlekowego (p < 0,05, analiza metodą testu rang Wilcoxona). Wartość środkowa przed rozpoczęciem karmienia wynosiła 1-10⁶ CFU/g wydalin (1 -10'⁵-1,7·10⁷), a po 2-3 miesiącach leczenia wzrosła do 3,5-10⁶ CFU/g (1·10^-5-3,8·10⁷). W wydalinach wszystkich karmionych koni znajdowano przede wszystkim bakterie L. plantarum JI:1.

Spadek całkowitej liczby bakterii Bacillus był bardzo wyraźny (p < 0,001, analiza metodą testu rang Wilcoxona), przy czym u 80% koniten spadek zaznaczał się po rozpoczęciu karmienia. Po leczeniu znacząco zmniejszyła się również liczba pałeczek beztlenowych redukujących siarczyny (p < 0,05, analiza metodą testu rang Wilcoxona). U 74% badanych koni nastąpiło zmniejszenie liczby pałeczek beztlenowych (konie, u których liczba tych bakterii była bardzo niska, poniżej 2-10² CFU/g wydalin, zostały wyłączone z analizy statystycznej). Nie zaobserwowano występowania żadnej tendencji w zakresie liczby bakterii z rodziny Enterobacteriaceae.

Podczas prowadzenia tych badań poczyniono również dodatkowe interesujące obserwacje:

-U niektórych koni występowały na początku badań problemy z biegunką, występującą w sytuacjach stresowych oraz podczas rozgrzewki przed wyścigiem. W krótkim czasie po stosowaniu sfermentowanej paszy te problemy ustąpiły we wszystkich przypadkach.

-U około 10 koni występowały na początku badań problemy z luźnymi wydalinami. Po kilku tygodniach u wszystkich koni po kilku tygodniach występowały normalne wydaliny.

- U prawie 10 koni występowały na początku badań problemy z ubogą tkanką tłuszczową. U wszystkich koni z wyjątkiem jednego po karmieniu sfermentowaną paszą ilość tkanki tłuszczowej uległa poprawie.

- Około 5 koni miało na początku badań sierść o słabym połysku. Po podawaniu sfermentowanej paszy przez kilka tygodni połysk sierści poprawił się u wszystkich koni.

-Trzy konie otrzymywały w okresie prowadzenia badań antybiotyki (dwa konie otrzymywały antybiotyki o szerokim spektrum działania, a jeden otrzymywał sulfonoamid). Wżadnym z tych przypadków antybiotyk nie spowodował wystąpienia działania niepożądanego. Wydaje się, że sfermentowana pasza owsiana wywiera pozytywne działanie na konie i kompensuje działania niepożądane, które są w innych przypadkach powszechne.

- Dwóch trenerów dawało niektórym koniom przed rozpoczęciem badania kwaśne mleko, bez uzyskania zauważalnego rezultatu. Obaj trenerzy uważali, że działanie sfermentowanej paszy owsianej było znacznie lepsze.

- Trzech trenerów dawało niektórym koniom przed rozpoczęciem badań produkt ColiCure ze słabymi wynikami. Wszyscy trzej trenerzy uważali, że działanie sfermentowanej paszy owsianej było znacznie lepsze.

Podsumowując efekty podawania sfermentowanej paszy owsianej u 26 koni można stwierdzić, że w 19 przypadkach zaobserwowano występowanie mniej lub bardziej korzystnego działania na florę jelitową u koni i/lub ogólny stan koni. Jedynie w siedmiu przypadkach nie obserwowanego wyraźnego korzystnego działania. W szeregu tych przypadków można to wyjaśnić np. spożywaniem skoncentrowanej paszy o niskiej jakości higienicznej albo występowaniem innych problemów, które np. powodowały konieczność leczenia farmakologicznego koni.

Jaffa Qui, przykład konia in vivo.

PL 192 776 B1

Jaffa Qui, numer rejestracyjny 92-1858, bardzo obiecujący kłusak, wygrała swój pierwszy wyścig jako młoda trzylatka. W momencie zmiany stajni miała trzy lata, a od sześciu miesięcy otrzymywała do picia wodę zawierającą znaczną ilość pałeczek okrężnicy. Gdy zwierzę trafiło później do nowego trenera okazało się, że w całej stajni panowało zakażenie wirusami Rhino i Herpes. Jaffa Qui chorowała najciężej ze wszystkich koni, prawdopodobnie ze względu na zmniejszoną odporność wywołaną niską jakością wody. U konia wystąpiła ponadto pokrzywka, a zwierzę codziennie wyglądało źle. Klacz nie zrzuciła zimowej sierści, która stała się puszysta, niemal przestała jeść i nie miała siły podczas treningów. Po podawaniu kleiku owsianego według wynalazku, który zwierzę zaakceptowało od razu i chętnie jadło, stan ogólny poprawiał się coraz bardziej. Obecnie można stwierdzić, że stan zwierzęcia nie był tak dobry nigdy przedtem. Tkanka tłuszczowa jest bardziej obfita niż przedtem, a sierść błyszcząca. W ciągu ostatnich kilku miesięcy zwierzę zaakceptowało treningi i obecnie jest zakwalifikowane do debiutu.

Podawanie Lactobacillus plantarum 299v koniom z nieżytem żołądka

Pięć koni z nieżytem żołądka, przy czym u jednego z nich nieżyt został częściowo wyleczony po zastosowaniu preparatu Losec (Astra AB, Sodertalje, Szwecja), leczono opisanym powyżej kiełkiem owsianym przez kilka tygodni. U wszystkich koni nastąpiła pełna poprawa kliniczna, a u dwóch koni stwierdzono w badaniu gastroskopowym 100% remisję choroby. W jednym przypadku koń był równocześnie leczony preparatem Losec. Szczegóły oraz wyniki tych badań przedstawiono w poniższej tabeli.

Tabela

Koń	Rozpoznanie przed leczeniem	Dawkowanie i czas trwania leczenia L. plantarum JI: 1	Odpowiedź na leczenie	Uwagi
Colombine	Nieżyt żołądka	2·10² CFU dziennie przez 3 miesiące	Pełna poprawa kliniczna, 100% remisja w badaniu gastroskopowym	Bez stosowania innych leków
Fantasy Pride	Nieżyt żołądka	2-10¹² CFU dziennie przez 1,5 miesiąca	Pełna poprawa kliniczna	Bez stosowania innych leków
Faxa	Nieżyt żołądka	2d0¹²CFU dziennie przez miesiąc	Pełna poprawa kliniczna	Bez stosowania innych leków
Bali Pet	Nieżyt żołądka	2d0¹²CFU dziennie przez miesiąc	Pełna poprawa kliniczna	12-dniowe leczenie preparatem Losec
Polk	Częściowo wyleczony nieżyt żołądka (60-70% poprawa)	2d0¹²CFU dziennie przez miesiąc	Pełna poprawa kliniczna, 100% remisja w badaniu gastroskopowym	Bez stosowania innych leków

Uzyskane wyniki wskazują, że pasza według wynalazku ma zdolność leczenia nieżytu żołądka u koni.

Porównanie podawania L. plantarum 299v i L. plantarum JI:1

W krótkim czasie dziesięciu koniom, które poddano pierwszym opisanym powyżej badaniom, podawano sfermentowany kleik owsiany wytworzony z użyciem bakterii L. plantarum 299v (wyizolowanych od człowieka), stanowiących część paszy ProViva®, zamiast L. plantarum JI:1 (szczep koński). Wykonano to bez wiedzy trenera. Po zaledwie jednym tygodniu trener zorientował się, że kleik owsiany nie był dobry. Zaobserwował on, że działanie sfermentowanego kleiku owsianego wyraźnie zmalało. Poza innymi faktami, temperatura ciała konia Luradej była jedynie nieco powyżej 37°C, mimo że koń otrzymywał sfermentowany kleik owsiany. Badania te wskazują, jak ważny jest odpowiedni wybór szczepu odpowiednich pałeczek kwasu mlekowego, a nie tylko wybór właściwego gatunku pałeczek kwasu mlekowego.

Claims

1. Pasza dla koni, znamienna tym, że zawiera jeden lub większą liczbę szczepów Lactobacillus wyizolowanych z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i wykazujących zdolność kolonizacji jelit konia, przy czym te szczepy są wybrane z grupy obejmującej Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520 i gatunek Lactobacillus AC:3 DSM 12429.

2. Pasza według zastrz. 1, znamienna tym, że została poddana fermentacji z użyciem szczepu Lactobacillus wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i wykazującego zdolność kolonizacji jelit konia, przy czym te szczepy są wybrane z grupy obejmującej Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520 i gatunek Lactobacillus AC:3 DSM 12429.

3. Pasza według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że paszę stanowi zboże, warzywa, pasza zielona lub siano.

4. Pasza według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że stanowi kleik owsiany poddany fermentacji z użyciem Lactobacillus plantarum JI:1 DSM 11520 lub gatunku Lactobacillus AC:3 DSM 12429.

5. Pasza według zastrz. 1 albo 2, znamienna tym, że stanowi paszę kiszoną.

6. Szczep Lactobacillus plantarum JI:1 o numerze depozytu DSM 11520.

7. Gatunek Lactobacillus AC: 3 o numerze depozytu DSM 12429.

8. Zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum JI:1 o numerze depozytu DSM 11520 wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelita konia i mającego zdolność kolonizacji jelit konia do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia zaburzeń flory jelitowej u konia.

9. Zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum JI:1 o numerze depozytu DSM 11520 wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i mającego zdolność kolonizacji jelit u konia do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia nieżytu żołądka u konia.

10. Zastosowanie szczepu Lactobacillus plantarum JI:1 o numerze depozytu DSM 11520 wyizolowanego z błony śluzowej żołądka lub jelit konia i mającego zdolność kolonizacji jelit u konia do wytwarzania leku do zmniejszania liczby bakterii gatunku Bacillus i laseczek beztlenowych redukujących siarczyny w jelitach konia.