KR20010015694A

KR20010015694A - 사료 생산물

Info

Publication number: KR20010015694A
Application number: KR1020007003606A
Authority: KR
Inventors: 요한슨마리에-루이제; 론너클라스
Original assignee: 프로비 아베
Priority date: 1997-10-03
Filing date: 1998-10-05
Publication date: 2001-02-26
Also published as: CA2304977C; SE511025C2; HK1030889A1; BR9812713A; JP4277295B2; CN1272877A; SE9703606D0; CA2304977A1; US6537544B1; KR100433300B1; CN1148440C; JP2001519144A; WO1999018188A1; AR015948A1; DE69828188D1; AU744609B2; EP1019488A1; AU9469698A; PL339733A1; PL192776B1

Abstract

말의 위나 장의 점막에서 분리되고 말의 장에 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가진 락토바실러스의 하나 또는 그 이상의 균주를 포함하는 말의 사료 생산물이다. 본 발명은 특히 기탁번호 DSM 11520로 기탁된 신규한 균주 락토바실러스 플란타룸 JI:1, 기탁번호 DSM 12429로 기탁된 락토바실러스 종 AC:3, 상기의 균주로 발효된 귀리 죽 및 말의 장내 미세세균군에서의 교란을 예방 치료하기 위한 이것의 사용에 관한 것이다.

Description

사료 생산물{FEED PRODUCT}

말의 장내세균군(intestinal flora)에서의 교란은 사료에서 영양분을 흡수하는 능력의 저하, 효율의 감소, 감염에 대한 저항성의 저하, 및 다른 종류의 감염 수반을 야기할 수 있다. 기타의 증상은 종종 나쁜 냄새가 나는 배설물의 변화된 농도 및 지저분한 모피이다. 결국 장내세균군의 교란은 스트레스 상황, 예를 들면 장기간 운송, 마구간 환경의 변화, 너무 심한 훈련 및 사료의 변화에서 나타나며, 또한 항생제 치료에서도 나타나는 것으로 알려졌다. 교란된 장내세균군의 문제는 또한 망아지에서도 발생하며, 이 망아지는 첫 생애동안 그들 자신의 장내 미세세균군을 획득해야만 한다.

장내 박테리아 세균군의 변화와 연관될 수 있는 다른 장애는 장내 점막의 염증 및 위계양, 및 일반적으로 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)에 의해 야기되고 설사 및 독혈증을 나타나는 장내 클로스트리디오시스(chlostridiosis)같은 급성 대장염을 야기하는 박테리아 감염, 및 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)에 의해 야기되는 바론-그루프-병(Baron-Gruff-disease)과 같은 복통 을 야기하는 박테리아 감염이다.

배설물에 대장균 박테리아의 존재는 장내세균군의 교란에 관한 말의 건강 상태를 판단하는데 오래전부터 사용되어왔다. 상기 박테리아의 고함량은 장이 좋은 상태임을 나타내는것으로 생각되었고, 반면에 상기 박테리아의 저함량은 바실러스(Bacillus) 및 클로스트리디움 에스피피(Clostridium spp)의 고함량과 마찬가지로 각각 장의 교란과 연관되어있다. 사상균과 기타 진균류의 존재는 또한 장내세균군에 해로운 영향을 주는 것으로 생각된다. 게다가 37℃ 이하의 감소된 체온은 위장관에 문제가 있음을 나타내는 것으로 생각된다. 말의 정상 체온은 37.3 내지 37.8℃범위 내이다.

락토바실러스(Lactobacillus)는 건강한 말의 장내 미세세균군의 주된 미생물 군 중의 하나이다. 후지사와(Fujisawa) 등은 문헌[Bifidobacteria Microflora(Vol.12(2), p.87-90,1993)]에서 건강한 말의 위장관에서 락토바실러스의 286 균주의 분리를 개시하였다. 균주의 주요 부분은 엘. 살리바리우스(L.Salivarius), 엘. 아시도필루스(L. acidophilus) 및 엘. 레우테리(L.reuteri) 종에 속하는 것으로 확인될 수 있고, 마지막 두 종은 위장관의 모든 부분에서 발견되나 엘. 살리바리우스는 위에서 분리되지 않았다. 미세세균군(microflora)은 또한 말이 먹는 사료의 유형에 의해 영향을 받는다는 것을 기억하는 것도 중요하다.

인간과 동물의 건강을 증진시킬 목적으로 구강으로 투여되는 다른 박테리아와 효모 제제인 프로바이오틱(probiotics)을 장의 기능과 일반적 건강 상태를 증진시키기 위해 장의 장애에 대하여 오래 전부터 사용되어 왔다. 락토바실러스 및 스트렙토콕쿠스(Streptococcus)의 균주와 같은 젖산 생성 박테리아의 다른 균주가 프로바이오틱으로서 공통적으로 사용된다. 프로바이오틱 가설은 만일 스트레스나 병에 걸린 상태 동안 즉, 병원성 박테리아가 유리한 방식으로 장내세균군에 장애가 생길때, 상기의 박테리아가 충분한 양으로 장에 투여될 수 있다면, 장내 원치않는 박테리아 균주의 확립이 방해될 것이라는 것이다. 따라서 건강한 장내세균군의 유지는 장내세균군의 장애와 연관된 그러한 질병을 예방하는데 결정적일 것이다.

문헌(Fox, Veterinary Medicine, 1988년 8월판)의 '프로바이오틱; 생산 동물을 위한 장내 접종물'에는 다른 동물들, 특히 닭, 돼지 및 송아지를 사육하는데 사용되는 기타의 상업적 프로바이오틱의 제조가 기재되어 있다.

선행기술

오늘날 냄새가 나쁜 배설물을 배설하는 말에게 위와 장의 근본적인 교란을 극복하기 위해 신 우유나 요구르트를 먹이는 것이 일반적이다. 시판된는 말 제품은 예를 들면 바크테리에발란스(Bakteriebalans)(스웨덴, 란트만넨) 및 락토사트하스트(Lactosathast)(소데르탈제(Sodertaije)의 에오스 스베리즈 에이비(Ewos Sverige AB)에서 시판)이며, 둘다 모두 유산(乳酸) 생성 박테리아의 3종류의 다른 균주를 포함하며, 상기의 박테리아는 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 스트렙토콕쿠스 써모필러스(Streptococcus thermophilus) 및 스트렙토콕쿠스 파에시움(Streptococcus faecium)이다. 상기의 제제는, 투여 제품에 존재하는 락토바실러스가 발효생산물에 자연적으로 퍼져있는 것이거나 또는 인간에서 분리된 것이라는 점에서 같다.

말의 장내 교란에 사용되는 또다른 제제는 콜리큐어(Colicure)(스톡홀름, 벳테크 에이비(VETTECH AB)에서 시판)로, 말에서 처음으로 분리된 정제되고 안정화된 대장균의 균주, >10⁹생(生) 박테리아/㎖의 농도로 이루어진 제품이다. 건강한 말에서 분산된 배설물이고, 장내 환경에 적당한 박테리아 균주를 얻어 거기에 자리잡게할 수 있는 "매쉬(mash)"의 투여에도 동일한 원리가 적용된다. 그러나, 장내세균과(the family Enterobacteriaceae)의 박테리아, 예를 들면 대장균을 첨가하는 것은 병원성 및 내독소(endotoxin) 생성의 관점에서 논란의 여지가 있다.

유럽특허 제 0 203 586호는 동물에서 위장의 장애 치료를 위한 조성물, 특히 대장균(Escherichia coli)의 장내독소발생 균주에 의해 야기되는 장애 치료를 위한 조성물을 개시하고 있는데, 상기의 대장균은 기탁번호 53113의 락토바실러스 페르멘툼(Lactobacillus fermentum)에 기초한 것이며, 돼지에서 분리된 것이다. 여기서 신규한 조성물의 장점은 병원성이 없고, 감염성의 유기체가 장내 점막에 결합하는 것을 방해함으로서 작용한다고 개시하고 있다. 또한 위장의 장애를 예방하고 치료하는데 사용되었으나 단지 부분적으로만 효과적인 것으로 판명된 기타 박테리아에 대해서도 언급되고 있다.

종전에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)의 어떤 균주는 일정한 기간동안 인간의 장 시스템에 자리잡는 능력을 갖는 것을 보여주었다. 유럽 특허 제92916294.9호는 락토바실러스의 어떤 균주, 특히 장에 자리잡고 경구 투여 후 11일 이상의 기간동안 생존하는 능력을 가진 엘. 플란타룸(L. plantarum) 299 DSM 6595 및 그것의 변이체가 기재되어 있다. 상기의 균주는 인간의 장내 세균군의 다른 교란에 유리한 영향을 주는 것으로 판명되었다.

다른 동물 종(種)의 장에서 정상의 락토바실러스 세균균은 서로 다르고, 동일한 종의 락토바실러스가 두 종류의 다른 동물 종에서 발견될 수 있더라도, 그 박테리아가 상기 종의 동일한 균주에 정상적으로 속하는 것은 아니다. 그 균주들은 실제 환경에서 자리잡는 기회에 있어서 중요한 그들간의 차이를 나타낸다. 따라서, 말에서 위장의 장애를 치료할 수 있기 위해서는, 말의 장에 자리잡을 수 있는 하나 또는 그 이상의 박테리아 균주를 포함하는 독성없는 제품이 계속적으로 필요하다.

본 발명은 락토바실러스 속(屬)의 신규한 균주 및 하나 또는 그 이상의 상기의 균주를 포함하는 말(馬) 사료 생산물에 관한 것이다.

도1은 RAPD 에 의해 분석되어진 균주의 전기영동 겔의 사진이다.

도2는 REA에 의해 분석되어진 균주의 전기영동 겔의 사진이다.

본 발명은 말의 위나 장의 점막에서 분리되고 말의 장에서 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가진 하나 또는 그 이상의 락토바실러스를 포함하는, 미생물에 의해 야기된 장내 교란을 예방하고 치유하는 말의 사료 생산물에 관한 것이다.

본 명세서에서 말은 에퀴대(Equidae) 속(屬)에 속하는 것들을 말하며, 말 뿐아니라 유사한 조성의 장내세균군을 갖는 당나귀와 얼룩말도 여기에 속한다.

본 발명에 따른 사료 생산물은 바람직하게는 말의 위나 장의 점막에서 분리되고 말의 장에서 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 갖는 락토바실러스의 균주로 발효된 사료이다.

본 발명에 따른 사료 생산물은 바람직하게는 곡물이나 보조 사료, 녹색 마초나 건초에 기초한다.

본 발명의 바람직한 면은 말에서 분리된 락토바실러스의 하나 또는 그 이상의 균주, 특히 하기에 설명된 신규한 균주 중 어떤 것들로 발효된 귀리에 기초한 사료 생산물이다.

본 발명의 또다른 면에 따르면, 사료 생산물은 말에서 분리된 락토바실러스의 하나 또는 그 이상의 균주로 발효된 녹색 마초 또는 건초에 기초한 저장목초(ensilage)이다.

본 발명은 또한 1997년 4월 21일 DSM 11520 수탁번호로 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 신규한 균주 락토바실러스 플란타룸 JI:1 및 그것의 변이체에 관한 것이다; 특히 장내 미세세균군에서의 교란의 치료 또는 예방을 위한 사용에 관한 것이다.

본 발명은 또한 1998년 10월 2일에 DSM 12429 수탁번호로 Deutsche Sammlung on Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 또다른 신규한 균주 락토바실러스 종 AC:3 및 그것의 변이체에 관한 것이다.

상기의 균주들은 귀리에서 잘 자라는 것으로 판명되었고, 맛 좋은 사료 생산물이 되고, 말의 위장관을 통한 통과동안 생존하고, 말의 장에서 자리잡는 능력을 가진다. 시험은 신규의 균주 락토바실러스 플란타룸 JI:1가 말의 장에서 원치않는 박테리아의 함량, 예를 들면 바실러스의 총 함량 및 클로스트리디움의 총 함량을 감소시키고, 말의 면역 반응을 향상시키는 것을 보여 주었다.

본 발명에 따른 사료 생산물은 고형 또는 액상 형태의 보조 사료 또는 사료일 수 있다. 사료 생산물은 락토바실러스의 선택된 균주에 의해 발효될 수 있는 임의의 유형의 사료에 기초한 보조 사료 또는 곡류로서, 예를 들면 귀리, 일반적으로. 검정 귀리, 보리, 밀, 호밀, 사탕수수 또는 옥수수와 같은 시리얼, 또는 콩과 식물, 특히 대두, 뿌리 채소 및 당근과 같은 야채, 또는 잔디 또는 건초와 같은 녹색 마초일 수 있다.

귀리는 비타민 및 미네랄의 고함량, 균형이 잘 잡힌 아미노산의 조성, 극성 지질 및 식섬유의 함유때문에 바람직한 사료이다. 더 높은 지방 함량을 가진 각종귀리가 최근에 고용량 말을 위한 알맞은 사료로 판명되었다.

본 발명에 따른 사료 생산물의 바람직한 측면은 영양 조성물의 제조와 관련하여 국제 특허 출원 WO89/08405에 따라 귀리에서 제조될 수 있다. 바람직한 사료 생산물 제조의 다른 실시예는 하기에서 주어진다.

또한 본 발명은 말의 장에서 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가진 말의 위나 장의 점막에서 분리된 하나 또는 그 이상의 락토바실러스의 이용에 관한 것이다.

또한 본 발명은 특히 말의 장내세균군에서의 교란의 치료나 예방을 위해 신규한 균주 락토바실러스 플란타룸 JI:1 또는 그것의 변이체를 이용하는 것과 관련이 있다. 또한 위나 장의 점막에서 염증 상태가 완화될 수 있다. 본 발명은 특히 말의 장내세균군에서의 교란의 치료나 예방을 위한 생산물의 제조를 위해 상기 균주를 이용하는 것에 관한 것이다.

본 발명에 따른 사료 생산물은 스트레스 상황 전에 또는 스트레스 상황과 관련하여, 예를 들면 경기, 운송 등을 하기 전의 워밍업 동안, 또는 그 전에, 이와 같은 경우에 가끔 설사를 하는 말에게 투여하여, 여위고 식욕이 없거나 질 나쁜 털을 가진 말의 일반적 상태를 향상시킬 수 있고, 감염에 덜 민감하게 하여 면역 반응을 강화할 수 있고, 항생제 치료기간동안 정상적으로 나타나는 장내세균군 교란과 따라서 항생제 치료와 자주 연관되는 설사를 예방할 수 있고, 위궤양을 가진 말에게, 클로스트리디움 디피실(Clostridium difficile)이나 임의의 다른 병원성 미생물로 감염되어 설사나 냄새가 나쁜 배설을 하는 말에게 투여할 수 있다.

사료에서 락토바실러스의 함량은 5×10⁸CFU/g 또는 ml 이하이면 안되고, 성장한 말에 적당한 용량은 매일 2×10¹²CFU이고, 이것은 하기에 예시된 약 2 내지 4 리터의 귀리죽 또는 하기와 같은 약 100 내지 200 ml의 냉동 배지에 대응한다. 더 높은 함량은 어떠한 위험없이 특별한 경우에 사용될 수 있다. 세균군에 투여될 때, 더 작은 양이 주어져야 한다.

실험 부분

신규한 균주를 생산하기 위해, 먼저 락토바실러스의 대표적인 균주를 말에서 분리하고, 귀리를 발효할 수 있는 능력에 따라 상기의 균주를 분류하고 조사하여, 빠르게 적당한 pH로 감소시켜서, 말에게 좋은 맛과 냄새의 시험용 사료를 만들어서 얻어지는 효과를 측정하였다.

락토바실러스 균주의 분리

3개의 다른 장소, 즉 하위(pylorus), 소장(ileum), 대장(colon)에서 장점막 1내지 2㎠을 생체조직검사를 하여 10마리의 건강하고 신선한 도살된 말의 위장관에서의 락토바실러스 세균군을 조사했다. 배설물에서 박테리아로부터 오염을 제거하기 위해, 직접 조심스럽게 살균된 운반용액(transport solution)으로 견본을 씻고, 실험실로 운반되는 동안 차갑게 유지시켰다. 장점막에서 박테리아를 떨어뜨리기 위해 거기서 5분동안 초음파 배쓰(bath)에서 견본을 처리한 후 튜브 셰이커에서 2분 처리하였다.

말의 위장관에서 락토바실러스 세균군의 확인

각각의 샘플에서 1 또는 2의 락토바실러스 분리체를 취하여 API 50 CH 시스템(API 시스템 S.A., 몽탈리우, 베르시우, 프랑스)에 따라 49개의 다른 탄소원을 발효시키는 능력에 대해 특정화 하였다. 이것은 정상적으로 종 특이성 패턴을 나타내며, 락토바실러스의 공지된 모든 종의 모든 유형의 균주를 포함하는 약 200개의 다른 공지의 락토바실러스 균주의 결과와 얻어진 결과를 비교하였다. 하기의 결과를 얻었다:

종 분리체에서의 %

엘. 살리바리우스(L. salivarius) 14

엘. 살리바리우스(L. salivarius)-유사 29

엘. 레우테리(L. reuteri)-유사 14

엘. 존소니이(L. johnsonii) 4

엘. 존소니이(L. johnsonii)-유사 10

엘. 플란타룸(L. plantarum) 12

엘. 아니말리스(L. animalis) 6

엘. 브레비스(L. brevis) 2

엘. 박시노스테르쿠스(L. vaccinostercus)-유사 2

엘. 무리누스(L. murinus) 2

엘. 스피시스(L. species) 4

선택된 균주 및 특정화

분리된 박테리아 분리체는 하기와 같이 제조된 귀리 죽을 발효할 수 있는 능력에 대해 조사하였다.

중량 18. 5%의 귀리(MP-450, 쿵소르넨 에이 비, 자르나(Kungsornen AB, Jarna)), 중량 0.925%의 맥아 보리 가루(MBF, 노드 몰트 에이비, 소더함(Nord Malt AB, Soderhamn)을 탭 워터(tap water)와 섞어서 천천히 교반하면서 95℃에서 가열하였다. 30분 후에 죽을 37℃에서 냉각하고 pH4 이하에서 20시간동안 다른 균주와 함께 발효시켰다. 특히 pH의 감소율 및 최종 산물의 냄새와 향기를 조사하였다. 시작 배지로서 분리체 엘. 플란타룸 및 엘. 살리바리우스-유사를 사용할때 가장 좋은 결과를 얻었고, 엘. 레우테리 및 엘. 존소니이-유사를 사용할 때 자장 나쁜 결과를 얻었다.

상기에 기초하여 두 균주를 선택하였다. API 50 CH에서 표현형으로, 분석 방법 RAPD 및 REA에 의해 유전자형으로 균주가 각각 락토바실러스 플란타룸 JI:1 및 락토바실러스 스피시스 AC:3임을 확인하였다. 이 과정에서 정제된 분리체를 브로쓰(broth)에서 밤새 배양하였다. API 50 CHL 배양기에 주입하기 전에 배지를 0.9% 염화나트륨 용액으로 한번 씻는다. 샘플을 2일과 7일 후에 측정하였다. 결과는 0(보라)에서 5(황색)으로 평가되었고, 3내지 5의 값은 양성으로 간주되었다.

유전자형 특정화

임의적으로 증폭된 다형체성 DNA(Randomly amplified polymorphic DNA(RAPD))

RAPD는 주형의 변성, 프라이머 어닐링(primer annealing) 및 프라이머 연장(primer extension)의 반복되는 주기를 포함하는 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)이다. RAPD는 게놈의 일정한 단편을 증폭시킬 수 있다. 락토바실러스 운반 배지(Lactobacillus Carring Medium)(LMC, 에프티미오우 앤드 한센(Efthymiou and Hansen), 1992)에서 1%포도당과 함께 정제된 박테리아 분리체를 밤새 배양하였다. 100㎕의 배지에서 세포를 원심분리에 의해 재생하여 1㎖ 항균 증류수로 두 번 세척하였다. 세포를 0.25㎖ 항균 증류수에서 재현탁한 후, 냉각된 상태에서 30분간 최고 속도로 아이케이에이비브락스 브이엑스알 (IKAVibrax VXR) 진동기를 사용하여 유리 규슬(지름 0.2㎜)과 함께 격렬한 진동에 의해 분해하였다. 세포 파편(debris)을 원심분리에 의해 펠렛으로 만들고, 상층액 1㎕를 PCR에 사용하였다. 8μmol/l의 농도로 9-염기 프라이머(9-mer primer)(서열 ACGCGCCCT;스웨덴의 파마시아 바이오텍에서 시판)를 사용하여 DNA 써말 시클러(Thermal Cycler) 480 ( 미국, 노르웍의 퍼킨 엘머에서 시판)에서 PCR을 수행하였다. 각각의 dNTP 0.2mmol/l의 농도로 핵산을 첨가하였다(미국, 뉴저지주 브란크버그의 퍼킨 엘머에서 시판). 태그-폴리머라아제(Tag-polymerase) 농도는 50U/ml(보에링거 만헤임에서 시판)이고, 버퍼 농도는 100U/ml(10×PCR 버퍼;보에링거 만헤임에서 시판)이다. 반응 혼합물은 미네랄 오일로 덮혀서 하기의 온도주기에 따른다:

94℃에서 45초; 30℃에서 120초; 72℃에서 60초로 4회의 주기 후, 94℃에서 45초, 36℃에서 30초, 72℃에서 30초로 26회의 주기(확장 단계는 각각 새로운 주기동안 1초 더 길게 만든다)이다. PCR 과정은 75℃에서 10분간 완성되고 샘플은 4℃에서 냉각하였다.

150×115mm 크기의 75ml 1.5% 아가로즈(유형Ⅲ:고 EEO, 미국 세인트 루이스의 시그마에서 시판)를 포함하는 침수의 수평 아가로즈 겔 플레이트에 샘플 20㎕를 첨가하여 겔 전기영동을 실행하였다. TB 전기영동 버퍼(89mM 브롬산, 89mM Tris-OH, 2.5mM EDTA, pH 8.3)에서 냉각없이 겔을 100V에서 약 2.5시간 동안 런닝하였다. DNA분자량 마커Ⅵ(스웨덴, 브롬마의 보에링거 만헤임 스칸디나비아에서 시판)의 0.5㎛를 기준으로 사용하였다. 전기영동 후에, 겔을 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)(3㎍/㎖)로 5분간 염색한 후, 10분간 세척하여, UV 프랜스일루미네이터(미국, 캘리포니아, 산 가브리엘의 UVP Inc.에서 시판)로 302nm에서 가시(可視)화하여 사진을 찍었다.

도1은 왼쪽부터 엘. 플란타룸 JI:1, 기탁번호149 17의 엘. 플란타룸의 균주 유형 및 마커의 RAPD-패턴을 보여준다. 상기에서 본 발명에 따른 이러한 신균 균주의 패턴이 균주 유형의 패턴과 약간 다르다는 것을 볼 수 있다. 동일한 방법으로 제안된 균주 락토바실러스 살리바리우스-유사 AC:3(API에 따른)는 기탁번호 11741의 균주 유형 엘.살리바리우스 에스에스피.살리바리움(데이타 없음)과 달랐다.

염색체 DNA의 정제

염색체 DNA의 제조와 정제는 스탈(Staho)등에 의해 설명된 방법(International Journal of Systematic Bacteriology 40:189-193, 1990에 게제)에 따라 수행되었다. 100ml 브로쓰(broth)에서 1% 포도당과 함께 균주를 37℃에서 밤새 배양하고 수확하여 TSE(50ml NaCl, 100mM Tris, 70mM 나트륨 EDTA, pH8.0)로 세척하고 3ml TSE+25%(중량/부피)수크로즈에서 현탁시켰다. 120mg 리소좀(품질Ⅵ, 시그마에서 시판) 및 140U 무타노라이신(시그마에서 시판)으로 보충되는 2ml TSE+25%수크로즈를 첨가하였다. 세포를 42℃에서 2시간동안 항온처리하였다; 3mg 프로티네이즈 K(품질; 시그마에서 시판)를 첨가하고 현탁액을 37℃에서 30분간 더 항온처리하였다. 얼음에서 냉각시킨후 1ml의 5% NaCl 용액을 첨가하고, 1ml 20% 도데실 설페이트 및 11ml TES 및 현탁액을 조심스럽게 유리막대로 교반하고 65℃에서 가열하였다. 한번은 재증류된 페놀-클로로포름(1:1)으로, 한번은 이소아밀 알코올-클로로포름(1;24)으로 세포 용해액(lysate)을 추출하였다. DNA를 20℃에서 에탄올로 추출하였다.

에티디움 브로마이드가 있는 CsCl-구배(gradient)에서 밀도 원심분리에 의하여 염색체 DNA를 공유적으로 결합된 닫힌 원형의 플라스미드 DNA에서 정제하여 분리하였다(Bauer and Vinograd, Journal of Molecular biology 33, 141-171, 1968). 플루오로미터(모델 TKO 100, 샌프란시스코의 호에퍼 사이언티픽 인스트루먼츠)에서 제조자의 권유에 따라 염색약 호에츠스트 33258를 자기고 DNA 농도를 결정하였다.

제한 엔도뉴클라아제 분석(Restriction endonuclease analysis)(REA)

37℃에서 4시간동안 10U HindⅢ, ClaI 및 EcoRI(베링거 만헤임에서 시판)로 0.75㎍의 정제된 염색체 DNA의 부분을 분리하게 잘랐다. 150ml 0.9% 아가로즈를 포함하는 침수 수평 아가로즈 겔 플레이트(울트라퓨어 DNA 품질, 바이오래드 레보라토리즈에서 시판)를 사용하여 겔 전기영동을 수행하였다. 0.5㎍의 DNA 분자량 마커 Ⅵ(베링거 만헤임에서 시판)과 함께 0.2㎍의 고 분자량 DNA 마커(BRL)를 기준으로 사용하였다. pHC79에 따라 EcoRI으로 잘려지고 내부 기준으로 각 웰(well)에 첨가되었다. 피콜 로딩 버퍼(2g 피콜, 8ml 물, 0.25%브로모페놀)에 DNA 샘플을 첨가함으로서 밴드 꼬임이 최소가 되고 예리함이 최대가 되었다.

8.5℃, 40V에서 18시간동안 0.9아가로즈 겔에서 조각을 분리하고 에티디움 브로마이드(2㎍/ml)에서 20분간 염색하고 증류수로 염색을 빼고 사진을 찍었다. 이렇게 하여 1.2×10의 분자량 아래로 잘 흩어지고 매우 잘 분리된 밴드를 얻었다(도2). 이 그림은 각각 제한 효소 Ecco R1, Cla 1 및 Hind Ⅲ로 연속적으로 처리한 후 락토바실러스 플란타룸 균주 JI:1, 299V 및 기탁번호 149 17의 REA 패턴을 보여준다. 첫 번째 및 마지막 레인은 마커를 보여준다. 균주 AC:3을 REA에 의해 분석하여 락토바실러스 살리바리우스 에스에스피. 살리바리우스의 균주 유형과는 매우 다르다는 것을 알았다(데이타 나타나지 않음).

사료 조성물의 실시예

공업적 규모에서 귀리 죽의 제조

귀리(318kg), 맥아 보리 가루(12.8kg) 및 물(1682 l)를 섞어서 88℃에서 가열하였다. 온도는 처음에는 55℃로 1시간동안 유지하다가 88℃로 0.5시간동안 유지하였다. 혼합물은 38℃에서 0.5시간동안 냉각하였다. 이 온도에서 시작 배지 락토바실러스 플란타룸 JI:1을 혼합물 2000 l에 대해 2 l의 양으로 2×10 CFU/ml의 농도로 항온처리하였다. pH가 3.9 미만으로 감소되도록 한후, 38℃에서 15-20시간동안 전체를 항온처리하였다. 발효된 혼합물을 6-8℃에서 냉각한 후, 포장하여 배포와 판매를 위해 준비된 냉각 저장되었다.

신선하게 제조된 최종 생산물은 1-2×10 CFU/ml를 포함하고 1-2달동안 저장후 박테리아 수가 약 5×10 CFU/ml로 감소되었다.

상기의 사료 생산물의 영양소 값은 하기의 표에서 명백하다.

영양소값 100g당 2kg당

에너지 값 240kJ=57kcal 4860kJ=1143kcal

단백질 2.1g 41.5g

식이섬유^*1.5g 29g

지방^**1.1g 23g

탄수화물 10g 190g

비타민 B1(티아민) 0.07g 1.3g

* ASP 등에 따르면, 제이 에이그릭 푸드 케미컬(J.Agric. Food Chem.) 31:476-482

** SBR에 따르면, 노르디스크 메토딕콤밋테 포르 리브스메델(Nordisk Metodikkommi for livsmedel) 번호 131, 1989

CaCO₃를 첨가함으로서 다소 확장된 발효과정 후에(20-22시간) 상기의 제조 방법에서 고 박테리아 수를 갖는 사료 조성물을 얻을 수 있다.

시작 배지로서 락토바실러스 종 AC:3을 사용하여 대응하는 귀리 죽을 얻는다.

발효된 당근

발효된 당근의 뱃치(batch)를 제조하기 위해 당근(10kg)을 거칠게 갈거나 또는 임의의 다른 방법으로 미세하게 가른다. 물(5 l)를 끓인후 40℃로 냉각시키고, 락토바실러스 플람타룸 JI:1(접종물 2×10¹¹CFU, 약 2g의 냉동 건조된 생산물이나 20ml의 냉동 배지에 대응하는) 및 염(100g)을 첨가한다. 항균 콘테이서에 갈은 당근과 접종물 유체로 층을 만들고 빽빽히 채운다. 야채가 액체의 표면아래에 있는 것이 중요하다. 콘테이너를 닫고 약2일 동안 24℃에서 항온처리한다. 냉장고나 냉동 저장실에서 약 3-4주 동안 익는다. 발효된 생산물은 약 1년동안 냉각 보존될 수 있다.

동결 건조된 생산물

1 l 물

200g 탈지 우유 가루

2 g 효모 추출물

1 l 박테리아 현탁액(5×10 CFU/ml)

상기의 성분을 혼합하여 냉동 건조기내의 선반에 놓여진 항균 플레이트로 전달한다. 건조가 시작되기 전에 생산물을 약 -40℃로 냉각한다. 약 3일 후에 건조가 끝나고 얻어진 생산물은 파우더 제분되어, 조절된 질소 공기 하의 항균 백으로 포장된다. 얻어진 생산물의 품질은 냉동 저장소에서 약 2년간 유지된다.

냉동 배지

5×10¹⁰CFU/ml의 내용물을 갖는 1 l의 박테리아 현탁액을 하기의 조성물을 갖는 냉동 배양기의 1 l에 첨가한다.

칼륨 디하이드로젠포스페이트 0.36g

이칼륨 하이드로젠포스페이트 1.64g

삼나트륨 시트레이트 1.18g

마그네시움 술페이트 0.5g

글리세롤 240g

증류수 760ml

얻어진 생산물을 200ml 병에서 -80℃로 냉각한다.

생목초의 제조

생목초화는 2개의 원칙에 기초한다. 즉 녹색 집단의 pH 값을 4.2 이하로 낮추고 공기 산소를 차단하는 것이다. 50g의 냉동 건조된 락토바실러스 플란타룸 JI:1배지를 물 몇 리터와 혼합하여 파우더를 용해하고, 추가로 물을 더 첨가하여, 멜라셋스(melasses) 약간의 kg, 총 부피 50 l로 만든다. 녹색 집단을 곤포로 포장하고 플라스틱으로 둘렀을 때 마초 절단기나 압력에 설치된 도싱(dosing) 펌프를 수단으로 하여 녹색 집단 200kg 당 약 1 l의 양으로 박테리아 용액을 집단에 적량으로 나눈다. 첨가된 박테리아가 곤포의 전체에서 자랄 수 있도록 박테리아 용액의 균일한 혼합물을 얻는 것이 중요하다. 사일로에서 생목초를 제조할 때 박테리아 용액을 사일로 팬을 통해 도시지(dosage) 펌프를 수단으로 하여 첨가한다.

말의 생체상 시험

귀리 죽에 엘. 플란타룸 JI:1의 투여

이 연구는 10개의 트롯터(trotter)로 구성되며 이중 5마리는 8주동안 매일 2 L의 발효된 귀리 죽을 먹이고, 나머지 5마리는 참고 말로서 연구에 참여하여 귀리 죽을 먹이지 않는다. 배설물의 샘플을 7번의 다른 시간에 , 말이 귀리죽을 먹기 직전, 말이 귀리 죽을 먹은 후 1, 3, 6, 8 주 및 귀리 죽을 다 먹은 후 1주에 직접 채취하였다. 미생물학적으로 분석은 락토바실러스, 장내 박테리아 및 바실루스의 총 수를 포함한다. 또한 배설물 샘플의 pH 값을 분석하였다. 또한 미생물학적 분석뿐 아니라 시험기간동안 말의 상태에 대해 몇몇 주관적인 평가가 행해졌다. 이것은 배설물의 점성, 배설물의 냄새, 말의 지방, 털의 총량 및 최종적으로 말의 일반적 상태를 포함한다.

결과는 사료를 먹인 기간동안 말 2마리에서 락토바실러스의 함량이 실질적으로 증가되었음을 보여준다. 상기의 말 둘 모두 시험의 시작시엔 낮은 함량의 락토마리실루스를 갖고 있었다. 발효된 귀리를 먹은 모든 말에서 박테리아 엘. 플란타룸 JI:1이 배설물에서 분리되었다. 숫자는 총 락토바실러스 세균군의 1내지 72%로 다양하다. 4마리 말 중 3마리는 귀리 죽을 완전히 먹은 후 1주에도 배설물에 엘. 플란타룸 JI:1을 갖는다.

사료를 먹인 동안 및 1주후 말 4마리에서 바실루스 에스피피의 수는 상당히 감소하였고, 반면에 시험동안과 후에 장내박테리아 수와 배설물의 pH 값에는 어떠한 변화도 관찰되지 않았다.

발효된 귀리죽은 말에 의해 평가되며 거의 맛있는 음식("tit bit")이 되었다. 또한 말의 식욕이 증가되는 것을 나타내는 몇가지 표시가 있다. 말들 중의 한 마리 루라데주(Luradej), 등록 번호 90-4843은 위와 장에 동시에 문제를 나타낸다.

상기 문제의 초기에 동시에 체온이 약 36℃까지 내려간다. 박테리아 락토바시루스 플란타룸 JI:1을 포함하는 발효된 귀리 죽을 2주동안 섭취한 후 체온이 수개월에 첫 기간 동안 37.5℃의 정상 수준으로 올라갔다. 말이 8주간 귀리 죽을 먹고, 먹기를 멈추었을때, 체온은 다시 2-3일 후에 약 36℃로 내려갔다. 짧은 휴지 후에 말은 다시 정상 수준으로 체온을 올리는 결과를 야기하는 귀리 죽을 먹었다. 이것을 나중의 기회에 한번 더 반복하였다. 설명된 귀리 죽의 2년간 매일 섭취 후에 루라데주에게 동량으로 엘. 스피시즈 AC:3의 박테리아 농축액을 주었다. 이것은 말의 일반적인 상태에 추가적 양성 반응을 야기하였다.

시험 기간 동안 말들 중의 마리는 넓은 스펙프럼 항생제로 처리되었다(Gentaject vet., 1.2g 7일 동안 하루에 2회). 말이 이러한 항생제로 처리될때 정상적으로 예를 들면 장기간 위와 장에 문제가 있는 몇가지 부작용이 있다. 이 경우에 말은 전체 항생제 처리기간 동안 및 추가로 그후 수주간 발효된 귀리 죽을 받았고 말은 위와 장에 전혀 문제가 없었다. 나중의 기회에 또다른 말과 또다른 항생제를 가지고 반복하여 동일한 양성 결과가 나왔다.

엘. 플란타룸 JI:1의 콜로니 형성 및 말의 배설물에서 장내박테리아, 바실루스, 클로스트리디움의 함량에 미치는 영향

상기의 시험에 설명되었던 동일한 생산물은 이 연구에서도 사용되었다. 34마리 모든 말이 연구에 포함되었다. 그 중 26마리는 스웨덴의 남쪽에 있는 6개의 다른 속보 훈련원에 있다. 말은 다른 배경을 가지며, 몇몇 말은 묽고 냄새가 안좋은 배설물 및/또는 불충분한 지방 및 빈약한 양의 머리털의 문제를 가지고 있다. 말은 예를 들면 곡류의 종류 및 일정한 보조 사료의 면에서 다소 다르게 먹는다. 또한 몇몇 말은 주기적으로 방목되고 있었다.

말에게 2달동안 매일 2 L의 발효된 귀리 사료를 먹였고 일정한 경우에 3달을 먹였다. 소수의 말은 주기적으로 하루에 단 1 L만을 먹였다. 이것은 예를 들면 몇몇 말이 방목되어 풀 이외의 다른 것을 먹는 것에 관심이 없는 경우이다. 배설물의 샘플은 말이 발효된 사료를 먹기 전 및 상기의 사료를 2-3개월 동안 먹은 후에 직접 채취하였다. 미생물학적 분석은 락토바실러스의 총 수, 락토바실러스의 총 수에서 엘.플란타룸 JI:1의 수, 비.세레우스의 수 뿐아니라 장내바이러스, 바실루스 및 클로스트리디움의 총 수를 포함한다.

미생물학적 분석 뿐아니라 말의 상태에 관한 수 개의 주관적인 평가가 또한 시험 기간동안 행해졌다. 이것은 배설물의 점성, 배설물의 냄새, 지방, 털의 양, 활동 및 식욕을 포함한다.

결과는 이 연구에서 말의 락토바실러스의 수가 상당히 증가하였음을 보여주었다(p<0.05 윌콕손이 서명한 랑크스 시험에 의한 분석 후). 사료를 주기 시작 전에 중간 값은 1·10⁶cfu/g의 배설물(1·10⁵-1.7·10⁷)이고 2-3개월간의 처리 후에는 3.5·10⁶cfu/g(1·10⁵-3.8·10⁷)이다. 사료를 먹인 후 모든 말의 배설물에서 예비적인 엘. 프란타룸 JI:1을 발견하였다.

바실루스의 총 수의 감소는 매우 명백하여(p<0.001 윌콕손이 서명한 랑크스 시험에 의한 분석 후), 분석된 말의 80%가 섭취후 이러한 수의 감소를 보여주었다. 또한 이황화-감소의 클로스트리디움의 수는 처리후 상당히 감소되었다(p<0.001 윌콕손이 서명한 랑크스 시험에 의한 분석 후). 여기서 분석된 말의 74%은 클로스트리디움의 양을 감소하였다(2·10²cfu/g의 배설물 이하의 매우 낮은 수를 보이는 말은 통계적 분석에서 제외되었다). 장내박테리아의 수에 관해서 어떠한 경향도 관찰되지 않았다.

이 시험동안 관심이된 추가의 관찰은 하기와 같다:

- 수개의 말은, 시험 초기에, 스트레스 상황 및 경기전 워밍업시에 설사를 하는 문제를 갖고 있다. 단기간 동안 발효된 사료를 섭취한 후 이러한 문제가 모든 사례에서 사라졌다.

- 약 10마리의 말은 시험 초기에 묽은 배설물을 갖는 문제가 있었다. 모든 말은 길어야 수 주후에 정상의 배설물을 얻었다.

- 약 10마리의 말은 연구 계획 초기에 불충분한 지방을 갖는 문제가 있었다. 1마리를 제외한 모두는 발효된 사료를 먹인 후 더 좋은 지방을 갖게 되었다.

- 약 5마리의 말은 시험 초기에 빈약한 양의 털은 갖고 있었다. 두 세 주간 발효된 사료를 먹인 후 모두는 더 좋은 털을 갖게 되었다.

- 3마리의 말은 시험 기간 동안 항생제를 얻었다(2마리의 말은 넓은-스펙트럼 항생제를 얻었고 1마리는 황제제를 얻었다). 어느 경우에도 항생제는 말에게 역 효과를 주지 않았으나 발효된 귀리 사료는 대신 말에 양성의 효과를 주는 것 같고, 그렇지 않으면 공통되는 부작용을 상쇄하였다.

- 2개의 훈련소는 시험 초기 전에 어떠한 눈에 띄는 결과없이 수개의 말에 상한 우유를 주었다. 두 곳 모두 발효된 귀리 사료가 매우 좋은 효과를 준다는 의견이었다.

- 3개의 훈련소는 시험 시작 전에 생산물 콜리큐어(ColiCure)를 나쁜 결과를 가진 몇몇 말에 시험하였다. 모두 발효된 사료가 더 좋은 결과를 준다는 의견이었다.

26마리의 말에서 발효된 귀리 사료의 효과를 정리하면, 19개의 사례에서 말의 장내세균군 및/또는 말의 일반적 상태에 다소간 양성의 효과를 관찰하였다. 단지 7 사례에서 어떠한 명백한 양성 효과도 관찰되지 않았다. 다수의 상기 사례에서, 예를 들면 말에 약물치료를 야기하는 기타의 질병이나 나쁜 위생상 품질의 농축된 사료를 먹는 것을 설명한다.

자파 퀴(Jaffa Qui), 말의 생체상 실시예

자파 퀴, 등록 번호 92-1858, 매우 유망한 속보말은 3년생 초기에 첫 경개에서 우승을 하였다. 마구간을 변경할 때, 3년생 자파 퀴에게 6개월 동안 상당량의 콜리 박테리아를 포함하는 물을 주었다. 자파 퀴가 나중에 새로운 훈련소로 옮겨갈 때, 점차적으로 전체 마구간이 리노(Rhino) 바이러스 및 헤르페스(Herpes) 바이러스를 갖는다는 것을 발견하였다. 자파 퀴는 모든 말 중에서 가장 아프게 되었고, 아마도 나쁜 품질의 물에 의한 감소된 저항력에 기인하는 것 같다. 또한 자파 퀴는 불안 초조하게 되고 매일 더 초라하게 되었다. 자파 퀴는 겨울 털을 갖지 못해 털이 거의 없고, 거의 먹지도 못해 훈련할 에너지도 없었다. 본 발명에 따른 귀리 죽의 투여 후에, 자파 퀴는 이 귀리 죽을 즉시 받아들여 먹기 시작했고, 자파 퀴의 상태는 매우 좋아져서, 현재 최상의 상태라고 선언할 수 있다. 자파 퀴는 전보다 더 좋은 지방과 숱 많은 털을 가졌다. 또한 지난 달 동안 훈련도 매우 잘 받았고 지금은 자격을 얻어 출전을 하였다.

위염이 있는 말에 락토바실러스 플란타룸 299V의 투여

위염 문제가 있는 말 5마리는, 이중 1마리는 로섹(Losec)(스웨덴의 소더탈제의 아스트라 에이비(Astra AB)에서 시판)의 투여 후에 위염을 부분적으로 치료한 것으로, 수주 동안 설명된 귀리 죽으로 처리되었다. 모든 말은 위염에서의 충분한 임상적 회복을 보여주었고, 그중 2마리는 위경검사법(gastroscopy)에 의해 100% 회복되었다. 어떤 사례에서 말은 동시에 로섹으로 처리되었다. 결과뿐 아니라 상세한 것은 다음의 표에 주어졌다.

말	치료전 진단	엘.플란타룸 JI:1에서 용량 및 치료기간	치료에 대한 반응	주해
콜롬바인	위염	3달 동안 2·10¹²cfu/d	완전한 임상적 회복, 위경 검사법에 의한 100% 회복	다른 약물 치료 없음
판타지 프라이드	위염	1.5달동안 2·10¹²cfu/d	완전한 임상적 회복	다른 약물 치료 없음
팍사	위염	1달 동안 2·10¹²cfu/d	완전한 임상적 회복	다른 약물 치료 없음
발리 페트	위염	1달 동안 2·10¹²cfu/d	완전한 임상적 회복	로섹으로 12일간 치료
폴크	부분적으로 치료된 위염(60-70% 회복)	1달 동안 2·10¹²cfu/d	완전한 임상적 회복, 위경 검사법에 의한 100% 회복	다른 약물 치료 없음

결과는 본 발명의 사료 생산물이 말의 위염을 치료하는 잠재력이 있음을 보여준다.

엘.플란타룸 299V의 투여와 엘.플란타룸 JI:1의 투여간의 비교

단기간 동안 상기에 설명된 첫 시험에 포함된 10마리의 말에게 엘.플란타룸 JI:1(말 균주)대신 푸드 프로비타(food ProVita)의 상품인 엘.플란타룸 299V(인간에서 분리)로 생산된 발효된 귀리 죽을 주었다. 이것은 조련사 모르게 행해졌다. 1주일 만에 조련사는 귀리 죽에 무언가 잘못된 것이 있음을 깨달았다. 조련사는 발효된 귀리 죽을 새로 공급한 효과가 전보다 덜하다는 것을 관찰하였다. 다른 것 중에서 말이 발효된 귀리 죽을 먹었음에도 불구하고 루라데주의 체온은 전처럼 37℃보다 조금도 더 증가하지 않았다. 이것은 락토바실러스의 적절한 종이 아니라 적절한 락토바실러스의 적절한 균주를 사용하는 것이 얼마나 중요한가를 보여준다.

Claims

말의 장에 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가지며, 말의 위 또는 장의 점막에서 분리된 락토바실러스의 하나 또는 그 이상의 균주를 포함하는 말 사료 생산물.
제1항에 있어서,

말의 장에 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가지며, 말의 위나 장의 점막에서 분리된 락토바실러스의 균주로 발효된 사료인 것을 특징으로 하는 사료 생산물
제1항 또는 제2항에 있어서,

균주 락토바실러스 플란타룸 JI:1 DSM 11520 또는 그것의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 생산물.
제1항 또는 제2항에 있어서,

균주 락토바실러스 종 AC:3 DSM 12429 또는 그것의 변이체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 생산물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,

사료가 시리얼, 야채, 녹색 마초 또는 건초임을 특징으로 하는 사료 생산물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

락토바실러스 플란타룸 JI:1 DSM 11520 또는 락토바실러스 종 AC:3 DSM 12429로 발효된 귀리 죽인 것을 특징으로 하는 사료 생산물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,

엔실라주(ensilage)인 것을 특징으로 하는 사료 생산물.
기탁 번호 DSM 11520인 락토바실러스 플란타룸 JI:1 및 그것의 변이체.
기탁 번호 DSM 12429인 락토바실러스 종 AC:3 및 그것의 변이체.
말의 장내세균군의 장애를 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조를 위한, 말의 장에 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가지며 말의 위나 장의 점막에서 분리된 락토바실러스의 하나 또는 그 이상의 균주의 사용.
제10항에 있어서,

기탁 번호 DSM 11520인 균주 락토바실러스 플란타룸 JI:1 또는 그것의 변이체의 사용.
제 10항에 있어서,

균주 락토바실러스 종 AC:3 DSM 12429 또는 그것의 변이체의 사용.
말의 위염을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조를 위한, 말의 장에서 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가지며, 말의 위나 장의 점막에서 분리된 락토바실러스의 하나 또는 그 이상의 균주의 사용.
말의 장에서 바실러스 에스에스피.(Bacillus ssp.) 및 아황산염-감소 클로스트리디움의 수를 감소시키기 위한 약제의 제조를 위한, 말의 장에서 콜로니를 형성할 수 있는 능력을 가지며, 말의 위나 장의 점막에서 분리된 락토바실러스의 하나 또는 그 이상의 균주의 사용.