CN103596452A - 以产乳酸菌发酵的食品 - Google Patents

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Abstract

提供了一种用于人消费的发酵食品组合物，所述食品组合物通过采用产乳酸菌发酵食品底物而制备，该乳酸菌特征在于：a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的；b)其是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；和c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。

Description

以产乳酸菌发酵的食品
本发明涉及人食品、尤其是发酵食品，以及涉及它们的制备方法和用途。本发明尤其涉及用于人的功能食品的提供，其是为消费者提供了除了食物营养价值之外的益处（例如增加肠运动、饱食感等等）的食品。 
通过用细菌发酵合适的底物制备动物食品是已知的。产生发酵饲料的过程可以认为是一种“生物保鲜”。EP0906952公开了一种用于青贮稻草饲料的菌株。发现乳球菌属的菌株在青贮青饲料中有效抑制酵母、梭状芽孢杆菌、霉菌、革兰氏阳性细菌和某些革兰氏阴性细菌的生长。 
此外，US2002/0054935涉及适于催肥家畜诸如牛、山羊、绵羊、猪和家禽的饲料组合物。饲料的营养价值通过用一种或多种曲霉菌株接种而增加。这样处理的饲料由纤维质饲料、谷物和有机废料组成。曲霉表现出可用来修饰饲料的营养含量。然而，这可具有不利的结果，因为许多曲霉菌产生对许多动物有害的真菌毒素。 
US6,403,084涉及用于改善青贮饲料的发酵和需氧稳定性的混合培养物。青贮饲料的需氧不稳定性的问题得以解决，尤其是可发生的导致青贮饲料受损的酵母和霉菌的迅速生长。此外，注意到青贮饲料可以由于酵母的生长而受损，即使在接种并经历良好的发酵阶段的情况下也是如此，其中微生物用于发酵所述青贮饲料并产生乳酸，降低pH而产生酸性条件。认为耐酸酵母导致发酵的青贮饲料的损坏。作为这些问题的解决方案，US6,403,084提出了用同型发酵乳酸菌植物乳杆菌和异型发酵乳酸菌布赫纳乳杆菌或短乳杆菌的组合接种青贮饲料。上述的微生物组合被认为提供足够低的pH条件来保存青贮饲料和预防由于霉菌和酵母生长导致的损坏。 
WO99/18188描述了马饲料产品。所述饲料产品包含一种或多种具有定居于马肠的能力的乳杆菌属菌株。该微生物分离自马的胃粘膜或肠粘膜。 
GB2,167,639公开了用于处理工业或农业废物诸如动物蛋白的方法。该方法包括将废物切碎成含水块并用蛋白水解酶处理得到的物质以形成混悬液，获得混悬液形式的凝胶化淀粉内容物，并向该混悬液加入淀粉分解酶和产生乳酸的培养物。发酵得到的混合物，产生单糖和乳酸。 
US4,214,985涉及污水处理。所述处理包括用植物乳杆菌和碳水化合物诸如乳糖接种污泥。发酵得到的混合物，直到pH降到4.0之下。由此产生的组合物被用作土壤增充剂。 
JP2007082468涉及提供用于饲料的微生物制剂。所述制剂包含特定菌株，植物乳杆菌和/或枯草杆菌。发酵饲料可以通过将所述微生物添加至有机废料诸如青贮饲料草并且发酵而产生。 
WO89/05849描述了筛选从猪的胃肠道分离的乳酸菌的在胃肠道环境中存活并且粘附至靶动物的胃肠道上皮的能力。采用这些性质选择的细菌可以被包含在用于人消费的发酵乳产品中或包含在用于提供给猪以预防或治疗胃肠疾病的兽用组合物中。 
最近，WO2008/006382公开了同型发酵的液体动物饲料产品。如在WO2008/006382中所讨论，使用包含微生物的接种剂产生发酵动物饲料是非常困难的，经常得到包含病原菌诸如弧菌、弯曲杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的发酵饲料。发酵饲料也可能包含高含量的各种酵母和霉菌。注意到家畜通过摄入这样的不适当发酵的饲料可能导致发病和死亡。WO2008/006382注意到，希望制备他们自己的发酵饲料的农民所要求的细菌的无菌处理通常是不可能实现的。此外，存在使用连续发酵工艺的实践，其中一个批次的发酵饲料的一部分被用作下一个发酵批次的接种体。这引起有害的和不合需要的微生物在发酵饲料中的逐渐累积。在解决这些问题的尝试中，WO2008/006382提出了一种用于制备发酵混合饲料的方法，所述方法包括：提供液体发酵产品；提供待发酵饲料产品；组合上述产品；和使用所述液体发酵产品作为接种体发酵所述饲料产品。还描述了由该方法制备的发酵饲料。 
EP0955061解决了猪胃肠感染的问题，尤其是猪轮状病毒、猪冠状病毒、大肠杆菌的产肠毒素和致肠病菌株、梭菌、沙门氏菌、猪痢疾 蛇形螺旋体(Serpulina hyodysenteriae)、结肠菌毛样螺旋体(Serpulina pilosicoli)、细胞内散沫花属、猪等孢子球虫和隐孢子虫属。作为猪胃肠感染问题的解决方案，EP0955061提出了一种口服产品，其特征在于包含上述微生物的至少一种来源于免疫母鸡卵黄的特异性抗体。在EP0955061中注意到，向猪施用的产乳酸菌可具有益生效应，抑制致肠病或产肠毒素细菌的繁殖和增强动物免疫系统的活性。因此，EP0955061的优选实施方案包括一种或多种乳酸菌，诸如肠球菌和乳杆菌。 
如EP0955061所讨论，年幼动物对于GI道的感染尤其敏感，引起病患和死亡。改善生长肥育猪的健康和福利的方式描述于P.Brooks等,′The Effect on Biological Performance and Faecal Microbiology of Feeding Finishing Pigs on Liquid Diets Fermented with Lactic Acid Bacteria′,SafePork,2005,第149页。Brooks等注意到，发酵液体饲料（FLF）已经显示减少猪中沙门氏菌属的发生。具体而言，发现发酵饲料中70mMol/kg的乳酸浓度针对沙门氏菌展示出抑菌活性，但对于灭菌而言，需要超过100mMol/kg的更高的乳酸浓度。然而，Brooks等已经发现，自然发酵已经在商品饲料单位中产生不可预测的结果，并且引用了这样的研究，该研究发现仅仅3%的小麦和大麦工业发酵在发酵24小时之后产生大于75mMol/kg的乳酸。得出结论，发酵饲料的工业生产并不能依靠采用存在于谷物中的原生微生物产生高浓度乳酸的发酵。Brooks等使用特定LAB进行实验来检验对发酵液体饲料的猪饲料饮食的生物学行为和粪便微生物学的效应。结果表明，当以发酵液体饲料饲养时，猪保持良好的健康状况，显示与标准饲料相比，当以FLF饲养时平均每日体重增加无变化。此外，所述实验表明，尽管发酵饲料包含高浓度乳酸菌，但在猪粪便中LAB浓度保持不变。然而，粪便大肠菌类的存在分析显示，大肠菌含量在用FLF饮食饲养的猪中减少。这反过来显示出猪的健康状态的改善以及感染和病患的低风险。总之，用于发酵的LAB的选择在实现大肠杆菌减少方面是重要的。 
如Brooks等所注意，在发酵饲料中实现特定乳酸浓度对于实现发酵 饲料的有益效果而言是重要的。用于测量发酵饲料中乳酸浓度的技术描述于S.J.Niven等,The Simultaneous Determination of Short Chain Fatty Acid,Monosaccharides and Ethanol in Fermented Liquid Pig Diets′,Animal Feed Science and Technology,117(2004),第339至345页。 
V.Demeckova的论文,′Benefits of Fermented Liquid Diets for Sows and their Piglets′,Department of Agriculture and Food,Faculty of Land,Food and Leisure,University of Plymouth,2003年7月，描述了采用以植物乳杆菌发酵的液体饲料进行的实验以测定其在妊娠晚期对母猪的抗菌和潜在免疫效应的影响。结果显示，乳杆菌属的某些菌株不但是用于制备发酵液体饲料的有效接种剂，而且一旦发酵饲料被摄取，又向母猪提供益生活性。值得注意的是，母猪初乳中的免疫球蛋白水平增加。添加母猪初乳的发酵饲料也增加了血液淋巴细胞和肠细胞的促有丝分裂活性。这些因素反过来可以改善母猪和它们的小猪对病原体攻击的抗性。 
WO2005/007834公开了耐酸益生菌剂植物乳杆菌Probiotic-38，其可以抑制某些病原体在宿主中的生长，同时耐受胃酸和胆汁酸。 
最近，未公布的共未决国际专利申请PCT/GB2010/000650涉及使用具有某些特征的产乳酸菌(LAB)提供动物发酵饲料。由此产生的饲料显示在年幼动物、尤其是家禽的饲养方面具有显著的积极效应。用于制备所述发酵动物饲料的产乳酸菌特征在于： 
a)其在靶动物胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；和 
c)其经发酵后能够在饲料底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。 
尽管已经显示向动物提供发酵饲料具有益处，但是如果同样有利的食品可以提供给人消费，这将是有益的。如果食品对于消费该食品的人可以展示出益生效应和增加他们的感染抗性，这将是特别有益的。特别地，如果食品可以提供对于诸如沙门氏菌、大肠杆菌、MRSA菌株和难辨 梭菌的生物体的感染抗性，这将是最有益的。 
Drago,L等，′Inhibition of in vitro growth of enteropathogens by new Lactobacillus isolates of human intestinal origin′,FEMS Microbiology Letters,153(1997),第455至463页，描述了从新生人婴儿的粪便分离乳杆菌属菌株并检验其在共培养物中对于某些病原菌的效应的实验。所进行的实验完全在体外，尽管其在减少某些病原体生长方面显示出所述乳杆菌属菌株的有益效果，但根本不涉及饲料制剂。 
用于人消费的发酵食品是本领域已知的。例如，Yakult
Figure BDA00003263446000051
是一种市售食品，其通过用干酪乳杆菌发酵乳而制备。该发酵食品具有以每100ml可达100亿的浓度存在的干酪乳杆菌微生物。 
EP1884566公开了包含高浓度的有活力的乳酸菌的乳酸菌发酵产品，并涉及食品、尤其是发酵乳品，其包含所述乳酸菌发酵产品。所述食品旨在用于人消费。 
EP1661983涉及产乳酸菌和包含所述产乳酸菌的组合物。所述细菌显示能够刺激宿主中的粘膜免疫性。所述组合物可以是食物、饮料或药剂的形式。 
发明人现在已经发现，用于人消费的特别有益的食品可以通过使用一种或多种某些特征的乳酸菌发酵合适的底物而制备。 
因此，在第一方面，本发明提供一种用于人消费的发酵食品组合物，所述食品组合物通过采用产乳酸菌发酵食品底物而制备，该乳酸菌特征在于： 
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；和 
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。 
已经发现，通过用具有上述特征的产乳酸菌发酵食物底物而产生的根据本发明的发酵食品与已知食物相比提供显著的优点。具体而言，所述食品能够存储一段延长的时间并可被运输而无损坏，所述发酵食品抵抗霉菌和酵母的生长并且抵抗对人潜在有害的细菌的侵入和定居。进一 步，一旦消费，所述发酵食品为人提供防止细菌感染的显著防护，尤其是可能引起人发生严重疾病甚至死亡的病原菌的感染。已经证明所述发酵食品具有抵抗诸如沙门氏菌、大肠杆菌、MRSA的菌株和梭菌的生物体的特别活性，所述生物体对于人、尤其是年轻人、老年人和体弱者具有显著威胁。 
所述食品通过发酵合适的底物而制备，所述底物用包含产乳酸菌的培养物接种并发酵。由此接种并发酵的底物本身可形成食品成品。可选地，一旦发酵，所述底物可以被添加到其它食物材料，以提供具有益生和免疫刺激效应的其它材料。 
所述底物可以是可以以经发酵的情况被人消费的任何合适的底物。所述底物可由来自单一来源的底物组成，或者可选地可包含底物组合。 
合适的底物包括有机材料，诸如乳和乳级分，例如脱脂乳和乳清、生的或熟的谷物和/或谷物组分，例如燕麦、小麦、大麦、玉蜀黍、粟和高粱。额外的合适底物包括其它富含碳水化合物的食物来源，例如马铃薯淀粉和木薯。燕麦和部分蒸煮的燕麦是特别合适的底物。取决于底物的组成，所述底物可以补充其它成分，诸如矿物质和维生素，以符合目标人群的营养需求，例如当用作体弱者、虚弱者或年长者的治疗食品或用作婴儿的断奶食物的情况。 
为适于发酵，所述底物应该包含足以支持用产乳酸菌发酵的量的水。优选地，所述底物具有按重量计至少20%、更优选按重量计至少30%、更加优选按重量计至少40%的含水量。干燥底物与水的优选比率取决于底物并且范围在1:0.25至1:4、更优选1:0.4至1:2。 
食品底物可包含足以支持用乳酸菌发酵的量的水。否则，水应该被加到所述食品底物，以实现发酵需要的含水量。水质对于目标人群应该是足够的。 
为产生本发明的发酵食品，所述底物用产乳酸菌接种并发酵。用于本发明的产乳酸菌由下列特征表征： 
a)接种体细菌在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)所述细菌能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集；和 
c)所述细菌经与所述食品底物发酵后能够在发酵食品中产生至少最低抑制浓度的乳酸。 
具有三个特征(a)至(c)的细菌产生本发明的发酵食品的有益性质。如上所述，所述食品底物用产乳酸菌接种。 
因此，在进一步的方面，本发明提供一种用于从食品底物制备发酵人食品的接种体，所述接种体包含具有下列特征的产乳酸菌的有活力的培养物： 
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；和 
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。 
接种体可以是任何合适的形式并且具有任何合适的组成，以便包含有活力的产乳酸菌，用于居住于并发酵食品底物以及居住于消费者的胃肠道(GTI)。接种体的优选呈现形式是冻干的或作为液体培养物。 
接种体应该包含有活力的形式以及这样的浓度的产乳酸菌，所述浓度足以使得一旦接种后食品底物发酵并在发酵产品中产生所需要的有活力的产乳酸菌的数目和所需的乳酸浓度。如果以液体形式呈现，在所述接种体中典型的产乳酸菌的数目是105至109CFU/ml、更优选约106CFU/ml，或者如果以冻干形式呈现，则为105至109CFU/g、更优选约106CFU/g。 
例如，用于底物的合适接种体是0.1%的包含109CFU/ml的所述产乳酸菌的液体肉汤培养物，或者0.1%的包含109CFU/g的所述产乳酸菌的冻干培养物。 
接种生物体可以存在于合适的载体中以保持货架期并当添加至食品底物时促进准确分散。这样的方法是本领域已知的并且是本领域技术人员容易理解的。 
作为第一特征，所述产乳酸菌应该是在人胃肠道(GIT)中是有活力的并且存活。人胃肠道中的条件防止许多微生物和潜在肠病原体定居和生长。然而，肠的微生物区系可以由于虚弱或施用药物诸如抗生素而被扰 乱，使得GIT对于肠病原体更加易感。如果受试者是免疫受损的，如在HIV感染的情况下，则对此类病原体的易感性进一步增加。为了提供本发明的发酵食品的有益性质，用于发酵食品底物的产乳酸菌应该在人上胃肠道的通常酸性条件下以及在人十二指肠中遇到的碱性条件下是有活力的。此外，所述产乳酸菌应该在小肠和大肠中都保持有活力的。 
在胃肠道中细菌的活力可以由本领域已知的方法和技术测定。具体而言，可以测量摄取含有活力的乳酸菌的饮食的人的粪便中有活力的乳酸菌的微生物计数。这样的方法是本领域已知的并且是本领域技术人员容易理解的。例如，建立对于所评价的微生物具有特异性的ELISA或16nRNA测定是已知的。 
作为进一步的可选方案或除此之外，人胃肠道中产乳酸菌的活力可以体外测定，尤其是通过在与人胃和十二指肠中的通常条件相似或相同的酸性和碱性条件下测量微生物的生长。因此，产乳酸菌的活力可以在合适的食品底物中于pH2暴露2小时、接着缓冲至pH6.0至8.0四小时后测定，以代表人胃和十二指肠中的条件。 
为了更精确地对人胃肠道条件进行建模，进一步优选的是，使用最终发酵食品组合物的食品底物作为微生物的生长培养基进行上述体外实验，因为这可具有缓冲效应并影响pH。以这种方式，可以测定当人消费可改变胃肠道内的条件和/或产乳酸菌的活力的发酵食品时在所述胃肠道内产生的任何效应。 
人胃肠道中产乳酸菌的活力的体外测定的步骤在下文实施例1中详细描述。 
在特别优选的实施方案中，本发明的发酵食品包含利用食品底物作为微生物的生长培养基、使用上述的体外步骤已经证明在人胃肠道中有活力的的产乳酸菌。 
作为第二要求，本发明的发酵食品的产乳酸菌是聚集细菌，即，所述细菌形成聚集体。此外或可选地，所述细菌能够与其它微生物、尤其是对人而言是病原性的微生物共聚集，即，与另一种微生物一起形成聚集体。优选地，产乳酸菌既是聚集性的，又是共聚集性的。所述产乳酸 菌可以在发酵期间和发酵之后在食品底物中的条件下和/或在人胃肠道的通常条件下展示出聚集和/或共聚集的能力。优选地，所述细菌在食品底物中和在人胃肠道中都是聚集性的和/或共聚集性的。 
微生物体外聚集的能力是其具有粘附于人肠的粘液层并粘附于人肠壁的上皮细胞的能力以及通常定居于人胃肠道的能力的强的指示。这反过来通过从粘附位点排除有害的或致病微生物而增加人对感染的抗性。此外，所述产乳酸菌优选是共聚集性的产乳酸菌，即，与其它微生物、尤其是有害的或病原菌形成共聚集体的产乳酸菌。具体而言，优选的是所述产乳酸菌与沙门氏菌属、大肠杆菌、梭菌属和甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)共聚集。这反过来增加有害细菌从消费所述食品的人的肠道通过和清除。 
产乳酸菌聚集能力可以通过本领域已知的体外方法和技术测定，例如，如上述Drago,L.等所描述的方法，或者通过上述Demeckova,V.描述的方法测定。具体而言，细菌可以在合适的液体生长培养基诸如Man-Rogosa-Sharpe(MRS)肉汤(商业可得）中培养。细菌聚集体可以被鉴定为在液体培养基中形成的颗粒或粒子，其通常在重力作用下在培养容器底部收集并留下澄清上清液。 
类似地，产乳酸菌与其它细菌共聚集的能力也可通过以形成聚集体类似的方式制备产乳酸菌与一种或多种目标细菌的共培养物而测定，其被观察为颗粒样粒子，该颗粒样粒子倾向于在培养物中沉淀并同样留下澄清上清液。 
尽管在细菌培养物中聚集体和共聚集体的形成可以如上所述使用肉眼观察，然而，关于微生物的聚集能力的进一步和更多的详细信息可以通过使用显微镜技术(包括扫描电子显微术(SEM))获得。 
用于鉴定聚集性和共聚集性的乳酸菌的方法在下文实施例2中阐述。 
作为第三特征，本发明的发酵食品的产乳酸菌能够在发酵食品中至少产生最低抑制乳酸浓度。对于本发明的食品，术语“最低抑制乳酸浓度”是于30℃在由按重量计包含2%葡萄糖的MRS肉汤组成的生长培养 基中发酵后在24小时内能够产生至少150mMol乳酸的产乳酸菌的参照。已经发现，能够在上述试验中产生该最小乳酸浓度的产乳酸菌在用于人消费的发酵食品的制备中是特别有益的。 
培养基中乳酸浓度可以使用本领域已知方法测定，例如Niven,S.J.等,′The simultaneous determination of short chain fatty acid monosaccharides and ethanol in fermented liquid pig diets′,Animal Feed Science and Technology,117(2004),(3-4),第339至345页中描述的方法。 
鉴定能够至少产生最低抑制乳酸浓度的产乳酸菌的方法在下文实施例3中阐述。 
更优选地，所述产乳酸菌在上述的方法和试验条件下能够产生至少200mMol的乳酸、更加优选至少250mMol的乳酸。也可有益地应用在上述的试验条件下产生的至少300mMol的乳酸浓度、更优选至少350mMol。 
一般而言，在发酵食品乳酸浓度越高从而食品产品的pH值越低将是优选的。因此，优选地，发酵食品的pH值是4.5或更低、更优选4.0或更低、更加优选3.5。pH值的下限以及由此乳酸浓度的上限将至少部分地由食品的味道及其用于人消费的可接受性而确定。 
用于制备本发明的发酵食品的产乳酸菌可以是同型发酵或异型发酵的。异型发酵菌产生乳酸作为它们的代谢产物，连同其它有机酸，诸如乙酸、丙酸和丁酸。然而，已经发现，显著量的这些其它酸代谢物的存在可不利地影响最终产品的味道和/或减少它的营养价值。相比之下，同型发酵产乳酸菌是代谢底物以产生乳酸作为唯一的酸代谢物的产乳酸菌。因此，优选的是，存在于发酵食品的产乳酸菌是同型发酵的。 
此外，用于本发明的发酵食品的产乳酸菌优选地拮抗可在人中引起病患的病原体。具体而言，优选的是，所述产乳酸菌对于沙门氏菌属、大肠杆菌、梭菌属和甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)的一种或多种菌株具有拮抗活性。 
用于测定产乳酸菌的拮抗活性的方法在下文实施例4中阐述。 
此外，用于本发明的发酵食品的产乳酸菌优选地能够粘附于人胃肠道的上皮细胞。用于测定这种方式的菌粘附的体外方法是本领域已知的。 
用于本发明的发酵食品的合适的产乳酸菌是自然存在的并且可以使用本领域已知的技术从合适的来源分离。用于本发明的产乳酸菌的合适来源包括动物和鸟的胃肠道。产乳酸菌的其它来源包括粮谷、底物中的自然发酵以及动物的乳头及其它部分。产乳酸菌的分离可以使用本领域已知的技术进行。 
同样，产乳酸菌可以使用本领域已知的技术鉴定。例如，可以使用革兰氏染色和过氧化氢酶试验鉴定乳酸杆菌，其中乳酸杆菌是革兰氏阳性的和过氧化氢酶阴性的杆状物。 
在进一步的方面中，本发明提供一种制备用于人消费的发酵食品组合物的方法，所述方法包括采用产乳酸菌发酵食品底物，该乳酸菌特征在于： 
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是聚集菌和/或与一种或多种病原菌共聚集；和 
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。 
更进一步，本发明提供本文所述的发酵组合物作为人食品的用途或在制备人食品中的用途。 
本发明的发酵食品可以以任何合适的方式制备。典型地，所述发酵食品通过用包含有活力的形式的产乳酸菌的接种体接种食品底物并在适宜条件下发酵底物而制备。在用产乳酸菌接种之后发酵底物的技术是本领域已知的。 
所发酵的食品组合物包含水。如果使用干燥底物，则将水添加至所述底物。所发酵的食品组合物可包含按重量计每份底物（折干计算）1至20份水的量的水、更优选按重量计1至15份水。一个优选的实施方案包含从1∶1至1∶3、更优选1∶1至1∶2、尤其是1∶1至1∶1.5的重量比的食品底物和水。在可选实施方式中，食品的含水量较高，其中食品底物和水的重量比为1∶5至1∶20。取决于底物和含水量，食品成 品可以为潮湿固体至液体组合物。 
食品底物的发酵可以在任何适于培养产乳酸菌的温度进行。最适发酵温度将取决于所使用的细菌菌株或多种细菌菌株。典型地，食品底物在15℃至45℃、更优选30℃至35℃的温度发酵。 
食品底物被发酵一段时间，足以使得产乳酸菌产生至少150mMol/l的最小乳酸浓度的乳酸、更优选至少200mMol/l、更加优选至少250mMol/l。典型的发酵时间为8至72小时、更优选8至24小时。 
在所述发酵食品中乳酸的产生可通过测量食品组合物的pH进行监测，该pH在发酵过程期间将随着乳酸产生而下降。在用产乳酸菌发酵后，食品组合物的pH值优选是4.5或更低、更优选4.0或更低。 
如上所述，具有低pH的食品的适口性将由产生通常pH的酸决定。因此，通过乳酸产生的pH3.5可能比具有源自乙酸、丙酸或丁酸的相似pH的食品更加可口得多。具有更高乳酸浓度和3.5以下pH值的发酵食品可以与其它材料有益地组合，以产生对于人消费可口的最终食品组合物，只要最低抑制浓度的乳酸得以保持。 
对于产乳酸菌的生长必要的营养素及其它成分可以根据需要被添加至食品底物。这样的营养素和成分在本领域中是已知的。 
发酵食品底物以在食品组合物产生有益于消费最终组合物的人的产乳酸菌浓度。具体而言，在发酵后存在于食品组合物的乳酸菌应该是有活力的，其数量足以定居于人胃肠道并在那里形成有活力的菌落。优选地，在发酵产品中产乳酸菌的浓度是至少106CFU/ml、更优选107至1010CFU/ml、更加优选109至1010CFU/ml。 
本发明的食品组合物和方法可以采用任何合适的产乳酸菌，前提条件是该菌株对人无害。优选的产乳酸菌包括乳杆菌属和片球菌属的菌株，其中特别优选乳杆菌属的菌株。特别优选的乳杆菌属菌株微生物包括植物乳杆菌和唾液乳杆菌。 
已经进行了大量的工作来分离一系列在制备发酵食品中具有特别优势的乳杆菌属菌株。通过上文描述的一般性方法和使用下文描述的详细方法，分离所述菌株。每一分离的菌株展示出如上所述的全部三种性质 (a)至(c)，使得它们特别适合用于制备根据本发明的食品组合物。每一分离的菌株已经于2009年2月11日保藏于位于苏格兰阿伯丁的国立工业和海洋微生物保藏有限公司（National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd.,下称′NCIMB′），并被赋予下文所列的NCIMB登录号。所述保藏依据国际承认的用于专利保护目的的微生物保藏布达佩斯条约进行并符合布达佩斯条约的要求。 
因此，在进一步的方面，本发明提供下列微生物的生物学上纯的培养物： 
植物乳杆菌，菌株号C28，登录号NCIMB 41605； 
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS3，登录号NCIMB 41606； 
植物乳杆菌，菌株号MS18，登录号NCIMB 41607； 
植物乳杆菌，菌株号VD23，登录号NCIMB 41608； 
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS6，登录号NCIMB 41609；和 
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS16，登录号NCIMB 41610。 
在进一步的方面中，本发明提供一种用于制备人消费的发酵食品的组合物，所述组合物包含上述微生物的一种或多种以及合适的载体。 
更进一步，本发明提供上述微生物的一种或多种在制备用于人消费的发酵食品中的用途。 
更总体地说，已经发现向人施用具有下列特征的产乳酸菌当被人消费时对于健康和福利通常是有益的： 
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是聚集菌和/或与一种或多种病原体共聚集；和 
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。 
因此，在进一步的方面，本发明提供一种改善人的总体健康的方法，所述方法包括向人施用具有下列特征的产乳酸菌： 
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是聚集菌和/或与一种或多种病原体共聚集；和 
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的 量的乳酸。 
用于向受试者人一般施用的优选的产乳酸菌如上所描述。 
所述产乳酸菌优选作为有活力的微生物向人施用，优选以至少106CFU/ml的浓度、更优选至少107CFU/ml、仍更优选至少109CFU/ml的浓度。 
已经发现，上述的产乳酸菌有效对抗对人有害的微生物。因此，向人施用所述细菌可以改善人的总体健康，尤其是增加其对潜在有害的微生物(尤其是肠病原体)感染的抗性。这对于年轻人、老年人和体弱者更是如此。 
此外，本发明提供了具有下列特征的产乳酸菌的生物学上纯的培养物： 
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是聚集菌和/或与一种或多种病原体共聚集；和 
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。 
用于向人提供乳酸菌的组合物包含上述的具有特征(a)至(c)的产乳酸菌的有活力的培养物和合适的载体。 
本发明将通过下列具体实施例并参考附图进行阐述，其中： 
图1是按照第一试验方法显示产乳酸菌自聚集能力的结果的图； 
图2是按照第二试验方法显示产乳酸菌自聚集能力的结果的图； 
图3是显示产乳酸菌与所示病原体共聚集能力的结果的图；和 
图4是显示产乳酸菌相对于所示病原体的拮抗活性的结果的图。 
使用来源于猪和小鸡、分离并鉴定的产乳酸菌进行在以下实施例中描述的实验。所采取的一般方法通过应用于小鸡的方法进行例示，如下： 
三只小鸡(Hubbard品种；年龄：9周零2天）自由进食商购可得的有机生长物食物、草和三叶草的饮食。人道屠宰小鸡并从各只鸡移出整个胃肠道。无菌地除去盲肠、空肠、回肠和嗉囊的内容物。此外，通过用滑板刮擦，从小肠和嗉囊除去上皮细胞。 
全部样品在10ml磷酸缓冲盐水(PBS，例如Oxoid,England)中稀 释并铺板于Man-Rogosa-Sharpe(MRS)和Rogosa琼脂(两者均来自例如Oxoid,England)。划线分离法被用来从细菌混合培养物获得纯的培养物。由此分离的纯的培养物在MRS琼脂板中二次培养并在包含5%体积的二氧化碳的大气中于厌氧培养罐中培养72小时。 
在MRS琼脂(乳杆菌属和片球菌属菌株的分离培养基)和Rogosa琼脂(乳杆菌属菌株的分离培养基)上分离出总共111株产乳酸菌。 
革兰氏染色和过氧化氢酶试验被用来确认分离群是产乳酸菌。使用API CHL试剂盒（例如BioMereux,UK），通过差异碳水化合物代谢，进一步鉴定革兰氏阳性和过氧化氢酶阴性的分离群。 
使用下文实施例的方法，分析由此分离并如此鉴定的产乳酸菌，以鉴定满足下列要求的那些产乳酸菌： 
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的； 
b)其是聚集菌和/或与一种或多种病原体共聚集；和 
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。 
此外，测定了分离的产乳酸菌对抗关键病原菌的拮抗活性。 
实施例
实施例1
人胃肠道中产乳酸菌活力的测定
可使用下列方法测定人胃肠道中产乳酸菌菌株的活力： 
各产乳酸菌菌株与牛乳混合。将葡萄糖或蔗糖添加至所述乳，以为所述产乳酸菌提供能源。可选地，可以使用碳水化合物来源诸如谷物。 
在与细菌组合之前，通过照射(25kGy,Co60)或通过加热对所述乳进行灭菌。 
将接种过的乳样品添加至烧瓶，通过添加蒸馏水稀释，并在水浴中加热至37℃，以代表人胃肠道内的温度。通过添加HCl(水溶液;1M），减少食品组合物的样品的pH，以将烧瓶中的pH调整至对应于人胃中存在的pH，即pH2.6。培养样品90分钟。 
在整个培养期间，定期将HCl(水溶液；1M)添加至各样品，以将pH保持在适当的水平。 
之后，添加足够量的碳酸氢钠(NaHCO3)，以增加pH至8.5，从而代表人肠道中的碱性条件。进一步培养样品90分钟。 
在培养的各个阶段在调节pH前即刻移出烧瓶中溶液样品(1ml)，用无菌蛋白胨水(9ml)稀释，并制备10倍梯度稀释液。使用无菌技术将100μl的每种稀释液分布于MRS琼脂上，并将平板在37℃培养24小时，之后对平板进行计数。将微生物的活力计算为存活通过模拟胃肠道的生物体的百分比。 
实施例2
聚集性的和共聚集性的乳酸菌的测定
使用下列方法测定乳酸菌自聚集和与其它细菌共聚集的能力： 
评价七株产乳酸菌(LAB)自聚集以及与九种病原体共聚集的能力。产乳酸菌及其来源概述于下文表1。 
表1 
Figure BDA00003263446000161
病原菌及其来源概括于下文表2中。 
表2 
Figure BDA00003263446000171
自聚集
列于表1中的产乳酸菌的自聚集测定使用两个方法进行。 
按照Kos,B.等,′Adhesion and aggregation ability of probiotic strain Lactobacillus acidophilus M92′,Journal of Applied Microbiology,94(2003),第981至987页中概述的方法，所述产乳酸菌在含有5%体积二氧化碳的大气中在MRS肉汤(例如Oxoid)中于37℃生长18小时。细胞以4000倍重力离心15分钟而收获，用磷酸缓冲盐水(PBS)洗涤两次并重悬于PBS，得到0.5的光密度(Opposition Division)。各混悬液的4ml等分试样以4000倍重力离心15分钟，通过涡旋10秒，将细胞重悬于4ml的过滤灭菌的培养物上清液。在室温下培养4小时之后通过将0.1ml的上部混悬液转移至包含0.4ml的PBS的比色皿，测定自聚集。测量样品在600nm处的吸光度(A)。 
自聚集程度(%)被表示为： 
1-(A4/A0)x100 
其中A4表示在培养4小时之后的吸光度，A0表示在培养开始时的吸光度。 
结果在图1的图中描述。 
按照Del Re,B.等,′Adhesion,autoaggregation and hydrophobicity of 13 strains of Bifidobacterium longum′,Letters in Applied Microbiology,31(2000),第438至442页中概述的方法，所述产乳酸菌在含有5%体积的二氧化碳的大气中在MRS肉汤(例如Oxoid)中于37℃生长24小时。细胞以4000倍重力离心15min而收获，用PBS洗涤两次并重悬于PBS，得到0.5的光密度(OD)。各细菌悬液的4ml等分试样以4000倍重力离心15min，通过涡旋10秒，将细胞重悬于4ml的过滤灭菌的培养物上清液。在室温培养4小时之后将0.1ml的上部混悬液转移转入包含0.4ml PBS的比色皿，并测定在600nm处的OD。通过涡旋10秒混合剩下的混悬液，将0.1ml的混悬液转移入包含0.4mlPBS的比色皿，以测量在600nm处的总细菌悬液的OD。 
自聚集程度(%)被表示为： 
(1-OD上部混悬液/OD总细菌混悬液)x100。 
结果在图2的图中描述。 
从图1和2可以看出，所分离和鉴定的产乳酸菌展示出非常高程度的自聚集。 
共聚集
产乳酸菌与表2所列的每一病原体共聚集的能力如下测定： 
所述产乳酸菌在含有5%体积二氧化碳的大气中在MRS肉汤(例如Oxoid)中于37℃生长18小时。沙门氏菌、大肠杆菌和MRSA菌株在营养肉汤(例如Oxoid)中在37℃有氧生长18h，而梭菌菌株在Meat Cooked Medium(例如Oxoid)中在37℃厌氧生长72h。细胞以4000倍重力离心15分钟而收获，用PBS洗涤两次并重悬于PBS，得到0.5的光密度(OD)。各病原体的2ml等分试样与各乳酸菌的2ml等分试样通过涡旋10秒混合。同时建立对照管，包含4ml的各细菌悬液。在初始混合之后以及在室温培养5小时之后，通过将0.1ml的混悬液转移至包含0.4ml的PBS 的比色皿，测量各混悬液在600nm处的吸光度(A)。 
使用下列等式计算共聚集程度(%)： 
Figure BDA00003263446000191
其中x和y表示对照管中两株菌株的每一株，而(x+y)表示混合物。 
结果在图3的图中描述。 
从图3可以看出，所分离和鉴定的产乳酸菌展示出非常高程度的与病原菌的共聚集。应当注意，在该情况下分离的细菌的共聚集程度比商购可得的产品显著高。 
实施例3
能够至少产生最低抑制乳酸浓度的产乳酸菌的测定。
使用使用下列方法测定产乳酸菌菌株产生至少最低抑制浓度的乳酸的能力： 
产乳酸菌株在MRS肉汤中于30℃生长24h。以0.1ml的24小时肉汤培养物接种新鲜MRS肉汤的十ml等分试样，并于30℃培养。根据Niven等的方法，在12、24和48小时后取1.0ml的子样品，用于通过高效液相色谱法进行乳酸分析。标准MRS肉汤包含2%葡萄糖作为碳水化合物来源，得到220mMol/L的最大乳酸产量。 
实施例4
产乳酸菌的拮抗活性的测定
使用下列方法测定表1所列的产乳酸菌菌株针对表2所列的病原性的大肠杆菌、沙门氏菌属和MRSA微生物的拮抗活性： 
通过Jin,L.Z.等,′Antagonistic effects of intestinalLactobacillus isolates on pathogens of chickens′,Letters in Applied Microbiology,23(1996),第67至71页描述的琼脂斑点试验定量拮抗活性。按照该方法，产乳酸菌菌株的培养物在MRS肉汤(例如Oxoid)生长并在37℃在厌氧条件下培养24小时。将5μl等分试样的 109CFU ml-1的培养物点涂于MRS琼脂板的表面并在5%CO2和37℃进一步培养24小时，以允许菌落发展。在保持于46℃的15ml营养琼脂中的约106CFU ml-1的各病原菌被倒入各板，并且所述板在37℃进一步培养24小时。在所述培养之后，检验所述板在乳酸杆菌斑点周围的抑制带，并记录任何抑制带的半径。一式三份进行各乳酸杆菌菌株抵抗每一病原体的试验。 
结果在图4的图中描述。 
从图1和2可以看出，所分离和鉴定的产乳酸菌展示出非常高程度的对所示病原菌的拮抗作用。具体而言，应当注意本发明的细菌展示出比商购可得的产品显著更高程度的拮抗作用。 
实施例5
乳作为用于人消费的食品底物的发酵
根据下列方法测试表1所列的产乳酸菌发酵两种乳底物的能力： 
根据厂商说明，制备商购可得的脱脂奶粉，以提供第一乳底物。将小牛代乳品(70g)与水(100g)混合，以提供第二乳底物。在3天的每一天将两种底物置于蒸汽发生器进行灭菌30分钟/日。 
各产乳酸菌在MRS肉汤(例如Oxoid)中在37℃生长24小时。 
100ml的各乳底物用100μl的各产乳酸菌的培养物接种。在30℃培养样品48小时。通过在培养期间以0、8、24、32和48小时的间隔监测pH，测定所述细菌发酵乳底物的能力，其中pH减少表明乳酸的产生。第一乳底物和第二乳底物的结果分别列于表3和表4。 
表3 
Figure BDA00003263446000211
表4 
Figure BDA00003263446000212
表3和表4中的结果证明，本发明的产乳酸菌特别适于从底物诸如乳底物制备发酵食品。 
本发明的食品向消费所述食物的人提供特别的益处，尤其是当消费者易于受到感染和病患攻击时更是如此。 
具体而言，本发明的食品为婴儿提供有益的发酵断奶食物。在这方面，在欠发达国家中即将戒断母乳的婴儿以发酵粥(通常基于玉蜀黍或高粱)级分喂养仍是常见的实践。在这些食品在不卫生的条件并采用污染水制备时，食品可以被肠病原体、特别是溶血性大肠杆菌和沙门氏菌严重污染。因此，婴儿死亡率由于婴儿感染腹泻和痢疾而增加。通过本发明产生的断奶食物可以改善这样的婴儿的健康状态并显著地降低死亡率。 
此外，遭受健康不良、免疫受损或紊乱GIT功能（例如源于健康不良、药物或老龄）的受试者，可受益于本发明的发酵食品，尤其是增加胃对肠病原体的屏障功能、使具有益生性质的有益生物体定居于GIT、 以及上调人免疫系统。 
通过调节肠生态系统和影响免疫反应，本发明的食品也使患有GI道紊乱的患者例如克罗恩病、IBS和溃疡性结肠炎患者收益。 

Claims (32)

1.一种用于人消费的发酵食品组合物，所述食品组合物通过采用产乳酸菌发酵食品底物而制备，该乳酸菌特征在于：
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的;
b)其是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；和
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。
2.根据权利要求1的发酵食品，其中所述底物包括乳、乳组分或富含碳水化合物的食物来源。
3.根据权利要求2的发酵食品，其中所述富含碳水化合物的食物来源包括生的或熟的谷物或谷物组分、马铃薯淀粉或木薯。
4.根据权利要求3的发酵食品，其中所述生的或熟的谷物或谷物组分是燕麦、小麦、大麦、玉蜀黍、粟或高粱。
5.前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中所述食物底物具有按重量计至少20%、更优选按重量计至少30%、更加优选按重量计至少40%的含水量。
6.根据前述权利要求任一项的发酵食品，其中干燥食物底物与水的比率为1∶0.25至1∶4、更优选1∶0.4至1∶2.5。
7.根据前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌在人胃肠道中在对应于多个位置的多个pH条件下是有活力的。
8.根据前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌在人胃肠道条件的体外实验模型中被证明是有活力的。
9.根据权利要求10的发酵液体饲料组合物，其中所述体外实验采用食物底物作为用于所述产乳酸菌的生长培养基。
10.根据前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌是共聚集的。
11.根据权利要求10所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌相对于对人有害的或者是人病原体的细菌而言是共聚集的。
12.根据权利要求11所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌与沙门氏菌属、大肠杆菌、梭菌属和甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)的菌株共聚集。
13.根据前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌在由含按重量计2%葡萄糖的MRS肉汤组成的生长培养基中于30℃发酵后在48小时内能够产生至少200mMol的乳酸。
14.根据权利要求13所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌在所述条件下产生至少250mMol的乳酸、更优选至少275mMol。
15.根据前述权利要求任一项的所述发酵食品，其具有4.5或更低的pH、优选4.0或更低。
16.根据前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌是同型发酵的。
17.根据前述权利要求任一项的发酵食品，其中所述产乳酸菌拮抗一种或多种在靶动物中常见的病原体。
18.根据前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中在所述发酵食品中产乳酸菌的浓度是至少106CFU/ml，更优选107至1010CFU/ml。
19.根据前述权利要求任一项所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌包括乳杆菌属和/或片球菌属的菌株。
20.根据权利要求19所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌包括选自菌种植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivahus）的乳杆菌属的菌株。
21.根据权利要求20所述的发酵食品，其中所述产乳酸菌选自下列的一种或多种：
植物乳杆菌，菌株号C28，登录号NCIMB 41605;
唾液乳杆菌唾液亚种（Lactobacillus salivarius ss.Salivarius），菌株号MS3，登录号NCIMB 41606;
植物乳杆菌，菌株号MS18，登录号NCIMB 41607;
植物乳杆菌，菌株号VD23，登录号NCIMB 41608;
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS6，登录号NCIMB 41609;和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS16，登录号NCIMB 41610。
22.用于从食品底物制备发酵人食品的接种剂，所述接种剂包含具有下列特征的有活力的产乳酸菌培养物：
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的;
b)其是能够聚集和/或与一种或多种病原体共聚集的细菌；和
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。
23.根据权利要求22所述的接种剂，其中在所述接种剂中产乳酸菌的浓度是105至109CFU/ml，更优选约106CFU/ml。
24.根据权利要求22或23所述的接种剂，其中所述产乳酸菌包括乳杆菌属和/或片球菌属的菌株。
25.根据权利要求24所述的接种剂，其中所述产乳酸菌包括选自菌种植物乳杆菌和唾液乳杆菌的乳杆菌属的菌株。
26.根据权利要求25所述的接种剂，其中所述产乳酸菌选自下列的一种或多种：
植物乳杆菌，菌株号C28，登录号NCIMB 41605;
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS3，登录号NCIMB 41606;
植物乳杆菌，菌株号MS18，登录号NCIMB 41607;
植物乳杆菌，菌株号VD23，登录号NCIMB 41608;
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS6，登录号NCIMB 41609；和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS16，登录号NCIMB 41610。
27.一种制备用于人消费的发酵食品组合物的方法，所述方法包括采用产乳酸菌发酵食品底物，该乳酸菌特征在于：
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的;
b)其是聚集菌和/或与一种或多种病原菌共聚集；和
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述产乳酸菌包括乳杆菌属和/或片球菌属的菌株。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述产乳酸菌包括选自菌种植物乳杆菌和唾液乳杆菌的乳杆菌属的菌株。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述产乳酸菌选自下列的一种或多种：
植物乳杆菌，菌株号C28，登录号NCIMB 41605;
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS3，登录号NCIMB 41606;
植物乳杆菌，菌株号MS18，登录号NCIMB 41607;
植物乳杆菌，菌株号VD23，登录号NCIMB 41608;
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS6，登录号NCIMB 41609；和
唾液乳杆菌唾液亚种，菌株号MS16，登录号NCIMB 41610。
31.权利要求30所述的产乳酸菌在制备用于人消费的发酵食品中的用途。
32.一种改善人的总体健康状态的方法，所述方法包括向人施用具有下列特征的产乳酸菌：
a)其在人胃肠道的通常条件下是有活力的；
b)其是聚集菌和/或与一种或多种病原体共聚集；和
c)其经发酵后能够在食品底物中产生至少为最低抑制乳酸浓度的量的乳酸。
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