SE511828C2 - Bakteriestam av typen Lactococcus för användning vid ensilering av grönfoder - Google Patents

Description

...u iil i' lir 10 15 20 25 30 35 511 828 2 framgångsrika och de framkom att uppkomsten och tillväxten av grampositiia bakterier hâmmades starkt, bl a Listería monocytogenes, Staphylococcus aureus, Clostridium tyroburyricum, Baci/Ius cereus och olika mjölksyrabakterier. Även vissa gramnegativa bakterier håmmades, om än relativt svagt, t ex Pseudomonas aeruginosa.

Det kunde konstateras att det varken var syror eller våteperoxid som orsakade hämningen av bakterietillväxten.

Vid den mikrobiologiska analysen av ett kontrollensilage vid detta försök, utan tillsats av någon starterkultur, upptäcktes tre olika kolonier i del odlingsmedium som bakterierna vuxit i, vilka kraftigt hâmmade de omkringliggande kolonierna. Bakterierna var mycket motståndskraftiga mot både värme och proteasbehandling med äggviteklyvande enzym. Det kunde också konstateras att bakterierna var resistenta mot den normalt bakteriedödande polypeptiden nisin. Detta kan indikera att åtminstone någon av de isolerade kolonierna själva producerar nisin.

Två stycken förmodat nisinproducerande isolat detekterades med hjälp av Polymerase Chain Reaction (PCR), generna sekvenserades, och det visade sig vara genvarianten nisin Z. Bakteriestammarna identifierades av det mikrobiologiska laboratoriet BCCM/LMG i Gent, Belgien som Lactococcus lactis, subsp. /actís. ldentifieringen skedde med hjälp av proteinmönstret från bakterierna. Andelen G- och C-nukelotideri genomen från den isolerade bakteriestammen analyserades och båda isolagen hade cirka 38% GC. Det ___ visade sig att bakterierna hämmades av vankomycin, vilket tyder på att stammen inte är en laktobacill utan en laktokock.

Det visade sig också att bakterien kan användas t ex för att förhindra uppkomst av bacillus-sporer som kan få mjölk att tjockna.

Bakterien har deponerats vid The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd, Aberdeen, Skottland, under depositionsnummer NCIMB 301 17.

Industriellt kan bakterien framställas genom att en ymp av renkultur tillsätts en i förväg steriliserad buljong. Bakterien odlas därefter under 10-20 timmar vid en för den speciella stammen optimal temperatur. Den under odlingen bildade mjölksyran neutraliseras genom tillsats av NaOH med målsättningen att bibehålla odlingsbuljongen vid optimalt pH. När tätheten av bakterieceller uppnått en viss koncentration avstannar tillväxten, och odlingen avslutas. Därefter vidtar en koncentrering med hjälp av separator eller filter, 10 15 20 25 30 35 3 511 828 varvid de erhållna bakteriecellerna avskiljs från odlingsbuljongen.

Den erhållna bakteriemassan kan därefter frystorkas och tillhandahållas som ett pulver som kan lösas i vatten och användas genom att t ex sprejas på grönfoder vid inläggning av detta i paket eller i ensilagetorn. Bakterien kan lämpligen tillsättas i en mängd av 4 - 8 liter per ton ensilage. Vid lagring av ensilaget i torn bör det vara finhackat och fuktigt och kan hålla en torrsubstanshalt av 20 - 45%.

Uppfinningen avser alltså en bakteriestam av typen Lactococcus för användning som starterkultur vid ensilering av grönfoder, och vilken hämmar uppkomsten av grampositiva bakterier, jäst och klostridier, samt även vissa gramnegativa bakterier i ensilaget, och som har god överlevnad i ensilaget.

Uppfinningen kännetecknas av att bakteriestammen är Lactococcus /actis subsp. /act/ls. Ett specifikt särdrag är att bakteriestammen själv producerar nisin.

Uppfinningen avser också användning av bakteristammen Lactococcus /actis subsp. lact/'s som starterkultur vid ensilering av grönfoder utan lufttillträde, varvid en lösning av bakteriestammen blandas in i grönfodret i en halt av 4 - 8 liter per ton grönfoder med en torrsubstanshalt av 20 - 45%.

Lämpligen används bakteriestammen Lactococcus /actis subsp. /actis enligt uppfinningen som en ingrediens in en bakterieblandning bestående av Enterococcus faecium, Pediococcus ac/'di/acti, Lactobacillus p/antarum samt en andel av enzymet cellulase. I den nämnda bakterieblandningen, vilken går under handelsbeteckningen "Lactisil Plus" förekommer de fyra ingredienserna i ungefär lika delar och i en total halt av mellan 105 och 105 CFU per gram ensilage. Enligt uppfinningen tillsätts bakterien Lactococcus /actis subsp. fact/s till den tidigare använda bakterieblandningen i en halt av mellan 104 och 106 per gram ensilage. dvs så att den sammanlagda konserveringstillsatsen tillsätts i mellan 110.000 och 2.000.000 CFU per gram ensilage.

Försök För att bedöma verkan av bakterien Lactococcus /actis subsp. /act/s, enligt uppfinningen vid ensilering av blandat grönfoder gjordes ett flertal försök, varvid den frystorkade bakterien enligt uppfinningen löstes i vatten och tillsattes genom sprutmunstycken i en halt motsvarande 4 - 8 liter per ton grönfoder. Nedanstående tabeller 1, 2 och 3 visar medelvärdet av de flerfaldiga försöken. Försöken bedömdes ur tre olika aspekter i förhållande till 10 15 20 511 828 4 obehandlat grönfoder, i förhållande till konventionellt tillsatsmedel benämnt "Lactisil Plus", vilket medel, enligt vad som anges ovan, är sammansatt av mjölksyraproducerande stammar samt ett enzym, och samma tillsatsmedel innehållande lika andel av bakterien Lactococcus /actis subsp. /actis enligt uppfinningen. I i den följande tabellen 1 redovisas lagringsförluster i %, i tabell 2 effekten av mikrobiell tillväxt av laktobakterier, klostridier och jäst i ensilaget, och i tabell 3 tillsatsmedlens effekt vid tillsats av förstöringsflora.

TABELL 1 Lagringsförluster i % Lagringsförluster % efter antal dagar Konserveringstillsats 2 dagar 10 dagar 30 dagar 70 dagar 101 dagar Ingen tillsats, kontroll 1,09 2,36 2,48 2,84 3,08 Lactisil Plus 1.17 1,54 1,66 1,85 1,97 Myrsyra 0,18 0,72 1,21 1,81 1,93 Lactisil Plus + uppfinningen 0,96 1,35 1,48 1,73 1,86 Det framgår att tillsats av konserveringsmedel radikalt minskar lagringsförlusterna hos ensilerat spannmål. Det framgår också av tabellen att effekten av tillsatsen av Lactococcus /actis subsp. /actis enligt uppfinning blir bäst märkbar vid längre tids lagring av ensilaget. Vid lagringstider om mellan 2 och 30 dagar kan myrsyra synas ge bättre effekt än tillsatsen enligt uppfinningen, men förhållandet vänder därefter. Härtill bör bemärkas att myrsyra, enligt vad som anförts ovan kan tillåta uppkomst av icke önskade bakterier och klostridier. Myrsyra är dessutom kemiskt aggresiv och kan vara svårhanterlig för lantbrukaren. 10 15 20 5 511 828 TABELL 2 Mikrobiell tillväxt och uppkomst av förstöringsflora i ensilaget Mikroflora, förstöringsflora CFU/g (log 10) Konserveringstillsats Klostridier Jäst Mögel Ingen tillsats, kontroll 3,7 g 3,6 1,7 Lactisil Plus 3,9 g g 0,7 1,2 l\/lyrsyra 4,7 0,7 O Lactisil Plus + uppfinningen 1,2 1,0 O Kontrollen av halten klostridier, jäst och mögel skedde efter 60 dagars lagring av ensilaget. Det framgår av det ovanstående att en tillsats av bakteriestammen Lactococcus /act/'s subsp. /act/'s mycket markant sänker halten klostridier i ensilaget; halten jäst är betydligt lägre än vid kontrollensilaget, men av samma storleksordning oberoende av vilken konserveringstillsats som användes; inget som helst mögel kunde konstateras, vare sig vid användning av myrsyra eller vid tillsats av bakterien enligt uppfinningen. Halten klostridier vid konservering med uppfinningen som tillsats är dock endast cirka 0,03 % av motsvarande halt vid användning av myrsyra som konserveringsmedel.

TABELL 3 Tillsatsmedlens effekt vid tillsats av förstöringsflora Förstöringsflora CFU logaritmiskt Konserveringstillsats Laktobaciller Klostridier Jäst Ingen tillsats, kontroll 6,1 4,2 5,5 Lactisil Plus 6,2 5,0 5,1 lVlyrsyra 6,1 5,7 5,5 Lactisil Plus + uppfinningen 6,0 < 2 < 2 Det framgår att tillsatsen av bakterien enligt uppfinningen ger upphov till mycket liten halt av klostridier och av jäst i ensilaget, jämfört med vad som är fallet såväl vid kontrollensilaget som vid tillsats av det kända konserverings- medlet Lacticil Plus och tillsats av myrsyra. 511 828 " 6 Den påvisade goda effekten hos bakteriestammen Lactococcus /actis subsp. /actis kan till stor del förmodas uppstå genom att bakteriestammen själv bildar polypeptiden nisin jämte eventuellt något annat ämne, vilket har bakteriehämmande verkan, och som därigenom hämmar uppkomst av jäst, mögel och klostridier redan i så små doser i ensilaget som 100.000 CFU per gram ensilage

Claims (8)

10 15 20 25 30 7 511 828 PATENTKRAV

1. Bakteriestam av typen Lactococcus vilken hämmar uppkomst av jäst och klostridier och jäst samt grampositiva bakterier och vissa gramnegativa bakterier, och som uppvisar god överlevnad, kännetecknad av att bakteriestammen utgör stammen Lactococcus /act/'s subsp. lactis, deponerad vid The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd, Aberdeen, Skottland, under depositionsnummer NClMB 30117.

2. Bakteriestam enligt krav 1, kännetecknad av att den har förmåga att bilda mjölksyra.

3. Bakteriestam enligt krav 1 eller 2, kännetecknad av att den har förmåga att själv producera en eller flera substanser med förmåga att hämma uppkomst och tillväxt av klostridier och jäst.

4. Bakteriestam enligt något av kraven 1, 2 eller 3, kännetecknad av att den har förmåga att själv producera nisin med bakteriehämmande verkan.

5. Användning av en bakteriestam enligt något av kraven 1 - 4 vid ensilering av grönfoder/stråfoder, kännetecknad av att bakteriestammen Lactococcus /act/'s subsp. /actis tillsätts till grönfodret, vilket därefter tillsluts lufttätt, varvid den tillsatta bakteriestammen hämmar uppkomst och tillväxt av klostridier och jäst i ensilaget.

6. Användning enligt krav 5, kännetecknad av att bakteriestammen Lactococcus /actis subsp. /actis tillsätt det färska grönfodret i en halt av mellan 104 och 106 CFU per gram grönfoder.

7. Användning enligt krav 5 eller 6, kännetecknad av att bakteriestammen Lactococcus /act/'s subsp. /actis tillförs grönfodret i kombination med andra konserverande medel och i en halt av mellan 10% och 90% Lactococcus lactis subsp. /actís i den totala mängden tillsatt konserveringsmedel.

8. Användning enligt krav 7, kännetecknad av att bakteriestammen Lactococcus /act/'s subsp. /act/'s blandas i en mängd av 10-90% med en bakterieblandning bestående av Enterococcus faec/'um, Pediococcus acid/lacti, Lactobacillus p/antarum samt en andel av enzymet cellulase.