KR20140015356A

KR20140015356A - 포자형성-결핍 b. 텍사스포러스 세포들 및 효율적이고 비용-효과적인 불활성화 방법들 그리고 그들의 용도

Info

Publication number: KR20140015356A
Application number: KR1020137023142A
Authority: KR
Inventors: 지웨이 지앙
Original assignee: 마이갤럭시 리미티드 컴파니
Priority date: 2011-03-01
Filing date: 2012-02-28
Publication date: 2014-02-06
Also published as: EP3002340A1; CO6751281A2; EP2681338B1; AU2012223481B2; CL2013002370A1; ZA201306276B; BR112013021892A2; US20120225037A1; CA2828541C; CN103732734B; RU2013137673A; US20140162343A1; CN105567587A; BR112013021892B1; JP5970483B2; EP2681338A1; US20140199753A1; MX350277B; JP2014512807A; MX2013009993A

Abstract

새로운 균주들 및 그들의 사용 방법이 제공된다. 상세하게는, 포자형성 결핍 브레비바실러스 (Brevibacillus) 균주를 포함하는 식품들 및 기타 경구적 산물들 또는 치료제들은 개체에게 투여될 때 개체에서 병원균들을 저해하거나 그들의 수를 감소시키고 개체의 건강을 개선시킬 수 있다.

Description

포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들 및 효율적이고 비용-효과적인 불활성화 방법들 그리고 그들의 용도 {Sporulation-deficient B. texasporus cells and methods for efficient and cost-effective inactivation and use thereof}

본 발명은 일반적으로 생물공학의 분야에 관한 것이고, 보다 상세하게는 브레비바실러스 텍사스포러스 (Brevibacillus taxasporus)의 스트레스-민감성 또는 포자형성-결핍 균주, B. 텍사스포러스 유기체의 효율적이고 비용-효과적인 세포 불활성화의 방법, 및 이러한 균주로부터 유래한 사료 또는 물 첨가물에 관한 것이다.

본 명세서에서의 문헌이라면 모두의 인용은 상기 문헌이 선행 기술이라거나, 본 명세서에서의 어느 청구항의 특허성에 대한 재료로 고려되는 점의 승인이 아니며, 어느 문헌의 내용 또는 일자에 관한 진술이라면 모두는 출원의 제출 시 입수가능한 정보를 기초로 하고 상기 진술이 정확한 점의 확증 또는 승인을 구성하지는 않는다.

건강한 동물들 또는 병원성 박테리아들과 같은 병원성 유기체들에 의해 감염되지 않은 동물들은 더욱 신속하게 성장하고 사료 킬로그램 당 더 많은 무게를 획득한다. 그 결과로, 항미생물성 화합물들이 1940년대 이래로 농장 동물들에게 성장촉진제들 (growth promoters)로서 사용되어 왔다. 전형적으로, 항미생물성 화합물들은 사료에서 치료하 (subtherapeutic) 또는 낮은 용량으로 투여된다.

항미생물성 화합물들의 치료하 용량들이 농장 동물들이 건강을 유지하고 더욱 신속하게 성장하도록 돕는데 오랫동안 사용되어 왔던 한편, 최근의 보고들은 항생제들의 사용 및 이들 동물들로부터 생산된 육류 상의 약물-저항성 박테리아의 존재 간의 연관성을 주장한다. 그 결과로, 유럽 위원회 (European Commission), 미국 농림부 (USDA)뿐만 아니라 미국 식품 및 의약품 안전청 (FDA)은 성장촉진제들로서 소정의 항생제들의 사용에 관한 금지들 및 지침들을 모두 규정하였다. 현재는, 규정들이 인간들을 치료하는 데 사용되는 항생제들과 동일하거나 유사한 항생제들의 사용에 관해 전형적으로 중점을 두고 있다. 그러나, 일반적으로 농장 동물들의 성장을 증진시키는 모든 항생제들의 사용에 대한 무성한 반대의견이 존재한다. 또한, 유기농으로 자란 육류를 위한 시장이 증가하고 있으며, 유기농으로 인증되기 위하여 미국 육류는 항생제들 없이 자란 동물들로부터 나와야 한다. 그 결과로, 농장 동물 사료를 위한 새로운 성장증진제에 대한 필요성이 존재한다.

또한, 반려 동물 건강이 신속하게 성장하는 시장이기도 하다. 선천적 면역의 자극을 통해 반려 동물들 (예로, 노화된 반려 동물)의 건강을 유지하는 것은 반려 동물들의 건강 유지에 대한 매력적인 접근법이고, 경구적으로 전달된 면역 자극제가 높게 가치 평가될 것이다.

브레비바실러스 텍사스포러스 (Brevibacillus texasporus, BT) (예로, ATCC PTA-5854)는 최근에 확인된 양이온성 NRPS 펩타이드들의 그룹을 생산하는 토양 박테리아이다 (국제특허출원 제 WO 2005/074626호, 및 WU et al. 2005를 참조하라). BT로부터 나온 양이온성 펩타이드들은 그램 양성 및 음성 박테리아, 곰팡이 및 원생동물을 죽이는, 시험관내 항박테리아 활성의 광범위한 스펙트럼을 보여준다 (국제특허출원 제 WO 2005/074626호).

시험관내 항박테리아 활성에도 불구하고, BT 펩타이드들은 생체내에서는 항박테리아 활성이 결여된 것으로 여겨진다. 반코마이신-저항성 엔테로코커스들은 시험관내에서 BT 펩타이드들에 매우 민감하다. 그러나, 최소 저해 농도들의 초과의 농도들에서 BT 펩타이드들은 마우스 GI관으로부터 얻은 공생적 VRE를 탈군집화하는 데 실패한다.

그러나, 분리된 펩타이드는 닭들에서 사료 첨가물로서 사용될 때 대장균증 및 살모넬라증을 예방하는 데 효과적인 것으로 확인되었다. 또한, 이러한 분리된 펩타이드는 닭들에서 성장을 촉진하고 사료 전환을 증가시키는 데 효과적인 것으로도 역시 확인되었다.

아마도 더욱 중요하는 것은, BT 펩타이드들의 생체내 효과가, 이것이 그의 시험관내 최소 저해 농도들 미만의 농도들에서 대장균 및 살모넬라에 의한 닭들의 감염들을 예방하는 데 효과적이기 때문에 그의 시험관내 항생제 활성들과는 독립적인 것으로 보인다 (JIANG et al. 2005; KOGUT et al. 2007; KOGUT et al. 2010). 혈액 이염색백혈구들 및 단핵구들이 BT 펩타이드들을 사료로 준 닭들에서 활성화를 위해 감작되고, 가능한 작용의 방식으로서 선천적 면역자극을 지적하는 점도 역시 주목된다. 이들 특징들은 농장 동물 생산에서 BT 펩타이드들을 이상적인 사료 첨가물 및 항생제 화합물들의 대안이 되게 한다.

또한, 선천적 면역은 지금 바이러스성 및 곰팡이성 감염들을 조절하는 데뿐만 아니라 비만/대사적 증후군 및 제 2형 당뇨병과 같은 비-감염성 질병들을 예방하는 데도 핵심 역할들을 하는 것으로 역시 알려져 있기 때문에 (VIJAY-KUMAR et al. 2010), BT 선천적 면역 조정인자도 역시 이들 치료요법적 영역들에서 중요한 적용들을 가져야 한다.

그러나, BT 펩타이드들의 시료 첨가물로서의 경제적 가치는, 생산의 비용이 경제적으로 더 이상 살아남을 수 없는 정도로 증가하는, 펩타이드들을 분리할 필요성에 의해 심각하게 제한된다. 펩타이드들을 정제하는 것의 대안으로서, 전체 유기체 (PTA-5854)가, 국제특허공고 제 WO 2005/074626호에서 논의된 바와 같이 사료 첨가물의 생산을 위해 직접 사용될 수 있는 것이 가능하다.

전형적으로, 직접-사료 미생물 (DFM) 또는 프로바이오틱 균주는 생존가능한 형태 및 충분한 수들로 장에 도달하는 것이 필요하고, 이는 사료 가공 및 소화과정 동안 균주의 생존을 요구한다 (미국 특허 제 5,480,641호 및 미국 특허공고 제 20040247568호를 참조하라). 사료 펠렛 생산은 전형적으로 생존도를 유의하게 감소시키기에 충분한 열이 관여하기 때문에, 대부분의 프로바이오틱 균주들은 위에서 발견되는 열 및 pH 조건들에 대한 그들의 저항성으로 선택된다. 현재까지 대부분의 안정한 프로바이오틱 균주들은, 박테리아 포자들이 열에 안정하고 장기간의 보관 기간 동안 살아남기 때문에 바실러스 포자들이 된다.

그러나, BT 유기체가 농장 동물들의 장관에서 정상적으로 발견되는 공생적 박테리아라고 여겨지지 않기 때문에, 사용 전에 유기체를 불활성화하는 것이 바람직하고 및/또는 필요하다. 그러나, 포자를 생산하는 균주들에서 이 점이 문제가 된다. 또한, 적어도 하나의 정부 규제기관은 미생물 출처들이 관여하는 새로운 사료들을 평가할 때 다음의 판단기준들을 고려하고 있다: 미생물 생산의 안전성; 미생물 산물의 인간, 동물들 및 환경에 대한 안전성; 수평적 유전자 전달의 잠재적인 영향; 위장관의 미생물총과의 상호작용들; 장에서의 지속성; 생존가능한 미생물들의 배출 (shedding)로 인한, 상세하게는 육류의 오염으로 인해 감지된 건강 문제들이 존재하는 경우라면 감지된 인간들 및 환경에 미치는 잠재적인 영향 (새로운 사료들의 평가를 위한 지침들에 관한 지도방안: 미생물 출처들, 초안 - 2007년 6월, 캐나다 식품조사국). 따라서, 미생물들을 식품 첨가물로서 사용할 때 두 가지의 모순되는 기대 성과들이 존재한다. 첫 번째는 유기체를 가공 및 소화 과정을 통하여 살아남는 조건에서 유지하는 것이고, 두 번째의 정반대되는 기대는 활성을 가진 펩타이드들의 불활성화는 없이 유기체를 완전하게 또는 거의 완전하게 불활성화하는 것이다. 불활성화의 추가적인 유익은 이것이 장 및 환경에서 B. 텍사스포러스 및 미생물들 간의 수평적인 유전자 전달의 기회들을 제거하거나 감소시키고; 위장관 (GI) 미생물총과의 잠재적인 상호작용들을 제거하거나 제한하며; 살아남는 세포들의 배출을 통한 인간들 및 환경에 미치는 잠재적인 위험성을 제거하거나 감소시키고; 및/또는 사료를 소비하는 동물로부터 유래한 육류의 오염을 제거하거나 감소시키는 점이다. 따라서, PTA-5854에 의한 계속적인 포자 형성은, 포자들이 무성생식 세포들을 불활성화하는 데 사용하는 대부분의 방법들과 극단적으로 저항하기 때문에, DFM으로서 본 균주를 사용하는 능력을 심각하게 제한하고 그들의 제거를 위해 어렵고도 값비싼 방법들을 강요한다.

그 결과로, 당해 기술분야에는 불활성화된 DFM으로서 효과적으로 사용될 수 있는 브레비바실러스 텍사스포러스 (Brevibacillus taxasporus)의 균주를 위한 필요성이 존재한다.

관련 출원들에 관한 교차 참조

본 출원은 2011년 3월 1일자로 제출된 미국 가특허출원 제 61/447,703호의 유익을 주장하고, 그의 전부는 참고문헌으로 통합되어 있다.

한 가지 구현예에서, 본 발명은 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 박테리아 균주의 활성화된 세포들 또는 활성화된 배양액을 포함하는 사료 또는 물 첨가물이다. 본 발명은, 이에 제한되는 것은 아니지만 가금류, 가축, 소, 돼지, 닭, 말, 칠면조, 양, 염소, 오리, 메추라기, 콘월 투계들, 암컷 새, 비둘기, 사육된 어류, 가재, 새우, 민물 거북이, 개 및 고양이를 포함하는 동물의 하나 이상을 위한, 사료 또는 음료수에 첨가될 수 있는 본 발명의 불활성화된 건조된 세포들 또는 배양액들 (예로, 동결건조된 또는 분산-건조된 세포들 또는 배양액들)의 용도에도 역시 관한 것이다. 예를 들면, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 세포들 또는 배양액들은 파스퇴르화, 기아, 온도 (열, 냉장 또는 냉동), 탈수 (예로, 열-건조, 냉동-건조, 분산-건조, 태양-건조, 공기-건조 또는 진공-건조), 산성화, 알칼리화, 알코올들, 계면활성제들, 라이소자임, 기계적 힘, 사차 암모늄 양이온들, 산화제들 (예로, 염소산화물, 과산화수소, 차아염소산염 또는 오존) 및/또는 방사선조사 (예로, UV, X-선들 또는 감마선들)를 통해 불활성화될 수 있고, 다음으로 불활성화된 세포들 또는 배양액은 음료수 또는 곡물-기초 사료, 예로 보리, 콩, 밀, 트리티케일, 호밀 및 그들의 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 곡물을 포함하는 사료와 같은 동물 사료에 포함될 수 있다. 사실상, 본 발명은 매우 다양한 사료들에 첨가될 수 있다. 본 발명의 불활성화된 세포들 또는 분리된 펩타이드들은 이유식 (milk replacer), 성장 사료 (grower feed), 최종 사료 (finisher feed), 전-개시 사료 (pre-starter feed), 개시 사료 (starter feed), 물 및 그들의 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 음료수 또는 가축용 사료와 혼합될 수 있다.

본 발명은 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들 또는 세포 배양액을 불활성화하고 (예로, 열 처리 또는 탈수) 불활성화된 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들 또는 배양 배지들을 더한 세포들을 동물에게 성장을 증가시키기에 충분한 양으로 제공하는 단계에 의해, 농장 및 반려 동물들의 체중 획득 및 사료 전환을 증가시키는 방법도 역시 포함한다. 선택적으로, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들 또는 상기 세포들을 포함하는 배양 배지들의 유효량이 동물 사료 내에 건조되고 (탈수되고) 및/또는 펠렛화 (열 처리의 형태)되거나 음료수에 첨가된다.

사료 성분들의 예들로는 곡물, 콩 사료 (soybean meal), 분리된 콩 단백질, 분리된 콩기름, 분리된 콩지방, 탈지우유, 어류 음식, 육류 음식, 뼈 음식, 혈액 음식, 혈장 단백질, 유장, 쌀겨, 밀기울도 역시 포함하고, 또한 감미료, 미네랄, 비타민, 소금, 및 목초도 포함할 수 있다.

대표적인 구현예에서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들은 사료 성분들 (예로, 옥수수 분말 및 콩 분말)의 현탁액을 포함하는 배지에서 성장된다. 다음으로 배양액은 사료 첨가물 (배양액의 입자들이 BT 펩타이드들을 위한 담체들로서 기능한다) 또는 증진된 사료를 만들도록 세포 불활성화 및/또는 건조/탈수 과정이 시행될 수 있다.

본 발명은 불활성화된 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들 또는 배양액을 동물에서 미생물 감염들을 치료하고 및/또는 예방하기에 충분한 유효량으로 제공하는 단계에 의해, 동물들에서 미생물 감염들을 예방하고 및/또는 치료하는 방법도 역시 포함한다.

본 발명은 불활성화된 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들 또는 배양액을 동물에서 미생물 감염들을 치료하고 및/또는 예방하기에 충분한 유효량으로 제공하는 단계에 의해, 성장하는 동물들에서 무게 획득 및 사료 전환을 촉진시키는 방법도 역시 포함한다.

본 발명은 포자형성-결핍 세포들의 인간 식품 또는 물 첨가물로서 용도도 역시 포함한다.

대표적인 구현예에서, 본 발명은 배양액을 약 50℃의 온도까지 약 5분 동안 놓아두고 생존율 또는 콜로니 형성 능력을 결정하는 단계에 의해 측정될 수 있는, 약 3.5 × 10^-3이하, 약 1 × 10^-4이하, 약 1 × 10^-5이하, 약 1 × 10^-6이하, 약 1 × 10^-7이하, 약 1 × 10^-8이하, 또는 약 1 × 10^-9이하의 생존율들을 가지는 B. 텍사스포러스의 포자형성-결핍 균주들을 제공한다.

대표적인 구현예에서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주는, 배양액이 기아, 냉동 (유효량의 동결보호제의 부재 시), 탈수 (고속 진공으로 23℃에서), pH 극단들 (예로, pH 1.0 또는 pH 13.0), 포화 부탄올, 계면활성제의 첨가 (예로, 1% SDS) 또는 용해제 (예로, 라이소자임), 초음파 파쇄, 기계적 힘 (예로, 동물 사료 펠렛화 기계의 프렌치 프레스) 또는 과산화수소 (예로, 1% H₂O₂ 이상 또는 이와 동등)과 같은 불활성화 처리에 놓여질 때, 약 1 × 10^-9이하의 생존율과 같은 감소된 생존율도 역시 보여준다.

본 발명은 또한 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주로부터 유래한 세포들을 사용하여 B. 텍사스포러스 제조물에서 BT 펩타이드 수율을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주로부터 유래한 세포들을 사용하여 BT 펩타이드들의 정제 또는 분리가 없이도 B. 텍사스포러스 제조물에서 BT 펩타이드들의 안정성 및 경제적 유용성을 증가시키는 방법에도 관한 것이다.

본 발명은 또한 분말에 실질적으로 포자들이 없는, B. 텍사스포러스 균주의 분말화된 형태에 관한 것이다. 대표적인 구현예에서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포 러스는 충분한 세포 밀도까지 액체 배지에서 성장되고, 상기 배양액은 실질적으로 포자들이 없는 분말을 생산하도록 탈수되고 건조된다. 다음으로 상기 분말은 B. 텍사스포러스 박테리아들로부터 얻은 유의하게 많은 살아남은 포자들을 포함하지 않는 증진된 동물 음료 또는 식품을 생산하도록 물 또는 사료 성분들과 혼합될 수 있다.

본 발명은 또한 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주를 불활성화하거나 죽이고 이후에 세포들을 단순하게 세척해 낼 수 있도록 장치 및/또는 설비를 처리하는 단계에 의해, B. 텍사스포러스 생산에 사용되는 장치 및/또는 설비로부터 B. 텍사스포러스 세포들을 제거하거나 탈오염시키는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 증기 또는 고온의 물이 장치 및/또는 설비를 청소하는 데 사용될 수 있고, 여기에서 물은 세포들을 제거하고 그들을 (온도로 인해) 죽일 것이고, 이에 의해 B. 텍사 스포러스 세포들을 장치 및/또는 설비로부터 효과적으로 제거한다.

본 발명은 또한 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 유효량을 투여하여, 동물 또는 인간에서 면역 체계를 자극하는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주가 성장될 수 있고, 세포들은 배양 배지들이 있거나 없이 수확될 수 있으며, 세포들은 이것이 투여되는 동물의 면역 체계를 자극하는 증진된 음료 또는 식품을 생산하도록 물 또는 추가적인 식품 성분들과 혼합될 수 있다. 예를 들면, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주는 불활성화되어 동물 또는 인간의 면역 체계를 자극하도록 동물 또는 인간에게 직접 주어질 수 있다. 또 다른 대표적인 구현예에서, 본 발명은 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 유효량 및 식품 담체를 동물 또는 인간에게 투여하여, 동물 또는 인간의 면역 체계를 자극하는 증진된 식품에 관한 것이다.

포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주는 성장되고 면역 체계를 자극하는 증진된 음료 또는 식품을 생산하도록 물 또는 식품 성분들과 혼합될 수 있으며, 예를 들면 이것은 증진된 음료 또는 식품과 조합으로 또는 증진된 음료 또는 식품을 전달하는 것과 연속으로 동물 또는 인간에 투여되는 백신에 대한 면역반응을 추가자극 (boost)할 수 있다. 또한, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주는 불활성화되어 동물 또는 인간에게 주어질 수 있으며, 예를 들면 불활성화된 세포들은 건조되고, 원하는 가공 및/또는 투여 부위로 전달되고, 동물 또는 인간에 의해 소비될 물과 식품으로서, B. 텍사스포러스 균주로부터 얻은 생존가능한 포자들을 포함하지 않는 물 또는 식품과 혼합될 수 있다.

본 발명은 또한 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 유효량을 하나 이상의 백신들과 조합으로 투여하여, 인간을 포함하는 동물의 면역 체계를 자극하는 조성물에 관한 것이다. 예를 들면 포자형성-결핍 균주는 성장되고, 세포들은 수확되고 (배양 배지가 있거나 없이, 예로 세포들은 원심분리 이후에 세척될 수 있고), 백신과의 조합 이전에 또는 조합으로 동물에게 투여될 수 있고, 여기에서 세포들은 백신에 대한 면역 체계의 반응을 감작시키거나 추가자극한다.

본 발명은 또한 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주를 동물에게 투여하는 단계를 포함하는, 동물에서 질병을 예방하고 및/또는 치료하는 조성물 및/또는 방법에 관한 것이다. 예를 들면, 치료는 동물에서 병원성 미생물 집단 (population)을 감소시키는 것이 관여할 수 있다. 감소될 수 있는 대표적인 병원균들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 아시네토박터 (Acinetobacter), 바실러스 (Bacilli), 보렐리아 (Borrelia), 캄파일로박터 (Campylobacter), 클로스트리디아 (Clostridia), 대장균 (E. coli), 엔테로코커스 (Enterococcus), 구제역병 바이러스, 고노리아 (Gonorrhea), 헤모필러스 (Haemophilus), 인플루엔자 바이러스, 만하이미아 (Mannheimia), 마이코박테리아 (Mycobacteria), 마이코플라스마 (Mycoplasma), 파스테렐라 (Pasteurella), 슈도모나스 (Pseudomonas), 살모넬라 (Salmonella), 스태필로코커스 (Staphylococcus) 및 스트렙토코커스 (Streptococcus)를 포함한다. 대표적인 질병들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 대장균증 (colibacillosis), 살모넬라증 (salmonellosis), 괴사성 장염, 콕시디아증 (coccidiosis), 인플루엔자, 구제역병, 돼지의 생식 및 호흡 증후군, 소의 항해 열성 폐렴 (bovine shipping fever pneumonia), 뇨관 감염, 비만/대사성 증후군 및 제 2형 당뇨병을 포함한다.

포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주들은, PTA-12307 (균주 MYG113), PTA-12308 (균주 MYG110), PTA-12309 (균주 MYG107) 및 PTA-12310 (균주 MYG11)로서 명명되고, 2011년 12월 7일에 기탁되었다. 이들 균주들 모두는 부다페스트 조약의 규정들 하에 미국 타입배양수집 (ATCC) 기관 (10801 University Blvd., Manassas, Virginia 20110-2209, USA)에 기탁되었으며, 참고문헌으로 통합되어 있다.

본 발명은 또한 PTA-12307, PTA-12308, PTA-12309 및 PTA-12310의 적어도 하나로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 브레비바실러스 (Brevibacillus) 속에 속하는 적어도 하나의 박테리아 균주에도 관한 것이다.

본 발명의 세포들을 불활성화하는 데 사용될 수 있는 한 가지 접근법은 세포들을 적당한 배지에서 배양하고, 다음으로 사료 성분들을 상기 배양액에 첨가하거나 상기 배양액을 사료 성분들에 첨가하여 세포들을 탈수시키는 단계가 관여한다.

본 발명의 세포들을 불활성화하는 데 사용될 수 있는 또 다른 접근법은 (열 충격 제외) 세포들을 약 1, 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 10, 약 11, 약 12, 약 13, 또는 약 14의 pH와 같은 pH 극단에 놓아두는 단계가 관여한다.

본 발명의 세포들을 불활성하기에 충분한 pH의 변화들은 생리학적으로 내성을 가지는 범위 초과로 pH를 효과적으로 이동시키도록 염기, 산 및/또는 다른 조성물의 첨가에 의해 달성될 수 있다. 예를 들면, 이산화탄소는 물에 용해되어 탄산을 생산하고 pH를 낮추어 세포들의 불활성화를 유발할 수 있다.

본 발명의 세포들을 불활성화하는 데 사용될 수 있는 또 다른 접근법은 ("고압 처리" 또는 "초-고압 처리" 또는 "초-고압 무균화"라고도 역시 알려진) 고압 가공이고, 이는 박테리아, 곰팡이 등의 무성생식 세포들을 이들 세포들이 존재하는 산물들로부터 제거하도록 100 내지 1,000 MPa (14,500 내지 145,000 psi), 또는 150 내지 600 MPa (25,000 내지 90,000 psi)의 범위로 압력의 적용이 관여할 수 있는 공정이다.

고압 처리의 예로는 세포 현탁액에 압력 (40,000 psi까지)을 적용한 다음 갑자기 압력을 방출하는 단계에 의해 세포를 파괴하는 프렌치 프레스 접근법 (프렌치 프레싱)이다. 따라서, 본 발명의 포자형성-결핍 균주는 약 40,000 psi, 20,000, 10,000, 5,000, 2,000, 1,000 psi의 압력 및 그들의 조합의 적용 및 방출에 의해 불활성화될 수 있다.

본 발명의 세포들을 불활성화하는 데 사용될 수 있는 보다 또 다른 접근법은 세포들을 알코올에 최종 농도 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 약 10%, 약 5%, 약 2%, 또는 약 1% (v/v)로 놓아두는 단계가 관여한다.

본 발명의 세포들을 불활성화하는 데 사용될 수 있는 보다 또 다른 접근법은 세포들을 계면활성제에 최종 농도 10%, 약 5%, 약 2%, 약 1%, 약 0.5%, 약 0.2%, 또는 약 0.1% (w/v)로 놓아두는 것이 관여한다.

본 발명의 세포들을 불활성화하는 데 사용될 수 있는 보다 또 다른 접근법은 세포들을 B. 텍사스포러스 세포들을 둘러싼 환경에서 물 함량을 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 2% 또는 약 1% 미만의 수준으로 감소시켜서 탈수를 시행하는 단계가 관여한다.

대표적인 구현예에서, 본 발명에 따른 포자형성-결핍 세포들의 배양액은 준비되고 하나 이상의 불활성화 방법들에 의해 처리되고 동물 사료에 적용된다. 예를 들면, 포자형성-결핍 세포들의 배양액 고수율 시스템을 사용하여 성장된 다음 분말을 생산하도록 분산 건조될 수 있다. 본 시나리오에서, 분산 건조는 세포들을 불활성화하고 건조된 사료 스톡들에 다음으로 첨가될 수 있는 산물을 생산하는 데 사용된다. 임의적으로, 세포 배양액은 펠렛화된 사료를 제조하는 공정 동안과 같은 열 및/또는 압력의 추가에 의해 불활성화될 수 있다.

또 다른 대표적인 구현예에서, 본 발명에 따른 MYG107, MYG110, 또는 MYG113와 같은 포자형성-결핍 세포들의 배양액은 액체 배지에서 성장되고, 다음으로 동물 사료 성분들의 실질적으로 건조한 혼합물 또는 동물 사료 곡물에 첨가되어 (고체들과 대비하여) 약 10% 및 약 25% 사이의 최종 수분 함량을 가지는 혼합물을 생산하고, 다음으로 습윤된 혼합물은 펠렛 제분기를 통과하여 적당한 크기의 펠렛들을 생산하고, 이는 다음으로 최종 수분 함량 예를 들면 약 5%로 건조된다. 본 예에서, 동물 사료 성분들의 실질적으로 건조한 혼합물에 세포들의 첨가는 다음으로 열의 추가 및 펠렛들의 건조화에 의해 강조된 탈수의 형태를 제공한다. 이들 조건들 하에서 모든 또는 사실상 모든 세포들이 불활성화될 것으로 믿어진다.

또 다른 대표적인 구현예에서, #2 노란색 옥수수, 콩 사료, 쌀겨들, 회수된 단백질 산물들, 소금, 분말화된 석회암 포스페이트, 액체 동물지방, 및 액체 콜린을 포함하는 사료 성분들이 본 발명의 불활성화된 세포들을 포함하는 사료를 생산하는 데 사용된다. 사료의 회분 (batch)은 일반적으로 건조 분말화된 또는 마쇄된 성분들을 균질한 상태로 혼합한 다음 액체 성분들을 첨가하여 제조될 수 있고, 이는 B. 텍사스포러스 세포들을 포자형성-결핍 배양액을 (탈수의 형태) 포함할 수 있다. 습윤된 혼합물은 증기가 첨가되고 (열 충격의 형태를 제공함) 사료가 반죽이 되는 조정 (conditioning) 체임버로 운반된다. 본 반죽은 펠렛화 이전에 철저하게 혼합되고 펠렛 제분기 내로 들어간다. 펠렛 제분기에서, 부드럽고 뜨거운 반죽은 다이를 통해 압박되고 기둥형의 펠렛들로 형성된다. 펠렛들은 냉각기/건조기로 보내지고, 여기에서 환풍기가 펠렛들로부터 수분 및 열을 제거 (또한 탈수)하도록 펠렛들의 베드를 통해 보통의 공기를 환기시킨다. 다음으로 운반대 및 용기 엘리베이터가 액체 코팅 공정으로 사료를 움직이는 데 사용될 수 있고, 여기에서 동물 지방이 무게로 약 2%로 사료 위에 분산될 수 있다. 다음으로 처리를 마친 사료는 사용을 위해 준비된다.

또 다른 대표적인 구현예에서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 약 1.0 × 10¹⁰, 1.0 × 10¹¹, 1.0 × 10¹², 1.0 × 10¹³, 1.0 × 10¹⁴, 또는 1.0 × 10¹⁵개의 불활성화된 세포들이 약 1,000 kg의 동물 사료에 첨가된다.

보다 또 다른 대표적인 구현예에서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들의 유효량이 동물에게 투여된다. 보다 또 다른 대표적인 구현예에서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들의 물 내 또는 사료 내의 유효 용량은 약 5 ppm 및 약 1000 ppm 사이, 약 15 ppm 및 약 1000 ppm 사이, 약 20 ppm 및 약 1000 ppm 사이, 약 5 ppm 및 약 100 ppm 사이, 약 10 ppm 및 약 100 ppm 사이, 약 20 ppm 및 약 100 ppm 사이, 약 5 ppm 및 약 75 ppm 사이, 약 10 ppm 및 약 75 ppm 사이, 약 20 ppm 및 약 75 ppm 사이, 약 5 ppm 및 약 50 ppm 사이, 약 10 ppm 및 약 50 ppm 사이 또는 약 20 ppm 및 약 50 ppm 사이 범위의 BT 펩타이드들을 포함한다.

또 다른 대표적인 구현예에서, 본 발명의 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들의 탈수는 냉동 건조화, 진공 건조화, 분산 건조화, 삼투적 탈수, 유체화된 베드 탈수, 용매 증발 탈수, 초음파 파쇄 조력된 탈수, 전자레인지 조력된 탈수, RF-조력된 탈수, 및/또는 그들의 조합에 의해 수행된다.

또 다른 대표적인 구현예에서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들 또는 배양액의 탈수는 물-흡수 물질 (예로, 사료 성분), 열 (동물 사료 펠렛화 공정에서 생성된 것과 같음) 및/또는 증발의 추가에 의해 시행된다.

본 명세서에서 사용되는 바 그리고 첨부된 청구항들에서, 단수형들, 예를 들면, "하나 (a)", "하나 (an)", 및 "그 (the)"는 달리 문맥이 명확하게 진술하지 않는 경우라면 복수형을 포함한다. 예를 들면, "B. 텍사스포러스 박테리아"에 대한 언급은 다수의 이러한 박테리아들을 포함하고, "세포"에 대한 언급은 역시 다수의 유사한 세포들, 및 그들의 동등물들에 대한 언급이다.

본 명세서에서 사용되는 바, "약 (about)"은 진술된 수 또는 양과 합리적으로 근접한, 대략, 또는 조금 이상 또는 이하를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "동물"은 말들, 염소들, 양들,, 소들, 돼지들, 닭들, 칠면조들, 투계들, 거위들, 오리들, 개들, 고양이들, 앵무새들, 어류, 가재들, 새우들, 민물 거북이들, 및 인간들 등을 포함하는, 무척추동물 또는 척추동물이라면 모두를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "사료 (feed)" 또는 "식품 (food)"은 아미노산들, 항산화제들, 탄수화물들, 양념들, 효소들, 지방들, 미네랄들, 비-단백질 질소 산물들, 단백질들, 비타민들, 및/또는 결합제들을 포함하는 물질 또는 물질들의 혼합물이라면 모두를 의미하고, 동물 또는 인간의 영양적 요구들의 적어도 일부를 제공하도록, 및/또는 동물에서 영양적 장애들을 예방하거나 치료할 목적을 위해 가축 및 애완 동물들과 같은 동물들, 또는 인간에 의한 소비를 위해 제조되거나, 판매되거나, 제시되는 펠렛화, 채색, 거품화 및/또는 향미 제제들을 포함할 수 있다. 생명의 영양분으로서, 물이 사료 성분으로서 고려되고 수용성 음료는 사료 또는 식품이 된다.

본 명세서에서 사용되는 바, "불활성화하다" 또는 "불활성화"는, 일반적으로 포자들을 죽일 수는 없고 배양액의 상대적 콜로니 형성 효율 (생존율)을 약 1 × 10^-3이하, 약 1 × 10^-4이하, 약 1 × 10^-5 이하, 약 1 × 10^-6이하, 약 1 × 10^-7이하, 약 1 × 10^-8이하, 또는 약 1 × 10^-9 이하로 감소시키는, 기아, 온도 충격, 탈수/동결건조/건조화 (예로, 열-건조, 냉동-건조, 분산-건조, 태양-건조, 공기-건조 및/또는 진공-건조), pH 변화들 (예로, 산성화 또는 알칼리화), 알코올 처리, 계면활성제로의 처리, 여과, 은 및 아연과 같은 금속들로의 처리, 고압 가공과 같은 압력 처리, 효소적 파괴 (예로, 라이소자임으로의 처리), 기계적 힘 (예로, 초음파 파쇄), 사차 암모늄 양이온들로의 처리, 산화제들 (예로, 염소산화물, 과산화수소, 차아염소산염 및/또는 오존), 소금화, 전기장 처리, 전자레인지 처리, 전자빔 처리, 방사선조사 및/또는 그들의 조합들과 같은 처리 또는 스트레스라면 모두를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 "불활성화된 세포들 또는 배양액"은 비-생존가능한 B. 텍사스포러스 세포들, 적어도 부분적으로 방출된 세포 내용물 및/또는 배양 배지 성분들의 혼합물을 의미한다. 본 발명의 포자형성-결핍 균주의 불활성화가 사용된 불활성화 조건들에 의존하여 많은, 대부분 또는 모든 세포들의 용해를 유도할 수 있는 점을 주목해야 한다. 따라서, "불활성화된 세포", "불활성화된 배양액" 및 동등한 어구들은 그들의 의미 내에 적어도 부분적으로는 불활성화 공정에 의해 생산된 세포 용출물을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "돌연변이"는 하나 이상의 뉴클레오타이드들의 삽입들, 결실들, 전이들 및 전환들을 포함하는 핵산의 서열에서 변화라면 모두를 의미한다. 결실 또는 삽입의 크기는 단일한 뉴클레오타이드로부터 많은 유전자들에 이르기까지 다양화될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "표현형"은 세포 또는 세포들의 배양액의 관찰된 생화학적, 생리학적, 및/또는 형태학적 특징들을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 바, "포자형성-결핍"은 전적으로 포자형성-능력을 갖춘 야생형 (wt) 상대편 균주와 대비하여 포자 형성 과정 또는 산물에서 검출가능한 결함이라면 모두를 나타내는 박테리아 균주를 말한다. 따라서, 용어 "포자형성-결핍"은 배양액의 상대적 콜로니 형성 효율 (생존율)을 약 8.1 × 10^-7이하, 약 3.5 × 10^-3이하, 약 1 × 10^-4이하, 약 1 × 10^-5 이하, 약 1 × 10^-6이하, 약 1 × 10^-7이하, 약 1 × 10^-8이하, 또는 약 1 × 10^-9 이하로 감소시키는, 기아, 온도 충격, 탈수, 산성화 알칼리화, 알코올들, 계면활성제들, 라이소자인, 기계적 힘, 사차 암모늄 양이온들, 산화제들 및/또는 방사선 조사와 같은 스트레스에 대한 민감성을 가지는 균주라면 모두를 말하고, 이는 포자형성-능력을 갖추지 못하고 실질적으로 포자형성-손상된 세포들 또는, 다른 방식으로 말하면 균주가 포자들을 형성할 수 없거나 세포들이 포자들을 형성하는 축소된 능력을 가지기 때문에 포자들이 형성되지 않는 세포들 또는 포자들이 형성되기는 하지만 포자들이 살아남을 수 없거나 포자들이 불활성화 스트레스에 민감하고 이에 노출 시 살아남을 수 없는 세포들을 포함한다. 포자형성-결핍들은 본 명세서에서 기술된 어떠한 방법들에 의해서도 측정될 수 있고, 예를 들면 활발하게 성장하는 배양액은 약 50℃ 또는 약 70℃의 열 충격이 시행되고 상대적 콜로니 형성 효율이 미처리된 배양액 또는 열 충격이 시행되지 않았던 배양액의 분량에 대해 측정될 수 있다.

"기아 (starvation)"는 활발한 또는 무성생식 세포들의 수에서 감소를 초래하고 (포자 형성 및/또는 세포 사망을 자극하는 영양분 고갈이다. 야생형 B. 텍사스포러스 세포들은 적어도 부분적으로 기아를 생존하도록 포자형성을 거치지만, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 세포들은 기아에 의해 유발된 세포 사망을 피할 수 없다. 따라서, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 불활성화된 배양액은 단순하게 균주를 성장 배지 내에 접종하고 세포들이 초기 배양기 이후에 기아로 죽도록 연장된 기간 동안 균주를 배양하는 것에 의해 획득될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, "온도 충격"은 약 50℃ 내지 약 100℃의 열, 약 0℃ 내지 약 16℃의 추위 또는 냉동을 의미한다.

"탈수"는 B. 텍사스포러스 세포들의 주위 환경에서 물 함량의 감소, 삼투적 충격을 유발하는, 예를 들면 약 80%, 약 70%, 약 60%, 약 50%, 약 45%, 약 40%, 약 35%, 약 30%, 약 25%, 약 20%, 약 15%, 약 10%, 약 5%, 약 2% 또는 약 1% 미만의 수준으로 주위 환경에서 물 함량을 감소시키는 공정 또는 처리라면 모두로서 정의된다.

본 발명의 세포들의 유효량은 바람직하게 동물의 크기 나이, 무게 및/또는 의학적 병태와 같은 요인들을 기초로 하여 의사 또는 수의사에 의해 결정된다.

PTA-5854에서 포자 형성은 PTA-5854 포자들이 BT 펩타이드들을 분해하는 것으로 보이기 때문에 BT 펩타이드들의 수득 수준을 제한한다. 이론에 얽매이려 하지 않더라도, 포자 형성 및/또는 포자 활성화는 PTA-5854에 의해 BT 펩타이드들의 생산을 감소시키는 것으로 보인다. 도 1에서 나타난 바와 같이, 영양분 고갈이 적어도 시작되는 시간대인 3일째 미만 37℃에서 LB 배지로 PTA-5854의 연속적 배양은 BT 펩타이드들의 고갈을 유도하였다 (#1). 본 BT 펩타이드 고갈은 3일째 UV-방사선 조사에 의해 예방될 수 있고, 이는 활발한 (무성생식) 세포들 및 포자들 (#2) 둘 다를 죽였다. 그러나, BT 고갈은 3일째 가열에 의해 예방될 수는 없었고, 이는 단지 활발한 세포들만을 죽이고 포자들을 불활성화하지는 못하였다 (#3).

BT 펩타이드 수준들의 감소에 추가하여, PTA-5854에서 포자형성은 균주를 사료 첨가물로서 사용하는 가장 경제적인 방법을 방해한다. 상세하게는, BT 펩타이드의 사료 첨가물로서 사용이 낮은 생산 비용을 요구하고, 이는 실제적으로 펩타이드 정제 단계라면 모두를 배제시킨다. 그 결과로서, 가장 경제적인 BT-기초 사료 첨가물은 탈수된 B. 텍사스포러스 배양액이 될 것이다. 탈수는 B. 텍사스포러스의 포자들은 아니지만 무성생식 세포들만을 불활성화할 수 있으며, 따라서 탈수는 포자형성 능력있는 균주를 불활성화할 수는 없다. 또한, 이러한 균주로부터 얻은 포자들은 발아하여 주변 BT 펩타이드들을 고갈시킬 수 있으며, 여기에서 포자들을 발아시키는 단계에 의한 BT 펩타이드들의 분해도 역시 사료 산물이라면 모두의 안정성을 위해 심각한 문제를 제시할 것이다.

마지막으로, B. 텍사스포러스 포자들을 포함하는 사료 첨가물은 규정 표준들을 만족시킬 수 없고 생산자 균주의 전파에 관한 문제점을 초래한다. 그 결과로, 포자들을 효과적으로 불활성화하거나 제거할 수 있는 단계가 매우 필요하게 된다.

그러나, B. 텍사스포러스는 제거하거나 불활성화하기 어려운 포자들을 계속적으로 형성한다. B. 텍사스포러스 및 그 결과로 나온 포자들을 불활성화하는 데 사용될 수 있는 보편적인 기법들로는, 감마선 조사, 고압멸균 및 기타 극단의 처리들을 포함한다. 감마선 조사가 BT 펩타이드들을 손상시키지 않고도 포자들을 제거하는 데, 상세하게는 물리적 설정들에서 효과적이라고 하더라도 이것은 일반적으로 산업에 의해 실행가능 또는 비용-효과적인 것으로 고려되지 못한다. 고압멸균은 포자들을 제거하는 또 다른 효과적인 방법이지만 공정이 BT 펩타이드들을 손상시키고 따라서 본 방법은 바람직하지 않게 된다.

산업적 설정에서 세포 불활성화의 가장 실행가능하고 비용-효과적인 방법은 BT 펩타이드들이 견딜 수 있는 적당한 열 (파스퇴르화, 예로 70℃에서 30분 동안과 같음) 및/또는 탈수의 간단한 처리이다. B. 텍사스포러스 포자들이 열 처리에 대해 매우 저항성을 가지기 때문에 (포자들은 100℃에서 60분 동안 가열, 표 1 및 탈수, 표 2와 같은 유의한 스트레스 수준들을 견딜 수 있다), 적당한 온도 및/또는 탈수에 대해 민감한 포자형성-결핍 균주가 DMF와 같은 B. 텍사스포러스의 실행가능 및/또는 비용-효과적 사용을 위해 필요하다. 본 발명은, 불활성화 조건들이 무성생식 세포들은 불활성화할 수 있지만 일반적으로 야생형 포자들은 불활성화할 수 없는, 파스퇴르화, 펠렛화, 동결건조 및/또는 건조화와 같은 BT 펩타이드-안전한 기법들을 사용하여 불활성화될 수 있는 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주를 제공한다.

무성생식 세포들의 불활성화를 위해 유용한 기법들의 예들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 기아, 온도 충격 (파스퇴르화와 같은 열 또는 냉동과 같은 추위), 탈수/동결건조/건조화 (예로, 열-건조, 냉동-건조, 분산-건조, 태양-건조, 공기-건조 및/또는 진공-건조), pH 변화들 (예로, 산성화 또는 알칼리화), 알코올 처리, 계면활성제로의 처리, 여과, 은 및 아연과 같은 금속들로의 처리, 고압 가공과 같은 압력 처리, 효소적 파괴 (예로, 라이소자임으로의 처리), 기계적 힘 (예로, 초음파 파쇄), 사차 암모늄 양이온들로의 처리, 산화제들 (예로, 염소산화물, 과산화수소, 차아염소산염 및/또는 오존), 소금화 (펄스), 방사성 빈도 (RF) 에너지를 사용하는 전기장 처리, 전자레인지 처리, 전자빔 처리, 방사선조사 (예로, UV, X-선들 또는 감마선들) 및 그들의 조합들을 포함한다. 대표적인 구현예에서, 이들 기법들의 하나 이상이 본 발명의 포자형성-결핍 세포들을 불활성화하는 데 사용될 수 있다.

본 발명자의 최고의 지식에 따르면, <10^-6,<10^-7,<10^-8,또는 <10^-9의 스트레스 생존율에서 불활성화된 DFM에 대한 인지된 규정 표준을 만족시키는 포자형성 결핍을 문헌화한 출판물은 전혀 존재하지 않는다. 예를 들면, 학문적 출판물들에서 10^-2의 바실러스 스트레스 생존율이 포자형성-결핍이라고 불리는 한편 (LEE et. al., 2001); 논의된 미국 특허들 제 4,302,544호, 제 4,450,235호, 제 4,450,236호, 제 4,465,773호, 제 6,284,490호 및 제 7,655,452호에서 공개된 방법들은 10^-7의 규모의 스트레스 생존율을 가지는 포자형성-결핍 ("미포자생성 (asporugenous)" 또는 "미포자생성 (asporugenic)") 바실러스 균주들만을 생산할 수 있을 것이다. 따라서, < 10^-9의 스트레스 생존율로 포자형성-결핍을 가진 바실러스 균주들을 생산하는 기술은 없는 것으로 여겨진다. 더욱 강력한 유전자 결실 방법이 두 가지 이유들로 인해 적합한 선택이 아닌 (유일하게 사용가능한 돌연변이화의 방법이 대부분 침묵 또는 "누출 (leaky)" 점 돌연변이들을 유발하는 화학적 방법) 점을 고려하면 이러한 기술을 만들어낼 필요성은 매우 크다. 첫째, B. 텍사스포러스는 비-유전적으로 다루기 쉬운 유기체이고, 유전자 결실이 수행될 수 없다. 둘째, 그 결과 얻은 유전자 녹아웃 균주는 유럽 연합과 같은 지역들에서 인간 식품에서는 금지된 유전적으로 변형된 유기체 (GMO)일 것이다. 또 다른 대표적인 구현예에서, 불활성화 방법은 본 발명에 따른 포자형성-결핍 균주의 생존율을 약 1 × 10^-4이하, 약 1 × 10^-5이하, 약 1 × 10^-6이하, 약 1 × 10^-7이하, 약 1 × 10^-8이하, 또는 약 1 × 10^-9이하로 감소시키기에 충분하지만, 여기에서 본 불활성화 방법이 포자형성-능력을 갖춘 PTA-5854의 생존율을 약 3.3 × 10^-1미만 또는 약 4.3 × 10^-1미만으로 감소시키기에는 불충분하다.

도 1은 PTA-5854의 포자들에 의한 BT 펩타이드들의 소비를 나타낸 것이다. PTA-5854가 LB 내로 접종되었고 37℃ 공기 진탕기로 성장되었다. 시료들은 매일 채취되었고 BT 펩타이드들이 추출되었으며 활성들에 대해 검정되었다. 3일째, 배양액은 3개의 분량들로 (#1, #2 및 #3) 배분되었다. 분량 #1은 미처리되었다. 분량 #2는 UV 교차-링커로 10분 동안 UV 조사되었다. 분량 #3는 10분 동안 가열되었다. 다음으로 분량들은 37℃ 공기 진탕기로 배양되었다.
도 2는 첫 번째 (1) 및 두 번째 (2) 시도 동안 새들의 성장을 나타낸 것이다.
도 3은 20일째 둘 다의 시도들로부터 조합된 새들의 평균 무게 (평균 ± SE)를 나타낸 것이다. N = 39 내지 42의 처리 당 접종된 새들 및 N = 16 내지 19의 처리 당 미접종된 새들. *p ≤ 0.05
도 4는 전체 사료 처리의 경우에 측정된 바와 같이 둘 다의 시도들로부터 얻은 평균 사료 전환율들 (평균 ± SE, N = 3 우리/처리/접종 시도된 새들, N = 1 우리/처리/미접종 시도된 새들)을 (1 = 시도 1, 2 = 시도 2) 나타낸 것이다. *p ≤ 0.05, ** p ≤ 0.01
도 5는 둘 다의 시도들로부터 나온 에이메리아-접종된 새들 (N = 20 내지 24) 및 미접종된 새들 (N = 8)에서 소장의 길이의 평균 (평균 ± SE)을 (1 = 시도 1, 2 = 시도 2) 나타낸 것이다.
도 6은 에이메리아-접종된 새들 (N = 10 내지 12) 및 미접종된 새들 (N = 4)에서 새 무게 대비 점액낭의 평균 비율 (평균 ± SE)을 나타낸 것이다.
도 7은 대조군 (N = 8) 및 BT 펩타이드 (N = 12) 그룹에서 에이메리아 병변 점수 (평균 ± SE)의 결과들을 나타낸 것이다. 처리들 간의 통계학적으로 유의한 차이가 있었다 (p = 0.098).
도 8은 접종된 (치료 당 N = 5 내지 6 풀들) 및 미접종된 새들 (치료 당 N = 2 풀들)에서 회장의 건조물의 평균 백분율 (평균 ± SE)을 나타낸 것이다.
도 9는 접종된 (치료 당 N = 4 내지 6 풀들) 및 미접종된 새들 (치료 당 N = 2 풀들)에서 맹장의 건조물의 평균 백분율 (평균 ± SE)을 나타낸 것이다.
도 10은 접종된 (치료 당 N = 5 내지 6 풀들) 및 미접종된 새들 (치료 당 N = 2 풀들)로부터 얻은 회장에서 전체 미생물 계수들 (평균 ± SE)을 나타낸 것이다.
도 11은 접종된 (치료 당 N = 5 내지 6 풀들) 및 미접종된 새들 (치료 당 N = 2 풀들)로부터 얻은 맹장에서 전체 미생물 계수들 (평균 ± SE)을 나타낸 것이다.
도 12는 둘 다의 시도들 (치료 당 N = 5 내지 6 풀들)로부터 얻은 에이메리 아-접종된 새들의 회장에서 서로 다른 미생물들의 양을 나타낸 것이다. P-값 대조군 vs. BT, 시도 1 = 0.037.
도 13은 둘 다의 시도들 (치료 당 N = 2 풀들)로부터 얻은 미접종된 새들의 회장에서 서로 다른 미생물들의 양을 나타낸 것이다. 그룹들 간의 유의한 차이들은 전혀 없음.
도 14는 둘 다의 시도들 (치료 당 N = 5 내지 6 풀들)로부터 얻은 에이메리 아-접종된 새들의 맹장에서 서로 다른 미생물들의 양을 나타낸 것이다. 그룹들 간의 유의한 차이들은 전혀 없음.
도 15는 둘 다의 시도들 (치료 당 N = 2 풀들)로부터 얻은 미접종된 새들의 맹장에서 서로 다른 미생물들의 양을 나타낸 것이다. 그룹들 간의 유의한 차이들은 전혀 없음.

실시예 1

PTA-5854의 포자형성-결핍 돌연변이의 분리가 다음과 같이 시도되었다. PTA-5854 세포들은 EMS로 돌연변이화 되었고 다음으로 LB-한천배지 상에 도말되었다. 약 50,000개의 콜로니들이 75℃에서 1시간 동안의 처리에 대한 민감성으로 검색되었고, 42개의 온도 민감성 후보 균주들이 분리되었다. 이들 초기 후보 균주들은 콜로니-정제되었고 열 민감성에 대해 재시험되었다. PTA-5854 균주 및 온도 민감성 후보 균주들은 액체 LB 배지로 37℃에서 3일 동안 성장되었다. 다음으로 세포들은 무균의 미세원심분리 튜브들 내로 100 μL 분량들로서 분배되었고, 다양한 온도들 (75, 70, 65, 60, 55, 50 또는 37℃)에서 서로 다른 길이들의 시간 동안 (5, 15, 30 또는 60분) 배양되었다. 처리된 세포들은 LB-한천배지 상에 도말되었고, 도말 효율을 결정하도록 37℃에서 밤샘 배양되었다. 열 충격 처리 이후에 생존율이 열 충격이 없는 37℃에서 도말 효율로 나눈 열 충격 이후에 도말 효율로서 계산되었다.

초기의 42개 분리물들 중에서, 여러 개의 온도 민감성 돌연변이체들이 확인되었다. 균주 B7는 최고의 온도 민감성 표현형을 보여주었다 (표 1). 50℃에서 간략한 5분 처리는 8.1 × 10^-7(약 1 × 10^-6)의 생존율을 가져왔고, 더 높은 온도들 및 더 긴 배양들이 생존율을 유의하게 감소시키지 않았다. 본 수준의 세포 불활성화는 B. 텍사스포러스를 DFM으로서 사용하는 목적을 위해서는 부적당한 것으로 고려된다. 반복된 돌연변이화 및 PTA-5854의 돌연변이체 분리는 B7보다 나은 온도 민감성 표현형을 가지는 균주를 생산하지 못하였다. 하나 이상의 돌연변이가 더욱 효율적인 세포 불활성화를 허용하도록 더욱 밀착된 온도 민감성 돌연변이들을 위해 필요할 것으로 추론되었다. 그러나, B7의 돌연변이화는 개선된 온도 민감성 표현형을 가진 돌연변이를, 아마도 B7의 약한 건강 (부모 PTA-5854와 대비함)으로 인해 수득하지 못하였다.

표 1은 B. 텍사스포러스 세포들 (2일 된 L-액체배지 배양액들)의 온도 민감성들을 나타낸다.

새로운 박테리아 균주 (MYG11, 기탁번호 PTA-12310)가 토양 시료로부터 분리되었다. 본 균주의 16S rDNA 서열결정은 이것이 PTA-5854와 동일한 종이지만 열 처리에 관하여 유의하게 서로 다른 표현형을 소유하는 것을 보여준다. MYG11는 L-액체배지로 37℃에서 신속하게 성장하고, 고온 또는 포자형성-결핍에 대해 초기 민감성을 보여준다. 50℃에서 5분 동안의 처리는 3.5 × 10^-3의 생존율을 가져왔다 (표 1). 따라서, MYG11가 돌연변이화되었고, 약 50,000개의 콜로니들이 증가된 온도 민감성을 나타내는 돌연변이체들을 위해 검색되었다. 적어도 3개의 돌연변이체들, MYG107 (기탁번호 PTA-12309), MYG110 (기탁번호 PTA-12308) 및 MYG113 (기탁번호 PTA-12307)이 본 방법에 의해 분리되었고 심각한 포자형성-결핍들을 보여주는 것으로 확인되었다. PTA-5854 및 B7과는 매우 대조적으로, 50℃의 온도에서 5분 동안의 처리는 MYG107, MYG110 및 MYG113의 경우 10^-9 보다 낮은 생존율을 가져왔다. 따라서, 본 발명은 적어도 50℃의 온도에 적어도 5분 동안 노출될 때 약 10^-8 또는 약 10^-9보다 낮은 생존율을 가지는 B. 텍사스포러스 균주들을 제공하고 있다.

MYG107는 로그기 L-액체배지 배양액에서 약 45분의 배가 시간을 가지고 좀 더 특성분석되었다. MYG107, MYG110 및 MYG113의 생존율이 본 실험에서 사용된 배양액들의 검출가능한 한계 또는 그의 미만인 경우라면, MYG107, MYG110 및 MYG113는 포자형성의 근본적인 결함을 가지고, 높은 포자형성-결함성 균주들인 것으로 믿어지며, 이는 또한 MYG107로부터 나온 BT 수율이 PTA-5854과 비교하여 세 배 이상인 것으로 여겨지는 점에 의해 지지된다.

게다가, 전형적인 측내생포자들 (lateral endospores)이 PTA-5854의 배양액으로 거의 모든 단계들에서 검출가능하다. 이러한 측내생포자들은 MYG107의 배양액들에서는 어떠한 단계에서도 관찰되지 않았고, MYG107이 포자형성의 근본적인 결함을 가지는 점을 지지한다. 또한, MYG107는 무성생식 세포들을 불활성화하지만 포자들은 아닌 다른 유형들의 스트레스에 대해 민감성들을 나타낸다.

표 2는 B. 텍사스포러스 세포들 (2일 된 L-액체배지 배양액들)의 스트레스 민감성들을 나타낸다.

냉동 민감성 테스트에서, 야생형 PTA-5854 균주 및 MYG107은 액체 LB 배지로 37℃에서 2일 동안 성장되었고, 다음으로 세포들은 무균의 미세원심분리 튜브들 내로 100 μL 분량들로서 분배되었고, -20℃에서 60분 동안 (또는 얼음의 형성 시) 배양되었다. 냉동-처리된 및 미처리된 세포들은 LB-한천 배지 상에 도말되었고 도말 효율을 결정하도록 37℃에서 밤샘 배양되었다. 냉동에 대한 생존율이 계산되었다 (처리된 세포들의 도말 효율 / 미처리된 세포들의 도말 효율). 냉동은 PTA-5854의 약 4.2 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

산성화 민감성 테스트에서, 야생형 PTA-5854 균주 및 MYG107은 액체 LB 배지로 37℃에서 2일 동안 성장되었고, 다음으로 세포들은 무균의 미세원심분리 튜브들 내로 100 μL 분량들로서 분배되었다. pH는 10 μL의 1 M HCl을 각각의 분량에 첨가하여 약 1.0으로 (실온에서) 조정되었고, 다음으로 10 μL의 1 M NaOH을 첨가하여 중화되었다. 산-처리된 및 미처리된 세포들은 LB-한천배지 상에 도말되었고 도말 효율을 결정하도록 37℃에서 밤샘 배양되었다. 산성화는 PTA-5854의 약 4.2 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

알칼리화 민감성 테스트는 NaOH가 pH를 13.0로 조절하도록 먼저 첨가되고 다음으로 중화를 위해 HCl가 첨가되었던 점을 제외하고는 유사한 방식으로 수행되었다. 알칼리화는 PTA-5854의 약 5.1 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

알코올 민감성 테스트는 부탄올이 1% (v/v)로 첨가되었던 점을 제외하고는 유사한 방식으로 수행되었다. 부탄올 처리는 약 5.6 ×10^-1에서의 PTA-5854의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

계면활성제 민감성 테스트는 SDS가 1% (v/v)로 첨가되었던 점을 제외하고는 유사한 방식으로 수행되었다. SDS 처리는 PTA-5854의 약 3.3 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9이하의 생존율을 가져왔다.

산화 민감성 테스트는 과산화수소가 1% (v/v)로 첨가되었던 점을 제외하고는 유사한 방식으로 수행되었다. 과산화수소 처리는 PTA-5854의 약 3.3 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

라이소자임 민감성 테스트에서, 야생형 PTA-5854 균주 및 MYG107은 액체 LB 배지로 37℃에서 2일 동안 성장되었고, 다음으로 세포들은 무균의 미세원심분리 튜브들 내로 100 μL 분량들로서 분배되었다. 라이소자임은 1 mg/mL의 농도로 첨가되었고 세포들은 37℃에서 60분 동안 배양되었다. 라이소자임-처리된 및 미처리된 세포들은 LB-한천배지 상에 도말되었고 도말 효율을 결정하도록 37℃에서 밤샘 배양되었다. 라이소자임 처리는 PTA-5854의 약 7.2 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

압력 민감성 테스트에서, 야생형 PTA-5854 균주 및 MYG107은 액체 LB 배지로 37℃에서 2일 동안 성장되었다. 배양액의 일부가 실온에서 프렌지 프레스로 압력-처리 (40,000 psi) 되었다. 프렌지 압력화에 대한 생존율이 계산되었다 (처리된 세포들의 도말 효율 / 미처리된 세포들의 도말 효율). 프렌치 압력화는 PTA-5854의 약 1.5 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

기아 민감성 테스트에서, 야생형 PTA-5854 균주 및 MYG107은 액체 LB 배지로 37℃에서 7일 동안 성장되었다. 기아에 대한 생존율이 계산되었다 (7일에서 도말 효율 / 2일에서 도말 효율). 기아 처리는 PTA-5854의 약 3.3 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

탈수 민감성 테스트에서, 야생형 PTA-5854 균주 및 MYG107은 액체 LB 배지로 37℃에서 2일 동안 성장되었고, 다음으로 세포들은 무균의 미세원심분리 튜브들 내로 100 μL 분량들로서 분배되었으며 고속-진공이 60분 동안 실온에서 시행되었다. 진공-건조된 세포들 (100 μL의 무균 증류수로 재수화됨) 및 미처리된 세포들은 LB-한천배지 상에 도말되었고 도말 효율을 결정하도록 37℃에서 밤샘 배양되었다. 진공-건조화에 대한 생존율이 계산되었다 (처리된 세포들의 도말 효율 / 미처리된 세포들의 도말 효율). 진공-건조화는 PTA-5854의 약 3.9 ×10^-1에서의 생존율과 비교하여 MYG107의 경우 약 10^-9 이하의 생존율을 가져왔다.

또 다른 탈수 민감성 테스트에서, 야생형 PTA-5854 균주 및 MYG107 세포들은 10% 및 20% 콩 사료를 포함하는 성장배지로 각각 접종되었다. 세포 성장은 10% 콩을 포함하는 배지에서 둘 다의 균주들의 경우에 달성되었고, 그러나 20% 콩 사료를 포함하는 배지에서는 아니었다. 20% 콩 사료 배양액들의 무균 물 (1:1)로의 희석은 PTA-5854의 경우는 성장을 회복시켰지만 MYG107는 아니었고, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주가 생존도를 유지하도록 환경에서 적어도 약 80%의 물 함량 수준을 요구하는 점을 가리킨다.

MYG107, MYG110 및 MYG113의 특징들 및 이러한 균주들을 제작하는 방법은 B. 텍사스포러스의 포자형성-결핍 균주들이 경제적으로 이용가능한 DFM으로서 사용되도록 허용한다. 상세하게, 본 발명의 균주들은 야생형 B. 텍사스포러스 세포들의 불활성화와 양립가능한 복수의 불활성화 방법들 (예로, 파스퇴르화 및/또는 탈수)의 사용들 제공하고, 이는 경제적으로 이용가능한 DFM으로서 사용될 수 있는 균주들을 제공한다.

불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들은 불활성화된 세포들이 정제된 펩타이드들과 동등하게 기능하였던 점을 보여주도록 정제된 펩타이드들과 비교된다. BT 펩타이드들은 B. 텍사스포러스 세포들 활발하게 분열시켜서 생산되고, BT 펩타이드들이 기아에 반응하여 생산된 "이차적인 대사물들"이 아닌 점을 가리킨다. LB 배양액에서, 10⁶개의 BT 세포들이 약 10 마이크로그램의 BT 펩타이드들을 포함한다. 다른 말로 하면, 10¹¹개의 BT 세포들이 약 10 그램의 BT 펩타이드들을 포함한다.

불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들에서 BT 펩타이드 농도가 결정되었고 정제된 펩타이드의 원하는 농도와 동등한 불활성화된 세포들의 양이 연구에 사용되었다. 새로이 부화된 병아리들이 서로 다른 농도들의 정제된 BT 펩타이드들 또는 불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들을 가진 사료들이 2일 동안 주어졌다. 3일째, 병아리들은 침습성 살모넬라 엔테리카 세로바 장염 (SE) 균주로 접종되었다. 4일째, 병아리들이 희생되었다. 간 및 비장이 수확되었고 균질화되었다. 균질물에서 SE 균주의 존재 또는 부재가 결정되었다. BT 펩타이드 또는 세포를 전혀 받지 않은 새들은 60%의 SE 감염율을 가지는 것으로 확인되었고, 12 ppm의 정제된 펩타이드 또는 12 ppm과 동등한 불활성화된 세포들의 양을 수여받은 새들은 정제된 펩타이드의 경우 28% 및 52% 그리고 불활성화된 세포들의 경우 35%의 SE 감염율들을 가졌다. 24 ppm 또는 불활성화된 세포들의 동등량을 수여받은 새들은 정제된 펩타이드의 경우 36% 및 16% 그리고 불활성화된 세포들의 경우 25%의 SE 감염율들을 가졌다. 48 ppm 또는 불활성화된 세포들의 동등량을 수여받은 새들은 정제된 펩타이드의 경우 27% 및 24% 그리고 불활성화된 세포들의 경우 10%의 SE 감염율들을 가졌다.

불활성화된 세포들에서 비-정제된 BT 펩타이드들은 살모넬라 기관 칩입을 예방하는 데 정제된 펩타이드들과 동일한 생체내 효능을 보여주었다.

실시예 2

클로스트리디움 퍼프린겐스 (Clostridium perfringens ) (A형)의 경구적 접종에 의해 초래되는 괴사성 장염을 예방하는 데 수의-등급의 BT 펩타이드들 (면역조정성 BT 양이온성 펩타이드들을 포함하는 불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들을 포함함)의 효과를 평가하기 위하여, 괴사성 장염 병변 및/또는 치사가 접종 새들에서 획득되었다.

실험 1에서, 사료에 전달된 약 24 ppm 및 약 48 ppm의 수의-등급 BT는 괴사성 장염 병변 점수들을 각각 2.3로부터 0.6 및 0.5까지, 치사도를 각각 17%로부터 6% 및 7%까지, C. 퍼프린겐스의 장 회복을 각각 3.60으로부터 2.36 및 2.48까지 (로그₁ ₀ cfu/g) 감소시켰다 (p < 0.05).

실험 2에서, 사료에 전달된 약 24 ppm 및 약 48 ppm의 수의-등급 BT는 괴사성 장염 병변 점수들을 각각 2.8로부터 0.8 및 0.6까지, 치사도를 각각 21%로부터 5% 및 1%까지, C. 퍼프린겐스의 장 회복을 각각 3.12으로부터 1.88 및 1.31까지 (로그₁ ₀ cfu/g) 감소시켰다 (p < 0.05).

이들 결과들은 경구적으로 전달된 불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들이 영계들에서 괴사성 장염을 예방하는 데 효과적인 점을 보여준다.

결과들:

표 3은 불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들의 경구적 전달로 영계 닭들에서 괴사성 장염의 예방을 나타낸다.

1. 24 및 48 ppm으로 나타낸 처리 그룹들은 1일부터 투여된 BT 농도들이다.

2. 병변 점수들은 평균 제곱 오차를 가진 처리 소집합 *n = 25의 평균으로 나타낸다.

3. 치사는 양성 대조군 (대조군 식사)과 대비된 발병 데이타로 나타낸다 (p < 0.05).

4. 로그10 cfu/g은 처리 소집합의 평균으로 나타낸다 (n = 10).

A - B 공통적인 위첨자들을 가지지 않은 동일한 칸 내의 평균들은 유의하게 서로 다르다 (p < 0.05).

재료들 및 방법들:

부화일에 병아리들은 샌더슨 농장들 (브라이언)로부터 획득되었고, 무작위적으로 실험 그룹으로 배분되었으며 깨끗한 소나무판 위의 개별 바닥 사육 우리 내에 두었다. 모든 동물들은 NRC 지침들을 충족시키거나 초과하는 시판되는 전-밀 (whole-wheat) 기초한 브로일러 개시 식사 및 물이 자유롭게 주어졌다. 새들은 대조군 식사, 또는 24 ppm 또는 48 ppm 둘 중 하나의 수의-등급 BT 펩타이드들을 포함하는 식사들이 1일부터 24에 이르기까지 사료로 주어졌다.

버지니아, 노스캐롤라이나 및 조지아주에서 활발한 방목 사례들로부터 획득된 C. 페프린겐스 (A형)의 복수의 분리물들이 본 연구에 사용되었다. 분리물은 티오글리콜레이트 배지에서 성장되었다. 무균의 티오글리콜레이트 배지가 닭들을 접종하는 데 사용되었고; 새들은 3일 동안 (부화-후 17 내지 19일) 하루 한 번 경구적 투여 (gavage) (1.5 mL/접종)에 의해 투여되었다.

접종에 의해 생산된 C. 페프린겐스의 각각의 회분이 일련으로 희석되었고 SFP 한천 플레이트들 상에 도말되었으며 다음으로 배양기에 37℃에서 24시간 동안 두었다. 다음으로 플레이트들이 새들에게 주어진 C. 페프린겐스의 양을 결정하기 위하여 계수되고 기록되었다. C. 페프린겐스의 회수를 정량적으로 측정하기 위하여, 소장의 절편이 제거되었고; 창자의 본 조각은 메켈 게실로의 머리 부분이었다. 일단 소장이 제거되면, 이것은 10 mL의 티오글리콜레이트와 함께 나선 포장 백에 두었고 30초 동안 소화되었다. 다음으로 0.5 mL이 제거되었고 혐기성 티오글리콜레이트에 두었으며 일련으로 희석시켰고 SFP 한천배지 상에 놓아두었다. SFP 한천배지는 표시 지침들에 따라 제조되었다. 본 배지는 오버레이 배지들이고, 첫 번째 층은 실험 수일 이전에 부어졌고 오염을 위해 테스트 배양되었다. 두 번째 층은 시료가 도말된 이후에 호기성 조건들에서 부검일에 적용되었다. 다음으로 플레이트들은 코이 박스 내로 운반되었고 플레이트들은 24시간 동안 배양되었고 다음날 해독되었다.

NE와 연관된 총 병변들을 평가하기 위하여, 소장의 공장 및 회장이 조사되었다. 병변 점수들은 다음의 판단기준을 사용하여 기록되었다:

0 = 총 병변들이 없음, 정상 창자 모양.

1 = 얇은-벽 또는 약한, 회색 모양.

2 = 얇은-벽, 국소적 괴사, 회색 모양, 적은 양들의 기체 생산.

3 = 얇은-벽, 괴사의 측정가능한 패치들, 기체 충만된 소장, 혈액의 작은 점들.

4 = 심각한 확장된 괴사, 현저한 출혈, 소장에서 많은 양들의 기체.

본 연구는 박테리아 접종 이전에 동물의 면역 체계를 감작시키는 데 불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들의 효용성 및 감작된 면역 체계가 이러한 접종에 더욱 신속하게 또는 더욱 효과적으로 반응하는 점을 보여준다.

실시예 3

수의-등급 BT (불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들)는 시험관내 검정법으로 측정될 때 세포들이 항생제 활성을 가지는 것으로 여겨지는 자연적 BT 펩타이드들을 보유하더라도 실제로는 비-항생제이다. 그러나, 시험관내 검정법는 인위적인 결과를 생산하는 것으로 믿어진다. BT는 생체내에서 항생제로서 작용하지 않고, 대신에 동물의 면역 체계를 증진/감작시키는 것으로 믿어지며, 유익하고 공생적인 박테리아 수준들은 상대적으로 영향받지 않지만 해로운 박테리아들의 수준들은 BT 펩타이드들 또는 세포들로 처리된 동물들에서 감소되는 이유를 설명한다. 이것은 또한 96 ppm으로 경구적으로 전달된 수의 등급 BT (불활성화된 세포들에서)가, 시험관내 검정법을 사용하여 BT-민감성 유익하고 공생적인 장 박테리아들인 것으로 여겨졌던 것에 미치는 생체내 효과를 가지지 않는 이유도 역시 설명한다 (실시예 4를 참조하라).

실시예 4

본 실험의 목표는 에이메리아 맥시마 (Eimeria maxima) 접종의 스트레스가 있거나 없이 브러일러 닭들에서 96 ppm의 높은 수준으로 수의 등급 BT ("BT 펩타이드"라고도 언급되는, BT 펩타이드들을 포함하는 불활성화된 브레비바실러스 텍사스 포러스 세포들)를 사료로 주는 것의 안전성을 평가하는 것이었다.

재료들 및 방법:

Ross 508 유형의 브로일러 병아리들이 시판되는 부화기에서 대략 1개월 간격으로 두 번 부화되었다. 둘 다의 시도들에서, 66마리의 수컷 병아리들이 닭집으로 운반되었다. 병아리들은 무게 측정되었고 4 또는 5마리의 그룹들로 사육상자에 분배되었다. 닭집에 도착 13일째, 새들은 각각 두 개의 우리를 가지고, 각각의 우리는 8마리의 새들을 가두는 4개의 방들로 이동되었다. 하나의 대조군 그룹 및 하나의 BT 펩타이드 그룹이 각각의 방에 존재하였다. 새들이 우리들로 이동된 이후에, E. 에이메리아 난포낭들이 새들의 곡식 내로 튜브로 주어졌다 (대조군의 경우 수돗물).

온도 및 상대 습도가 자동적으로 매일 24시간마다 측정되었다. 첫 번째 및 두 번째 실험일 동안 온도는 30℃를 초과하였고, 다음으로 20℃에 도달할 때까지 약 0.5℃씩 강하되었다. 광 프로그램은 실험 전체를 통하여 24시간 매일 명주기이었다.

표 4는 처리 당 새들의 양을 나타낸다.

식사들은 밀, 콩 사료, 보리, 평지씨 사료, 평지씨 오일, 비타민들, 미네랄들 및 아미노산들로 구성되었다. 미변형된 사료는 핀란드 MTT, Jokioinen 아그리푸드 리서치사로부터 획득되었다. 사료는 메쉬 형태로 있었고, 구균증 치료제 또는 효소들은 전혀 첨가되지 않았다. 수의 등급 BT가 96 ppm의 BT 펩타이드 농도의 동등량으로 사료에 첨가되었다. 처리 그룹들은 실험 전체를 통하여 동일한 식사를 먹었다. 사료 및 물은 자유롭게 제공되었다.

표 5는 식사 조성을 나타낸다.

4개 중 3개 방들에 있는 모든 새들은 13일째 E. 에이메리아 난포낭들이 주어졌고, 한편으로 네 번째 방은 미접종된 새들의 대조군 방이었다. 용량은 새 당 대략 25,000개의 포자형성된 난포낭들이었다. 난포낭들은 2 mL의 수도물에 넣은 곡물 내에 튜브로 주어졌다. 에이메리아 난포낭들은 영국 서레이, 수의학 연구소로부터 구입되었다. 한 개의 방은 접종이 없었다.

새들은 도착 시, 6일, 13일, 17일, (시도 2에서는 18일, 및 19일) 및 20일령에서 사육상자를 기초로 무게 측정되었다. 사료 섭취는 6일, 13일 및 20일령에 측정되었다. 사료 섭취는 사육상자 또는 암컷 기초로 측정되었다. 새들의 병태는 적어도 하루 두 번 조사되었다. 치사율 및 죽은 새들의 무게가 기록되었다. 매우 아픈 새들 또는 손상입은 새들은 사람에 의해 안락사되었다. 20일령에서, 병아리들은 경추 탈골로 죽였고 회장 및 공장이 시료 채취되었고, 처리 및 시도 당 32개의 장 시료들을 수득하였다.

장 시료들의 미생물 분석, 그리고 세포 용해 및 염색체 DNA 의 분리

회수된 박테리아 DNA가 서로 다른 그룹들의 양이 계산되도록 허용하는 정량적 PCR에 의해 분석되었다. 다음의 박테리아 비피도박테리움 아속 (Bifidobacterium spp), 대장균, 락토바실러스 아속 (Lactobacillus spp.) 및 C. 퍼프린겐스 그룹 군집 I이 분석되었다. DNA의 측정을 위해, 세 벌의 시료들이 사용되었고, 신선한 장 무게 당 평균 박테리아 양이 계산되었다.

장 시료들에서 전체 박테리아 세포 계수들은 유동세포측정법에 의해 결정되었다.

에이메리아 병변 점수화는 첫 번째 시도를 위해서만 수행되었고 공평한 전문가가 병변들을 확인하였다. 에이메리아 병변들의 확인은 공장의 마지막 부분 및 전체 회장에 대해 시행되었다. 병변들은 0 내지 4의 척도로 점수화되었고 여기에서 0점은 정상적인 창자를 가리키고 4점은 삼각하게 손상된 창자를 가리킨다.

활액낭의 무게가 모든 풀로부터 나온 2마리의 새들로부터 측정되었다. 활액낭들은 두 번째 시도를 위해서만 무게 측정되었다.

소장 (공장 + 회장)의 전체 길이는 모든 새로부터 측정되었다.

T-테스트들이 계산되었고 처리들 간의 통계학적 차이들을 측정하는 데 사용되었다.

결과들:

에이메리아 접종은 대조군 새들의 성장을 유의하게 감소시켰다. 그러나 BT 펩타이드-보충된 식사는 대조군 그룹과 대비하여 미접종된 및 에이메리아-접종된 그룹들 둘 다에서 새들의 증가된 성장을 어느 정도 가리켰다 (도 2). 20일째 BT 펩타이드 그룹의 새들은 약간 더 무거웠지만 통계학적으로 유의한 차이는 확인되지 않았다 (도 3). 20일째 미접종된 새들의 무게가 첫 번째 및 두 번째 시도들로부터 분리되어 조사되었던 경우, 두 번째 시도에서 새들의 무게가 대조군 그룹과 비교 시 BT 펩타이드 보충된 식사에 의해 유의하게 (p = 0.026) 증가되었다.

에이메리아 접종 (13일 및 20일 사이에) 동안 사료 전환율 (FCR)이 대조군 그룹과 비교 시 BT 펩타이드 그룹에서 개선되었다 (첫 번째 시도의 경우 p = 0.02 및 두 번째 시도의 경우 p = 0.006) (도 4).

에이메리아 접종은 기대된 바와 같이 소장의 길이를 증가시켰다. 소장의 증가된 길이는 감소된 영양분 흡수로 인한 보완적인 성장을 가리킬 수 있다. 그러나 처리들 간에 소장의 평균 길이들에서 통계학적으로 유의한 차이는 전혀 존재하지 않았다 (도 5).

파브리시우스 활액낭은 새들에서만 발견되는 상피 및 림프성 기관이다. 활액낭은 조혈 부위이고, B 세포들의 발생을 위해 필수적인 특수화된 기관이다. 활액낭은 배설강의 직장 부위의 등쪽 게실로서 발생한다. 두 번째 시도를 위해, 활액낭은 무게 측정되었고 살아있는 새들의 무게와 비교되었다. 살아있는 새들의 무게와 비교 시 활액낭의 무게의 비율은 에리메리아-접종된 새들보다 미접종된 새들에서 약간 더 크게 나타났다. BT 펩타이드 보충된 및 대조군 그룹 간에 차이들은 전혀 주목되지 않았다. 그러나, 미접종된 새들의 활액낭은 BT 펩타이드 그룹에서보다 대조군 그룹에서 어느 정도 더 크게 나타났다 (도 6).

E. 맥시마는 주로 소장의 중앙 부위, 말단 공장 및 근위 회장을 감염시킨다. 높은 감염 점수들은, 아마도 감염의 피크가 병변 점수화가 수행되는 E. 맥시마 접종 이후 7일째에 이미 초과하기 때문에 전혀 검출되지 않았다. E. 맥시마의 평균 생활 주기는 5일 내지 6일 사이이다. 평균 점수는 BT 펩타이드 보충된 새들에서 ( p = 0.098) 더욱 신속한 회복 또는 감소된 염증의 표시로서 더욱 낮다 (도 7).

둘 다의 시도들에서 어느 하나의 식사를 준 미접종된 새들에서는 치사가 전혀 존재하지 않았다. 첫 번째 시도 동안, 치사도는 대조군 그룹에서 가장 높았고 BT 펩타이드 그룹에서 가장 낮았던 한편 (p = 0.011), 두 번때 시도 동안 상황이 역전되었다. 둘 다의 시도들의 치사가 조합 시, 전체적인 치사도는 대조군 그룹에서보다 BT 펩타이드 그룹에서 어느 정도 더 낮게 나타났지만 차이는 유의하지 않았다 (표 6). 치사율이 시도 2보다 시도 1에서의 처리들 간에 서로 다른 이유는 시도 2에서 매우 심각하게 아픈 새들이 바로 안락사되었기 때문일 수 있다. 시도 1에서, BT 펩타이드 그룹으로부터 나온 새들은 전혀 없었고 대조군 사료 그룹으로부터 나온 3마리의 새들이 시도의 종결 이전에 희생되었다. 시도 2에서 BT 펩타이드 그룹으로부터 나온 3마리의 새들 및 대조군 사료 그룹으로부터 나온 1마리의 새가 시도의 종결 이전에 희생되었다.

표 6는 치사도 (%)를 나타낸다.

장 건조물의 백분율은 이것이 장의 건강 및 미생물총의 균형을 가리키기 때문에 주요한 기저 매개변수이다. 에이메리아 접종은 새들에게 설사를 유발하였고 회장 및 맹장의 건조물 함량을 감소시켰다. 이들 결과는 접종된 새들이 창자 건강의 문제점을 가졌고 에이메리아 접종이 창자 미생물총의 균형에 영향을 주었던 점을 제시한다. 에이메리아 접종된 및 미접종된 새들의 회장 건조물에 미치는 BT 펩타이드의 효과는 유의하지 않았다 (도 8).

맹장의 장 건조물 함량들은 미접종된 새들에서보다 접종된 새들에서 더눅 낮았다. 에이메리아-접종된 새들의 맹장의 건조물은 BT 펩타이드 보충에 의해 정상적 수치들의 방향으로 약간 증가되었을 수 있다 (도 9).

미생물들의 전체 수는 회장보다 맹장에서 더욱 높았다. 에이메리아 접종은 대조군 및 BT 펩타이드 보충된 그룹들 둘 다에서 회장의 미생물들의 전체 수를 증가시켰다. 맹장에서 미생물들의 수들은 둘 다의 시도들 및 둘 다의 처리 그룹들에서 에이메리아 접종으로 인해 감소되었다. 어느 시도에서도 두 가지의 사료 처리들 간의 통계학적으로 유의한 차이가 전혀 검출될 수 없었다 (도 10 및 도 11).

이들 두 가지의 시도들 동안, 에이메리아 접종은 대조군 사료 및 BT 펩타이드 보충된 그룹들 둘 다에 있는 회장 및 맹장 둘 다에서 락토바실러스 아종 및 비피 도박테리아 아종의 수들을 증가시키는 경향이 있었다. 시도 2에서는, BT 펩타이드 그룹에서 회장의 감소된 박테리아 수준들로의 통계학적으로 유의하지 않는 경향성이 존재하였지만, 시도 2에서는 BT 펩타이드 그룹에서 C. coccoides -E. rectale 그룹의 회장 수준들에서 증가가 존재하였다 (도 12). 미접종된 새들에서 차이들은 전혀 관찰되지 않았다 (도 13 및 도 15). 맹장의 박테리아 함량은 BT에 의해 영향받지 않았다 (도 14 및 도 15). 살모넬라 아종은 어느 시도에서도 검출되지 않았다. 종합하면 미생물총 분석들은 현재의 용량에서 BT 펩타이드가 고유의 (비-병원성) 박테리아 집단들에 미치는 효과가 적거나 거의 없는 점을 제시하고 있고, 이는 BT 펩타이드들이 처리된 동물들에 의해 내성을 지녔고 항생제 효과들을 나타내지 않는 점을 가리킨다.

본 실험은 고유의 또는 원하는 장 박테리아에 미치는 역효과들이 96 ppm의 BT 펩타이드로 보충된 닭들에서 검출되지 않았던 점을 보여준다. FCR은 에이메리 아-접종된 브로일러 닭의 BT 펩타이드-보충된 그룹에서 대조군 그룹과 비교 시 유의하게 개선되었다 (첫 번째 및 두 번째 시도의 경우 각각 p = 0.02 및 p = 0.006). 두 번째 시도에서 새들의 무게는 BT 펩타이드-보충된 식사에 의해 대조군 그룹과 비교 시 유의하게 개선되었다 (p = 0.026). 에이메리아-접종된 브로일러들의 치사도는 BT 펩타이드 처리에 의해 대조군 그룹과 비교 시 유의하게 감소되었다 (p = 0.011). 또한, BT 펩타이드에 의한 사료의 보충은 감염된 조직에서 평균 병변 점수들을 감소시켰다 (p = 0.098).

실시예 5

본 연구는 돼지에서 무게 획득, 살모넬라 군집화 및 백혈구 기능에 미치는 효과를 위한 수의 등급 BT (불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들)의 사료 첨가물로서의 용도를 테스트하는 것이다.

재료들 및 방법들

실험적 설계. 이유기 (17일 내지 21일령)에, 새끼 돼지들은 추가적인 보온을 위한 열 램프들을 가진 우리에 5마리의 그룹들로 무작위로 배분되었다. 돼지들은 물 및 국가 연구위원회 (1994) 지침들을 충족시키는 미조제된 제 I상 식사가 자유롭게 제공되었다. 체중들이 이유기-후 0일, 3일, 5일 및 7일째 기록되었다. 돼지들은 4가지 실험 그룹들로 배치되었다. 그룹들 1 및 2는 각각 대조군 균형잡힌 미조제된 옥수수 및 0 ppm 또는 12 ppm (반복 1) 또는 24 ppm (반복들 2, 3) BT 펩타이드들을 각각 포함하였던 콩 사료-기초 식사를 준 5마리의 돼지들을 포함하였다. 그룹들 3 및 4는 0 또는 12 (또는 24) ppm의 BT 펩타이드들 포함하였던 식사들을 주었지만, 이들 그룹들에서 돼지들은 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium, ST)으로 접종되었다. 돼지들은 실험들 전체를 통하여 이들 식사들이 주어졌다. BT 펩타이드들은 프리믹스로서 불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들의 형태로 전달되었다.

살모넬라 엔테리카 세로바 티피무리움 (Salmonella enterica serovar Typhimurium, ST). S. 엔테리카 세로바 티피무리움 (ST) (National Veterinary Sciences Laboratory [NVSL]), Ames, IA (PT 24)의 분리물이 사용되었고 이것은 카베니실린 및 노보바이오신 (CN)에 대한 저항성을 위해 선택되었던 균주이고 TSB 또는 트립틱 소이 한천배지로 4℃에서 유지된다. 광택 그린 한천 (BGA), 살모넬라를 위한 선택적 배양 배지는 실험적 연구들에서 저항성 분리물을 배양하는 데 사용되었고 다른 박테리아의 성장을 저해하도록 100 μg/mL 카베니실린 및 25 μg/mL 노보바이오신 (예로, BGA + CN)을 포함하였다. 투여를 위한 접종액은 18시간으로부터 24시간까지 준비되었고 (TSB + CN 배양액들) 41℃에서 유지되었으며 무균의 PBS (pH 7.2)로 희석되었다. 스톡 용액 (1 × 10⁹ cfu/mL)이 접종 실험들을 위해 준비되었다.

이유기-후 3일째, 접종 그룹들에서 돼지 새끼들은 경구적 투여에 의해 10⁷cfu ST가 투여되었다. 접종-후 5일째 (이유기-후 7일째), 돼지들은 안락사되었고 각각의 돼지로부터 얻은 맹장 내용물들의 1.0 g 시료들이 무균적으로 수집되었다. 맹장 시료들은 일련으로 희석되었고 광택 그린 한천 (BGA) 플레이트들 상에 도말되었다. 다음으로 플레이트들은 37℃에서 24시간 동안 배양되었고 맹장 내용물들의 그램 당 ST의 cfu 수가 결정되었다. 또한, 조직들 (간, 비장, 회장-맹장 림프절들, 맹장 및 직장)은 확립된 방법들을 사용하여 ST의 존재를 위해 배양될 것이다. 의심되는 살모넬라 콜로니들은 세 벌의 당 한천배지 및 라이신 철 한천배지 상의 생화학적 테스트들에 의해 검증되었고 또한 살모넬라 O 항혈청을 사용하여 ST로서 검증되었다. 살모넬라 콜로니 플레이트 계수들은 맹장 내용물들의 그램 당 로그₁₀ 살모넬라로서 표현된다.

이유된 돼지들에서 선천적 면역 반응. 백혈구들이 이전에 기술된 바와 같이 (KOGUT et al. 2010) 밀도 구배 분리법을 사용하여 분리되었다. 기능적 검정법들이 서로 다른 처리들을 받은 돼지들로부터 분리된 호중성구들의 능력들을 평가하도록 수행되었다. 호중성구들에 의해 사용되는 미생물 사멸의 두 가지 방법들이 연구되었다. 상세하게, 호중성구 탈과립화, 호중성구 내부의 과립들로부터 박테리아 살상 산물들의 방출, 및 산화적 파괴, 박테리아 살상 반응성 산소종 (ROS)의 생산이 검정되었다. 간략하게, 본 검정법들이 하기에 기술된다.

기능적 검정법. 백혈구 산화적 파열이 DCFH-DA의 형광성 DCF로의 산화에 의해 (HE et al. 2003)에 기술된 바와 같이 측정되었다. 백혈구들은 측정 이전에 포볼 A-미리스테이트 13 아세테이트 (PMA [2.0 μg/mL], Sigma) 또는 RPMI 1640 배지로 60분 동안 자극된다. 세포들은 96-웰 플레이트들에 넣고 형광이 GENios 플러스 형광 마이크로플레이트 리더 [(485/530 nm) Tecan US Inc., Research Triangle Park, NC]를 사용하여 측정된다.

통계학적 분석. 통계학적 분석은 SigmaStat® 통계학적 소프트웨어 (Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA)를 사용하여 데이타 상에서 수행되었다. 실험적 그룹들 간의 차이들은 스튜던트 T 테스트를 사용하여 결정될 것이다. P = 0.05가 통계학적으로 유의한 것으로 고려되었다.

결과들.

하기에 제시된 데이타로부터, BT 세포들을 준 돼지들은 대조군 식사를 준 돼지들보다 심지어 살모넬라 감염 (24 ppm으로)의 존재 시에도 더 큰 평균 일간 무게의 획득들 (ADG)을 가졌다 (표 7).

표 7, 평균 일간 획득, Rep. 3, 24 ppm BT. 파운드의 수치들 (lbs). 개별 돼지들로부터 이유기-후 0일, 3일, 5일 및 7일째 수집된 무게들로부터 얻은 데이타는 각각의 시간대를 위해 풀로 형성되었다. 데이타는 평균 획득 +/- 표준 편차를 나타낸다.

ST의 변 배출에서 일정 감소가 직장 분변검사 데이타에서 나타난 바와 같이 관찰되었다 (표 8). 반복 1에서, 5일째를 제외하고 12 ppm BT로 변 배출에서 차이가 전혀 관찰되지 않았다. 반복 2에서, 대조군 및 24 ppm의 BT는 ST 배출에서 4일째를 제외하고 유사하였으며, 여기에서 BT 24 ppm 그룹은 대조군 그룹보다 더 많은 양성 돼지들을 가졌다. 반복 3에서, 24 ppm의 BT 그룹은 측정된 모든 일에서 대조군 그룹보다 ST 배출하는 돼지들을 덜 가졌다. 반복 3에서, 돼지들은 반복 1 및 2에서와 같이 감염-후 5일 대신에 7일 동안 추적되었다.

표 8은 매일 직장 분변검사 데이타를 나타낸다.

펩타이드 사료를 준 돼지들은 기관들에서 - 림프절들, 간, 비장 - 전체적으로 대조군 돼지들과 대비하여 더 적은 살모넬라를 가졌지만, 장 조직들에서는 - 회장 (반복 3 제외), 맹장, 직장 - 감소들을 보여주지 않았다. 반복 1에서, 12 ppm의 BT 그룹은 간 및 비장 둘 다에서 ST에 대한 양성인 돼지들을 더 적게 가졌지만, ST의 회수는 림프절들, 맹장 및 회장에서 동일하였다 (표 9). 반복 2에서, BT 그룹은 맹장을 제외한 모든 조직들에서 양성인 돼지들을 더 적게 가졌다. 반복 3에서는, BT 그룹의 돼지들은 림프절들, 비장, 회장, 맹장 및 직장에서 ST에 대해 거의 양성이 없었다. 군집화 데이타 (CFUs)는 ST의 낮은 회수로 인해 미결정되었다 (데이타 미도시). 펩타이드는 살모넬라 침입 및 이유된 돼지들의 군집화에 미치는 일정 양성적 효과들을 가졌던 것으로 여겨진다.

표 9는 조직들로부터 분리된 살모넬라를 나타낸다.

BT 포자형성-결핍 균주를 준 돼지들로부터 얻은 백혈구들은 BT 펩타이드를 준 3일, 5일 및 7일째 대조군 돼지들로부터 얻은 백혈구들보다 유의하게 더욱 높은 산화적 파열 반응 (표 10)을 가졌다 (p < 0.05).

표 10, 돼지의 백혈구 산화적 파열 활성. 돼지들은 연구 기간들 전체를 통하여 각각의 식사들이 주어졌다 (24 ppm BT). 돼지들은 이유기-후 3일, 5일 및 7일째 채혈되었다. 데이타는 10마리 돼지들/그룹으로부터 풀 형성된 두 번의 반복들을 재연한다. 데이타는 평균 획득 +/- 표준 편차로서 표현된다. RFU = 반사 형광 단위들 (1,000으로).

데이타는 불활성화된 B. 텍사스포러스 세포들이 돼지에서 무게 획득 그리고 장 및 조직들에서 살모넬라의 운반에 미치는 잠재적인 양성적 효과들을 가진 효과적인 면역조정인자인 점을 제시한다.

American Type Culture Collection

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Claims

포자형성-결핍이 배양을 약 50℃의 온도까지 약 5분 동안 시행하고 생존율을 측정하는 단계에 의해 측정될 수 있는, 약 3.5 × 10^-3이하의 생존율을 가지는 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 (B. texasporus) 균주.
제 1항에 있어서,
상기 생존율이 약 1 × 10^-5이하인, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주.
제 1항에 있어서,
상기 생존율이 약 1 × 10^-7이하인, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주.
제 1항에 있어서,
상기 생존율이 약 1 × 10^-9이하인, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주.
제 1항에 있어서,
상기 균주는 MYG11 (PTA-12310), MYG107 (PTA-12309), MYG110 (PTA-12308) 또는 MYG113 (PTA-12307)인, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주.
B. 텍사스포러스 세포들의 배양액을 세포들을 불활성하기에 충분한 스트레스에 놓아두는 단계를 포함하는, 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주를 불활성화하는 방법.
제 6항에 있어서,
상기 스트레스는 기아, 온도 충격, 탈수, pH 변화들, 알코올 노출, 계면활성제로의 처리, 압력 처리, 효소적 파괴, 기계적 힘, 및 그들의 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제 6항에 있어서,
상기 B. 텍사스포러스 배양액의 생존율을 1 × 10^-8 이하로 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
제 7항에 있어서,
상기 스트레스는 상기 세포들을 적어도 50℃까지 적어도 5분 동안 가열하는 단계, 상기 세포들을 동결보호제의 부재 시 냉동시키는 단계, 상기 세포들을 약 80% 이하의 물 함량까지 탈수시키는 단계, 계면활성제를 첨가하는 단계, 상기 세포들을 분산 건조하는 단계, 기계적 힘을 적용하는 단계 및 그들의 조합들로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주를 포함하는, 증진된 동물 사료 또는 음료.
제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서,
무게로 약 10% 이하의 수분 함량을 가지는, 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주.
동물에게 제 10항의 증진된 동물 사료 또는 음료를 투여하는 단계; 및
상기 동물의 무게 획득 또는 사료 전환을 상기 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주가 결여된 사료 또는 음료를 받은 동물과 대비하여 개선하는 단계:
를 포함하는, 동물의 성장률 및 사료 전환을 개선하는 방법.
동물에서 질병의 예방 및/또는 치료를 위한, 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 포자형성-결핍 B. 텍사스포러스 균주의 용도.
제 13항에 있어서,
상기 질병의 예방 및/또는 치료는 상기 동물에서 병원성 미생물 집단을 감소시키는 단계가 관여하고, 상기 병원균들은 아시네토박터, 바실러스, 보렐리아, 캄파일로박터, 클로스트리디아, 대장균, 엔테로코커스, 고노리아, 구제역병 바이러스, 헤모필러스, 인플루엔자 바이러스, 만하이미아, 마이코박테리아, 마이코플라스마, 파스테렐라, 슈도모나스, 살모넬라, 스태필로코커스 및 스트렙토코커스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.
제 13항에 있어서,
상기 질병은 대장균증, 살모넬라증, 괴사성 장염, 콕시디아증, 인플루엔자, 구제역병, 돼지의 생식 및 호흡 증후군, 소의 항해 열성 폐렴, 뇨관 감염, 비만/대사성 증후군 및 제 2형 당뇨병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 용도.