CN104640566A - 液体稳定的病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了包含减毒活病毒、10-30%糖添加剂和氨基酸的液体稳定疫苗。本发明还公开了此类疫苗的制造和通过施用此类疫苗保护动物的方法。

Description

液体稳定的病毒疫苗
与相关申请的交叉引用
根据35 U.S.C. § 119(e)，本申请要求于2012年8月21日提交的临时申请美国序列号61/691,507；和于2013年3月12日提交的临时申请美国序列号61/777,164的优先权，所述临时申请的内容在此全文引入作为参考。
发明领域
本发明涉及包含减毒活病毒的液体稳定疫苗。本发明还涉及此类疫苗的制造和对动物对象进行疫苗接种的方法。
发明背景
存在可以感染犬和/或猫的大量病毒。虽然由于相应的病毒，感染的症状例如可以包括轻度感冒样症状，但其他可以是快速致命的，如犬瘟热病毒(CDV)感染的情况[参见例如US2010/0196420]。事实上，CDV触发可以涉及眼、呼吸道、胃肠道、皮肤和神经系统的多系统感染。源于犬细小病毒(CPV)的死亡率也相当高[参见例如US2009/0010955]。CPV主要是肠病原体，其感染犬，尤其是幼犬，并且特征在于在超过4至5周龄的犬和幼犬中的急性腹泻、发热和白细胞减少症。甚至更年幼的犬可患有心肌疾病。犬瘟热病毒和犬细小病毒是需要保护幼犬/犬不受其害的两种最重要的犬病毒。
另外的犬病毒包括：犬副流感(CPI)病毒，其是引起促成上呼吸道疾病和传染性气管支气管炎传染的呼吸系统疾病的高度传染性病毒；导致传染性肝炎的犬1型腺病毒(CAV1)；和高度传染性且可以引起严重类型的呼吸系统疾病的犬流感病毒(CIV)。已报道，CIV能够引起100%感染，伴随80%发病率，和在严重感染中高达5-8%的死亡率[Crawford等人，Science 310 (5747)：482-485 (2005)；U.S. 7,959,929 B2]。
类似地，存在困扰猫的许多猫病毒，包括猫杯状病毒(FCV)、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)、猫冠状病毒(FCoV)和猫鼻气管炎(FVR)病毒。
目前广泛接受的是，预防由于犬或猫病毒感染的疾病的最佳方法是给它们接种针对这些病毒的疫苗。事实上，犬瘟热病毒疫苗已显著降低相应疾病的流行。类似地，犬传染性肝炎已被犬腺病毒-2疫苗(CAV2)极大限制。在疫苗中使用减毒的活CAV2代替紧密相关的CAV1消除了关于下述的担忧，即在已用减毒的活CAV1接种的犬中观察到的间质性肾炎和角膜混浊[Taguchi等人，Can 　 Vet 　 J. 52(9)：983–986(2011)]。
此外，可以安全地施用多价减毒活病毒疫苗，其限制需要的疫苗注射次数。相应地，存在几种商购可得的多价减毒活病毒疫苗，其防御犬瘟热、犬传染性肝炎、犬细小病毒和犬副流感病毒。另外，更新的多价疫苗还进一步防御犬流感病毒。
迄今为止，当贮存于液体溶液中时，减毒的犬和猫病毒一直不稳定。因此，在其长期贮存前，大多数减毒的活犬或猫病毒疫苗是冻干的，即冷冻干燥的。减毒的活犬或猫病毒通常作为在水中的悬浮液与保护剂混合，冷冻，并且随后通过在冻干过程期间的升华和二次干燥脱水。冷冻和通过升华干燥的低温连同所涉及的低表面与体积比会需要长干燥时期，并且因此显著增加制造时间和成本。
另外，在大型商业干燥过程中存在固有矛盾，这是因为：不能跨越整个产物负荷调整货架温度，跨越干燥器的可变冷冻速度，边缘效应和辐射能效应。提高干燥温度以缩短干燥时间通常不是可选的方案，因为干燥温度必须保持显著低于保护性蛋白质基质的玻璃转化温度。此外，长的不一致的干燥时间和/或高干燥温度通常导致对减毒活病毒的结构性损伤，连同其生物活性的显著丧失。
因此，为了补偿功效的固有丧失，包含减毒活病毒的冻干的犬和/或猫疫苗以增强的滴度贮存。然而，如果冻干过程实际上导致的活性丧失比预料的少，此类增加的滴度可以导致显著的不利事件。因此，需要非常小心地配制疫苗，以使所包含的病毒滴度不仅安全地低于导致不利事件的量，而且在考虑到由于冻干和后续贮存的病毒滴度丧失的情况下还维持足够功效。因此，需要新的减毒的活犬和/或猫病毒疫苗，其可以使其病毒滴度可靠地保持在安全和有效水平。
本文任何参考文献的引用不应解释为承认此参考文献可用作本申请的“现有技术”。
发明概述
为了克服现有疫苗的缺陷，本发明提供了新型液体稳定的减毒活病毒疫苗以及其相应的免疫原性组合物。在某些实施方案中，所述减毒活病毒是减毒的活犬病毒。在其他实施方案中，所述减毒活病毒是减毒的活猫病毒。本发明还提供了给动物施用此类疫苗的方法。本发明进一步提供了通过施用本发明的疫苗来预防动物中的疾病的方法。在具体实施方案中，所述动物是犬科动物。在其他实施方案中，所述动物是猫科动物。
相应地，本发明提供了包含减毒活病毒的液体稳定疫苗。在某些实施方案中，所述减毒活病毒是重组病毒。在这种类型的具体实施方案中，将所述重组病毒作为编码异源蛋白质的重组载体使用。在这种类型的更具体的实施方案中，所述异源蛋白质是病毒或细菌抗原。
在具体实施方案中，所述疫苗包含糖添加剂和氨基酸。在这种类型的某些实施方案中，所述疫苗包含10-30%糖添加剂。在具体实施方案中，所述疫苗包含12-27%糖添加剂。在某些实施方案中，所述疫苗包含15-25%糖添加剂。在相关实施方案中，所述疫苗包含15-20%糖添加剂。在其他实施方案中，所述疫苗包含20-25%糖添加剂。在更具体的实施方案中，所述疫苗包含16-18%糖添加剂。在甚至更具体的实施方案中，所述疫苗包含17%糖添加剂。
在本发明的液体稳定病毒疫苗的具体实施方案中，所述糖添加剂是蔗糖。在其他实施方案中，所述糖添加剂是山梨糖醇。在另外其他实施方案中，所述糖添加剂是甘露醇。在另外其他实施方案中，所述糖添加剂是海藻糖。在另外其他实施方案中，所述糖添加剂是右旋糖。在具体实施方案中，所述糖添加剂实际上是两种或更多种糖添加剂的组合。在这种类型的具体实施方案中，所述糖添加剂是蔗糖和山梨糖醇的组合。在这种类型的更具体的实施方案中，所述糖添加剂是15%蔗糖和10%山梨糖醇的组合。
本发明的液体稳定疫苗的pH范围可以为pH 6.0-pH 8.0。在某些实施方案中，所述pH范围为pH 6.5-pH 7.8。在具体实施方案中，所述pH范围为pH 6.8-pH 7.5。在更具体的实施方案中，所述pH范围为pH 7.0-pH 7.4。在甚至更具体的实施方案中，所述pH为7.2。
本发明的液体稳定疫苗可以包含缓冲剂。在这种类型的具体实施方案中，所述缓冲剂包含2.5-50 mM Tris。在相关实施方案中，所述缓冲剂包含5-25 mM Tris。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含10-20 mM Tris。在另外其他实施方案中，所述缓冲剂可包含2.5-50 mM组氨酸。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含2.5-50 mM Tris和2.5-50 mM组氨酸。在更具体的实施方案中，所述缓冲剂包含5-25 mM Tris和5-25 mM组氨酸。在仍更具体的实施方案中，所述缓冲剂包含10-20 mM Tris和10-20 mM组氨酸。在其他实施方案中，所述缓冲剂包含2.5-50 mM磷酸盐。在相关实施方案中，所述缓冲剂包含5-25 mM磷酸盐。在具体实施方案中，所述缓冲剂包含10-20 mM磷酸盐。
本发明的液体稳定疫苗包含氨基酸。在某些实施方案中，所述氨基酸是精氨酸。在其他实施方案中，所述氨基酸是甲硫氨酸。在另外其他实施方案中，所述氨基酸是甘氨酸。在另外其他实施方案中，所述氨基酸是谷氨酸。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸和甲硫氨酸两者。在其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸和甘氨酸两者。在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含甘氨酸和甲硫氨酸两者。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗包含谷氨酸和甲硫氨酸两者。在其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含谷氨酸和甘氨酸两者。在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含谷氨酸和精氨酸两者。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甘氨酸。在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、谷氨酸和甲硫氨酸。在仍其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸。在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗包含精氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸和谷氨酸。
在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为0.15-0.6 M。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为0.2-0.5 M。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为0.25-0.35 M。在甚至更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸或谷氨酸或甘氨酸的最终浓度为0.3 M。
在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸和/或谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为0.15-0.6 M。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸和/或谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为0.2-0.5 M。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸和/或谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为0.25-0.35 M。在甚至更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的精氨酸和/或谷氨酸和/或甘氨酸的最终组合浓度为0.3 M。
在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.025-0.3 M。在相关实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.04-0.15 M。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.06-0.09 M。在甚至更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗中的甲硫氨酸的最终浓度为0.07 M。
本发明的液体稳定疫苗还可以包含稳定剂蛋白质。所述稳定剂蛋白质可以是完整蛋白质和/或蛋白质水解物。在具体实施方案中，所述稳定剂蛋白质是明胶。在更具体的实施方案中，由本发明的液体稳定疫苗包含的稳定剂蛋白质是0.4-1.6%明胶。在可选的实施方案中，所述稳定剂蛋白质是完整酪蛋白的水解物。在这种类型的具体实施方案中，由本发明的液体稳定疫苗包含的稳定剂蛋白质是稳定剂蛋白质是0.5-2.0%的完整酪蛋白的水解物。在某些实施方案中，所述完整酪蛋白的水解物是完整酪蛋白的蛋白水解的水解物(proteolytic hydrolysate)。
另外，本发明的液体稳定疫苗还可以进一步包含醇。在这种类型的具体实施方案中，所述醇是乙醇。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗包含0.25-1.0%乙醇。在相关实施方案中，本发明的液体稳定疫苗还可以包含右旋糖酐硫酸酯。在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗包含1-20 mM右旋糖酐硫酸酯。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗包含2.5-10 mM右旋糖酐硫酸酯。在甚至更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗包含5 mM右旋糖酐硫酸酯。
另外，本发明的液体稳定疫苗还可以进一步包含螯合剂。此类螯合剂可以包括但不限于：乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)。在本发明的液体疫苗中的此类螯合剂浓度可以从约50 µM到10 mM不等。
在某些实施方案中，所述螯合剂是EDTA。在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗包含50 µM-10 mM EDTA。在这种类型的某些实施方案中，所述液体稳定疫苗包含50-200 µM EDTA。在其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含250 µM-7.5 mM EDTA。在仍其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含0.5 mM-5.0 mM EDTA。在另外其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含1.0 mM-3.0 mM EDTA。在更具体的实施方案中，所述液体稳定疫苗包含约2 mM EDTA。
本发明的液体稳定疫苗可以进一步包含佐剂。在这种类型的具体实施方案中，所述佐剂是磷酸铝。在其他此类实施方案中，所述佐剂是氢氧化铝。在仍其他实施方案中，所述佐剂是低分子量共聚物佐剂，其可以在溶液中形成交联以变成高分子量凝胶。在另外其他实施方案中，所述佐剂由在水中的丙烯酸钠的凝胶颗粒构成。在仍其他实施方案中，所述佐剂是两种或更多种此类佐剂的组合。
在某些实施方案中，本发明的液体稳定疫苗可以进一步包含自由基清除剂和/或抗氧化剂。在相关实施方案中，本发明的液体稳定疫苗保持在密封容器中，所述密封容器具有在液体上的惰性气体，例如氩、氮或氦(例如已用所述惰性气体反填充)。
本发明的液体稳定疫苗可以包含减毒的活犬病毒。在某些实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬瘟热病毒。在其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬2型腺病毒。在另外其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬细小病毒(CPV)。在这种类型的一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2 (CPV-2)。在这种类型的另外一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2a (CPV-2a)。在这种类型的仍一个实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2b (CPV-2b)。在这种类型的另外一个具体实施方案中，所述犬细小病毒是犬细小病毒2c (CPV-2c)。在这种类型的具体实施方案中，所述CPV 2c是ATCC登录号PTA-13492。在另外一个实施方案中，所述犬细小病毒是重组犬细小病毒，其已构建为包含异源CPV-2c/CPV-2基因组，即编码衣壳蛋白质的区域来自CPV-2c分离物，并且编码非结构蛋白质的区域来自CPV-2分离物。
在另外其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬副流感病毒。在具体实施方案中，所述犬副流感病毒是重组载体。在更具体的实施方案中，所述重组犬副流感病毒编码且表达异源蛋白质。在这种类型的某些实施方案中，所述异源蛋白质是非犬抗原。在更具体的实施方案中，所述抗原是家禽病毒或细菌抗原。在某些实施方案中，所述重组犬副流感病毒是重组副流感病毒5。
在另外其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬冠状病毒。在仍其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬肺病毒。在另外其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬传染性肝炎病毒。在仍其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬疱疹病毒。在另外其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是狂犬病病毒。在仍其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬微小病毒(minute virus)。在另外其他实施方案中，所述减毒的活犬病毒是犬流感病毒。在可选的实施方案中，所述减毒的活犬病毒是伪狂犬病病毒。
本发明的液体稳定疫苗可以包含减毒的活猫病毒。在某些实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫疱疹病毒(FHV)。在其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫杯状病毒(FCV)。在另外其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫肺病毒(FPN)。在仍其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫细小病毒(FPV)。在另外其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫白血病病毒(FeLV)。在仍其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)。在另外其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫免疫缺陷病毒(FIV)。在仍其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是博尔纳病病毒(BDV)。在另外其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫流感病毒。在仍其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)。在另外其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫冠状病毒(FCoV)。在仍其他实施方案中，所述减毒的活猫病毒是猫鼻气管炎病毒(FVR)。
另外，本发明提供了液体稳定疫苗，其为多价疫苗。在具体实施方案中，本发明的多价疫苗仅包含减毒的活病毒疫苗。此类多价疫苗可以含有减毒活病毒的任何组合。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒和减毒的活犬细小病毒。在相关实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒和减毒的活犬2型腺病毒。在其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒和减毒的活犬副流感病毒。在仍其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬细小病毒和减毒的活犬副流感病毒。在另外其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬细小病毒和减毒的活犬2型腺病毒。
在仍其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬副流感病毒和减毒的活犬2型腺病毒。在另外其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬细小病毒、减毒的活犬副流感病毒和减毒的活犬2型腺病毒。在具体实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬细小病毒、减毒的活犬副流感病毒、减毒的活犬2型腺病毒和减毒的活犬冠状病毒。在相关实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬细小病毒、减毒的活犬副流感病毒、减毒的活犬2型腺病毒和减毒的活猫冠状病毒。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬细小病毒、减毒的活犬副流感病毒和减毒的活犬流感病毒。
在其他实施方案中，本发明提供了液体稳定疫苗，其为包含减毒的活犬2型腺病毒和减毒的活犬副流感病毒的多价疫苗。在另外其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬2型腺病毒和减毒的活犬细小病毒。在另外其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬细小病毒和减毒的活犬副流感病毒。在仍其他实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬细小病毒和减毒的活犬副流感病毒。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗包含减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬细小病毒、减毒的活犬副流感病毒和减毒的活犬流感病毒。
可选地，本发明的液体稳定疫苗可以进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例如菌苗)和/或菌苗的亚级分。相应地，包含一种或多种减毒活病毒疫苗的本发明的液体稳定疫苗中的任一种可以进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌和/或菌苗的亚级分。在具体实施方案中，所述灭活的病毒是犬流感病毒。在其他实施方案中，所述灭活的病毒是犬肺病毒。在仍其他实施方案中，所述灭活的病毒是犬冠状病毒。在另外其他实施方案中，本发明的液体稳定疫苗可以包含这些灭活的犬病毒中的两种或更多种。
在某些实施方案中，所述灭活的细菌是支气管炎博德特菌(Bordetella 　 bronchiseptica)。在另外其他实施方案中，所述灭活的细菌是支原体属(Mycoplasma)物种。在仍其他实施方案中，所述灭活的细菌是犬埃立克体(Ehrlichia 　 canis)。在另外其他实施方案中，所述灭活的细菌是无浆体属(Anaplasma)物种。在另外其他实施方案中，所述灭活的细菌是钩端螺旋体(Leptospira)。在一个此类实施方案中，所述钩端螺旋体是犬钩端螺旋体(Leptospira 　 canicola)。在另一个实施方案中，所述钩端螺旋体是感冒伤寒型钩端螺旋体(Leptospira 　 grippotyphosa)。在另外一个实施方案中，所述钩端螺旋体是哈德焦钩端螺旋体(Leptospira 　 hardjo)。在另外一个实施方案中，所述钩端螺旋体是黄疸出血型钩端螺旋体(Leptospira 　 icterohaemorrhagiae)。在另外一个实施方案中，所述钩端螺旋体是波摩那钩端螺旋体(Leptospira 　 Pomona)。在另外一个实施方案中，所述钩端螺旋体是问号钩端螺旋体(Leptospira 　 interrogans)。在另外一个实施方案中，所述钩端螺旋体是秋令热钩端螺旋体(Leptospira 　 autmnalis)。在仍一个实施方案中，所述钩端螺旋体是布拉迪斯拉发钩端螺旋体(Leptospira 　 Bratislava)。在另外其他实施方案中，本发明的液体稳定疫苗可以包含这些灭活的细菌中的两种或更多种。在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗包含犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体。
本发明进一步提供了帮助保护猫或犬预防临床疾病的方法，所述临床疾病起因于犬或猫病毒感染，所述方法包括给动物施用本发明的疫苗。在某些实施方案中，所述施用经粘膜进行。在其他实施方案中，所述施用经肠胃外进行。在仍其他实施方案中，所述施用皮内进行。在另外其他实施方案中，所述施用经皮进行。在更具体的实施方案中，本发明的疫苗皮下施用于动物。在其他具体实施方案中，本发明的疫苗肌内施用于动物。本发明还包括初免和/或加强疫苗的使用。
在具体实施方案中，所述动物对象是犬科动物，并且该方法包括给所述犬科动物施用包含减毒活病毒的本发明的液体稳定疫苗。在具体实施方案中，所述液体稳定疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬细小病毒和减毒的活犬副流感病毒。在这种类型的某些实施方案中，所述液体稳定疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬细小病毒、减毒的活犬副流感病毒和减毒的活犬流感病毒。在这种类型的其他实施方案中，所述液体稳定疫苗包含减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬细小病毒、减毒的活犬副流感病毒和灭活的减毒的犬流感病毒。
还提供了制备任一种和全部的本发明的液体稳定疫苗的方法。在某些实施方案中，该方法包括组合治疗有效量的减毒活病毒与10-30%糖添加剂、氨基酸和pH 6.0-pH 8.0的缓冲溶液，以形成液体稳定疫苗。所述氨基酸可以是精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸，或精氨酸、甘氨酸、谷氨酸和/或甲硫氨酸的组合。在具体实施方案中，精氨酸和/或甘氨酸和/或谷氨酸在液体稳定疫苗中具有0.15-0.6 M的最终浓度。在某些实施方案中，甲硫氨酸在液体稳定疫苗中具有0.025-0.3 M的最终浓度。在具体实施方案中，所述减毒活病毒的治疗有效量为减毒活犬病毒的治疗有效量。在这种类型的具体实施方案中，所述减毒活犬病毒的治疗有效量包括减毒的活犬瘟热病毒、减毒的活犬2型腺病毒、减毒的活犬细小病毒和减毒的活犬副流感病毒的治疗有效量。
本发明的这些及其他方面通过参考下述详述将得到更佳理解。
发明详述
与灭活的病毒疫苗相比，本发明的液体稳定的活病毒疫苗是减毒的。迄今为止，当配制此类减毒活病毒疫苗时需要特别小心，以使减毒病毒的滴度维持在安全地低于可以导致显著不良事件的水平。事实上，大多数减毒的活犬或猫病毒疫苗是冻干的，并且冻干可以由于冻干过程本身以及在长期贮存期间随着时间的推移而导致减毒活病毒疫苗功效的大幅下降。
本发明已通过提供液体稳定疫苗来克服这个问题，所述液体稳定疫苗即使在贮存期间也保持有效，而无需使减毒活病毒抗原的初始滴度增加超过可靠的安全水平。作为附加益处，本发明通过显著减少制备此类安全且有效的疫苗所必需的减毒活病毒量，提供了用于降低所提供的疫苗的制造成本的方法。另外，本发明的减毒活病毒疫苗比其冻干配对物更便于使用。相应地，本发明提供了安全且有效的减毒活病毒疫苗，其可以作为液体在冷藏温度贮存且仍保持稳定12-18个月或甚至更久。
此外，令人惊讶的是，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括任何类型的犬和/或猫病毒。因此，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括有包膜和无包膜病毒两者。另外，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以包括具有单链RNA基因组、单链DNA基因组或双链DNA基因组的减毒活病毒。
另外，本发明的液体稳定的活病毒疫苗还可以包括重组犬或猫载体，其为单独的和/或连同其他此类重组载体、和/或连同减毒的活犬或猫病毒和/或与灭活的细菌和/或灭活的犬或猫病毒组合。此类重组犬或猫载体可以进一步编码一种或多种异源病毒或细菌抗原。此类重组载体的具体实例是重组犬副流感病毒5，其近来已由Li等人描述[J. 　 of 　 Virology 87(10) 5985-5993(2013)；在此全文引入作为参考]。
本发明的液体稳定的活病毒疫苗的重组载体，例如重组副流感病毒5，可以编码来自犬病毒、和/或猫病毒、和/或人病毒、和/或猿猴病毒、和/或牛病毒、和/或绵羊病毒、和/或猪病毒、和/或家禽病毒(例如鸡病毒)的异源抗原。在具体实施方案中，本发明的液体稳定的活病毒疫苗包含重组副流感病毒5，其编码来自一种或多种鸡病毒的一种或多种抗原。
令人惊讶的是，在螯合剂(例如2mM EDTA)和/或佐剂(例如磷酸铝)的存在下，即使在制剂中包括灭活的细菌时，本发明的液体稳定的活病毒疫苗也保持其稳定性(参见下文实施例2)。相应地，本发明的液体稳定的活病毒疫苗可以进一步包含一种或多种灭活的犬或猫病毒和/或细菌(例如菌苗)和/或菌苗的亚级分。
为了方便起见在说明书中使用的单数术语绝非期望受到如此的限制。因此，例如，除非另有说明，提及“糖添加剂”包括提及此类糖添加剂中的一种或多种。除非另有说明，复数术语的使用也不期望是限制性的。类似地，除非另有说明，否则当在本文中指示为任一时，可以被称为酸或其相应碱的化学化合物意指该化合物的任一形式。因此，术语谷氨酸的使用意欲包括谷氨酸盐，并且反之亦然。
如本文使用的，“疫苗”是适合于应用于动物(在某些实施方案中，包括人)的组合物，在施用于动物后，所述组合物诱导免疫应答，其强度足以最低限度地帮助防御起因于由野生型微生物感染的临床疾病，即强度足以帮助预防临床疾病，和/或预防、改善或治愈临床疾病。除非另有明确说明，否则术语疫苗的使用包括多价疫苗。
如本文使用的，“多价疫苗”是包含两种或更多种不同抗原的疫苗。在这种类型的具体实施方案中，所述多价疫苗刺激接受者的免疫系统预防两种或更多种不同病原体。
如本文使用的，“液体稳定”疫苗是作为液体维持的疫苗(包括液体多价疫苗)，当贮存于或低于7℃(例如在标准冷藏库中，和/或在0℃-7℃下)时，所述疫苗保持有效至少一年。在具体实施方案中，即使当贮存于或低于7℃至少1.5年时，所述液体稳定疫苗保持有效。在更具体的实施方案中，即使当贮存于或低于7℃至少2年时，所述液体稳定疫苗保持有效。在仍更具体的实施方案中，即使当贮存于或低于7℃至少2.5-3年时，所述液体稳定疫苗保持有效。
如本文使用的，术语“保护”("protect", "protecting")、“提供保护”("provide protection to", "providing protection to")和“帮助防御”("aids in the protection")不要求免于任何感染指征的完全保护。例如，“帮助防御”可以意指保护是足够的，从而使得在攻击后，潜在感染的症状至少被减少，和/或引起症状的潜在细胞、生理学或生物化学原因或机制中的一种或多种被减少和/或被消除。如本文中使用的，应当理解“减少的”是指相对于感染状态，包括感染的分子状态，而不只是感染的生理学状态。
如本文使用的，术语“治疗有效量”是给定抗原(例如减毒活病毒)的量，当在单一施用中提供时和/或当预期，作为伴随一个或多个后续加强施用的初始施用提供时，所述量足以提供保护和/或帮助防御施用该抗原以防御的病原体。
如本文使用的，“有效”疫苗包含治疗有效量的给定抗原。
如本文使用的，术语“药学可接受的”作为形容词使用，以意指被修饰的名词适合于用于药物产品中。当它例如用于描述药物疫苗中的赋形剂时，它将赋形剂表征为与组合物的其他成分相容，并且不对预期接受者不利地有害。
术语“载体”指与化合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。药学可接受的载体可以是无菌液体，例如水和/或油，包括石油、动物、植物或合成起源的那些，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。水或水溶液盐水溶液，和右旋糖和甘油的水溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。
如本文使用的，“佐剂”是这样的物质，其能够有利于或放大免疫学事件级联，最终导致更佳的免疫应答，即针对抗原的整合的身体应答。佐剂一般而言不是免疫应答发生所需的，但有利于或放大该应答。
如本文使用的，“全身施用”是施用到身体的循环系统(包含心血管和淋巴系统)内，其影响作为整体的身体而不是特定部位，例如胃肠道(经由例如经口或直肠施用)和呼吸系统(经由例如鼻内施用)。全身施用可以例如通过施用到肌肉系统内(肌内)、真皮内(皮内、经皮或真皮上(supradermal))、皮肤下方(皮下)、粘膜下方(粘膜下)、静脉中(静脉内)等来进行。
“肠胃外施用”包括皮下注射、粘膜下注射、静脉内注射、肌内注射、皮内注射和输注。
除非另有说明，如本文使用的，术语“犬/犬科动物”包括所有驯养犬、家犬(Canis 　 lupus 　 familiaris)或家犬(Canis 　 familiaris)。
犬细小病毒“CPV”在1978年被首次分离，并且命名为CPV-2，以使其与犬细小病毒微小病毒(CMV或CPV-1)区分。在CPV-2最初分离后大约一年，鉴定出遗传变体CPV-2a。在1980年代中期，鉴定出第二种遗传变体CPV-2b。CPV-2a和CPV-2b很快完全顶替CPV-2。今天，在美国不再检测到CPV-2a [Parrish和Kawaoka，Annu 　 Rev. 　 Microbiol. ，59：553-586(2005)]。该家族中的第四种CPV变体，CPV-2c，在2000年首次得到描述[参见U.S. 8,227,593；U.S. 8,258,274；Hong等人，J. 　 Vet. 　 Diagn. 　 Invest.(5)：535-9(2007)]。于2013年12月19日提交的美国临时申请61/739,067 (其内容在此全文引入作为参考)，描述了特异性减毒的CPV-2c分离物(ATCC登录号PTA-13492)，其随后根据满足国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约要求的条件，于2013年1月24日保藏于美国典型培养物中心(ATCC；10801 University Boulevard，Manassas，Va. 20110-2209，U.S.A.)。另外，已构建了重组犬细小病毒，其包含异源CPV-2c/CPV-2基因组，即编码衣壳蛋白质的区域来自CPV-2c分离物，且编码非结构蛋白质的区域来自CPV-2分离物[WO2011107534(A1)；US 20120328652；WO2012007589(A1)，其内容在此全文引入作为参考]。如本文使用的，包含“犬细小病毒”的本发明的疫苗可以包含这些CPV类型/变体/分离物中的一种或多种，包括近期构建的包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组犬细小病毒。
如本文使用的，术语“猫/猫科动物”指猫(Felidae)科的任何成员。该科的成员包括野生、动物园和驯养成员，例如猫(Felinae)亚科的任何成员，例如猫、狮子、老虎、美洲狮、美洲虎、豹、雪豹、黑豹、北美山狮、猎豹、猞猁、山猫、狞猫或其任何杂交种。猫还包括驯养猫、纯种和/或杂种伴侣猫、展示猫、实验室猫、克隆猫和野生或野猫。
如本文使用的，“糖添加剂”是5-12碳糖(例如蔗糖、麦芽糖、海藻糖、右旋糖、乳糖、葡萄糖、果糖、半乳糖)或糖醇/多元醇(例如山梨糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、肌醇、麦芽糖醇)。除非另有具体相反说明，否则糖添加剂的百分比(%)作为疫苗中的糖添加剂的重量(w)与疫苗体积(v)，(w/v)提供。
除非另有具体相反说明，如本文使用的，疫苗中的固体添加剂(例如糖添加剂或明胶)的百分比(%)是基于1%溶液，其为1g固体/100 ml疫苗体积(w/v)。
除非另有具体相反说明，如本文使用的，疫苗中的液体添加剂(例如乙醇)的百分比(%)是基于1%溶液，其为1 ml液体添加剂/100 ml疫苗体积(v/v)。
除非另有具体相反说明，如本文使用的，提供的pH值是在25℃下测定/测量的pH值。
如本文使用的，术语“大约”与术语“约”可互换使用，并且表示值在所示值的25%内，即“约”2 mM EDTA的浓度可以是1.5 mM-2.5 mM EDTA。
可以用于本发明的液体稳定疫苗中的完整酪蛋白的水解物可以通过许多操作获得，包括例如作为酸性水解物或酶促水解物获得。此类水解物含有混合的氨基酸和肽的形式的最初存在于酪蛋白中的所有氨基酸。可以用于本发明的液体稳定疫苗中的完整酪蛋白的一种胰水解物作为CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC®由MP Biomedicals销售。可比较产品以NZ-AMINE®、NZ-AMINE® A、NZ-AMINE® AS和NZ-AMINE® B和Tryptone的名称由Sigma-Aldrich销售。
因为本发明的液体稳定疫苗理想的pH范围为pH 6.0-pH 8.0，所以本发明的液体稳定疫苗可以包含缓冲剂。用于本发明的液体稳定疫苗中的缓冲剂包括但不限于：Tris、Tris-组氨酸、BIS-Tris、BIS-Tris-丙烷、磷酸(phosposphate)钾和/或钠、焦磷酸钠或钾、咪唑、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、三(羟甲基)甲基甘氨酸、甘氨酰甘氨酸和HEPES。可以使用任何合适的抗衡离子，使缓冲剂达到所需pH。
本发明的疫苗可以含有佐剂，或可选地不含佐剂，通常取决于疫苗含有的一种或多种抗原。用于本发明的疫苗中的佐剂的例子包括磷酸铝，例如REHYDROPHOS® (General Chemical, Parsippany, New Jersey)，和/或氢氧化铝，例如REHYDROGEL®、REHYDROGEL® HPA或REHYDROGEL® LV (General Chemical, Parsippany, New Jersey)，和/或低分子量共聚物佐剂，其可以在溶液中形成交联以变成高分子量凝胶，例如POLYGENTM (MVP Laboratories, Omaha)，和/或由在水中的丙烯酸钠的凝胶颗粒构成的佐剂，例如MONTANIDETM PET GEL A TM (Seppic, Paris France)。
当加入时，疫苗中的佐剂的量通常在约1%-20% (v/v)之间。在具体实施方案中，所述佐剂的量在约2%-10% (v/v)之间。在下文提供的实施例2中，所述佐剂为约5%(v/v)。
本发明的疫苗还可以含有螯合剂。适当螯合剂的例子包括乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、和二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)。
多价疫苗：本发明提供了液体稳定的多价疫苗。例如，本发明的液体稳定的多价犬疫苗可以包括下述中的两种或更多种：犬瘟热病毒、犬2型腺病毒、犬细小病毒、犬副流感病毒、犬流感病毒、犬肺病毒、犬冠状病毒、犬疱疹病毒、犬传染性肝炎病毒、犬微小病毒、狂犬病病毒和伪狂犬病病毒。此类液体稳定疫苗还可以与一种或多种减毒的或灭活的抗原组合并且贮存，或可选地在施用前组合，所述抗原例如犬流感病毒、犬冠状病毒、支气管炎博德特菌、支原体属物种、犬埃立克体、无浆体属物种、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、秋令热钩端螺旋体和布拉迪斯拉发钩端螺旋体。
另外，本发明的液体稳定的多价猫疫苗可以包含下述猫病原体中的一种或多种：猫疱疹病毒、猫杯状病毒、猫肺病毒、猫细小病毒、猫白血病病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫免疫缺陷病毒、博尔纳病病毒、猫流感病毒和禽流感。此类液体稳定的疫苗随后可以与减毒的或灭活的猫衣原体(Chlamydophila 　 felis)和/或巴尔通氏体属物种(Bartonella 　 spp.)(例如汉赛巴尔通氏体(B. 　 henselae))组合并且贮存，或可选地在施用前组合。
本发明的疫苗还可以含有抗菌剂，例如抗生素。此类抗生素的例子可以包括：10-100 µg/mL庆大霉素、0.5-5.0 µg/mL两性霉素B、10-100 µg/mL四环素、10-100单位/mL制霉素(制霉菌素)、10-100单位/mL青霉素、10-100 µg链霉素、10-100 µg多粘菌素B和10-100 µg新霉素。
疫苗施用：本发明的液体稳定疫苗可以通过任何方便方式施用，例如通过全身施用，包括通过肠胃外施用，例如但不限于皮下或肌内施用。本发明的液体稳定疫苗还可以通过粘膜施用，例如通过鼻内、经口、气管内、直肠和/或眼施用。可选地，所述疫苗可以经由皮肤贴剂、划痕或局部施用进行施用。考虑到本发明的液体稳定疫苗还可以经由接受者动物对象的饮用水和/或食物进行施用。进一步考虑到此类疫苗可以以处理(treat)或玩具的形式施用。
本发明的疫苗(包括多价疫苗)还可以作为组合疗法的一部分施用，所述组合疗法即除疫苗自身之外，还包括施用一种或多种另外的活性剂、疗法等的疗法。在所述情况下，应认识到构成“治疗有效”量的疫苗量可以多于或少于疫苗单独施用时将构成“治疗有效”量的疫苗量。其他疗法可以包括本领域已知的那些，例如，如止痛药、退烧药、祛痰药、抗炎药、抗组胺剂、和/或流体的施用。
免疫原性水平可以通过本领域一般已知的攻击剂量滴度研究技术通过实验进行测定。此类技术通常包括用不同剂量的疫苗对许多动物对象进行疫苗接种，并且随后用剧毒病毒攻击动物对象，以测定最低限度保护剂量。
影响优选剂量方案的因素可以包括例如对象的物种或品种(例如犬或猫)、年龄、重量、性别、饮食、活动、肺大小，和状况；施用途径；使用的特定疫苗的功效、安全性和免疫持续时间概况；是否使用递送系统；以及疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的一部分施用。因此，实际上采用的剂量可以对于具体动物不同，并且因此可以偏离上文所述的典型剂量。此类剂量调整的确定通常在使用常规方法的疫苗开发领域技术人员的技术内。
类似地，可以与此类剂量一起施用的体积通常在0.1 mL (通常用于皮内或经皮施用)和5.0 mL之间。对于肌内或皮下施用，施用体积的典型范围在0.2-2.0 mL之间，并且为约1.0-2.0 mL。
考虑疫苗可以单次施用，或可选地经过数天、数周、数月或数年两次或更多次施用于疫苗接受者。在一些实施方案中，所述疫苗施用至少两次。在某些此类实施方案中，例如，所述疫苗施用两次，其中第二个剂量(例如加强剂量)在第一个剂量后至少2周施用。在具体实施方案中，所述疫苗施用两次，其中第二个剂量在第一个剂量后不长于8周施用。在其他实施方案中，第二个剂量在第一个剂量后1周至2年、在第一个剂量后1.5周至8周、或在第一个剂量后2周至4周施用。在其他实施方案中，第二个剂量在第一个剂量后约3周施用。
在上述实施方案中，第一个和后续剂量可以例如在量和/或形式中有所不同。然而，通常，剂量在量和形式中是相同的。当仅施用单个剂量时，该单独剂量中的疫苗量一般包含治疗有效量的疫苗。然而，当施用超过一个剂量时，那些剂量中疫苗量一起可以构成治疗有效量。另外，可以初始施用疫苗，并且随后例如2-12周后可以施用加强剂量。然而，疫苗的后续施用可以在每年(1年)或每两年(2年)基础上进行，与是否施用加强剂量无关。
通过参考下述非限制性实施例，本发明可以得到更佳理解，所述实施例作为本发明的示例提供。呈现下述实施例以便更全面地举例说明本发明的实施方案。然而，它们决不应解释为限制本发明的广泛范围。
实施例
实施例 1
液体犬病毒疫苗的稳定性
材料与方法
材料 ：细胞培养级别蔗糖和山梨糖醇购自Fisher Scientific。纯度超过98%的分子级别L-精氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-组氨酸和氯化钠购自Sigma。纯度> 95%的具有平均分子量10,000的右旋糖酐硫酸酯购自Sigma。分子生物学级别乙醇(>99%)、TWEEN 80、TWEEN 20、1.0M Tris (pH 8.0)和EDTA (pH 8.0)溶液购自Sigma。20%明胶bloom 250 (冻力250)溶液和7.61% NZ胺 AS溶液由可获得的最佳商业试剂制备。
散装抗原制剂 ：已制备下述溶液且通过0.2 µm过滤灭菌：80%蔗糖、70%山梨糖醇、1.0M L-精氨酸(pH 7.2)、5% L-甲硫氨酸、5mM右旋糖酐硫酸酯。具有6.5-9.5之间的滴度的散装抗原CDV、CAV2、CPV和CPI在-80℃下冷冻，以在临掺和前解冻。
液体疫苗掺和与灌装 ：制备液体疫苗CDV、CAV2、CPV和CPI掺和物(1.0 mL/剂)的操作如下：将一个剂量的抗原量掺和到如下表1中所示的不同制剂内，其中对于病毒抗原具有5.0-7.5 (Log10 TCID50)的目标滴度。制备且标记200mL无菌容器，并且随后将每种稳定剂和赋形剂组分，以根据基于如下表1中所示的每种组分的最终浓度计算的量加入容器中。用双蒸水(ddH2O)调整至稳定剂和赋形剂的目标体积。在搅拌板上混合至少10分钟，直至所有组分完全溶解。冷却且使稳定剂溶液保持在4℃，直至抗原准备好。
在37℃水浴中解冻冷冻的抗原，伴随偶尔振荡，直至几乎所有冰都融化。一些抗原具有在溶液中可见的细胞碎片，因此在吸取前充分混合抗原。在使用前，解冻的抗原应在2-8℃保持不超过8小时。将适当量的CDV、CAV2、CPV和CPI加入具有稳定剂溶液的标记容器中。在搅拌板上混合直至抗原和稳定剂均匀掺和。在该混合步骤期间尽力避免生成气泡和泡沫。在25℃测量pH，并且如果pH不在7.2±0.1内，则用1M HCL或1M NaOH将pH调整至目标pH。将疫苗掺和物保持在2-8℃，直至在同一天分配或等分成小体积且在<-70℃下冷冻，用于未来使用。以1mL/小瓶将疫苗掺和物分配到2mL玻璃安瓿小瓶内。在灌装后将氩气加入安瓿小瓶中，以帮助阻止在贮存期间的氧化，并且随后热密封安瓿。在安瓿上标记样品名称、批号、贮存温度、日期，并且随后转移到盒内，并且在如指定的不同温度下贮存。
在加速温度和实时下的稳定性测试 ：液体样品在相应温箱中分别于25℃±1℃和4℃±1℃贮存。25℃用于筛选目的的加速稳定性测试，而在4℃下贮存的样品是实时稳定性样品。在指定时间点，从每种制剂取回3个小瓶，并且通过基于细胞培养的滴定测定来测量每种抗原的滴度，并且报告为半数组织培养感染剂量(TCID50)和/或50%荧光抗体感染剂量(FAID50)。
分析方法
CPI 效力 ：将病毒样品的稀释物接种到犬肾(DK)细胞上。在4-6天后，将单细胞层固定且用荧光素缀合的CPI抗血清染色，并且通过Spearman-Karber方法计算病毒滴度[Cunningham，C.H. A Laboratory Guide in Virology，第7版，Burgess Publishing Co.，Minneapolis，MN.(1973)；Kaplan，M.M.和Koprowski，H.，Laboratory Techniques in Rabies，World Health Organization，Switzerland，(1973)]。
CDV 效力 ：将病毒样品的稀释物接种到Vero细胞上。在5-7天后，就细胞病理效应观察单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
CAV2 效力 ：将病毒样品的稀释物接种到DK细胞上。在7天后，就细胞病理效应观察单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
CPV 效力 ：将病毒样品的稀释物接种到DK细胞上。在3天后，用荧光素缀合的CPV抗血清染色单细胞层，并且通过如上引用的Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
结果
在 25 ℃下的加速稳定性测试 ：对于液体制剂筛选已进行两个研究。第一个研究包括制剂L-001至L-008，并且第二个研究包括制剂L-009至L-026。(关于制剂细节参见表1)。以1mL/小瓶/剂贮存在密封玻璃安瓿小瓶中的液体样品，在25℃或4℃下贮存后的不同时间点进行测试。对于25℃贮存样品，关于CDV、CAV2和CPI的稳定性数据显示于表2中。因为液体CPV被视为四种病毒中最稳定的级分，没有就25℃贮存对CPV进行测试。对于在25℃下温育的研究1样品(L-001至L-008)，将第0天、第6周和第8周数据用于比较不同制剂。对于在25℃下温育的研究2样品(L-009至L-026)，将第0天、第6周和第12周数据用于制剂筛选。已经测试了在两者之间的另外时间点，并且趋势是相似的。基于降解趋势，每种制剂的相对稳定性如表2中所示手工分级，其中五个“+”是最稳定的，并且一个“+”是最不稳定的。每个病毒级分单独地分级，并且随后总体分级考虑了所有3种病毒。基于分级和比较，观察到许多趋势。相应地，在测试的三种糖(蔗糖、山梨糖醇和甘油)中，蔗糖和山梨糖醇的稳定性贡献明显优于甘油。还存在对于更高浓度糖的强烈优选，其中17%-25%组合的糖表现优于具有小于10%的制剂。在来自蛋白质或氨基酸的稳定剂中，0.3M L-精氨酸具有最高稳定性贡献，随后为1%甲硫氨酸、0.8%明胶和1% NZ胺。在其他稳定剂中，右旋糖酐硫酸酯和自由基清除剂(FRS)看起来促成液体CPV、CDV、CAV2和CPI制剂的稳定性，并且尽管它们的存在没有显著改变稳定性概况，但它们对稳定剂也没有负面作用。因此，在某些情况下，优选在最终制剂中包括右旋糖酐硫酸酯和/或FRS，用于液体活猫或犬病毒疫苗在25℃下的长期贮存稳定性。另一方面，发现TWEEN 80和TWEEN 20对于病毒制剂的稳定性是有害的。
在 4 ℃下实时稳定性测试 ：还监控液体活CPV、CDV、CAV2和CPI疫苗在4℃下的长期贮存稳定性，并且数据呈现于表3中。对于L-001至L-008由在第12个月和第18个月时的数据点，并且对于L-009至L-026由在第6个月和第12个月时的数据点外推出在4℃下在24个月时的所研究的病毒滴度(参见下表3)。在期满时关于每种病毒的最低限度剂量滴度要求在下表3的底部列出，并且用于测定何种制剂可以提供在4℃下稳定的产品。存在高度可能产生稳定产品的十种制剂(L-009、L-011、L-012、L-014、L-15、L-016、L-018、L-019、L-025和L-026)，而制剂L-003和L-007具有极大的潜力产生在4℃下具有2年贮存期限的稳定产品。在检查的四种病毒中，CDV看起来是最不稳定的。对于CAV2、CPV和CPI，所有十种制剂看起来能够提供在0-8℃下超过3年的稳定性，并且对于CDV能够提供在0-8℃下至少2年的稳定性。
实施例 2
具有灭活的细菌的活犬病毒的液体疫苗的稳定性
材料与方法
材料：
细胞培养级别蔗糖和山梨糖醇购自Fisher。纯度超过98%的分子级别L-精氨酸盐酸盐、L-甲硫氨酸、L-组氨酸、氯化钠购自Sigma。纯度> 95%的具有平均分子量10,000的右旋糖酐硫酸酯购自Sigma。分子生物学级别乙醇(>99%)、Tween 80、Tween 20、1.0M Tris (pH 8.0)和EDTA (pH 8.0)溶液、庆大霉素(50mg/mL)、两性霉素B (25mg/mL)购自Sigma。20%明胶bloom 250溶液和7.61% NZ胺 AS溶液内部制备。
散装抗原制剂 ：
已制备下述溶液且通过0.2 µm过滤灭菌：80%蔗糖、70%山梨糖醇、1.0M精氨酸(pH 7.2)、5% L-甲硫氨酸、5mM右旋糖酐硫酸酯。
获得散装DA2PPv抗原CDV、CAV2、CPV和CPI，滴度分别为6.7、7.8、8.0和9.2。散装抗原在-80℃下冷冻，并且在临掺和前解冻。
获得散装钩端螺旋体抗原，其具有约2x1010个细菌/毫升的浓度。散装钩端螺旋体抗原于4℃下贮存。
液体疫苗掺和与灌装 ：
制备液体DA2PPv疫苗掺和物(1.0 mL/剂)的操作如下：根据对于多价CDV、CAV2、CPI和CPV (DA2PPv)产物的标准操作，将一个剂量的抗原量掺和到如下表4中所示的不同制剂内，其中对于病毒CDV、CAV2、CPV和CPI分别具有5.5、6.1、6.0和7.0的目标滴度。对于具有四种钩端螺旋体抗原的制剂，每种钩端螺旋体级分的目标浓度为约1x109个细胞/毫升。制备且标记200mL无菌容器，并且随后将每种稳定剂和赋形剂组分，以根据基于如下表4中所示的每种组分的最终浓度计算的量加入容器中。
用双蒸(dd)H2O调整至稳定剂和赋形剂的目标体积。在搅拌板上混合至少10分钟，直至所有组分完全溶解。冷却且保持使稳定剂溶液在4℃，直至抗原准备好。
在37℃水浴中解冻冷冻的DA2PPv抗原，伴随偶尔振荡，直至几乎所有冰都融化。一些抗原具有在溶液中可见的细胞碎片，因此在吸取前充分混合抗原。在使用前，解冻的抗原应在2-8℃保持不超过8小时。将适当量的CDV、CAV2、CPV和CPI加入具有稳定剂溶液的标记容器中。将适当量的散装的4种钩端螺旋体(Lepto)抗原等分到疫苗掺和物中。在搅拌板上混合直至抗原和稳定剂均匀掺和。在该混合步骤期间尽力避免生成气泡和泡沫。在25℃测量pH，并且如果pH不在7.2±0.1内，则用1M HCL或1M NaOH将pH调整至目标pH。将疫苗掺和物维持在2-8℃，直至在同一天分配或等分成小体积且在<-70℃下冷冻用于未来使用。以1 mL/小瓶将疫苗掺和物分配到2 mL玻璃安瓿小瓶内。在灌装后用氩气填充安瓿小瓶，以阻止在贮存期间的氧化，并且随后热密封安瓿。在安瓿上标记样品名称、批号、贮存温度、日期，并且随后转移到盒内，并且如指定的不同温度下贮存。
在加速温度和实时下的稳定性测试 ：
液体DA2PPv或DA2PPv-Lepto 4种样品将贮存于25±1℃温箱。25℃用作用于筛选目的的加速稳定性测试。在指定时间点，从每种制剂取回3个小瓶，并且通过基于细胞培养基于TCID50或FAID50来测量每种抗原的滴度。
分析方法：
CPI 效力 ：
测定在DA2PPv疫苗中的CPI病毒滴度。简言之，将病毒的稀释物接种到犬肾细胞(DK细胞)上。在4-6天后，将单细胞层固定且用荧光素缀合的CPI抗血清染色，并且通过Spearman-Karber方法计算病毒滴度(参见上文实施例1)。
CDV 效力 ：
测定在DA2PPv疫苗中的CDV病毒滴度。简言之，将病毒的稀释物接种到Vero细胞上。在5-7天后，就细胞病理效应观察单细胞层，并且通过Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
CAV2 效力 ：
测定在DA2PPv疫苗中的CAV-2病毒滴度。简言之，将病毒的稀释物接种到DK细胞上。在7天后，就细胞病理效应观察单细胞层，并且通过Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
CPV 效力 ：
测定在DA2PPv疫苗中的CPV病毒滴度。简言之，将病毒的稀释物接种到DK细胞上。在3天后，用荧光素缀合的CPV抗血清染色单细胞层，并且通过Spearman-Karber方法计算病毒滴度。
结果和结论
在 25 ℃下的加速稳定性测试 ：
在制剂表4中列出的疫苗如上文方法中所述进行掺和。除了含有庆大霉素和两性霉素B之外，制剂L-037与先前鉴定的上文L-015制剂相同(参见表1)。制剂L-040、L-043和L-045含有四种活犬病毒级分，即DA2PPv，和四种灭活的钩端螺旋体抗原(Canicola、Grippo、Pomona和Ictero)。液体疫苗样品以1mL/小瓶/剂贮存于密封玻璃安瓿小瓶中。它们在25℃下贮存后的不同时间点进行测试。关于CDV、CAV2和CPI的稳定性数据显示于表5中。因为液体CPV被视为四种活病毒中最稳定的级分，没有就25℃贮存对CPV进行测试。基于表5中所示的稳定性数据，已观察到下述：
1) 作为防腐剂的抗生素没有负面影响制剂L-015中的DA2PPv的病毒稳定性。
2) 四种灭活的钩端螺旋体抗原的存在降低液体制剂中减毒的活CDV和CPI的稳定性。
3) 即使在四种灭活的钩端螺旋体抗原的存在下，2 mM EDTA对L-040制剂的补充也提供了稳定的DA2PPv制剂。
4)在REHYDROPHOS佐剂的存在下，这种液体稳定的制剂还可以用于具有四种灭活的钩端螺旋体抗原的DA2PPv组合中。

Claims (35)

1.一种液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬或猫病毒、10-30% (w/v)糖添加剂，和氨基酸；其中所述液体稳定疫苗具有6.0-8.0的pH；并且其中所述氨基酸选自精氨酸和甲硫氨酸；其中当所述氨基酸为精氨酸时，它在所述液体稳定疫苗中的最终浓度为0.15-0.6 M；并且其中当所述氨基酸为甲硫氨酸时，它在所述液体稳定疫苗中的最终浓度为0.025-0.3 M。
2.权利要求1的液体稳定疫苗，其中所述减毒的活犬病毒选自犬瘟热病毒、犬2型腺病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒。
3.权利要求2的液体稳定疫苗，其中所述犬副流感病毒(CPV)选自CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c和包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组CPV。
4.权利要求1-3的液体稳定疫苗，其进一步包含0.4-1.6% (w/v)明胶。
5.权利要求1-4的液体稳定疫苗，其进一步包含0.5-2.0% (w/v)的完整酪蛋白的蛋白水解的水解物。
6.权利要求1-5的液体稳定疫苗，其进一步包含0.25-1.0% (v/v)乙醇。
7.权利要求1-6的液体稳定疫苗，其进一步包含50-200 µM EDTA。
8.权利要求1-7的液体稳定疫苗，其进一步包含缓冲剂。
9.权利要求8的液体稳定疫苗，其中所述缓冲剂包含2.5-50 mM Tris。
10.权利要求9的液体稳定疫苗，其中所述缓冲剂进一步包含2.5-50 mM组氨酸。
11.权利要求1-10的液体稳定疫苗，其中所述糖添加剂选自蔗糖、山梨糖醇，以及蔗糖和山梨糖醇的组合。
12.权利要求2或4-11的液体稳定疫苗，其中所述减毒活病毒是犬瘟热病毒。
13.权利要求2或4-12的液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬细小病毒(CPV)。
14.权利要求13的液体稳定疫苗，其中所述CPV选自CPV-2、CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c和包含异源CPV-2c/CPV-2基因组的重组CPV。
15.权利要求14的液体稳定疫苗，其中所述CPV是CPV-2b。
16.权利要求14的液体稳定疫苗，其中所述CPV是CPV-2c。
17.权利要求16的液体稳定疫苗，其中所述CPV-2c具有ATCC登录号PTA-13492。
18.权利要求2或4-17的液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬2型腺病毒。
19.权利要求2或4-18的液体稳定疫苗，其包含减毒的活犬副流感病毒。
20.权利要求19的液体稳定疫苗，其中所述犬副流感病毒是编码且表达异源抗原的重组载体。
21.权利要求20的液体稳定疫苗，其中所述异源抗原是家禽病毒抗原。
22.权利要求1-6或8-21的液体稳定疫苗，其进一步包含螯合剂。
23.权利要求22的液体稳定疫苗，其中所述螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、1,2-双(邻氨基苯氧基)乙烷-N,N,N',N'-四乙酸(BAPTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、二巯基琥珀酸(DMSA)、和二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、2,3-二巯基-1-丙磺酸(DMPS)。
24.权利要求23的液体稳定疫苗，其中所述螯合剂为0.5-5mM EDTA。
25.权利要求1-24的液体稳定疫苗，其进一步包含佐剂。
26.权利要求25的液体稳定疫苗，其中所述佐剂选自磷酸铝、氢氧化铝、可以在溶液中形成交联以变成高分子量凝胶的低分子量共聚物佐剂，以及由在水中的丙烯酸钠的凝胶颗粒构成的佐剂。
27.权利要求1-26的液体稳定疫苗，其中所述疫苗进一步包含灭活的病毒。
28.权利要求27的液体稳定疫苗，其中所述灭活的病毒选自犬流感病毒、犬肺病毒、犬冠状病毒，或其任何组合。
29.权利要求1-28的液体稳定疫苗，其中所述疫苗进一步包含灭活的细菌。
30.权利要求29的液体稳定疫苗，其中所述灭活的细菌选自支气管炎博德特菌、支原体属物种、犬埃立克体、无浆体属物种、犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、哈德焦钩端螺旋体、黄疸出血型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体、问号钩端螺旋体、秋令热钩端螺旋体、布拉迪斯拉发钩端螺旋体，或其任何组合。
31.权利要求30的液体稳定疫苗，其中所述灭活的细菌包含犬钩端螺旋体、感冒伤寒型钩端螺旋体、波摩那钩端螺旋体和黄疸出血型钩端螺旋体的组合。
32.权利要求1-31的液体稳定疫苗，其中所述疫苗进一步包含抗生素。
33.一种针对下述中的至少一种对犬科动物进行疫苗接种的方法，其包括给所述犬科动物施用权利要求1-32的液体稳定疫苗：犬瘟热病毒、犬2型腺病毒、犬细小病毒和犬副流感病毒。
34.权利要求33的方法，其中所述施用通过皮下注射进行。
35.一种制备权利要求1-32的液体稳定疫苗的方法，其包括将治疗有效量的减毒的活犬或猫病毒与10-30% (w/v)糖添加剂、氨基酸和pH 6.0-pH 8.0的缓冲溶液组合，以形成液体稳定疫苗；
其中所述氨基酸选自精氨酸和甲硫氨酸；其中当所述氨基酸为精氨酸时，它在所述液体稳定疫苗中的最终浓度为0.15-0.6 M；并且其中当所述氨基酸为甲硫氨酸时，它在所述液体稳定疫苗中的最终浓度为0.025-0.3 M。
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