JP6259457B2 - 液体安定ウイルスワクチン - Google Patents

Description

関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１２年８月２１日付け出願の仮特許出願Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ Ｎｏ．６１／６９１，５０７および２０１３年３月１２日付け出願の６１／７７７，１６４（それらの内容の全体を参照により本明細書に組み入れることとする）の、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。

発明の分野
本発明は、生弱毒化ウイルスを含む液体安定ワクチンに関する。本発明はまた、そのようなワクチンの製造および動物対象にワクチン接種する方法に関する。

イヌおよび／またはネコに感染しうる相当な数のウイルスが存在する。対応するウイルス感染症による症状は、例えば、軽度な風邪のような症状を含みうるが、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）感染症の場合のように、急速に致死的となりうるものもある［例えば、ＵＳ２０１０／０１９６４２０を参照されたい］。実際、ＣＤＶは、眼、呼吸器、胃腸、外皮および神経系を冒しうる多重全身性感染を誘発する。イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）による死亡率も、比較的高い［例えば、ＵＳ２００９／００１０９５５を参照されたい］。ＣＰＶは、主として、イヌ、特に若いイヌに感染する腸内病原体であり、４〜５週齢を超える子イヌおよびイヌにおける急性下痢、発熱および白血球減少症により特徴づけられる。より若い子イヌでさえも心筋疾患に罹患しうる。イヌジステンパーウイルスおよびイヌパルボウイルスは、子イヌ／イヌが防御されるべき２つの最も重要なイヌウイルスである。

追加的なイヌウイルスには、上部呼吸器疾患および感染性気管気管支炎の罹患に関与する、呼吸器疾患を引き起こす非常に伝染性のウイルスであるイヌパラインフルエンザ（ＣＰＩ）ウイルス；感染性肝炎を引き起こすイヌアデノウイルス１型（ＣＡＶ１）；ならびに重篤なタイプの呼吸器疾患を引き起こしうる非常に伝染性であるイヌインフルエンザウイルス（ＣＩＶ）が含まれる。ＣＩＶは、重篤な感染においては８０％の罹患率および５〜８％までの致死率を伴う１００％の感染を引き起こしうると報告されている［Ｃｒａｗｆｏｒｄら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０（５７４７）：４８２−４８５（２００５）；Ｕ．Ｓ．７，９５９，９２９ Ｂ２］。同様に、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）およびネコ鼻気管炎（ＦＶＲ）ウイルスを含む、ネコを冒す幾つかのネコウイルスが存在する。

イヌまたはネコウイルス感染による疾患を予防する最良の方法は、これらのウイルスに対してそれらにワクチン接種することである、と現在広く受け入れられている。実際、イヌジステンパーウイルスワクチンは、対応疾患の罹患率を有意に低減している。同様に、感染性イヌ肝炎は、イヌアデノウイルス２ワクチン（ＣＡＶ２）により非常に抑制されている。ワクチンにおいて生弱毒化ＣＡＶ２を密接に関連したＣＡＶ１の代わりに使用することは、生弱毒化ＣＡＶ１が接種されたイヌにおいて観察される間質性腎炎および角膜混濁に関する懸念を排除する［Ｔａｇｕｃｈｉら，Ｃａｎ Ｖｅｔ Ｊ．５２（９）：９８３−９８６（２０１１）］。

更に、必要なワクチン注射の回数を減らす多価生弱毒化ウイルスワクチンが、安全に投与されうる。したがって、イヌジステンパー、イヌ感染性肝炎、イヌパルボウイルスおよびイヌパラインフルエンザウイルスに対して防御する幾つかの商業的に入手可能な多価生弱毒化ウイルスワクチンが存在する。また、より新たな多価ワクチンは、更にイヌインフルエンザウイルスに対しても防御する。

これまでのところ、弱毒化イヌおよびネコウイルスは、液体溶液中で貯蔵された場合には不安定である。したがって、ほとんどの生弱毒化イヌまたはネコウイルスワクチンは、それらの長期貯蔵の前に凍結乾燥される。生弱毒化イヌまたはネコウイルスは一般には水中の懸濁液として保護剤と混合され、凍結され、ついで凍結乾燥プロセス中に昇華および二次乾燥により脱水される。凍結および昇華による乾燥の低温は、関与する低い表面積対体積比と組み合わされると、長い乾燥期間を要求することがあり、それにより製造時間およびコストを有意に増加させうる。

また、製品負荷の全体にわたって貯蔵温度を調節し得ないこと、乾燥機の全体において一様でない凍結速度、エッジ効果および放射エネルギー効果により、大規模な商業的乾燥プロセスにおいては固有の非一貫性が生じる。乾燥温度は保護タンパク質マトリックスのガラス転移温度より有意に低く保たれる必要があるので、乾燥時間を減少させるために乾燥温度を増加させることは選択肢にならないことが多い。更に、長い一貫しない乾燥時間および／または高い乾燥温度は、しばしば、生弱毒化ウイルスに対する構造的損傷を、それらの生物活性の有意な喪失と共に招く。

したがって、効力における固有の低下を相殺するために、生弱毒化ウイルスを含む凍結乾燥されたイヌおよび／またはネコワクチンは、力価を増加させて貯蔵される。しかし、凍結乾燥プロセスが、予想されるものより低い活性喪失を実際に招くならば、そのような力価の増加は有意な有害事象を招きうる。したがって、有害事象を招く量を安全に下回るだけでなく、凍結乾燥および後続の貯蔵によるウイルス力価低下を考慮して十分な効力を維持もするウイルス力価を含有するワクチンを製剤化するためには、細心の注意が要求される。したがって、ウイルス力価を安全かつ有効なレベルで高い信頼性で保有しうる新規生弱毒化イヌおよび／またはネコウイルスワクチンが必要とされている。

本明細書におけるいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本出願に対する「先行技術」として入手可能であることを自認するものとして解釈されるべきではない。

発明の概括
現在のワクチンの欠点を克服するために、本発明は、新規液体安定生弱毒化ウイルスワクチン、およびそれらの対応免疫原性組成物を提供する。ある実施形態において、生弱毒化ウイルスは、生弱毒化イヌウイルスである。他の実施形態において、生弱毒化ウイルスは、生弱毒化ネコウイルスである。本発明はまた、そのようなワクチンを動物に投与する方法を提供する。本発明は更に、本発明のワクチンを投与することにより動物における疾患を予防する方法を提供する。特定の実施形態において、動物はイヌである。他の実施形態においては、動物はネコである。

したがって、本発明は、生弱毒化ウイルスを含む液体安定ワクチンを提供する。ある実施形態において、生弱毒化ウイルスは組換えウイルスである。このタイプの特定の実施形態において、組換えウイルスは、異種タンパク質をコードする組換えベクターとして使用される。このタイプのより詳細な実施形態においては、異種タンパク質はウイルスまたは細菌抗原である。

特定の実施形態において、ワクチンは糖添加物およびアミノ酸を含む。このタイプの或る実施形態において、ワクチンは１０〜３０％の糖添加物を含む。特定の実施形態において、ワクチンは１２〜２７％の糖添加物を含む。ある実施形態において、ワクチンは１５〜２５％の糖添加物を含む。関連実施形態において、ワクチンは１５〜２０％の糖添加物を含む。他の実施形態において、ワクチンは２０〜２５％の糖添加物を含む。より詳細な実施形態においては、ワクチンは１６〜１８％の糖添加物を含む。より一層詳細な実施形態においては、ワクチンは１７％の糖添加物を含む。

本発明の液体安定ウイルスワクチンの特定の実施形態において、糖添加物はスクロースである。他の実施形態において、糖添加物はソルビトールである。更に他の実施形態においては、糖添加物はマンニトールである。更に他の実施形態においては、糖添加物はトレハロースである。更に他の実施形態においては、糖添加物はデキストロースである。特定の実施形態において、糖添加物は、実際には２以上の糖付加剤の組み合せである。このタイプの特定の実施形態においては、糖添加物は、スクロースとソルビトールとの組み合せである。このタイプのより詳細な実施形態においては、糖添加物は、１５％スクロースと１０％ソルビトールとの組み合せである。

本発明の液体安定ワクチンは、ｐＨ６．０〜８．０のｐＨ範囲でありうる。ある実施形態において、ｐＨ範囲はｐＨ６．５〜ｐＨ７．８である。特定の実施形態において、ｐＨ範囲はｐＨ６．８〜ｐＨ７．５である。より詳細な実施形態においては、ｐＨ範囲はｐＨ７．０〜ｐＨ７．４である。より一層詳細な実施形態においては、ｐＨは７．２である。

本発明の液体安定ワクチンは、バッファーを含みうる。このタイプの特定の実施形態において、バッファーは２．５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（トリス）を含む。関連実施形態において、バッファーは５〜２５ｍＭ Ｔｒｉｓを含む。特定の実施形態において、バッファーは１０〜２０ｍＭのＴｉｒｓを含む。更に他の実施形態においては、バッファーは２．５〜５０ｍＭ ヒスチジンを含みうる。特定の実施形態において、バッファーは２．５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび２．５〜５０ｍＭ ヒスチジンを含む。更に詳細な実施形態においては、バッファーは５〜２５ｍＭ Ｔｒｉｓおよび５〜２５ｍＭ ヒスチジンを含む。更により詳細な実施形態においては、バッファーは１０〜２０ｍＭ Ｔｒｉｓおよび１０〜２０ｍＭ ヒスチジンを含む。他の実施形態において、バッファーは２．５〜５０ｍＭ ホスファートを含む。関連実施形態において、バッファーは５〜２５ｍＭ ホスファートを含む。特定の実施形態においては、バッファーは１０〜２０ｍＭ ホスファートを含む。

本発明の液体安定ワクチンはアミノ酸を含む。ある実施形態において、アミノ酸はアルギニンである。他の実施形態において、アミノ酸はメチオニンである。更に他の実施形態においては、アミノ酸はグリシンである。更に他の実施形態においては、アミノ酸はグルタミン酸である。関連実施形態においては、液体安定ワクチンはアルギニンとメチオニンとの両方を含む。他の実施形態においては、液体安定ワクチンはアルギニンとグリシンとの両方を含む。更に他の実施形態においては、液体安定ワクチンはグリシンとメチオニンとの両方を含む。関連実施形態においては、液体安定ワクチンはグルタミン酸とメチオニンとの両方を含む。他の実施形態においては、液体安定ワクチンはグルタミン酸とグリシンとの両方を含む。更に他の実施形態においては、液体安定ワクチンはグルタミン酸とアルギニンとの両方を含む。関連実施形態では、液体安定ワクチンはアルギニン、グルタミン酸およびメチオニンを含む。他の実施形態においては、液体安定ワクチンはアルギニン、グルタミン酸およびグリシンを含む。更に他の実施形態においては、液体安定ワクチンはアルギニン、グルタミン酸およびメチオニンを含む。更に他の実施形態においては、液体安定ワクチンはアルギニン、グリシンおよびメチオニンを含む。更に他の実施形態においては、液体安定ワクチンはアルギニン、グリシンおよびメチオニンを含む。特定の実施形態においては、液体安定ワクチンはアルギニン、グリシン、メチオニンおよびグルタミン酸を含む。

特定の実施形態において、液体安定ワクチンにおけるアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの最終濃度は、０．１５〜０．６Ｍである。関連実施形態において、液体安定ワクチンにおけるアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの最終濃度は、０．２〜０．５Ｍである。より詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンにおけるアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの最終濃度は、０．２５〜０．３５Ｍである。より一層詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンにおけるアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの最終濃度は、０．３Ｍである。

特定の実施形態において、液体安定ワクチンにおけるアルギニンおよび／またはグルタミン酸および／またはグリシンの最終組み合せ濃度は、０．１５〜０．６Ｍである。関連実施形態において、液体安定ワクチンにおけるアルギニンおよび／またはグルタミン酸および／またはグリシンの最終組み合せ濃度は、０．２〜０．５Ｍである。より詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンにおけるアルギニンおよび／またはグルタミン酸および／またはグリシンの最終組み合せ濃度は、０．２５〜０．３５Ｍである。より一層詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンにおけるアルギニンおよび／またはグルタミン酸および／またはグリシンの最終組み合せ濃度は、０．３Ｍである。

特定の実施形態において、液体安定ワクチンにおけるメチオニンの最終濃度は、０．０２５〜０．３Ｍである。関連実施形態において、液体安定ワクチンにおけるメチオニンの最終濃度は、０．０４〜０．１５Ｍである。より詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンにおけるメチオニンの最終濃度は、０．０６〜０．０９Ｍである。より一層詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンにおけるメチオニンの最終濃度は、０．０７Ｍである。

本発明の液体安定ワクチンは安定化タンパク質をも含みうる。安定化タンパク質は、無傷タンパク質および／またはタンパク質加水分解物でありうる。特定の実施形態において、安定化タンパク質はゼラチンである。より詳細な実施形態においては、本発明の液体安定ワクチンに含有される安定化タンパク質は、０．４〜１．６％ゼラチンである。代替的実施形態においては、安定化タンパク質は全カゼインの加水分解物である。このタイプの特定の実施形態においては、本発明の液体安定ワクチンに含有される安定化タンパク質は、全カゼインの加水分解物０．５〜２．０％である。ある実施形態においては、全カゼインの加水分解物は、全カゼインのタンパク質加水分解物である。

また、本発明の液体安定ワクチンは、アルコールをも更に含みうる。このタイプの特定の実施形態においては、アルコールはエタノールである。より詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンは、０．２５〜１．０％エタノールを含む。関連実施形態においては、本発明の液体安定ワクチンは、デキストラン硫酸をも含みうる。特定の実施形態において、液体安定ワクチンは、１〜２０ｍＭ デキストラン硫酸を含む。より詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンは、２．５〜１０ｍＭ デキストラン硫酸を含む。より一層詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンは、５ｍＭ デキストラン硫酸を含む。

また、本発明の液体安定ワクチンは、キレート化剤をも更に含みうる。そのようなキレート化剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）および２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）が含まれうるが、これらに限定されるものではない。本発明の液体ワクチンにおけるそのようなキレート剤の濃度は、約５０μＭ〜１０ｍＭの様々な値となりうる。

ある実施形態において、キレート剤はＥＤＴＡである。特定の実施形態においては、液体安定ワクチンは、５０μＭ〜１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。このタイプの或る実施形態においては、液体安定ワクチンは、５０〜２００μ ＥＤＴＡを含む。他の実施形態において、液体安定ワクチンは、２５０μＭ〜７．５ｍＭ ＥＤＴＡを含む。更に他の実施形態においては、液体安定ワクチンは、０．５ｍＭ〜５．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。更に他の実施形態においては、液体安定ワクチンは、１．０ｍＭ〜３．０ｍＭ ＥＤＴＡを含む。
より詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンは、約２ｍＭ ＥＤＴＡを含む。

本発明の液体安定ワクチンは、アジュバントを更に含みうる。このタイプの特定の実施形態においては、アジュバントはリン酸アルミニウムである。他のそのような実施形態においては、アジュバントは水酸化アルミニウムである。更に他の実施形態においては、アジュバントは、溶液中で架橋を形成して高分子量ゲルになりうる低分子量共重合体アジュバントである。更に他の実施形態においては、アジュバントは、水中においてアクリル酸ナトリウムのゲル粒子から構成される。更に他の実施形態においては、アジュバントは２以上のそのようなアジュバントの組み合せである。

ある実施形態においては、本発明の液体安定ワクチンは、フリーラジカルスカベンジャーおよび／または抗酸化剤を更に含みうる。関連実施形態においては、本発明の液体安定ワクチンは、液体上に、例えばアルゴン、窒素またはヘリウムのような不活性ガスを含有する密閉容器内に維持されている（例えば、不活性ガスで逆充填されている）。

本発明の液体安定ワクチンは、生弱毒化イヌウイルスを含みうる。特定の実施形態において、生弱毒化イヌウイルスは、イヌジステンパーウイルスである。他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌアデノウイルス２型である。更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）である。このタイプの１つの特定の実施形態においては、イヌパルボウイルスは、イヌパルボウイルス２（ＣＰＶ−２）である。このタイプの更にもう１つの特定の実施形態においては、イヌパルボウイルスは、イヌパルボウイルス２ａ（ＣＰＶ−２ａ）である。このタイプの更にもう１つの特定の実施形態においては、イヌパルボウイルスは、イヌパルボウイルス２ｂ（ＣＰＶ−２ｂ）である。このタイプの更にもう１つの特定の実施形態においては、イヌパルボウイルスは、イヌパルボウイルス２ｃ（ＣＰＶ−２ｃ）である。このタイプの特定の実施形態においては、ＣＰＶ−２ｃは、ＡＴＣＣアセッション番号ＰＴＡ−１３４９２である
。更にもう１つの実施形態においては、イヌパルボウイルスは、異種ＣＰＶ−２ｃ／ＣＰＶ−２ゲノムを含むように構築された組換えイヌパルボウイルスであり、すなわち、カプシドタンパク質をコードする領域は、ＣＰＶ−２ｃ分離体からのものであり、非構造タンパク質をコードする領域は、ＣＰＶ−２分離体からのものである。

更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌパラインフルエンザウイルスである。特定の実施形態においては、イヌパラインフルエンザウイルスは、組換えベクターである。より詳細な実施形態においては、組換えイヌパラインフルエンザウイルスは、異種タンパク質をコードし、発現する。このタイプの或る実施形態においては、異種タンパク質は、非イヌ抗原である。より詳細な実施形態においては、抗原は、家禽ウイルスまたは細菌抗原である。ある実施形態においては、組換えイヌパラインフルエンザウイルスは、組換えパラインフルエンザウイルス５である。

更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌコロナウイルスである。
更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌニューモウイルスである。
更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌ伝染性肝炎ウイルスである。更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌヘルペスウイルスである。更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、狂犬病ウイルスである。更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌ微小ウイルスである。更に他の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスは、イヌインフルエンザウイルスである。代替的実施形態においては、生弱毒化ウイルスは、仮性狂犬病ウイルスである。

本発明の液体安定ワクチンは、生弱毒化ネコウイルスを含みうる。ある実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコヘルペスウイルス（ＦＨＶ）である。他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコカリシウイルス（ＦＣＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコニューモウイルス（ＦＰＮ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス（ＦＩＰＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ウイルスは、ネコボルナ病ウイルス（ＢＤＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコインフルエンザウイルスである。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコ汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネココロナウイルス（ＦＣｏＶ）である。更に他の実施形態においては、生弱毒化ネコウイルスは、ネコ鼻気管炎ウイルス（ＦＶＲ）である。

また、本発明は、多価ワクチンである液体安定ワクチンを提供する。特定の実施形態においては、本発明の多価ワクチンは、生弱毒化ウイルスワクチンのみを含む。そのような多価ワクチンは、生弱毒化ウイルスの、任意の組み合せを含有しうる。このタイプの特定の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルスおよび生弱毒化イヌパルボウイルスを含む。関連実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルスおよび生弱毒化イヌアデノウイルス２型を含む。他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルスおよび生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスを含む。更に他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌパルボウイルスおよび生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスを含む。更に他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌパルボウイルスおよび生弱毒化イヌアデノウイルス２型を含む。

更に他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスおよび生弱毒化イヌアデノウイルス２型を含む。更に他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌパルボウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスおよび生弱毒化イヌアデノウイルス２型を含む。特定の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌパルボウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルス、生弱毒化イヌアデノウイルス２型および生弱毒化イヌコロナウイルスを含む。関連実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌパルボウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルス、生弱毒化イヌアデノウイルス２型および生弱毒化ネココロナウイルスを含む。このタイプの特定の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌアデノウイルス２型、生弱毒化イヌパルボウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスおよび生弱毒化イヌインフルエンザウイルスを含む。

他の実施形態においては、本発明は、生弱毒化イヌアデノウイルス２型および生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスを含む多価ワクチンである液体安定ワクチンを提供する。更に他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌアデノウイルス２型および生弱毒化イヌパルボウイルスを含む。更に他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌパルボウイルスおよび生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスを含む。更に他の実施形態においては、多価ワクチンは、生弱毒化イヌアデノウイルス２型、生弱毒化イヌパルボウイルスおよび生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスを含む。このタイプの特定の実施形態では、多価ワクチンは、生弱毒化イヌアデノウイルス２型、生弱毒化イヌパルボウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスおよび生弱毒化イヌインフルエンザウイルスを含む。

あるいは、本発明の液体安定ワクチンは、不活化（死滅）ウイルスおよび／または不活化細菌（例えば、バクテリン）および／またはバクテリンの亜画分を更に含みうる。したがって、１以上の生弱毒化ウイルスワクチンを含む本発明の液体安定ワクチンのいずれかは、不活化ウイルスおよび／または不活化細菌および／またはバクテリンの亜画分を更に含みうる。特定の実施形態においては、不活化ウイルスは、イヌインフルエンザウイルスである。他の実施形態においては、不活化ウイルスは、イヌニューモウイルスである。更に他の実施形態においては、不活化ウイルスは、イヌコロナウイルスである。更に他の実施形態においては、本発明の液体安定ワクチンは、これらの不活化イヌウイルスの２以上を含みうる。

ある実施形態においては、不活化細菌は、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）である。更に他の実施形態においては、不活化細菌は、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属種である。更に他の実施形態においては、不活化細菌は、エールリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）である。更に他の実施形態においては、不活化細菌は、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属種である。更に他の実施形態においては、不活化細菌は、レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）である。１つのそのような実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）である。もう１つの実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・グリッポチホサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）である。更にもう１つの実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・ハージョ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ）である。更にもう１つの実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）である。更にもう１つの実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｐｏｍｏｎａ）である。更にもう１つの実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）である。
更にもう１つの実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・アウトムナリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｍｎａｌｉｓ）である。更にもう１つの実施形態においては、レプトスピラは、レプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）である。更に他の実施形態においては、本発明の液体安定ワクチンは、これらの不活化細菌の２以上を含みうる。特定の実施形態においては、液体安定ワクチンは、レプトスピラ・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラはレプトスピラ・グリッポチホサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｐｏｍｏｎａ）およびレプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）を含む。

本発明は更に、本発明のワクチンを動物に投与することを含む、イヌまたはネコウイルス感染から生じる臨床疾患に対するネコまたはイヌの防御を補助する方法を提供する。ある実施形態においては、投与を経粘膜的に行う。他の実施形態においては、投与を非経口的に行う。更に他の実施形態においては、投与を皮内に行う。更に他の実施形態においては、投与を経皮的に行う。より詳細な実施形態においては、本発明のワクチンを動物の皮下に投与する。他の特定の実施形態においては、本発明のワクチンを動物に筋肉内に投与する。本発明は、初回（一次）および／または追加ワクチンの使用をも含む。

特定の実施形態においては、動物対象はイヌであり、該方法は、生弱毒化ウイルスを含む本発明の液体安定ワクチンをイヌに投与することを含む。特定の実施形態においては、液体安定ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌアデノウイルス２型、生弱毒化イヌパルボウイルスおよび生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスを含む。このタイプの或る実施形態においては、液体安定ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌアデノウイルス２型、生弱毒化イヌパルボウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスおよび生弱毒化イヌインフルエンザウイルスを含む。
このタイプの他の実施形態においては、液体安定ワクチンは、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌアデノウイルス２型、生弱毒化イヌパルボウイルス、生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスおよび不活化弱毒化イヌインフルエンザウイルスを含む。

本発明の液体安定ワクチンの任意の及びあらゆる製造方法も提供する。ある実施形態においては、該方法は、生弱毒化ウイルスの治療的有効量を、１０〜３０％糖添加物、アミノ酸およびｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の緩衝液（バッファー）と組み合わせて液体安定ワクチンを得ることを含む。アミノ酸は、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、メチオニン、或いは、アルギニン、グリシン、グルタミン酸および／またはメチオニンの組み合せでありうる。特定の実施形態においては、アルギニンおよび／またはグリシンおよび／またはグルタミン酸は、液体安定ワクチンにおいて０．１５〜０．６Ｍの最終濃度を有する。
ある実施形態において、メチオニンは、液体安定ワクチンにおいて０．０２５〜０．３Ｍの最終濃度を有する。特定の実施形態においては、生弱毒化ウイルスの治療的有効量は、生弱毒化イヌウイルスの治療的有効量である。このタイプの特定の実施形態においては、生弱毒化イヌウイルスの治療的有効量は、生弱毒化イヌジステンパーウイルス、生弱毒化イヌアデノウイルス２型、生弱毒化イヌパルボウイルスおよび生弱毒化イヌパラインフルエンザウイルスの治療的有効量を含む。

本発明のこれらの及び他の態様は、以下の詳細な説明を参照することにより、より良く理解されるであろう。

発明の詳細な説明
不活化（死滅）ウイルスワクチンとは対照的に、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、弱毒化されている。従来であれば、そのような弱毒化生ウイルスワクチンを製剤化する場合、有意な有害事象を招きうるレベルを安全に下回るレベルに弱毒化ウイルスの力価を維持するために、格別の注意が必要であろう。実際、ほとんどの生弱毒化イヌまたはネコウイルスワクチンは凍結乾燥され、凍結乾燥プロセス自体と長期貯蔵中の経時的影響との両方により、凍結乾燥は弱毒化生ウイルスワクチンの効力における相当な低下を招きうる。

本発明は、信頼可能に安全なレベルより高いレベルに生弱毒化ウイルス抗原の初期力価を増加させる必要性を伴うことなく、貯蔵中でさえも依然として有効である液体安定ワクチンを提供することにより、この問題を克服した。追加的な利点として、本発明は、そのような安全かつ有効なワクチンを製造するのに必要な生弱毒化ウイルスの量を有意に減少させることによりもたらされる、ワクチンの製造のコストを低下させるための手段を提供する。また、本発明の生弱毒化ウイルスワクチンは、それらの凍結乾燥対応物よりより簡便に使用される。したがって、本発明は、冷凍温度で液体として貯蔵され、１２〜１８カ月間または更にはそれより長期にわたって尚も安定なままでありうる安全かつ有効な生弱毒化ウイルスワクチンを提供する。

更に、驚くべきことに、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、任意のタイプのイヌおよび／またはネコウイルスを含みうる。したがって、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両方を含みうる。また、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、一本鎖ＲＮＡゲノム、一本鎖ＤＮＡゲノムまたは二本鎖ＤＮＡゲノムを有する生弱毒化ウイルスを含みうる。

また、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、他の組換えイヌまたはネコベクターをも含むことが可能であり、ベクターは、単独で、および／または他のそのような組換えベクターと共に、および／または生弱毒化イヌもしくはネコウイルスと共に、および／または不活化細菌および／または不活化イヌもしくはネコウイルスと組み合わされて存在す
る。そのような組換えイヌまたはネコベクターは更に、１以上の異種ウイルスまたは細菌抗原をコードしうる。そのような組換えベクターの特定の一例として、組換えイヌパラインフルエンザウイルス５が挙げられ、これは、最近、Ｌｉら［Ｊ．ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８７（１０）５９８５−５９９３（２０１３）；その全体を参照により本明細書に組み入れることとする］により記載された。

本発明の液体安定生ウイルスワクチンの組換えベクター、例えば組換えパラインフルエンザウイルス５は、イヌウイルスおよび／またはネコウイルスおよび／またはヒトウイルスおよび／またはシミアンウイルスおよび／またはウシウイルスおよび／またはヒツジウイルスおよび／またはブタウイルスおよび／または家禽ウイルス（例えば、ニワトリウイルス）からの異種抗原をコードしうる。特定の実施形態においては、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、１以上のニワトリウイルスからの１以上の抗原をコードする組換えパラインフルエンザウイルス５を含む。

驚くべきことに、キレート化剤（例えば、２ｍＭ ＥＤＴＡ）および／またはアジュバント（例えば、リン酸アルミニウム）の存在下では、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、製剤中に不活化細菌が含まれている場合でさえも、それらの安定性を保有する（後記実施例２を参照されたい）。したがって、本発明の液体安定生ウイルスワクチンは、１以上の不活化イヌもしくはネコウイルスおよび／または細菌（例えば、バクテリン）および／またはバクテリンの亜画分を更に含みうる。

本明細書においては簡便のために単数形の用語が用いられているが、これは何らそのように限定的であるとは意図されない。したがって、例えば、「糖添加物」に対する言及は、特に示されていない限りそのような糖添加物の１以上に対する言及を含む。複数形の用語の使用も、特に示されていない限り、限定的であるとは意図されない。同様に、酸またはその対応塩基と称されうる化合物は、特に示されていない限り、本明細書においてそのいずれかとして示されている場合、化合物のいずれもの形態を意味することが意図される。したがって、グルタミン酸なる語の使用はグルタメートを含むことが意図され、その逆も言える。

本明細書中で用いる「ワクチン」は、動物（ある実施形態においては、ヒトを含む）への適用に適した組成物であり、動物への投与により、野生型微生物による感染から生じる臨床疾患からの防御を少なくとも補助するのに十分な程度に強力な、すなわち、臨床疾患の防御および／または臨床疾患の予防、改善もしくは治癒を補助するのに十分な程度に強力な免疫応答を誘導する。特に明示されていない限り、ワクチンなる語の使用は多価ワクチンを含む。

本明細書中で用いる「多価ワクチン」は、２以上の異なる抗原を含むワクチンである。
このタイプの特定の実施形態においては、多価ワクチンは、２以上の異なる病原体に対して被投与者の免疫系を刺激する。

本明細書中で用いる「液体安定」ワクチンは、７℃以下で（例えば、標準的な冷凍庫において、および／または０℃〜７℃で）貯蔵された場合に少なくとも１年間にわたって有効なままの、液体として維持されるワクチン（液体多価ワクチンを含む）である。特
定の実施形態においては、液体安定ワクチンは、７℃以下で貯蔵された場合に少なくとも１．５年間にわたって有効なままである。より詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンは、７℃以下で貯蔵された場合に少なくとも２年間にわたって有効なままである。更により詳細な実施形態においては、液体安定ワクチンは、７℃以下で貯蔵された場合に少なくとも２．５〜３年間にわたって有効なままである。

本明細書中で用いる「防御する」、「防御」、「防御をもたらす」、「防御をもたらし」および「防御を補助する」なる語は、感染の任意の徴候からの完全な防御を要しない。
例えば、「防御を補助する」は、チャレンジ後、根本的な感染の症状が少なくとも低減するように、ならびに／または症状を引き起こす細胞的、生理的もしくは生化学的な根本原因もしくはメカニズムの１以上が低減および／もしくは排除されるように、防御が十分であることを意味しうる。この文脈で用いられる「低減」は、感染の生理的状態だけではなく、感染の分子状態を含む、感染の状態に関連したもの意味すると理解される。

本明細書中で用いる「治療的有効量」なる語は、与えられた抗原、例えば、生弱毒化ウイルスの量であって、単一投与で与えられた場合、および／または所望により、初回投与およびそれに伴う１以上の後続の追加投与（ブースター）として与えられた場合、抗原を投与して防御する病原体に対する防御をもたらすのにおよび／または病原体からの防御を補助するのに十分な量である。

本明細書中で用いる「有効」なワクチンは、与えられた抗原の治療的有効量を含む。

本明細書中で用いる「医薬上許容される」なる語は、修飾される名詞が医薬品における使用に適していることを意味するものとして形容詞的に用いられる。それが、例えば医薬ワクチンにおける賦形剤を示すために用いられる場合、それは、組成物のその他の成分に適合しており、意図される被投与者に有害でないものとして賦形剤を特徴づける。

「担体」なる語は、化合物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。医薬上許容される担体は、無菌液、例えば、水、および／または油、例えば石油、動物、植物または合成由来の油、例えば、ラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などでありうる。水または水溶液 塩類溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液は、担体として、特に注射用溶液のために使用されうる。

本明細書中で用いる「アジュバント」は、免疫学的事象のカスケードを促進または増幅して、最終的により良好な免疫応答、すなわち、抗原に対する統合された身体応答を招きうる物質である。アジュバントは、一般に、免疫応答の発生に要求されないが、この応答を促進または増幅する。

本明細書中で用いる「全身投与」は、胃腸管（例えば、経口または直腸投与によるもの）および呼吸系（例えば、鼻腔内投与によるもの）のような特定の部位ではなく、身体全体に影響を及ぼす（心血管およびリンパ系を含む）身体の循環系内への投与である。全身投与は、例えば、筋肉組織内（筋肉内）、皮膚内（皮内、経皮または皮膚上）、皮膚の下（皮下）、粘膜の下（粘膜下）、静脈（静脈内）などに投与することにより行われうる。

「非経口投与」には、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および注入を含む。

本明細書中で用いる「イヌ」なる語は、特に示されていない限り、全ての飼育イヌ、カニス・ルプス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）またはカニス・ファミリアリス（Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）を含む。

イヌパルボウイルス「ＣＰＶ」は１９７８年に最初に分離され、それをイヌパルボウイルス微小ウイルス（ＣＭＶまたはＣＰＶ−１）から区別するためにＣＰＶ−２と命名された。ＣＰＶ−２の最初の分離の約１年後、遺伝的変異体ＣＰＶ−２ａが特定された。１９８０年代半ばに、第２の遺伝的変異体であるＣＰＶ−２ｂが特定された。まもなく、ＣＰＶ−２ａおよびＣＰＶ−２ｂがＣＰＶ−２に取って代わった。現在、ＣＰＶ−２ａは、米国ではもはや検出されない［ＰａｒｒｉｓｈおよびＫａｗａｏｋａ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：５５３−５８６（２００５）］。この科における第４のＣＰＶ変異体であるＣＰＶ−２ｃが、２０００年に最初に記載された［Ｕ．Ｓ．８，２２７，５９３；Ｕ．Ｓ．８，２５８，２７４；Ｈｏｎｇら，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．（５）：５３５−９（２００７）を参照されたい］。２０１３年１２月１９日付け出願の米国仮特許出願６１／７３９，０６７（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）は、特定の弱毒化ＣＰＶ−２ｃ分離体（ＡＴＣＣアセッション番号
ＰＴＡ １３４９２）を記載しており、これは後に、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の要件を満たす条件下、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．２０１１０−２２０９，Ｕ．Ｓ．Ａ．）に２０１３年１月２４日付けで寄託された。また、異種ＣＰＶ−２ｃ／ＣＰＶ−２ゲノム（すなわち、カプシドタンパク質をコードする領域はＣＰＶ−２ｃ分離体に由来し、非構造タンパク質をコードする領域はＣＰＶ−２分離体に由来する）を含む組換えイヌパルボウイルスが構築されている［ＷＯ２０１１１０７５３４（Ａ１）；ＵＳ ２０１２０３２８６５２；ＷＯ２０１２００７５８９（Ａ１）（その全内容を参照により本明細書に組み入れることとする）］。本明細書中で用いる、「イヌパルボウイルス」を含む本発明のワクチンは、異種ＣＰＶ−２ｃ／ＣＰＶ−２ゲノムを含む最近構築された組換えイヌパルボウイルスを包含する、これらのＣＰＶ型／変異体／分離体の１以上を含みうる。

本明細書中で用いる「ネコ」なる語は、ネコ科の任意のメンバーを意味する。この科のメンバーには、野生、動物園および飼育ネコ科動物、例えば、ネコ亜科の任意のメンバー、例えば、ネコ、ライオン、トラ、ピューマ、ジャガー、ヒョウ、ユキヒョウ、パンサー、北米山岳ライオン、チーター、オオヤマネコ、ボブキャット、カラカルまたはそれらの任意の交雑種を含む。ネコはまた、飼育ネコ、純粋繁殖および／または雑種伴侶ネコ、見世物用のネコ、実験室用のネコ、クローン化ネコおよび野生または野良ネコを含む。

本明細書中で用いる「糖添加物」は、５−１２炭素の糖（例えば、スクロース、マルトース、トレハロース、デキストロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、ガラクトース）または糖アルコール／ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトール、アラビトール、イノシトール、マルチトール）である。特に示されていない限り、糖添加物の比率（％）は、ワクチンの体積（ｖ）に対する糖添加物の重量（ｗ）、すなわち、ワクチンにおける（ｗ／ｖ）として示される。

特に示されていない限り、本明細書中で用いるワクチンにおける固体添加物、例えば糖添加物またはゼラチンの比率（％）は、１００ｍｌのワクチン体積当たりの１ｇの固体である１％（ｗ／ｖ）溶液に基づく。

特に示されていない限り、本明細書中で用いるワクチンにおける液体添加物、例えばエタノールの比率（％）は、１００ｍｌのワクチン体積当たりの１ｍｌの液体添加物である１％（ｖ／ｖ）溶液に基づく。

特に示されていない限り、本明細書中で用いる、示されているｐＨ値は、２５℃で決定／測定されたｐＨ値である。

本明細書中で用いる「およそ」なる語は、「約」なる語と互換的に用いられ、値が、示されている値の２５％以内であることを示す。すなわち、「約」２ｍＭ ＥＤＴＡの濃度は１．５ｍＭ〜２．５ｍＭ ＥＤＴＡでありうる。

本発明の液体安定ワクチンにおいて使用されうる全カゼインの加水分解物は、幾つかの方法により得られうる（例えば、酸加水分解物または酵素加水分解物を含む）。そのような加水分解物は、元々はカゼインに存在する全てのアミノ酸を、混合アミノ酸およびペプチドの形態で含有する。本発明の液体安定ワクチンにおいて使用されうる全カゼインの１つの膵加水分解物は、ＭＰ ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓによりＣＡＳＥＩＮ ＨＹＤＲＯＬＹＳＡＴＥ ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ（登録商標）として販売されている。比較されうる製品は、ＮＺ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＮＺ ＡＭＩＮＥ（登録商標）Ａ、ＮＺ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＡＳおよびＮＺ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＢおよびＴｒｙｐｔｏｎｅの名称でＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより販売されている。

本発明の液体安定ワクチンは理想的にはｐＨ６．０〜ｐＨ８．０のｐＨ範囲であるため、本発明の液体安定ワクチンは、バッファーを含みうる。本発明の液体安定ワクチンにおいて使用されるバッファーには、Ｔｒｉｓ（トリス）、Ｔｒｉｓ−ヒスチジン、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ−プロパン、リン酸カリウムおよび／またはナトリウム、ピロリン酸ナトリウムまたはカリウム、イミダゾール、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、トリシン、グリシルグリシンおよびＨＥＰＥＳが含まれるが、これらに限定されるものではない。バッファーは、いずれかの適当な対イオンの使用により、所望のｐＨに調整されうる。

本発明のワクチンはアジュバントを含有することが可能であり、またはアジュバントを含有しないことが可能であり、これは、しばしば、ワクチンが含有する抗原に左右される。本発明のワクチンにおいて使用されるアジュバントの例には、リン酸アルミニウム、例えばＲＥＨＹＤＲＯＰＨＯＳ（登録商標）（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）および／または水酸化アルミニウム、例えばＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）、ＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）ＨＰＡまたはＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）ＬＶ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）、および／または溶液中で架橋を形成して高分子量ゲルになりうる低分子量共重合体アジュバント、例えばＰＯＬＹＧＥＮ（商標）（ＭＶＰ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｍａｈａ）、および／または水中でアクリル酸ナトリウムのゲル粒子から構成されるアジュバント、例えばＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＰＥＴ ＧＥＬ Ａ（商標）（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ Ｆｒａｎｃｅ）が含まれる。添加される場合、アジュバントの量は、通常、ワクチンにおいて約１％〜２０％（ｖ／ｖ）である。
特定の実施形態においては、アジュバントの量は約２％〜１０％（ｖ／ｖ）である。後記実施例２においては、アジュバントは約５％（ｖ／ｖ）である。

本発明のワクチンは、キレート化剤をも含有しうる。適当なキレート化剤の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ν，Ν，Ν’，Ν’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）およびジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）が含まれる。

多価ワクチン：本発明は液体安定多価ワクチンを提供する。例えば、本発明の液体安定多価イヌワクチンは、以下のものの２以上を含みうる：イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルス、イヌインフルエンザウイルス、イヌニューモウイルス、イヌコロナウイルス、イヌヘルペスウイルス、伝染性イヌ肝炎ウイルス、イヌ微小ウイルス、狂犬病ウイルスおよび仮性狂犬病ウイルス。そのような液体安定ワクチンはまた、例えばイヌインフルエンザウイルス、イヌコロナウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属種、エールリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属種、レプトスピラ・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリッポチホサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・ハージョ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・アウトムナリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｍｎａｌｉｓ）およびレプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）のような１以上の弱毒化または不活化抗原と組み合わされることが可能であり、（あるいは投与前）貯蔵されうる。

また、本発明の液体安定多価ネコワクチンは、以下のネコ病原体の２以上を含みうる：ネコヘルペスウイルス、ネコカリシウイルス、ネコニューモウイルス、ネコパルボウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ伝染性腹膜炎ウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、ボルナ病ウイルス、ネコインフルエンザウイルスおよびトリインフルエンザ。ついで、そのような液体安定ワクチンは、弱毒化または不活化クラミドフィラ・フェリス（Ｃｈｌａｍｙｄｏｐｈｉｌａ ｆｅｌｉｓ）および／またはバルトネラ属種（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．）（例えば、バルトネラ・ヘンゼレ（Ｂ．ｈｅｎｓｅｌａｅ））と組み合わされ、そして（あるいは投与前に）貯蔵されることが可能である。

本発明のワクチンは、抗細菌物質、例えば抗生物質をも含有しうる。そのような抗生物質の例には、１０−１００μｇ／ｍｌゲンタマイシン、０．５−５．０μｇ／ｍｌアムホテリシンＢ、１０−１００μｇ／ｍｌテトラサイクリン、１０−１００単位／ｍＬナイスタチン（ミコスタチン）、１０−１００単位／ｍＬペニシリン、１０−１００μｇストレプトマイシン、１０−１００μポリミキシンＢおよび１０−１００μｇネオマイシンが含まれうる。

ワクチン投与：本発明の液体安定ウイルスワクチンは、任意の通常の手段により、例えば非経口投与、例えば皮下または筋肉内投与（これらに限定されるものではない）を含む全身投与により投与されうる。本発明の液体安定ウイルスワクチンは、粘膜投与により、例えば鼻腔内、経口、気管内、直腸内および／または眼投与により投与されうる。あるいは、ワクチンは、皮膚パッチ、乱切または局所投与により投与されうる。本発明の液体安定ウイルスワクチンは、被投与動物対象の飲料水および／または食事によっても投与されうると想定される。更に、そのようなワクチンは、馳走または玩具の形態で投与されうると想定される。

本発明のワクチン（多価ワクチンを含む）は、組み合せ療法、すなわち、ワクチン自体に加えて１以上の追加的な活性な物質、療法などを投与することを含む療法の一部として投与されうる。その場合、「治療的有効」量を構成するワクチンの量は、ワクチンを単独で投与しようとする場合の「治療的有効」量を構成するワクチンの量より多い又は少ないことが可能であると認識されるべきである。他の療法には、当技術分野で公知のもの、例えば、鎮痛剤、解熱薬、去痰剤、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬および／または流体の投与が含まれうる。

免疫原性レベルは、当技術分野で一般に公知のチャレンジ用量力価測定研究技術により実験的に決定されうる。そのような技術は、典型的には、種々の投与量のワクチンを幾つかの動物対象にワクチン接種し、ついで動物対象をビルレントウイルスでチャレンジして最小防御用量を決定することを含む。

好ましい投与レジメに影響を及ぼす要因には、例えば、対象の種または雑種（例えば、イヌまたはネコのもの）、年齢、体重、性別、食事、活動性、肺サイズおよび状態；投与経路；使用される個々のワクチンの効力、安全性および免疫持続プロファイル；運搬系が用いられるかどうか；ならびにワクチンが薬物および／またはワクチンの組み合せの一部として投与されるかどうか、が含まれうる。したがって、実際に使用される投与量は具体的な動物に関して変動することがあり、したがって、前記の典型的な投与量から逸脱しうる。そのような投与量調節の決定は、一般に、通常の手段を用いるワクチン開発の分野の当業者の技量の範囲内である。

同様に、そのような用量が投与されうる体積は、典型的には、０．１ｍＬ（皮内または経皮適用で典型的である）および５．０ｍＬである。投与体積に関する典型的な範囲は、０．２〜２．０ｍＬ、および約１．０〜２．０ｍＬ（筋肉内または皮下投与の場合）である。

ワクチンは、単一時点で、あるいは数日間、数週間、数か月間または数年間にわたる２以上の時点で、ワクチンの被投与者に投与されうることが意図される。幾つかの実施形態においては、ワクチンは少なくとも２回投与される。そのようなある実施形態においては、例えば、ワクチンは２回投与され、第１用量の投与の少なくとも２週間後に第２用量（例えば、ブースター）が投与される。特定の実施形態においては、ワクチンは２回投与され、第１用量の投与の８週間以内に第２用量（例えば、ブースター）が投与される。他の実施形態においては、第２用量は第１用量の投与の１週間後〜２年後、第１用量の投与の１．５週間後〜８週間後、または第１用量の投与の２〜４週間後に投与される。他の実施形態においては、第２用量は第１用量の投与の約３週間後に投与される。

前記実施形態においては、第１および後続投与は、例えば量および／または形態において様々でありうる。しかし、しばしば、それらの投与は量および形態において同一である。単一用量のみが投与される場合、その用量のみにおけるワクチンの量は、一般に、ワクチンの治療的有効量を含む。しかし、２以上の用量が投与される場合、それらの用量におけるワクチンの総量が治療的有効量を構成しうる。また、ワクチンは初回投与され、ついで２〜１２週間後にブースター投与されうる。しかし、ワクチンの後続投与は、ブースターが投与されるか否かに無関係に、毎年（１年）または隔年（２年）で行われうる。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、より良く理解され、それらの実施例は本発明の典型例として記載されている。以下の実施例は、本発明の実施形態をより完全に例示するために記載されている。しかし、それらは、いかなる点においても、本発明の広範な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

実施例
実施例１
液体イヌウイルスワクチンの安定性
材料および方法
材料：細胞培養等級のスクロースおよびソルビトールを、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入する。分子等級のＬ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ヒスチジン、および９８％を超える純度を有する塩化ナトリウムを、Ｓｉｇｍａから購入する。９５％を超える純度で平均分子量１０，０００を有する硫酸デキストランをＳｉｇｍａから購入する。分子生物学等級のエタノール（＞９９％）、ＴＷＥＥＮ ８０、ＴＷＥＥＮ ２０、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）およびＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液をＳｉｇｍａから購入する。２０％ゼラチンブルーム２５０溶液および７．６１％ ＮＺ Ａｍｉｎｅ溶液を、最も良く入手可能な市販試薬から調製した。

バルク抗原の製造：以下の溶液は、調製され、０．２μｍ濾過により滅菌されている：８０％スクロース、７０％ソルビトール、１．０Ｍ Ｌ−アルギニン（ｐＨ７．２）、５％Ｌ−メチオニン、５ｍＭ硫酸デキストラン。６．５〜９．５の力価を有するバルク抗原ＣＤＶ、ＣＡＶ２、ＣＰＶおよびＣＰＩを−８０℃で凍結し、混合の直前に解凍した。

液体ワクチン混合および充填：液体ワクチンＣＤＶ、ＣＡＶ２、ＣＰＶおよびＣＰＩ混合物（１．０ｍＬ／用量）の製造方法は以下のとおりである。１用量の抗原を、ウイルス抗原に関する５．０〜７．５（Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０）の目標力価で、以下の表１に示されている種々の製剤中に混合する。２００ｍＬの滅菌容器を調製し、標識し、ついで各安定剤および賦形剤成分を、以下の表１に示されている各成分の最終濃度に基づく計算用量に従い容器に加える。安定剤および賦形剤について二重蒸留水（ｄｄＨ２Ｏ）で目標体積に調節する。全ての成分が完全に溶解するまで、撹拌プレート上で少なくとも１０分間混合する。安定剤溶液を冷却し、抗原の準備が整うまで４℃に維持する。

凍結抗原を、ほぼ全ての氷が融解するまで、時々振とうしながら３７℃の水浴中で解凍する。抗原の幾つかは溶液中に視認可能な細胞残渣を有し、したがって、ピペッティング前に抗原を十分に混合する。解凍抗原は、使用前に８時間以下の時間にわたって２〜８℃で維持すべきである。適当な量のＣＤＶ、ＣＡＶ２、ＣＰＶおよびＣＰＩを、安定剤溶液と共に標識容器に加える。抗原および安定剤が均一に混合されるまで、撹拌プレート上で混合する。この混合工程中、気泡および泡の発生を避けることを試みる。ｐＨを２５℃で測定し、ｐＨが７．２±０．１以内でなければ、ｐＨを１Ｍ ＨＣＬまたは１Ｍ ＮａＯＨで目標ｐＨに調節する。同じ日に分注するまでワクチン混合物を２〜８℃に維持し、または小さな体積中にアリコート化し、更なる使用まで−７０℃未満で凍結する。ワクチン混合物を、２ｍＬガラスアンプルバイアル中に１ｍＬ／バイアルで分注する。充填後、貯蔵中の酸化の防止を助けるために、アルゴンガスをアンプルバイアルに加え、ついでアンプルを加熱密封する。アンプルにサンプル名、ロット番号、貯蔵温度、日付の標識を付け、ついで箱内に移し、示されている種々の温度で貯蔵する。

加速温度およびリアルタイムにおける安定性試験：液体サンプルをそれぞれ２５±１℃および４℃±１℃で対応インキュベーター内に貯蔵した。スクリーニング目的の加速安定性試験には２５℃を用い、一方、４℃で貯蔵されたサンプルはリアルタイム安定性サンプルであった。示されている時点で、各製剤からの３個のバイアルを回収し、各抗原の力価を細胞培養に基づく力価測定アッセイにより測定し、平均組織培養感染用量（ＴＣＩＤ_５０）として、および／または５０％蛍光抗体感染用量（ＦＡＩＤ_５０）として表した。

分析方法
ＣＰＩ効力：ウイルスサンプルの希釈物を、イヌ腎臓（ＤＫ）細胞上に接種する。４〜６日後、単層を固定し、フルオレセイン共役ＣＰＩ抗血清で染色し、スピアマン−カーバー（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）法［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｃ．Ｈ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｕｒｇｅｓｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ．（１９７３）；Ｋａｐｌａｎ，Ｍ．Ｍ．およびＫｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｈ．，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｒａｂｉｅｓ，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９７３）］によりウイルス力価を計算する。

ＣＤＶ効力：ウイルスサンプルの希釈物を、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞上に接種した。５〜７日後、細胞変性効果に関して単層を観察し、前記のスピアマン−カーバー法によりウイルス力価を計算する。

ＣＡＶ２効力：ウイルスサンプルの希釈物を、ＤＫ細胞上に接種した。７日後、細胞変性効果に関して単層を観察し、前記のスピアマン−カーバー法によりウイルス力価を計算する。

ＣＰＶ効力：ウイルスサンプルの希釈物を、ＤＫ細胞上に接種した。３日後、フルオレセイン共役ＣＰＶ抗血清で単層を染色し、前記のスピアマン−カーバー法によりウイルス力価を計算する。

結果
２５℃での加速安定性試験：液体製剤スクリーニングのために２つの研究を行った。第１の研究は製剤Ｌ−００１〜Ｌ−００８を含み、第２の研究は製剤Ｌ−００９〜Ｌ−０２６を含む（製剤の詳細は、表１を参照されたい）。密封ガラスアンプル内で１ｍＬ／バイアル／用量で貯蔵された液体サンプルを、２５℃または４℃での貯蔵の後の種々の時点で試験する。２５℃の貯蔵サンプルに関して、ＣＤＶ、ＣＡＶ２およびＣＰＩの安定性データを表２に示す。液体ＣＰＶはそれらの４つのウイルスのなかで最も安定な画分とみなされるので、ＣＰＶは、２５℃の貯蔵に関しては試験しなかった。２５℃でインキュベートされた研究１のサンプル（Ｌ−００１〜Ｌ−００８）に関しては、第０日、第６週および第８週のデータを、種々の製剤を比較するために使用する。２５℃でインキュベートされた研究２のサンプル（Ｌ−００９〜Ｌ−０２６）に関しては、第０日、第６週および第１２週のサンプルを製剤スクリーニングのために使用する。それらの間の追加的な時点が試験されており、傾向は類似している。

その分解傾向に基づいて、各製剤の相対安定性を、表２に示されているとおり手動でランク付けし、この場合、５つの「＋」が最も安定であり、１つの「＋」が最も不安定である。各ウイルス画分を個々にランク付けし、全体的なランキングは全３個のウイルスを含む。ランキングおよび比較に基づいて、幾つかの傾向が観察された。したがって、試験された３つの糖類（スクロース、ソルビトールおよびグリセロール）のうち、スクロースおよびソルビトールの安定性寄与はグリセロールより有意に良好であった。また、より高い糖濃度が非常に好ましく、１７％〜２５％の合計糖濃度は、１０％未満の製剤より良好に機能する。タンパク質またはアミノ酸由来の安定剤のうち、０．３Ｍ Ｌ−アルギニンが最高の安定性寄与を示し、１％メチオニン、０．８％ゼラチンおよび１％ＮＺアミンがそれに続いた。その他の安定剤のうち、硫酸デキストランおよびフリーラジカルスカベンジャー（ＦＲＳ）は、液体ＣＰＶ、ＣＤＶ、ＣＡＶおよびＣＰＩ製剤の安定性に寄与するようであり、それらの存在は安定性プロファイルを有意に変化させないが、それらは安定性に対して負の影響を及ぼすこともなかった。したがって、ある場合には、２５℃における液体生ネコまたはイヌウイルスワクチンの長期貯蔵安定性のために、硫酸デキストランおよび／またはＦＲＳを最終製剤中に含有させることが好ましいであろう。一方、ＴＷＥＥＮ８０およびＴＷＥＥＮ２０は、ウイルス製剤の安定性に有害であることが判明した。

４℃でのリアルタイム安定性試験：４℃における液体生ＣＰＶ、ＣＤＶ、ＣＡＶ２およびＣＰＩワクチンの長期貯蔵安定性もモニターし、そのデータを表３に示す。４℃での２４カ月の時点の推定ウイルス力価を、Ｌ−００１〜Ｌ−００８の１２カ月および１８カ月、ならびにＬ−００９〜Ｌ−０２６の６カ月および１２カ月のデータ点から外挿する（以下の表３を参照されたい）。終結時の各ウイルスに関する最小用量力価要件が以下の表３の下に一覧されており、どの製剤が４℃で安定な製品を与えうるかを決定するために用いられる。安定な製品を与える可能性が高かった１０個の製剤（Ｌ−００９，Ｌ−０１１，Ｌ−０１２，Ｌ−０１４，Ｌ−１５，Ｌ−０１６，Ｌ−０１８，Ｌ−０１９，Ｌ−０２５およびＬ−０２６）が存在し、一方、製剤Ｌ−００３およびＬ−００７は、４℃で２年間の貯蔵寿命を有する安定な製品を与える大きな可能性を有する。検査された４個のウイルスのうち、ＣＤＶが最も不安定のようである。全１０個の製剤が、ＣＡＶ２、ＣＰＶおよびＣＰＩに関しては０〜８℃で３年間を超える安定性、およびＣＤＶに関しては０〜８℃で少なくとも２年間の安定性をもたらしうるようである。

実施例２
不活化細菌を含有する生イヌウイルスの液体ワクチンの安定性
材料および方法
材料：
細胞培養等級のスクロースおよびソルビトールをＦｉｓｈｅｒから購入する。分子等級のＬ−アルギニン塩酸塩、Ｌ−メチオニン、Ｌ−ヒスチジン、および９８％を超える純度を有する塩化ナトリウムを、Ｓｉｇｍａから購入する。９５％を超える純度で平均分子量１０，０００を有する硫酸デキストランをＳｉｇｍａから購入する。分子生物学等級のエタノール（＞９９％）、ＴＷＥＥＮ ８０、ＴＷＥＥＮ ２０、１．０Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）およびＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）溶液、ゲンタマイシン（５０ｍｇ／ｍＬ）、アンホテリシンＢ（２５ｍｇ／ｍＬ）をＳｉｇｍａから購入する。２０％ゼラチンブルーム２５０溶液および７．６１％ ＮＺ Ａｍｉｎｅ溶液を、内部で調製した。

バルク抗原の製造：
以下の溶液が調製され、０．２μｍ濾過により滅菌されている：８０％スクロース、７０％ソルビトール、１．０Ｍ Ｌ−アルギニン（ｐＨ７．２）、５％ Ｌ−メチオニン、５ｍＭ硫酸デキストラン。

バルクＤＡ２ＰＰｖ抗原ＣＤＶ、ＣＡＶ２、ＣＰＶおよびＣＰＩを、それぞれ６．７、７．８、８．０および９．２の力価で得る。バルク抗原を−８０℃で凍結し、混合の直前に解凍する。

バルク レプトスピラ抗原を、約２×１０^１０細菌／ミリリットルの濃度で得る。バルク レプトスピラ抗原を、４℃で貯蔵する。

液体ワクチン混合および充填：
液体ＤＡ２ＰＰｖワクチン混合物（１．０ｍＬ／用量）の製造方法は以下のとおりである。多価ＣＤＶ、ＣＡＶ２、ＣＰＩおよびＣＰＶ（ＤＡ２ＰＰｖ）製品の標準的な方法に従い、１用量の抗原を、ウイルスＣＤＶ、ＣＡＶ２、ＣＰＶおよびＣＰＩに関するそれぞれ５．５、６．１、６．０および７．０の目標力価で、表４に示されている種々の製剤中に混合する。４つのレプトスピラ抗原を含有する製剤に関しては、各レプトスピラ画分の目標濃度は、約１×１０^９細胞／ミリリットルである。２００ｍＬの滅菌容器を調製し、標識し、ついで各安定剤および賦形剤成分を、以下の表４に示されている各成分の最終濃度に基づく計算用量に従い、容器に加える。

安定剤および賦形剤について二重蒸留水（ｄｄ）Ｈ２Ｏで目標体積に調節する。全ての成分が完全に溶解するまで、撹拌プレート上で少なくとも１０分間混合する。安定剤溶液を冷却し、抗原の準備が整うまで４℃に維持する。凍結ＤＡ２ＰＰｖ抗原を、ほぼ全ての氷が融解するまで、時々振とうしながら３７℃の水浴中で解凍する。抗原の幾つかは溶液中に視認可能な細胞残渣を有し、したがって、ピペッティング前に抗原を十分に混合する。解凍抗原は、使用前に８時間以下の時間にわたって２〜８℃で維持すべきである。適当な量のＣＤＶ、ＣＡＶ２、ＣＰＶおよびＣＰＩを、安定剤溶液と共に標識容器に加える。
バルク４レプトスピラ（Ｌｅｐｔｏ）抗原の適当な量を、ワクチン混合物にアリコート化する。抗原および安定剤が均一に混合されるまで、撹拌プレート上で混合する。この混合工程中、気泡および泡の発生を避けることを試みる。ｐＨを２５℃で測定し、ｐＨが７．２±０．１以内でなければ、ｐＨを１Ｍ ＨＣＬまたは１Ｍ ＮａＯＨで目標ｐＨに調節する。同じ日に分注するまでワクチン混合物を２〜８℃に維持し、または小さな体積中にアリコート化し、更なる使用まで−７０℃未満で凍結する。ワクチン混合物を、２ｍＬガラスアンプルバイアル中に１ｍＬ／バイアルで分注する。充填後、貯蔵中の酸化を防止するために、アルゴンガスをアンプルバイアルに充填し、ついでアンプルを加熱密封する。
アンプルに、サンプル名、ロット番号、貯蔵温度、日付の標識を付け、ついで箱内に移し、示されている種々の温度で貯蔵する。

加速温度およびリアルタイムにおける安定性試験：
液体ＤＡ２ＰＰｖまたはＤＡ２ＰＰｖ−Ｌｅｐｔｏ４サンプルを、２５±１℃のインキュベーター内に貯蔵する。スクリーニング目的の加速安定性試験としては２５℃を用いる。示されている時点で、各製剤からの３個のバイアルを回収し、各抗原の力価を、細胞培養に基づくＴＣＩＤ５０またはＦＡＩＤ５０により測定する。

分析方法
ＣＰＩ効力：
ＤＡ２ＰＰｖワクチンにおけるＣＰＩウイルス力価を決定する。簡潔に説明すると、ウイルスの希釈物をイヌ腎臓（ＤＫ）細胞上に接種する。４〜６日後、単層を固定し、フルオレセイン共役ＣＰＩ抗血清で染色し、スピアマン−カーバー法（前記実施例１を参照されたい）によりウイルス力価を計算する。

ＣＤＶ効力：
ＤＡ２ＰＰｖワクチンにおけるＣＤＶウイルス力価を決定する。簡潔に説明すると、ウイルスの希釈物を、ベロ（Ｖｅｒｏ）細胞上に接種した。５〜７日後、細胞変性効果に関して単層を観察し、スピアマン−カーバー法によりウイルス力価を計算する。

ＣＡＶ−２効力：
ＤＡ２ＰＰｖワクチンにおけるＣＡＶ−２ウイルス力価を決定する。簡潔に説明すると、ウイルスの希釈物を、ＤＫ細胞上に接種した。７日後、細胞変性効果に関して単層を観察し、スピアマン−カーバー法によりウイルス力価を計算する。

ＣＰＶ効力：
ＤＡ２ＰＰｖワクチンにおけるＣＰＶウイルス力価を決定する。簡潔に説明すると、ウイルスの希釈物を、ＤＫ細胞上に接種した。３日後、フルオレセイン共役ＣＰＶ抗血清で単層を染色し、スピアマン−カーバー法によりウイルス力価を計算する。

結果および結論
２５℃での加速安定性試験：
製剤の表４に挙げられているワクチンを、前記方法に記載されているとおりに混合した。製剤Ｌ−０３７は、それがゲンタマイシンおよびアンホテリシンＢを含有すること以外は、既に特定されている前記Ｌ−０１５製剤と同じである（表１を参照されたい）。製剤Ｌ−０４０、Ｌ−０４３およびＬ−０４５は、４つの生イヌウイルス画分、すなわち、ＤＡ２ＰＰｖおよび４つの不活化レプトスピラ抗原（カニコラ（Ｃａｎｉｃｏｌａ）、グリッポ（Ｇｒｉｐｐｏ）、ポモナ（Ｐｏｍｏｎａ）およびイクテロ（Ｉｃｔｅｒｏ））の両方を含有する。液体ワクチンサンプルを、１ｍＬ／バイアル／用量で密封ガラスアンプル内で貯蔵した。それらを２５℃での貯蔵の後の種々の時点で試験した。ＣＤＶ、ＣＡＶ２およびＣＰＩの安定性データを表５に示す。液体ＣＰＶはそれらの４つの生ウイルスのなかで最も安定な画分とみなされるので、ＣＰＶは２５℃の貯蔵に関しては試験しなかった。表５に示されている安定性データに基づいて、以下のことが観察されている。

１）保存剤としての抗生物質は、製剤Ｌ−０１５におけるＤＡ２ＰＰｖのウイルス安定性に負の影響を及ぼさない。

２）前記の４つの不活化レプトスピラ抗原の存在は、液体製剤における生弱毒化ＣＤＶおよびＣＰＩの安定性を低減する。

３）Ｌ−０４６製剤への２ｍＭ ＥＤＴＡの補足は、前記の４つの不活化レプトスピラ抗原の存在下であっても安定なＤＡ２ＰＰｖ製剤を与える。

４）この液体安定製剤は、ＲＥＨＹＤＲＯＰＨＯＳアジュバントの存在下、前記の４つの不活化レプトスピラ抗原とのＤＡ２ＰＰｖ組み合せ体にも使用されうる。

Claims (14)

1. 生弱毒化イヌまたはネコウイルス、１０〜３０％（ｗ／ｖ）糖添加物およびアミノ酸を含む液体安定ワクチンであって、ここで、液体安定ワクチンは、６．０〜８．０のｐＨを有し、そしてここで、アミノ酸は、アルギニンおよびメチオニンからなる群から選択され、ここで、アミノ酸がアルギニンである場合には、液体安定ワクチンにおけるその最終濃度が０．１５〜０．６Ｍであり、そして、アミノ酸がメチオニンである場合には、液体安定ワクチンにおけるその最終濃度が０．０２５〜０．３Ｍである、液体安定ワクチンであって、ここで、
   生弱毒化イヌウイルスが、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパルボウイルス、イヌパラインフルエンザウイルスまたはそれらのいずれかの組み合せからなる群から選択される、液体安定ワクチン。
2. イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）が、ＣＰＶ−２、ＣＰＶ−２ａ、ＣＰＶ−２ｂ、ＣＰＶ−２ｃ、および異種ＣＰＶ−２ｃ／ＣＰＶ−２ゲノムを含む組換えＣＰＶからなる群から選択される、請求項１記載の液体安定ワクチン。
3. ＣＰＶ−２ｃがＡＴＣＣアセッション番号ＰＴＡ−１３４９２を有する、請求項２記載の液体安定ワクチン。
4. イヌパラインフルエンザウイルスが、異種抗原をコードし発現する組換えベクターである、請求項１記載の液体安定ワクチン。
5. ０．４〜１．６％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．５〜２．０％（ｗ／ｖ）の、全カゼインのタンパク質加水分解物、０．２５〜１．０％（ｖ／ｖ）エタノール、キレート化剤、バッファー、抗生物質およびアジュバント、ならびにそれらのいずれかの組み合せからなる群から選択される成分を更に含む、請求項１、２、３または４記載の液体安定ワクチン。
6. バッファーが、２．５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、および２．５〜５０ｍＭ ヒスチジンを含有する２．５〜５０ｍＭ Ｔｒｉｓからなる群から選択される、請求項５記載の液体安定ワクチン。
7. 糖添加物が、スクロース、ソルビトールおよび糖とソルビトールとの組合せからなる群から選択される、請求項１、２、３、４、５または６記載の液体安定ワクチン。
8. ワクチンが、不活化ウイルス、不活化細菌、および、不活化細菌を伴う不活化ウイルス、からなる群から選択される抗原を更に含む、請求項１、２、３、４、５、６または７記載の液体安定ワクチン。
9. 不活化ウイルスが、イヌインフルエンザウイルス、イヌニューモウイルス、イヌコロナウイルスまたはそれらのいずれかの組み合せからなる群から選択される、請求項８記載の液体安定ワクチン。
10. 不活化細菌が、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属種、エールリキア・カニス（Ｅｈｒｌｉｃｈｉａ ｃａｎｉｓ）、アナプラズマ（Ａｎａｐｌａｓｍａ）属種、レプトスピラ・カニコラ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、レプトスピラ・グリッポチホサ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｇｒｉｐｐｏｔｙｐｈｏｓａ）、レプトスピラ・ハージョ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｈａｒｄｊｏ）、レプトスピラ・イクテロヘモラジア（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｃｔｅｒｏｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉａｅ）、レプトスピラ・ポモナ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｐｏｍｏｎａ）、レプトスピラ・インテロガンス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｎｓ）、レプトスピラ・アウトムナリス（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ａｕｔｍｎａｌｉｓ）、レプトスピラ・ブラチスラバ（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ）またはそれらのいずれかの組み合せからなる群から選択される、請求項８または９記載の液体安定ワクチン。
11. 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の液体安定ワクチンをイヌに投与することを含む、イヌウイルスに対してイヌにワクチン接種する方法。
12. 請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の液体安定ワクチンをイヌに投与することを含む、イヌジステンパーウイルス、イヌアデノウイルス２型、イヌパルボウイルスおよびイヌパラインフルエンザウイルスに対してイヌにワクチン接種する方法。
13. 投与を皮下注射により行う、請求項１１または１２記載の方法。
14. 生弱毒化イヌまたはネコウイルスの治療的有効量を、１０〜３０％（ｗ／ｖ）糖添加物、アミノ酸およびｐＨ６．０〜ｐＨ８．０のバッファー溶液と組み合わせて液体安定ワクチンを得ることを含む、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０記載の液体安定ワクチンの製造方法であって、
    ここで、アミノ酸は、アルギニンおよびメチオニンからなる群から選択され、ここで、アミノ酸がアルギニンである場合には、液体安定ワクチンにおけるその最終濃度が０．１５〜０．６Ｍであり、そして、アミノ酸がメチオニンである場合には、液体安定ワクチンにおけるその最終濃度が０．０２５〜０．３Ｍである、製造方法。