JP2016510794A - 液体安定性のウシウイルスワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、生きた弱毒化ウイルスおよび糖アルコールを含む液体安定性のウシワクチンを開示する。本発明はまた、かかるワクチンの製造およびかかるワクチンの投与により動物を保護する方法を開示する。【選択図】なし

Description

本発明は、生きた弱毒化ウシウイルスを含む液体安定性のウシワクチンに関する。本発明はまた、かかるワクチンの製造および動物対象にワクチン接種する方法に関する。

ウシに感染することができるウイルスは相当数ある。かかるウイルスとしては、ウシウイルス性下痢ウイルス１型および２型（ＢＶＤＶ１あるいはＢＶＤ１；およびＢＶＤＶ２あるいはＢＶＤ２）、ウシ感染性鼻気管炎（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｏｖｉｎｅ ｒｉｎｏｔｒａｃｈｅｉｔｉｓ）（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３型（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）およびウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）が挙げられる。加えて、ウシに感染することができる細菌も多数あり、これらとしてはパスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉ）およびマイコプラズマ・ボビス（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）が挙げられる。

現在、ウシにおいて細菌またはウイルス感染による疾患を予防する最良の方法がこれらのウイルスに対するワクチンをウシに接種することであることは、広く受け入れられている。そのうえ、必要とされるワクチン注射の回数を制限する多価の生きた弱毒化ウイルスまたは細菌ワクチンは、安全に投与することができる。したがって、ＢＶＤＶ１およびＢＶＤＶ２、ＩＢＲ、ＰＩ３および／またはＢＲＳＶから保護する市販の多価生ウイルスワクチンがある。しかしながら、従来、弱毒化されたウシウイルスは、溶液中で保存された場合は不安定であった。それ故、ほとんどの生きた弱毒化ウシウイルスワクチンは、それらの長期保存前に凍結乾燥、すなわちフリーズドライされる。生きた弱毒化ウシウイルスは一般に水懸濁液として保護剤と混合され、凍結され、次いで凍結乾燥プロセスの間に昇華および二次乾燥により脱水される。低温の凍結および昇華による乾燥は、関係する低い表面積対体積比と共に、長い乾燥期間を要することがあり、それによって製造時間およびコストを顕著に増加させる。

加えて、生産物負荷の全体にわたって棚温度が調整できないこと、乾燥機内の凍結速度が変わりやすいこと、エッジ効果および放射エネルギー効果のため、大規模な商業的乾燥プロセスにおいて内在的な不調和がある。乾燥温度は保護タンパク質マトリックスのガラス転移温度を著しく下回ったままにしなければならないことから、乾燥時間を低減させるために乾燥温度を上昇させることは、しばしば選択肢でない。そのうえ、長く不調和な乾燥時間および／または高い乾燥温度は、しばしば、生きた弱毒化ウイルスへの構造的ダメージにつながり、これはそれらの生物学的活性の著しい損失を伴う。

その結果として、内在的な効力損失の責任を取るため、生きた弱毒化ウイルスを含む凍結乾燥ウシワクチンは、力価を増大させて保存される。しかしながら、凍結乾燥プロセスにより導かれる活性損失が実際には予想されたものよりも小さいならば、かかる力価増加は著しい有害事象につながることがある。それ故、ワクチンを製剤化して、有害事象につながる量を安全に下回るだけでなく、凍結乾燥およびその後の保存によるウイルス力価損失の観点で十分な効力も維持するウイルス力価を含有させるには、高度な注意が必要とされる。

さらに、これらのバイアル頂部用の標準的な栓サイズが比較的小さいために、凍結乾燥バイアルの大きさおよび／またはかかるバイアル内に含有される分量の数に制限がある。それ故、大量の液体は、比較的小さな開口部を通って昇華するのが難しくなる。加えて、大きなバイアルでは使用者が大量の希釈剤を凍結乾燥ケークに何とかして滅菌的に移すことが要求される一方、多くのより小さなバイアルの再水和はただ不便である。実際、いずれの選択肢も、ワクチンのレシピエント、例としてウシが住む肥育場環境において、とりわけ厄介である。それ故、ウイルス力価を安全かつ有効なレベルで確かに保持することができる新たな生きた弱毒化ウシウイルスワクチンへのニーズがある。

本明細書中のあらゆる参考文献の引用は、かかる参考文献が本出願に対する「従来技術」として利用可能であることを認めたものと解釈されるべきではない。

現行のワクチンの欠陥を克服するため、本発明は、新規の液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチン、同様にその対応する免疫原性組成物を提供する。本発明の液体安定性の生きたウシウイルスワクチンは、長期間、例えば９ヶ月間またはより長く（例として、約１年から３年まで）、有効なままであることができる。本発明はまた、かかるワクチンを動物に投与する方法を提供する。本発明はさらに、本発明のワクチンの投与を介して動物において疾患を予防する方法を提供する。

したがって、本発明は、生きた弱毒化ウイルスを含む液体安定性ワクチンを提供するものであり、これは生きたウイルスを含む多価ワクチンを包含する。ある実施形態において、生きたウイルスは弱毒化されたウイルスである。他の実施形態において、生きたウイルスは組換えウイルスである。特定の実施形態において、生きたウイルスは、弱毒化されており、かつ組換え体でもある。本発明の組換えウイルスはまた、異種タンパク質をコードすることができる。このタイプの特定の実施形態において、異種タンパク質は、ウイルス、寄生生物または細菌の抗原である。

特定の実施形態において、ワクチンは、糖アルコールである糖添加物を含む。ある実施形態において、ワクチンは、さらにアミノ酸を含む。特定の実施形態において、ワクチンは５から４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。ある実施形態において、ワクチンは１０から３０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。特定の実施形態において、ワクチンは１５から２５％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。関連する実施形態において、ワクチンは１０から２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。他の実施形態において、ワクチンは２０から２５％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。より特定の実施形態において、ワクチンは１２から１８％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。さらにより特定の実施形態において、ワクチンは約１５％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。関連する実施形態において、ワクチンは約２３％（ｗ／ｖ）の糖アルコールを含む。ある実施形態において、本発明の液体安定性ウイルスワクチンは、２またはそれより多い糖アルコールを含み、この液体安定性ワクチン中の糖アルコールの総量は５〜４０％（ｗ／ｖ）である。関連する実施形態において、液体安定性ウイルスワクチンは２またはそれより多い糖アルコールを含み、この液体安定性ワクチン中の糖アルコールの総量は１０〜３０％（ｗ／ｖ）である。

本発明の液体安定性ウイルスワクチンの特定の実施形態において、糖アルコールはソルビトールである。このタイプの代替的実施形態において、糖添加物はマンニトールである。関連する実施形態において、液体安定性ワクチンはさらに非アルコール性糖（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌ ｓｕｇａｒ）である糖添加物を含み、ここで液体安定性ワクチン中の糖アルコールおよび非アルコール性糖の総量は１０〜４０％（ｗ／ｖ）である。関連する実施形態において、ワクチンは１０〜２５％（ｗ／ｖ）の糖アルコールおよび５〜２０％（ｗ／ｖ）の非アルコール性糖を含む。より特定の実施形態において、ワクチンは１０〜２０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールおよび７．５〜１５％（ｗ／ｖ）の非アルコール性糖を含む。１のかかる実施形態において、非アルコール性糖である糖添加物はトレハロースである。なお他の実施形態において、非アルコール性糖である糖添加物はブドウ糖である。なお他の実施形態において、非アルコール性糖である糖添加物はショ糖である。このタイプの特定の実施形態において、糖添加物はショ糖（非アルコール性糖）およびソルビトール（糖アルコール）の組み合わせである。このタイプのより特定の実施形態において、糖添加物は１０〜２０％のソルビトールおよび５〜１５％のショ糖の組み合わせである。このタイプのさらにより特定の実施形態において、糖添加物は１５％のソルビトールおよび１０％のショ糖の組み合わせである。特定の実施形態において、非アルコール性糖である糖添加物は、実際に、２またはそれより多い非アルコール性糖である糖添加物の組み合わせである。

本発明の液体安定性ワクチンは、ｐＨの範囲がｐＨ６．０からｐＨ８．０であることができる。ある実施形態において、ｐＨ範囲はｐＨ６．５からｐＨ７．８である。特定の実施形態において、ｐＨ範囲はｐＨ６．８からｐＨ７．５である。より特定の実施形態において、ｐＨ範囲はｐＨ７．０からｐＨ７．４である。さらにより特定の実施形態において、ｐＨは７．２である。

本発明の液体安定性ワクチンは、バッファーを含むことができる。このタイプの特定の実施形態において、バッファーは２．５から５０ｍＭのリン酸塩、例として、リン酸ナトリウム（ＮａＰＨＯＳ）またはリン酸カリウム（ＫＰＨＯＳ）を含む。関連する実施形態において、バッファーは５から２５ｍＭのリン酸塩を含む。特定の実施形態において、バッファーは１０から２０ｍＭのリン酸塩を含む。

さらなる他の実施形態において、バッファー（すなわち、バッファー溶液）は０．１５から０．７５Ｍのアルギニンを含むことができる。特定の実施形態において、バッファーは２．５から５０ｍＭのリン酸塩および０．１５から０．７５Ｍのアルギニンを含む。より特定の実施形態において、バッファーは５から２５ｍＭのリン酸塩および０．１５から０．７５Ｍのアルギニンを含む。なおより特定の実施形態において、バッファーは１０から２０ｍＭのリン酸塩および０．３から０．５Ｍのアルギニンを含む。他の実施形態において、バッファーは２．５から５０ｍＭのリン酸塩を含む。関連する実施形態において、バッファーは５から２５ｍＭのＴｒｉｓを含む。特定の実施形態において、バッファーは１０から２０ｍＭのＴｒｉｓを含む。関連する実施形態において、Ｔｒｉｓバッファーはヒスチジンを含む。

本発明の液体安定性ワクチンはアミノ酸を含むことができる。上で詳述されているようなある実施形態において、アミノ酸はアルギニンである。他の実施形態において、アミノ酸はメチオニンである。なお他の実施形態において、アミノ酸はグリシンである。さらなる他の実施形態において、アミノ酸はグルタミン酸である。関連する実施形態において、液体安定性ワクチンはアルギニンおよびメチオニンの両方を含む。他の実施形態において、液体安定性ワクチンはアルギニンおよびグリシンの両方を含む。さらなる他の実施形態において、液体安定性ワクチンはグリシンおよびメチオニンの両方を含む。関連する実施形態において、液体安定性ワクチンはグルタミン酸およびメチオニンの両方を含む。他の実施形態において、液体安定性ワクチンはグルタミン酸およびグリシンの両方を含む。さらなる他の実施形態において、液体安定性ワクチンはグルタミン酸およびアルギニンの両方を含む。

関連する実施形態において、液体安定性ワクチンは、アルギニン、グルタミン酸およびメチオニンを含む。他の実施形態において、液体安定性ワクチンは、アルギニン、グルタミン酸およびグリシンを含む。さらなる他の実施形態において、液体安定性ワクチンは、アルギニン、グルタミン酸およびメチオニンを含む。なお他の実施形態において、液体安定性ワクチンは、アルギニン、グリシンおよびメチオニンを含む。さらなる他の実施形態において、液体安定性ワクチンは、アルギニン、グリシンおよびメチオニンを含む。特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、アルギニン、グリシン、メチオニンおよびグルタミン酸を含む。

特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、０．１５から０．７５Ｍである。関連する実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、０．２５から０．７５Ｍである。より特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、０．２から０．６Ｍである。より特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、０．２から０．５Ｍである。なお他の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、０．２５から０．４５Ｍである。

さらにより特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、約０．４５Ｍである。他の特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンまたはグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、約０．３Ｍである。

特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンとグルタミン酸および／またはグリシンを合わせた最終組み合わせ濃度は、０．１５から０．７５Ｍである。関連する実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンとグルタミン酸および／またはグリシンを合わせた終濃度は、０．２５から０．７５Ｍである。他の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンとグルタミン酸および／またはグリシンを合わせた最終組み合わせ濃度は、０．２から０．６Ｍである。より特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンとグルタミン酸および／またはグリシンを合わせた最終組み合わせ濃度は、０．３から０．５Ｍである。なお他の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンおよびグルタミン酸またはグリシンの終濃度は、０．２５から０．４５Ｍである。

さらにより特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンとグルタミン酸および／またはグリシンを合わせた最終組み合わせ濃度は、約０．４５Ｍである。他の特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のアルギニンとグルタミン酸および／またはグリシンを合わせた終濃度は、約０．３Ｍである。

特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のメチオニンの終濃度は、０．０２５から０．３Ｍである。関連する実施形態において、液体安定性ワクチン中のメチオニンの終濃度は、０．０４から０．１５Ｍである。より特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のメチオニンの終濃度は、０．０６から０．０９Ｍである。さらにより特定の実施形態において、液体安定性ワクチン中のメチオニンの終濃度は、約０．０７Ｍである。

本発明の液体安定性ワクチンはまた、安定化タンパク質を含むことができる。安定化タンパク質は、インタクトなタンパク質および／またはタンパク質加水分解物であることができる。特定の実施形態において、安定化タンパク質はゼラチンである。より特定の実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンに含有される安定化タンパク質は、０．４から１．６％のゼラチンである。代替的実施形態において、安定化タンパク質は、全カゼインの加水分解物である。このタイプの特定の実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンに含有される安定化タンパク質は、０．５〜２．０％の全カゼイン加水分解物である。ある実施形態において、全カゼインの加水分解物は、全カゼインのタンパク質分解性加水分解物である。さらなる他の実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンに含有される安定化タンパク質は、ラクトグロブリンまたはラクトアルブミン加水分解物である。

加えて、本発明の液体安定性ワクチンはまた、さらにキレート化剤を含むことができる。かかるキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸塩、１，２−ビス（ｏ−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）および２，３−ジメルカプト−１−プロパンスルホン酸（ＤＭＰＳ）を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。本発明の液体ワクチン中のかかるキレート化剤の濃度は、約５０μＭから１０ｍＭまで変わることができる。

特定の実施形態において、キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。このタイプのある実施形態において、液体安定性ワクチンは、０．０５０から１ｍＭのＥＤＴＡを含む。特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、０．２５から０．７５ｍＭのＥＤＴＡを含む。より特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、約０．５ｍＭのＥＤＴＡを含む。

ある実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンは、さらに１または複数のフリーラジカルスカベンジャーおよび／または抗酸化剤を構成成分として含むことができる。このタイプの特定の実施形態において、本発明のワクチンは、アスコルビン酸を含む。このタイプの特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、約０．５ｍＭのアスコルビン酸を含む。関連する実施形態において、ワクチンは、アルファ−トコフェロールを含む。このタイプの特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、約０．５ｍＭのアルファ−トコフェロールを含む。さらなる別の実施形態において、ワクチンは、グルタチオンを含む。このタイプの特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、約３ｍＭのグルタチオンを含む。なお別の実施形態において、ワクチンは、アルファ−トコフェロールおよびアスコルビン酸の両方を含む。さらなる別の実施形態において、ワクチンは、アルファ−トコフェロールおよびグルタチオンの両方を含む。なお別の実施形態において、ワクチンは、グルタチオンおよびアスコルビン酸の両方を含む。さらなる別の実施形態において、ワクチンは、アスコルビン酸、アルファ−トコフェロールおよびグルタチオンを含む。

関連する実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンは、密封された容器内で維持される。このタイプの特定の実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンは、不活性ガス、例えばアルゴン、窒素またはヘリウムなどを液体上に有する（例として、不活性ガスで埋め戻された）密封された容器内で維持される。

本発明の液体安定性ワクチンは、さらにアジュバントを含むことができる。このタイプの特定の実施形態において、アジュバントは、リン酸アルミニウムである。他のかかる実施形態において、アジュバントは、水酸化アルミニウムである。なお他の実施形態において、アジュバントは、溶液中で架橋を形成して高分子量ゲルになることができる低分子量コポリマーアジュバントである。さらなる他の実施形態において、アジュバントは、水中のアクリル酸ナトリウムのゲル粒子から構成される。なお他の実施形態において、アジュバントは、２またはそれより多いかかるアジュバントの組み合わせである。

特定の実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンは、さらに洗剤および／または界面活性剤を含むことができる。このタイプのある実施形態において、界面活性剤は、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーである。このタイプの特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、約０．０１％のポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーを含む。このタイプの具体的な実施形態において、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマーは、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ−６８である。

本発明の液体安定性ワクチンは、生きた弱毒化ウシウイルスを含むことができる。ある実施形態において、生きた弱毒化ウシウイルスは、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルスである。他の実施形態において、生きた弱毒化ウシウイルスは、ウシウイルス性下痢１型ウイルス（ＢＶＤＶ１）である。さらなる実施形態において、生きた弱毒化ウシウイルスは、ウシウイルス性下痢２型ウイルス（ＢＶＤＶ２）である。なお他の実施形態において、生きた弱毒化ウシウイルスは、パラインフルエンザ３型（ＰＩ３）ウイルスである。さらなる他の実施形態において、生きた弱毒化ウシウイルスは、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）である。なお他の実施形態において、生きた弱毒化ウシウイルスは、ウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）である。さらなる他の実施形態において、生きた弱毒化ウシウイルスは、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）である。

加えて、本発明は、多価ワクチンである液体安定性ワクチンを提供する。本発明の多価ワクチンは、ウシウイルスの任意の組み合わせを含有することができる。ある実施形態において、本発明の多価ワクチンは、死滅ウシウイルスおよび生きた弱毒化ウシウイルスの両方を含む。このタイプの特定の実施形態において、多価ワクチンは、死滅ＢＶＤＶ１、死滅ＢＶＤＶ２および死滅ＩＢＲを、生きた弱毒化ＰＩ３および生きた弱毒化ＢＲＳＶと合わせて含む。関連する実施形態において、多価ワクチンは、死滅ＢＶＤＶ１、死滅ＢＶＤＶ２および死滅ＩＢＲを、生きた弱毒化ＰＩ３、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶと合わせて含む。

他の実施形態において、本発明の多価ワクチンは、生きた弱毒化ウシウイルスのみを含む。特定の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１および生きた弱毒化ＢＶＤＶ２を含む。他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１およびＩＢＲを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１およびＰＩ３を含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１および生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１および生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＩＢＲを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＰＩ３を含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲおよび生きた弱毒化ＰＩ３を含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＰＩ３および生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＰＩ３および生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＲＶＦＶおよび生きた弱毒化ＢＶＤＶ１を含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＲＶＦＶおよび生きた弱毒化ＢＶＤＶ２を含む。他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＲＶＦＶおよびＩＢＲを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＲＶＦＶおよびＰＩ３を含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＲＶＦＶおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＲＶＦＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

関連する実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＩＢＲウイルスを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。

なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲ、生きた弱毒化ＰＩ３および生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲ、生きた弱毒化ＰＩ３および生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲ、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＰＩ３、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＢＲＣＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲ、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。さらなる他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。なお他の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。このタイプの特定の実施形態において、多価ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

本発明の液体安定性ワクチンは、さらに死滅ウイルスおよび／または細菌（例として、バクテリンまたは弱毒化された細菌）および／またはバクテリンのサブフラクションを含むことができる。したがって、１または複数の生きたウイルスワクチンを含む本発明の液体安定性ワクチンのいずれも、死滅ウイルスおよび／または弱毒化もしくは死滅細菌および／またはバクテリンのサブフラクション、例として１または複数の弱毒化または死滅させた、例えばパスツレラ・ムルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ、ヒストフィルス・ソムニおよびマイコプラズマ・ボビスなどの細菌抗原を有するものをさらに含むことができる。

本発明はさらに、本発明のワクチンを動物に投与することを含む、ウシウイルス感染から生じる臨床疾患に対するウシの保護を援助する方法を提供する。したがって、本発明は、本発明の任意の液体安定性ワクチンをウシに投与することを含む方法を提供する。ある実施形態において、投与は粘膜に対して（例として、鼻腔内または経口経路により）行われる。他の実施形態において、投与は非経口的に行われる。なお他の実施形態において、投与は皮内に行われる。さらなる他の実施形態において、投与は経皮的に行われる。より具体的な実施形態において、本発明のワクチンは動物に皮下投与される。他の具体的な実施形態において、本発明のワクチンは動物に筋肉内投与される。本発明はまた、プライマリーワクチンおよび／またはブースターワクチンの使用を包含する。

特定の実施形態において、方法は、生きた弱毒化ウイルスを含む本発明の液体安定性ワクチンをウシに投与することを含む。ある実施形態において、ウシにワクチン接種する方法は、ＢＶＤＶ１および／またはＢＶＤＶ２および／またはＩＢＲおよび／またはＰＩ３および／またはＢＲＳＶおよび／またはＲＶＦＶおよび／またはＢＲＣＶおよび／またはそれらの任意の組み合わせを包含する１または複数のウイルスに対する、ならびに細菌に対する、パスツレラ・ムルトシダおよび／またはマンヘミア・ヘモリチカおよび／またはヒストフィルス・ソムニおよび／またはマイコプラズマ・ボビスおよび／またはそれらの任意の組み合わせに対するものであり、この方法は、ＢＶＤＶ１および／またはＢＶＤＶ２および／またはＩＢＲおよび／またはＰＩ３および／またはＢＲＳＶおよび／またはＲＶＦＶおよび／またはＢＲＣＶおよび／またはそれらの任意の組み合わせを含む液体安定性ワクチンを、パスツレラ・ムルトシダおよび／またはマンヘミア・ヘモリチカおよび／またはヒストフィルス・ソムニおよび／またはマイコプラズマ・ボビスおよび／またはそれらの任意の組み合わせを含む細菌製剤と組み合わせることで組み合わせワクチンを形成させること、ならびに次いで組み合わせワクチンをウシに投与することを含む。

具体的な実施形態において、液体安定性ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２および生きた弱毒化ＩＢＲウイルスを含む。他の実施形態において、液体安定性ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。なお他の実施形態において、液体安定性ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。さらなる他の実施形態において、液体安定性ワクチンは、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶを含む。

本発明の液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンのいずれもまた、１または複数の弱毒化または死滅させた、例えばパスツレラ・ムルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ、ヒストフィルス・ソムニおよびマイコプラズマ・ボビスなどの細菌抗原と組み合わせることができる。ある実施形態において、細菌抗原（複数可）は、本発明の液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンと組み合わされる前およびその後の組み合わせワクチンの動物対象への投与の前に別々の製剤、例としてワクチン内にある。

特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカおよび生きた弱毒化ヒストフィルス・ソムニと組み合わされた生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶ（プラスまたはマイナス生きた弱毒化ＢＲＣＶ）を含む。このタイプの特定の実施形態において、液体安定性ウイルスワクチンおよび生きた弱毒化細菌ワクチンは、別々の容器内で保存され、組み合わせワクチンの動物対象への投与前に組み合わされる。

本発明はさらに、本発明の液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンを含む第一の容器およびウシ細菌ワクチンを含む第二の容器を含むキットを提供する。１のかかる実施形態において、第一の容器は生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶ、生きた弱毒化ＲＶＦＶまたは生きた弱毒化ＢＲＣＶのうちの１または複数を含む液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンを含み、第二の容器はパスツレラ・ムルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ、マイコプラズマ・ボビスおよびヒストフィルス・ソムニのうちの１または複数を含むウシ細菌ワクチンを含む。ある実施形態において、ウシ細菌ワクチンは、凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）として保存される。特定の実施形態において、ウシ細菌ワクチンは、その中の細菌抗原の全てが生きた弱毒化抗原である、生きたウシ細菌ワクチンである。他の実施形態において、ウシ細菌ワクチンは、少なくとも１の死滅細菌抗原を含む。このタイプのより特定の実施形態において、ウシ細菌抗原の全てが死滅細菌抗原である。ある実施形態において、キットはまた、ワクチンの保存および／または組み合わせおよび／または投与方法についての説明書をキット中に含有する。

本発明の液体安定性ワクチンのいずれかおよび全てを作製する方法もまた提供される。ある実施形態において、方法は、治療的有効量の生きた弱毒化ウイルスを５〜４０％の糖添加物（例として、糖アルコールまたは糖アルコールと非アルコール性糖との組み合わせ）、アミノ酸およびｐＨ６．０からｐＨ８．０の緩衝液と組み合わせることで液体安定性ワクチンを形成させることを含む。アミノ酸は、アルギニン、グリシン、グルタミン酸、メチオニン、またはアルギニン、グリシン、グルタミン酸および／もしくはメチオニンの組み合わせであることができる。特定の実施形態において、アルギニンおよび／またはグリシンおよび／またはグルタミン酸は、液体安定性ワクチン中の終濃度が０．１５から０．７５Ｍである。ある実施形態において、ワクチンは、液体安定性ワクチン中の終濃度が０．０２５から０．３Ｍであるメチオニンをさらに含む。特定の実施形態において、治療的有効量の生きた弱毒化ウイルスは、治療的有効量の生きた弱毒化ウシウイルスである。このタイプの具体的な実施形態において、治療的有効量の生きた弱毒化ウシウイルスとしては、治療的有効量の生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＩＢＲウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶが挙げられる。このタイプのより特定の実施形態において、治療的有効量の生きた弱毒化ウシウイルスとしては、治療的有効量の生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルス、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＢＲＳＶおよび生きた弱毒化ＢＲＣＶが挙げられる。

本発明はさらに、本発明の液体安定性ウシウイルスワクチンのいずれかを９ヶ月間または１２ヶ月間または１５ヶ月間または１８ヶ月間または２４ヶ月間または３０ヶ月間またはより長い期間、保存する方法を提供するものであり、この方法は、本発明の液体安定性ウシウイルスワクチンを取ること、およびそれを約０℃から約７℃の間で９ヶ月間または１２ヶ月間または１５ヶ月間または１８ヶ月間または２４ヶ月間または３０ヶ月間またはより長く保存することを含み、この液体安定性ウシウイルスワクチンは、９ヶ月間または１２ヶ月間または１５ヶ月間または１８ヶ月間または２４ヶ月間または３０ヶ月間またはより長いそれぞれの保存期間にわたって有効なままである。

本発明のこれらのおよび他の態様は、以下の発明を実施するための形態への参照により、より良く理解されるものである。

本発明の液体安定性ウシウイルスワクチンは生きた弱毒化ウイルスを含むことから、従来、ワクチンの製剤化の間に弱毒化ウイルスの力価を著しい有害事象につながることがあるレベルを安全に下回るレベルで維持するために特別な注意が必要であった。実際に、ほとんどの生きた弱毒化ウシウイルスワクチンは凍結乾燥されているが、凍結乾燥は、凍結乾燥プロセスそれ自体のためにも、同様に長期保存の間に経時的にも、弱毒化された生きたウイルスワクチンの効力の実質的な減退を導くことがある。

本発明は、生きた弱毒化ウイルス抗原の初発力価を確かに安全なレベルを上回って増加させることを必要とせずに、保存中でさえ有効なままである液体安定性のウシワクチンを提供することによりこの課題を克服した。付加的な利点として、本発明は、ワクチンの製造コストを下げる手段を提供するものであり、これは、このような安全かつ有効なワクチンを作製するために必要な生きた弱毒化ウシウイルスの量を著しく低減させることにより提供される。加えて、本発明の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンは、その凍結乾燥対応物よりも、使用により好都合である。したがって、本発明は、液体として冷蔵温度で保存することができ、１２から１８ヶ月間および／または１８から２４ヶ月間および／またはより長い間、なお安定なままである、安全かつ有効な生きた弱毒化ウシウイルスワクチンを提供する。

そのうえ、驚くべきことに、本発明の液体安定性の生きたウシウイルスワクチンとしては、あらゆるタイプのウシウイルスを挙げることができる。それ故に、本発明の液体安定性の生きたウイルスワクチンとしては、エンベロープウシウイルスおよび無エンベロープウシウイルスの両方を挙げることができる。加えて、本発明の液体安定性の生きたウイルスワクチンとしては、一本鎖ＲＮＡゲノム、一本鎖ＤＮＡゲノムまたは二本鎖ＤＮＡゲノムを持つ生きた弱毒化ウシウイルスを挙げることができる。加えて、特定の場合において、例として生きた弱毒化ＲＶＦＶの使用を伴って、液体安定性の生きたウシウイルスワクチンはまた、ヒツジおよびヤギにワクチン接種するために用いることもできる。

記述における便宜のための単数形の用語の使用は、そのように限定することを何ら意図するものではない。それ故に、例えば、「糖添加物」への言及は、特に指定がないかぎり、かかる糖添加物のうちの１または複数への言及を包含する。複数形の用語の使用もまた、特に指定がないかぎり、限定することを意図するものではない。同様に、酸またはその対応する塩基として言及することができる化合物は、特に指定がないかぎり、いずれかとして本明細書中で表示された場合、化合物のいずれの形態をも意味することが意図される。それ故に、用語グルタミン酸の使用は、グルタミン酸塩を包含することを意味し、逆もまた同様である。

本明細書中で用いられるとき、「ワクチン」は、動物に投与されると、野生型微生物の感染から生じる臨床疾患からの保護を最小限援助するのに十分な強さの、すなわち、臨床疾患の予防を援助するのにおよび／または臨床疾患を予防、寛解もしくは治療するのに十分な強さの免疫応答を誘導する、動物（ある実施形態において、ヒトを包含する）への適用に好適な組成物である。特に明示的に指示がないかぎり、用語ワクチンの使用は、多価ワクチンを包含する。

本明細書中で用いられるとき、「多価ワクチン」は、２またはそれより多い異なる抗原を含むワクチンである。このタイプの特定の実施形態において、多価ワクチンは、２またはそれより多い異なる病原体に対するレシピエントの免疫系を刺激する。

本明細書中で用いられるとき、「液体安定性の」ワクチンは、７℃以下で（例として、標準的な冷蔵庫内で、および／または０℃〜７℃で）で保存された場合に少なくとも１年間有効なままである、液体として維持されているワクチン（液体多価ワクチンを包含する）である。特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、７℃以下で少なくとも１．５年間保存された場合に有効なままである。より特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、７℃以下で少なくとも２年間保存された場合に有効なままである。なおより特定の実施形態において、液体安定性ワクチンは、７℃以下で少なくとも２．５から３年間保存された場合に有効なままである。

本明細書中で用いられるとき、用語「保護する」、「保護すること」、「に保護を与える」、「に保護を与えること」および「保護を援助する」は、感染のあらゆる兆候からの完全な保護を必要とするものではない。例えば、「保護を援助する」は、チャレンジ後に潜在する感染の症状が少なくとも低減されるように、ならびに／または症状を引き起こす潜在する細胞の生理的もしくは生化学的な原因もしくはメカニズムのうちの１もしくは複数が低減および／もしくは除去されるように、保護が十分であることを意味することができる。「低減される」は、本発明との関連で用いられるとき、感染の生理的状態だけでなく感染の分子状態を包含する感染の状態と比較してという意味であると理解される。

用語「予防的有効量」は、ウシに投与されたときに所与の病原体による内寄生／外寄生の蓋然性および／または程度を著しく低減させる組成物の量を指す。

「メタフィラキシス（ｍｅｔａｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、例として感染のリスクが高い１または複数の動物において予期される疾患発生を除去または最小化するための、動物の群全体の時宜を得た集団投薬である。１の特定の実施形態において、高リスクの子ウシは、健康歴が未知である、軽量の、群れ混合された（ｃｏｍｍｉｎｇｌｅｄ）、長距離輸送のウシである。

用語「化学的予防」は、ウイルス、細菌および／もしくは寄生生物の内寄生／外寄生を予防もしくは低減させる；ならびに／またはその内寄生／外寄生に関連した疾患および／もしくは症状を予防もしくは低減させる目的のための、投薬／処置、例として、１または複数の予防的組成物の投与を指す。

用語「予防的組成物」は、ウシにおいて所与の病原体による内寄生／外寄生の蓋然性および／または程度を著しく低減させる、単独でまたは他の剤と組み合わせて用いられる任意の剤を指す。１のかかる実施形態において、ウシは、一般にウシに付随するウイルス性、細菌性または寄生生物性病原体の存在に関連した症状および／または疾患を惹起することがある群れ混合（ｃｏｍｍｉｎｇｌｉｎｇ）、輸送、気候の変化、栄養の変化および／または他のストレス要因の後、ウシ呼吸器疾患にかかるリスクが高く、これは剤または剤の組み合わせにより標的とされる。

本明細書中で用いられるとき、用語「治療的有効量」は、単回投与でおよび／または意図した場合は１もしくは複数回のその後に続くブースター投与（複数可）を伴う初回投与として与えられたときに、それに対する保護のために抗原が投与された病原体からの保護を与えるおよび／または保護を援助するのに十分な量の所与の抗原、例として生きた弱毒化ウシウイルスである。

本明細書中で用いられるとき、「有効な」ワクチンは治療的有効量の所与の抗原を含む。「有効な」ワクチンは、ワクチンが投与される場所の管轄である、その抗原についての規制要件を順守するように所与の抗原に対する十分な力価を保持するものであり、例として、米国におけるワクチン投与は米国農務省（ＵＳＤＡ）により管理される。

本明細書中で用いられるとき、用語「薬学的に許容される」は、修飾された名詞が医薬製品における使用のために適切であることを意味するように形容詞的に用いられる。例えば医薬ワクチンにおける添加剤を記述するために用いられる場合、この用語は、添加剤を、組成物中の他の成分と適合しており、対象のレシピエントに対して不利に有害でないものと特徴付ける。

用語「担体」は、それと共に化合物が投与される希釈剤、アジュバント、添加剤または媒体を指す。薬学的な許容される担体は、滅菌された液体、例えば水および／または石油起源、動物起源、植物起源もしくは合成起源のものを包含する油、例えばピーナッツ油、ダイズ油、ミネラルオイル、ゴマ油などであることができる。水または生理食塩水溶液および糖水溶液、例として、ブドウ糖および／またはグリセロール溶液を、とりわけ注射用溶液のための担体として使用することができる。加えて、担体は、例として、ウシ、例として子ウシに対して噴霧されることになるウシワクチンの粘度を高めるため、親水コロイドおよび／またはポリマー溶液であることができ、および／またはこれを含むことができる。

本明細書中で用いられるとき、「アジュバント」は、免疫学的イベントのカスケードを助力または増幅し、最終的により良好な免疫学的応答、すなわち、抗原に対する統合された身体的応答を導くことが可能な物質である。アジュバントは、一般的に免疫学的応答を生じさせるために必要とされないが、この応答を助力または増幅する。

本明細書中で用いられるとき、「全身投与」は、体の循環系（心血管系およびリンパ系を含む）内への投与であり、それ故に特定部位、例えば消化管（例として経口または直腸投与を介するもの）および呼吸器系（例として鼻腔内投与を介するもの）などよりもむしろ全身に影響を及ぼす。全身投与は、例として、筋肉組織内（筋肉内）、真皮内（皮内、経皮的または真皮上（ｓｕｐｒａｄｅｒｍａｌ））、皮膚の下（皮下）、粘膜の下（粘膜下）、静脈の中（静脈内）などに投与することにより行うことができる。

「非経口投与」としては、皮下注射、粘膜下注射、静脈内注射、筋肉内注射、皮内注射および点滴が挙げられる。

本明細書中で用いられるとき、「糖添加物」は、５から１２個の炭素の糖（例としてショ糖、マルトース、トレハロース、ブドウ糖、乳糖、グルコース、フルクトース、ガラクトース）または糖アルコール／ポリオール（例としてソルビトール、マンニトール、アラビトール、イノシトール、マルチトール）である。具体的に反するように述べられていないかぎり、糖添加物のパーセント（％）は、ワクチン中のワクチンの体積（ｖ）に対する糖添加物の重量（ｗ）、（ｗ／ｖ）として与えられる。

本明細書中で用いられるとき、「非還元糖」は、塩基性水性媒体中でアルデヒド基を含有する何らかの化合物を生成しない糖添加物である。本発明の非還元糖の例としては、ショ糖およびトレハロースが挙げられる。

本明細書中で用いられるとき、用語「非糖アルコール」および「非アルコール性糖」は交換可能に用いられる。「非糖アルコール」（または「非アルコール性糖」）である糖添加物は、本明細書中で用いられるとき、糖アルコール、例として非還元糖でない任意の糖添加物であることができる。

本明細書中で用いられるとき、具体的に反するように述べられていないかぎり、ワクチン中の固体添加物、例として糖添加物またはゼラチンのパーセント（％）は、１％溶液が１ｇの固体／１００ｍｌのワクチン体積（ｗ／ｖ）であることに基づく。

本明細書中で用いられるとき、具体的に反するように述べられていないかぎり、ワクチン中の液体添加物、例としてエタノールのパーセント（％）は、１％溶液が１ｍｌの液体添加物／１００ｍｌのワクチン体積（ｖ／ｖ）であることに基づく。

本明細書中で用いられるとき、用語「およそ」は、用語「約」と交換可能に用いられ、値が指示された値の２５パーセント内であることを一般に示し、特に指示がないかぎり、例として、「約」２ｍＭ ＥＤＴＡの濃度は１．５ｍＭから２．５ｍＭ ＥＤＴＡであることができる。

本明細書中で用いられるとき、具体的に反するように述べられていないかぎり、与えられるｐＨ値は２５℃で決定／測定されたｐＨ値である。

本発明の液体安定性ワクチンのｐＨの範囲は理想的にはｐＨ６．０からｐＨ８．０であることから、本発明の液体安定性ワクチンはバッファーを含むことができる。本発明の液体安定性ワクチン中での使用のためのバッファーとしては、限定されるものではないが、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、Ｔｒｉｓ、Ｔｒｉｓ−ヒスチジン、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ、ＢＩＳ−Ｔｒｉｓ−プロパン、ピロリン酸ナトリウムまたはカリウム、イミダゾール、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、トリシン、グリシルグリシンおよびＨＥＰＥＳが挙げられる。バッファーは、任意の好適な対イオンの使用を伴って、所望のｐＨにすることができる。

本発明の液体安定性ワクチン中で用いることができる全カゼインの加水分解物は、多数の手法により得ることができ、例として、酸加水分解物または酵素的加水分解物としてのものを包含する。かかる加水分解物は、カゼイン中に元々存在するアミノ酸の全てを有する混合アミノ酸およびペプチドの形で含有する。本発明の液体安定性ワクチン中で用いることができる１の全カゼイン膵性加水分解物は、ＣＡＳＥＩＮ ＨＹＤＥＯＬＹＳＡＴＥ ＥＮＺＹＭＡＴＩＣ（登録商標）としてＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓにより販売されている。同等の製品は、ＮＺ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＮＺ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）Ａ、ＮＺ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）ＡＳおよびＮＺ−ＡＭＩＮＥ（登録商標）Ｂおよびトリプトンの名称の下でＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈにより販売されている。

本発明のワクチンが含むことができる親水コロイドの例としては、ゼラチン、デンプンポリマーおよびガム、例えばキサンタンガム（ｘａｎｔｈｕｍ ｇｕｍ）、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｅｎｉｎ）およびアラビアガム（アカシアガム）などが挙げられる。

多価ワクチン：本発明は、液体安定性の多価ワクチンを提供する。本発明の液体安定性の多価ウシワクチンは、以下の生きた弱毒化ウシウイルス：ＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２、ＰＩ３ウイルス、ＩＢＲウイルス、ＢＲＳＶ、ＲＶＦＶおよび／またはＢＲＣＶのうちの１または複数を包含する２またはそれより多い抗原を包含することができる。上記のように、本発明の液体安定性の多価ウシワクチンはまた、以下の生きた弱毒化ウイルス：ＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２、ＰＩ３ウイルス、ＩＢＲウイルス、ＢＲＳＶ、ＲＶＦＶおよび／またはＢＲＣＶのうちの１または複数を、１または複数の死滅ウシウイルスと共に包含することができる。

加えて、本発明の液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンは、１または複数の生きた弱毒化または死滅細菌抗原を包含することができる。関連する実施形態において、本発明の液体安定性ワクチンは、投与前であるが保存後であるどこかの時点で１または複数の生きた弱毒化または死滅細菌抗原と組み合わせることができる。このタイプの具体的な実施形態において、細菌抗原（複数可）はワクチン（一価または多価のもの）に含まれ、そのウシ細菌ワクチンは投与前に本発明の液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンと組み合わされる。より具体的な実施形態において、液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンは、組み合わせワクチンの動物対象への投与の前に、フリーズドライのウシ細菌ワクチンを液化／可溶化させるために用いることができる。なお他の実施形態において、液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンならびに弱毒化および／または死滅ウシ細菌ワクチンは、逐次的に投与される。

したがって、本発明の液体安定性の生きた弱毒化ウシウイルスワクチンは、動物対象への投与の前に、抗原、例えばパスツレラ・ムルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ、ヒストフィルス・ソムニおよびマイコプラズマ・ボビスなどを含む１または複数の生きた弱毒化または死滅細菌ワクチンと組み合わせることができる。それ故、ある実施形態において、弱毒化細菌ワクチンは、弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）を含む。このタイプの特定の実施形態において、弱毒化されたマンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）は、ロイコトキシン欠失体である。このタイプの具体的な実施形態において、弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）は、ロイコトキシンＡをコードする遺伝子がロイコトキシンＡタンパク質のアミノ酸３４〜３７８をコードするヌクレオチド配列を欠損するように改変された、無毒の生きたマンヘミア・ヘモリチカである［Ｕ．Ｓ．６，３３１，３０３Ｂ１を参照されたい、この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる］。

さらなる他の実施形態において、弱毒化細菌ワクチンは、弱毒化パスツレラ・ムルトシダを含む。より特定の実施形態において、パスツレラ・ムルトシダは、そのｈｙａＥ遺伝子の欠失を含む。このタイプの具体的な実施形態において、弱毒化パスツレラ・ムルトシダは、ｈｙａＥタンパク質をコードする遺伝子がｈｙａＥタンパク質のアミノ酸２３９〜３５９をコードするヌクレオチド配列を欠損するようにおよび／またはヌクレオチド７１８〜１０８４を欠損するように改変された、生きた無毒のパスツレラ・ムルトシダである［Ｕ．Ｓ．７，３５１，４１６Ｂ２を参照されたい、この文献は参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる］。さらなる他の実施形態において、弱毒化細菌ワクチンは、弱毒化ヒストフィルス・ソムニを含む。より特定の実施形態において、ヒストフィルス・ソムニは、ａｒｏＡ変異体である生きた無毒のヒストフィルス・ソムニである。

本発明の方法の特定の実施形態において、弱毒化細菌ワクチンは、弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）および弱毒化パスツレラ・ムルトシダの両方を含む。より具体的な実施形態において、抗菌性組成物は、ロイコトキシンＡをコードする遺伝子がロイコトキシンＡタンパク質のアミノ酸３４〜３７８をコードするヌクレオチド配列を欠損するように改変された無毒の生きたマンヘミア・ヘモリチカ、ならびにｈｙａＥタンパク質をコードする遺伝子がｈｙａＥタンパク質のアミノ酸２３９〜３５９をコードするヌクレオチド配列を欠損するようにおよび／またはヌクレオチド７１８〜１０８４を欠損するように改変された無毒の生きたパスツレラ・ムルトシダを含む弱毒化細菌ワクチンである。本発明の方法のより特定の実施形態において、弱毒化細菌ワクチンは、弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、弱毒化パスツレラ・ムルトシダおよび無毒のヒストフィルス・ソムニを含む。

アジュバント：上で指し示されているように、本発明のワクチンはまた、アジュバントを包含することができる。特定の実施形態において、アジュバントはアルミニウム塩を含む。生きたウイルスワクチンを伴うアルミニウム塩の使用は、記述されている。特定の実施形態において、アルミニウム塩は、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および水酸化アルミニウムよりなる群から選ばれる。他の周知のアジュバントとしては、炭化水素油およびサポニンが挙げられる。１のリン酸アルミニウムアジュバントは、ＲＥＨＹＤＲＯＰＨＯＳ（登録商標）（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）である。水酸化アルミニウムアジュバントの例としては、ＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）、ＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）ＨＰＡまたはＲＥＨＹＤＲＯＧＥＬ（登録商標）ＬＶ（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）が挙げられる。他の周知のアジュバントとしては、炭化水素油、ポリマー、サポニンおよび／または水中アクリル酸ナトリウムのゲル粒子から構成されるアジュバント、例としてＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）ＰＥＴ ＧＥＬ Ａ（商標）（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｐａｒｉｓ フランス）が挙げられる。１の低分子量コポリマーアジュバントは、溶液中で架橋を形成して高分子量ゲルになることができる、例としてＰＯＬＹＧＥＮ（商標）（ＭＶＰ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｏｍａｈａ）である。加えられる場合、アジュバントの量は通常、ワクチン中で約１％から２０％（ｖ／ｖ）の間である。特定の実施形態において、アジュバントの量は、約２％から１０％（ｖ／ｖ）の間である。

本発明のワクチンはまた、抗菌物質、例えば抗生物質などを含有することができる。かかる抗生物質の例としては、１０〜１００μｇ／ｍＬのゲンタマイシン、０．５〜５．０μｇ／ｍＬのアンホテリシンＢ、１０〜１００μｇ／ｍＬのテトラサイクリン、１０〜１００ユニット／ｍＬのナイスタチン（マイコスタチン）、１０〜１００ユニット／ｍＬのペニシリン、１０〜１００μｇのストレプトマイシン、１０〜１００μｇのポリミキシンＢおよび１０〜１００μｇのネオマイシンを挙げることができる。

ワクチン投与：本発明の液体安定性ウイルスワクチンは、任意の慣用的な手段により、例えば、限定されることなく皮下または筋肉内投与などの非経口投与を包含する全身性投与により、投与され得る。本発明の液体安定性ウイルスワクチンはまた、粘膜投与、例えば鼻腔内、経口、気管内、直腸および／または眼球投与などにより投与され得る。あるいは、ワクチンは、皮膚パッチ、遅延放出インプラント内、乱刺または局所投与を介して投与され得る。本発明の液体安定性ウイルスワクチンはまた、レシピエントのウシの飲料水および／または餌を介して投与され得ると考えられる。

本発明のワクチン（多価ワクチンを包含する）はまた、組み合わせ療法の一部として、すなわち、ワクチン自体に加えて１または複数の追加の活性剤、療法などを投与することを包含する療法の一部として投与され得る。その場合、「治療的有効」量を構成するワクチンの量は、ワクチンが単独で投与されるものであった場合の「治療的有効」量を構成するワクチンの量より多いまたは少ないものであり得ることが認められる。他の療法としては、当該技術分野で公知のもの、例として鎮痛剤、熱を下げる薬、去痰薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬および／または流動物の投与などが挙げられ得る。

本発明の方法のある実施形態において、粘膜投与に好適な本発明のウイルスワクチンは、弱毒化ＩＢＲウイルスを含む。より特定の実施形態において、粘膜投与に好適な本発明のウイルスワクチンは、生きた弱毒化ＩＢＲウイルス、生きた弱毒化ＢＶＤＶ１、生きた弱毒化ＢＶＤＶ２、生きた弱毒化ＰＩ３ウイルスおよび生きた弱毒化ＢＲＳＶを含む。

免疫原性レベルは、当該技術分野で一般に知られているワクチン分量力価測定およびチャレンジ調査技術により実験的に決定され得る。かかる技術は、典型的に、多数の動物対象に異なる用量でワクチンを接種すること、および次いで動物対象に毒性ウイルスをチャレンジして最小の保護分量を決定することを包含する。

好ましい投薬レジメンに影響を及ぼす因子としては、例えば、対象の種または品種（例としてウシの）、齢、体重、性別、食事、活動性、肺の大きさおよび状態；投与の経路；用いられる特定のワクチンの効力、安全性および免疫持続時間プロファイル；送達系が用いられるか；ならびにワクチンが薬剤および／またはワクチン組み合わせの一部として投与されるかが挙げられ得る。それ故に、実際に使用される用量は具体的な動物によって変えることができ、それ故、上記の典型的用量から外れることがある。かかる用量調整を決定することは、一般に、慣用的な手段を用いるワクチン開発の当業者の技量の内にある。

同様に、そのような分量を投与することができる容量は、典型的に、０．１ｍＬ（皮内または経皮的な適用に典型的である）から５．０ｍＬの間にある。投与量の典型的範囲は０．２から２．０ｍＬの間であり、筋肉内または皮下投与の場合は約１．０から２．０ｍＬである。

ワクチンは、数日、数週間、数ヶ月または数年にわたって、単回あるいは２またはそれより多い回数、ワクチンレシピエントに投与され得ると考えられる。いくつかの実施形態において、ワクチンは少なくとも２回投与される。ある種のかかる実施形態において、例えば、ワクチンは２回投与され、２回目の分量（例としてブースター）は１回目の分量の少なくとも２週間後に投与される。特定の実施形態において、ワクチンは２回投与され、２回目の分量は１回目の分量の後８週間を超えずに投与される。他の実施形態において、２回目の分量は、１回目の分量の１週間から２週間後、１回目の分量の１．５週間から８週間後または１回目の分量の２週間から４週間後に投与される。他の実施形態において、２回目の分量は、１回目の分量の約３週間後に投与される。

上の実施形態において、１回目およびその後の用量は、例えば量および／または形態などが変わり得る。しかしながら、しばしば用量は量および形態が同じである。単一の分量のみが投与される場合、その分量単独の中にあるワクチンの量は、治療的有効量のワクチンを一般に含む。しかしながら、１より多い分量が投与される場合、それらの分量におけるワクチンの量は共に治療的有効量を構成し得る。加えて、上で論じられているように、ワクチンが最初に投与され、次いでブースターが２週間から１２週間後に投与され得る。しかしながら、その後のワクチン投与は、ブースターが投与されたか否かにかかわらず、年１回（１回−年）または年２回（２回−年）ベースでなされ得る。

本発明は、本発明の典型として提供される以下の限定されない実施例への参照によってより良く理解され得る。以下の実施例は、本発明の実施形態をより完全に説明するために存在する。しかしながら、これは、本発明の広い範囲を限定するものと決して解釈されるべきではない。

実施例１
液体ウシウイルスワクチンの安定性
序文
ワクチンは、ヒトおよび動物の両方において病原体に起因する疾患を予防するために欠かせない。しかしながら、驚くことではないが、ヒトにおいて使用されるワクチンのタイプに対する焦点は、動物のためのそれと異なる。それ故に、ヒトの場合、多くのワクチンは一価ワクチンであり、すなわち、ただ１つの病原体に対する保護を与える単一の免疫剤を含有する。他方、多価ワクチンは獣医学においてより普及している。これは畜牛業において、例として複数のワクチン接種のコストが著しい問題になる牛生産者により使用されるワクチンにとりわけ当てはまる。そのうえ、ワクチン接種のために拘束装置を走り抜けさせることによりウシを集めること、およびヒトに極めて接近した狭い領域内に動物を密集させることは、動物にとってストレスの多い環境を作り出し、これはしばしばウシへの免疫系抑制、食欲不振および／または物理的な傷害につながることがある。さらに、各ワクチン投与は、対応する注射部位の周囲にある局所組織に対する作用を生み出す可能性がある。

したがって、獣医学（ｖｅｒｔｅｒｎａｒｙ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）において、単一の多価ワクチンの中でできるだけ多くの抗原を組み合わせることがしばしば望ましい。しかしながら、かかる多価ワクチンの製剤化は、想定されるように単純ではない。例えば、所与の製剤中のワクチン抗原は不適合であることが判明するかもしれない。加えて、局所組織損傷を引き起こす製剤は一般に許容されない。

そのうえ、別の方法で液体安定性を導き得るワクチン製剤は、溶解された固形分含量がより高い傾向がある。固形分含量が高い（３０から４０％を超える）ワクチン製剤は、一般に高張であると考えられる。高張溶液の皮下注射は局所の腫脹、浮腫を引き起こすことがあり、これはおそらく組織損傷につながる。さらに、組織損傷がない場合であっても、注射部位における局所の腫脹または浮腫はなお、需要者にとって視覚的に望ましくないことがある。高張製剤は、鼻腔内または経口で送達される多価ワクチンの場合はより問題にならなくなる。しかしながら、より望まれる製剤はなお固形分含量がより低いものであり得るが、これはより低い固形分含量は商品のより低いコストと一般に相関するためである。

材料と方法
バルク抗原調製：２セットの各ウイルス抗原（ＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２、ＰＩ３およびＩＢＲ）を生産した。１セットは動物起源のものを含まない培地中で増殖させ、他のセットは動物起源の構成成分を含有する培地中で増殖させた。下の表２Ａおよび２Ｂ中のデータは、動物起源の構成成分を含有する培地中で増殖させたウイルスを用いて得られた。

Ａ．ストック試薬：
８０％ショ糖 ７０％ソルビトール
３７．５％トレハロース ４０％ Ｌ−アルギニン（Ｌ−アルギニンＨＣｌからのもの）
５％ Ｌ−メチオニン １Ｍ グルタミン酸一カリウム
１０％ Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−６８ ０．５Ｍ ＥＤＴＡ
１Ｍ リン酸カリウムバッファー
Ｂ．ｐＨ調整：バルク製剤を２〜３時間混合し、次いで分割して３．５Ｌを４℃（低温域）に、４．５Ｌを２５℃（高温域）に割り当てた。

低温域：製剤を（可能な場合は混合しながら）４℃まで冷やし、ｐＨを７．２５に調整した。製剤を次いで４℃で一晩保ち、翌朝ｐＨを再度チェックしてｐＨが７．２５で安定化したことを確保した。いずれかの時点で微調整が必要であった場合、適切な酸／塩基を用いた（Ｋ２ＨＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４）。

高温域：製剤を（可能な場合は混合しながら）２５℃まで温め、ｐＨを７．２５に調整した。製剤を次いで２５℃で一晩保ち、翌朝ｐＨを再度チェックしてｐＨが７．２５で安定化したことを確保した。いずれかの時点で微調整が必要であった場合、適切な酸／塩基を用いた（Ｋ２ＨＰＯ４またはＫＨ２ＰＯ４）。１５℃、２５℃および３７℃の間のｐＨドリフトはわずかであったことから、製剤を増やして３つの温度の各々において保存した。

ｐＨメーター：ｐＨは、非常に高感度のｐＨプローブおよびメーターを用いて測定する。メーターはｐＨを小数点の右側３ケタの有効数字まで表示する。メーターは分離型の温度プローブを備え、両者とも溶液内にあって安定でなければならない。調整は相当量の時間を取り、ｐＨは実験に決定的である。このｐＨメーターは５点較正曲線の能力があり、３点が絶対最少限である。

Ｃ．フィルター滅菌およびアルゴン注入：最初のｐＨ調整がなされたら、全７つの製剤を０．２μＭフィルターを用いてフィルター滅菌した（好ましいフィルター基材＝ＰＥＳ、単純にろ過能力改善のため）。目下、ろ過は吸引を用いて行われており、吸引ろ過の第二の利点は製剤の付加的な脱気である。

製剤をフィルター滅菌した後、アルゴンガスを注入することで、願わくば時間をかけて製剤のより低い反応性をもたらすＯ_２の枯渇を向上させる。注入が完了したら、保存の前にアルゴン重層が配置されていることを確実にする（保存のためにできるだけしっかり密封されていることを確保する）。

Ｄ．製剤を調製した後の朝、所望の温度（４℃または２５℃）でｐＨを確認／７．２５に調整する。製剤化および先の手順が正しく行われた場合、ｐＨは７．２５に近いはずである。一晩インキュベーションすると、先のｐＨ調整およびさらなる脱気に付随する化学反応が完了するため、ｐＨは若干ドリフトする。

Ｅ．ウイルスの解凍：ウイルスの解凍においては最適な条件が用いられるべきであり、解凍が必要な場合、通常はバルク液体が温まるのを防ぐために頻繁に混合しながら温水浴中で迅速解凍する。使用準備ができるまで物を冷たく保つため、および残存する熱を液体部分から取り除くため、製剤中に少量の氷が残っているところでプロセスを完了する。

Ｆ．バルク製剤へのウイルスの添加：ワクチンブレンドの調製：２５０ｍＬの４℃製剤および７５０ｍＬの２５℃製剤を各製剤（全７つの製剤）のバルクから取り出し、適切な容器（Ｎａｌｇｅｎｅスクリューキャップボトル）内に入れる。非常に短い時間枠（数分）のうちにウイルスを加える場合、さらなる問題はなくウイルスを加え得る。ウイルスを直ちに加えない場合、残存するＯ_２を置き換えるためにアルゴン重層を配置するべきである。ウイルスが加えられたら、混合前に新たなアルゴン重層を配置するべきである。アルゴンガスは低い流速を用いてボトルに加えられるべきである。

Ｇ．ワクチンの充填：製剤の充填順序：４℃製剤は常に２５℃の姉妹製剤の前に充填されるべきである。

分析方法
全ての細胞培養アッセイは清浄な細胞環境の中で行われる。マニピュレーション、希釈および培地添加は、クラスＩＩ生物学的安全キャビネット内で、無菌条件下でなされる。全てのプレート、ボトル、フラスコ、ピペット、ピペットチップおよび希釈チューブは、使用前に滅菌されなければならない。全ての培地および関連成分は滅菌されなければならない。

ＢＶＤＶ１効能：ＢＶＤＶの増殖に好適な細胞株をこの力価測定アッセイのために用いる。例えば、マディン−ダービーウシ腎臓細胞（Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙ ｂｏｖｉｎｅ ｋｉｄｎｅｙ、ＭＤＢＫ）細胞をフラスコまたはローラーボトル内で、５〜１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質（ゲンタマイシン（１２〜２５μｇ／ｍＬ））を補充したハンクス改変必須培地（Ｈａｎｋｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ、ＨＭＥＭ）を用いてコンフルエントまで増殖させる。所望のウイルス力価測定時間のおよそ２４時間前に、健常に増殖しているＭＤＢＫ細胞のフラスコ／ローラーボトルから培地をデカンテーションする。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を用いてフラスコ／ローラーボトルから血清含有培地を洗い流す。デカンテーションし、適切な量のトリプシン／ＥＤＴＡを含有する溶液で置き換えて、細胞をフラスコ／ローラーボトルの表面から穏やかに剥離させる。トリプシンの量は、フラスコまたはローラーボトルの表面の大きさに適合させるべきである。トリプシン処理された細胞を含有するフラスコ／ローラーボトルを３７℃のインキュベーター内で、細胞を脱離させるのに十分な時間、置く。細胞が適当な脱離レベルにあるように見えたら、Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有する５〜２０ｍＬのイーグル改変必須培地（Ｅａｇｌｅｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ、ＥＭＥＭ）を加える。５％ ＦＢＳをＥＭＥＭに加えて、トリプシンを中和する。細胞をピペッティングして凝集塊をばらばらにする。細胞密度を血球計数器を用いて決定する。生存率は、４％トリパンブルー溶液を用いて決定することができる。５％ ＦＣＳを添加したＥＭＥＭ中に１ｍＬあたり１×１０^５細胞になるように細胞を希釈し、１００μＬを９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに加える。培地が蒸発するのを防ぐため、プレートに覆いをして、３７℃に設定された５％ ＣＯ_２を有する加湿インキュベーター内に置く。ウイルス力価測定用の１０倍希釈のために用いられることになるチューブを、適切な量のＥＭＥＭ／５％血清を各々のチューブに加えることにより準備する。別のチューブに陰性対照のためのＥＭＥＭを充填する。ウイルス試料の１０倍希釈を準備されたチューブ内に作製する。力価がわかっている用意された１型ＢＶＤＶの基準品もまたＥＭＥＭ中で希釈し、陽性対照として用いる。９６ウェルプレートがＭＤＢＫ細胞の健常な単層でコンフルエントであることを確実にして、１００μＬの各々の希釈ウイルス試料を９６ウェルＭＤＢＫ細胞プレートの適切なウェルにアプライする。陰性対照および陽性対照を包含する。プレート上のふたを交換し、加湿された３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内におよそ４日間置く。４日後、倒立顕微鏡を用いて、細胞に対するウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）についてプレートを調べることで、プレートが読み取られ得る。ＢＶＤＶの株が非細胞変性株である場合、以下の手法がウイルス力価を決定するために用いられ得る。４日後、感染させたプレートをインキュベーターから取り出し、培地を適切な廃液容器内へとデカンテーションする。単層をＰＢＳで２回洗い流す。２回目の洗浄後、プレートで吸収紙をそっとたたくことにより過剰な水分を取り除く。細胞基質をドラフト下、５０〜２００μＬ／ウェルの冷７０％アセトン／３０％メタノール固定剤で固定し、プレートを室温で１０分間固定する。用いられた固定剤を適切な器内にデカンテーションする。プレートで吸収紙をそっとたたくことにより過剰な水分を取り除き、プレートを風乾する。固定されたプレートを染色前に２〜７Ｃで３０日間まで保存してもよい。プレートを染色するため、ＰＢＳで各１回洗い流し、過剰な水分をたたいて落とす。１ウェルあたり５０〜７５ｕＬのＢＶＤＶ１に対する特異的抗体を加える。プレート上のふたを交換し、３７℃、５％ ＣＯ２中で３０〜６０分間、加湿状態でインキュベートする。プレートをインキュベーターから取り出し、付着していない抗体を含有する液体をデカンテーションする。プレートを少なくとも２回洗い流し、結合していない抗体を取り除く。適切なレベルに希釈された５０〜７５μＬの蛍光イソチオシアネートタグ付加（ＦＩＴＣ）２次抗体を、マルチチャンネルピペットを用いてプレートの各ウェルに加える。カバーを交換し、プレートを加湿された３７℃、５％ＣＯ_２のインキュベーター内でおよそ３０分間インキュベートする。プレートをインキュベーターから取り出し、ふたを取り外して結合していないＦＩＴＣ標識抗体をデカンテーションする。プレートをＰＢＳで２回洗い流し、吸収紙上でプレートを軽くたたくことで、過剰な水分を取り除く。プレートは、ＦＩＴＣコンジュゲートのための適切なフィルターを備えた蛍光顕微鏡を用いて、直ちに読み取られ得る。感染した基質は、澄んだ黄緑色に見える細胞質および暗い（染色されていない）核を有する細胞を含有する。ＢＶＤＶ１の細胞変性株の場合、明らかなＣＰＥを示すウェルを陽性とみなす。全ての陰性対照ウェルは陰性のままであって、ＣＰＥを示さないまたは陽性に染色されないはずである。スピアマン−カーバー（Ｓｐｅａｒｍａｎ−Ｋａｒｂｅｒ）法によりウイルス力価を計算し、ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして報告する。陰性対照が陰性であって、陽性対照がその試料について予想される力価範囲内にある場合、試験は妥当である。

ＢＶＤＶ２効能：ＢＶＤＶ２効能試験は、ＢＶＤＶ１の場合と全く同じようになされる。株が細胞変性株である場合、２型株に対する抗体を用いるべきである。陽性対照ウイルスはＢＶＤＶ２である。

ＩＢＲ効能：ＩＢＲの増殖に好適な細胞株をこの力価測定アッセイのために用いる。例えば、マディン−ダービーウシ腎臓細胞（ＭＤＢＫ）細胞をフラスコまたはローラーボトル内で、５〜１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質（ゲンタマイシン（１２〜２５μｇ／ｍＬ））を補充したハンクス改変必須培地（ＨＭＥＭ）を用いてコンフルエントまで増殖させる。所望のウイルス力価測定時間のおよそ２４時間前に、健常に増殖しているＭＤＢＫ細胞のフラスコ／ローラーボトルから培地をデカンテーションする。リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を用いてフラスコ／ローラーボトルから血清含有培地を洗い流す。デカンテーションし、適切な量のトリプシン／ＥＤＴＡを含有する溶液で置き換えて、細胞をフラスコ／ローラーボトルの表面から穏やかに剥離させる。トリプシンの量は、フラスコまたはローラーボトルの表面の大きさに適合させるべきである。トリプシン処理された細胞を含有するフラスコ／ローラーボトルを３７℃のインキュベーター内で、細胞を脱離させるのに十分な時間（５〜１０分間）、置く。細胞が適当な脱離レベルにあるように見えたら、Ｌ−グルタミンおよびゲンタマイシンを含有する５〜２０ｍＬのイーグル改変必須培地（ＥＭＥＭ）を加える。５％ ＦＢＳをＥＭＥＭに加えて、トリプシンを中和する。細胞をピペッティングして凝集塊をばらばらにする。細胞密度を血球計数器を用いて決定する。生存率は、４％トリパンブルー溶液を用いて決定することができる。５％ ＦＣＳを添加したＥＭＥＭ中に１ｍＬあたり２．４×１０^５細胞になるように細胞を希釈し、５ｍＬを６０ｍｍ組織培養プレートの各ウェルに加える。培地が蒸発するのを防ぐため、プレートに覆いをして、３７℃に設定された５％ ＣＯ_２を有する加湿インキュベーター内に置く。ウイルス力価測定用の１０倍希釈のために用いられることになるチューブを、適切な量のＥＭＥＭ／５％血清を各々のチューブに加えることにより準備する。別のチューブに陰性対照のためのＥＭＥＭを充填する。ウイルス試料の１０倍希釈を準備されたチューブ内に作製する。力価がわかっている用意されたＩＢＲの基準品もまたＥＭＥＭ中で希釈し、陽性対照として用いる。６０ｍｍプレートがＭＤＢＫ細胞の健常な単層でコンフルエントであることを確実にする。播種されることになる試料識別および希釈を各プレートにラベルする。培地を次いで各々の６０ｍｍプレートからデカンテーションする。各々のプレートに、陰性対照および陽性対照を包含する、試験されることになる１００μＬの試料を接種する。プレートを前後に傾けて、接種物を分散させる。プレート上のふたを交換し、吸着のため、加湿された３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内におよそ６０分間置く。ウイルス吸着の後、５％ ＦＣＳ、Ｌ−グルタミン、ゲンタマイシンおよびカルボキシメチルセルロースを添加したダルベッコ最小必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｉｎｉｍａｌ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ）からなる５ｍＬの重層培地を各６０ｍｍプレートに加える。４日後、ＣＭＣ重層培地を各プレートからデカンテーションする。各プレートを水で洗い流し、デカンテーションする。２ｍＬの（または底部を覆うのに十分な）クリスタルバイオレット染色剤を各プレートまたはウェルに加え、室温（１５〜３０℃）で２０〜３０分間インキュベートする。冷水を使用して染色剤を各プレートから穏やかに洗い流す。プレートを逆さにして、プレートを乾燥させる。プレートが乾燥した後、倒立顕微鏡を用いてプレート上のプラークを目視でカウントする。プラークの平均数が１０から１５０の間である希釈のみを力価決定のために用いる。プラーク形成単位（ＰＦＵ）ウイルス力価／０．１ｍＬを以下の計算式により計算する：ＰＦＵ力価／０．１ｍＬ＝Ｌｏｇ_１０（個々の力価の各希釈についてカウントされたプラークの平均）＋Ｌｏｇ_１０（希釈計数）。力価をｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして報告する。陰性対照がウェル内にプラークの兆候を示さず、陽性対照の力価が予想される力価範囲内にある場合、試験は妥当である。

ＢＲＳＶ効能：ＢＲＳＶの増殖に好適な細胞株をこの力価測定アッセイのために用いる。例えば、Ｖｅｒｏ細胞をフラスコまたはローラーボトル内でコンフルエントまで増殖させる。Ｖｅｒｏ細胞は抗生物質（ゲンタマイシン（１２〜５０μｇ／ｍＬ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ ５％）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補充したダルベッコ改変必須培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉａ、ＤＭＥＭ）上で増殖させることができる。力価測定プレートを、必要とされるおよそ２４時間前に準備する。Ｖｅｒｏ細胞の健常な単層から培地をデカンテーションする。細胞をＰＢＳで洗い流す。少量のトリプシン／ＥＤＴＡをフラスコ／ローラーボトルに加え、細胞を表面から脱離させる。フラスコ／ローラーボトルを次いで３７℃で５〜１０分間インキュベートするが、この時、表面からの脱離についてそれらを観察する。抗生物質、Ｌ−グルタミン、非必須アミノ酸、ラクトアルブミン加水分解物（ＬＡＨ ０．０５％）およびグルコース（０．３％）を添加したイーグル改変必須培地をトリプシン／ＥＤＴＡを含有するフラスコ（５〜２０ｍＬ）に加え、細胞をピペッティングして細胞凝集塊をばらばらにする。細胞の生存率カウントを決定するために対比染色を用いて、血球計数器を用いて細胞数を決定する。希釈剤としてＥＭＥＭを用いて、細胞を１×１０^５の終濃度に希釈する。マルチチャンネルピペットを用いて、１００μＬの希釈細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに加える。接種されたプレートを加湿されたインキュベーター内に３７℃、５％ ＣＯ_２で置いて、細胞を付着および増殖させる。ウイルス力価測定用の１０倍希釈のために用いられることになるチューブを、適切な量のＥＭＥＭを各々のチューブに加えることにより準備する。別のチューブに陰性対照のためのＥＭＥＭを充填する。ウイルス試料の１０倍希釈を準備されたチューブ内に作製する。力価がわかっている用意されたＢＲＳＶの基準品もまたＥＭＥＭ中で希釈し、陽性対照として用いる。

９６ウェルプレートがＶｅｒｏ細胞の健常な単層でコンフルエントであることを確実にして、１００μＬの各々の希釈ウイルス試料を９６ウェルＶｅｒｏ細胞プレートの適切なウェルにアプライする。陰性対照および陽性対照を包含する。プレート上のふたを交換し、加湿された３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に評価前におよそ８日間置く。８日目に、倒立顕微鏡を用いて細胞変性効果（ＣＰＥ）について９６ウェルプレートの各ウェルを評価する。陰性対照を最初に見て、各ウェルについてのベースラインであるバックグラウンドのデブリ量を決定する。各希釈についてＣＰＥ陽性ウェルの数を記録する。スピアマン−カーバー法を用いることによりウイルス力価を計算し、Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして報告する。陰性対照がウェル内にＣＰＥの兆候を示さず、陽性対照の力価が予想される力価範囲内にある場合、試験は妥当である。

ＰＩ３効能：ＰＩ３の増殖に好適な細胞株をこの力価測定アッセイのために用いる。例えば、Ｖｅｒｏ細胞をフラスコまたはローラーボトル内でコンフルエントまで増殖させる。Ｖｅｒｏ細胞は抗生物質（ゲンタマイシン（１２〜５０μｇ／ｍＬ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ ５％）およびＬ−グルタミン（２ｍＭ）を補充したダルベッコ改変必須培地（ＤＭＥＭ）上で増殖させることができる。Ｖｅｒｏ細胞の健常な単層から培地をデカンテーションする。細胞をＰＢＳで洗い流す。少量のトリプシン／ＥＤＴＡをフラスコ／ローラーボトルに加え、細胞を表面から脱離させる。フラスコ／ローラーボトルを次いで３７℃で５〜１０分間インキュベートするが、この時、表面からの脱離についてそれらを観察する。ゲンタマイシン、Ｌ−グルタミンおよび５％ ＦＣＳを添加したイーグル改変必須培地をトリプシン／ＥＤＴＡを含有するフラスコ（５〜２０ｍＬ）に加え、細胞をピペッティングして細胞凝集塊をばらばらにする。細胞の生存率カウントを決定するために対比染色（トリパンブルー）を用いて、血球計数器を用いて細胞数を決定する。希釈剤としてＥＭＥＭを用いて、細胞を１×１０^５の終濃度に希釈する。マルチチャンネルピペットを用いて、１００μＬの希釈細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに加える。接種されたプレートを加湿されたインキュベーター内に３７℃、５％ ＣＯ_２で置いて、細胞を付着および増殖させる。ウイルス力価測定用の１０倍希釈のために用いられることになるチューブを、適切な量のＥＭＥＭを各々のチューブに加えることにより準備する。別のチューブに陰性対照のためのＥＭＥＭを充填する。ウイルス試料の１０倍希釈を準備されたチューブ内に作製する。力価がわかっている用意されたＰＩ３の基準品もまたＥＭＥＭ中で希釈し、陽性対照として用いる。９６ウェルプレートがＶｅｒｏ細胞の健常な単層でコンフルエントであることを確実にして、１００μＬの各々の希釈ウイルス試料を９６ウェルＶｅｒｏ細胞プレートの適切なウェルにアプライする。陰性対照および陽性対照を包含する。プレート上のふたを交換し、加湿された３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター内に評価前におよそ７日間置く。７日目に、倒立顕微鏡を用いて細胞変性効果（ＣＰＥ）について９６ウェルプレートの各ウェルを評価する。陰性対照を最初に見て、各ウェルについてのベースラインであるバックグラウンドのデブリ量を決定する。各希釈についてＣＰＥ陽性ウェルの数を記録する。スピアマン−カーバー法を用いることによりウイルス力価を計算し、Ｌｏｇ_１０ ＴＣＩＤ_５０／ｍＬとして報告する。陰性対照がウェル内にＣＰＥの兆候を示さず、陽性対照の力価が予想される力価範囲内にある場合、試験は妥当である。

ＢＲＣＶ効能：ＭＤＢＫ細胞を、Ｌ−グルタミン、ウシ胎児血清および抗生物質を添加したＤＭＥＭ（増殖培地）を用いて、フラスコまたはローラーボトル内で、健常細胞のコンフルエントな単層が達成されるまで増殖させる。フラスコ／ボトルをデカンテーションし、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗い流す。ＰＢＳをデカンテーションし、十分なトリプシン含有溶液を加えて細胞を表面から脱離させる。培養物を３７℃インキュベーター内に戻して、細胞に脱離のための時間を与える。細胞が表面から脱離したら、用いられたトリプシンの２倍に相当する量の培地を細胞に加える。細胞を数回ピペッティングして、細胞凝集塊をばらばらにする。懸濁液中の非生存細胞のパーセンテージを決定するためにトリパンブルーを用いて、血球計数器または他の好適な方法を用いて生存カウントを行う。細胞懸濁液を次いで増殖培地で２×１０^５細胞／ｍｌに希釈する。マルチチャンネルピペッターを用いて、１００μＬの細胞懸濁液を９６ウェル組織培養プレートの各ウェルに加える。シードされたプレートを、約９０〜１００％のコンフルエンシーで単層が形成されるまで、３７℃、５％ ＣＯ_２、高湿度においてインキュベートする。生きたウイルスを含有する試料を接種培地（ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミン、抗生物質およびＩＸ型トリプシン）中で１０倍希釈する。ＢＲＣＶはトリプシン依存性ウイルスであり、それ故にウイルスを細胞に感染させるためにトリプシンを接種培地に加えなければならない。トリプシン依存性ウイルス用の希釈培地にＦＢＳを加えてはならない。９６ウェルプレートを用意したら、増殖培地をデカンテーションし、プレートをＰＢＳで洗浄する。ＭＤＢＫ細胞単層を含有する９６ウェルプレートからＰＢＳを除去し、直ちにウイルスの希釈試料をプレートにアプライする。量がわかっているウイルスを含有する陽性対照の希釈系列もまたプレートに加える。培地のみを含有する陰性対照系列もまたプレートに加える。プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２で５日間インキュベートする。５日後、プレートをインキュベーターから取り出し、顕微鏡を用いて、ウイルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）について細胞を観察する。ＣＰＥを示すウェルを陽性としてマークし、インタクトな細胞を有するウェルを陰性とみなす。スピアマン−カーバー法により陽性対照および試料のウイルス力価を計算し、ＴＣＩＤ_５０／ｍｌとして報告する。陰性対照ウェルが細胞変性効果の兆候を示さず、陽性対照が予想される範囲内にある場合、アッセイは妥当である。

結果／結論
ウシウイルスワクチンのための安定化製剤を調製し、次いでアルゴンガスを用いて注入し、０．２ｕｍ ＰＥＳボトルトップフィルターを用いてフィルター滅菌し、保存前にアルゴンガス重層をアプライした。充填の日、ウイルスを加えて混合し、次いでワクチン１ｍＬを２．２ｍＬガラスアンプル内に分注し、アルゴンガスで埋め戻し、炎で封入してインキュベートした。各安定剤組み合わせについて、ＢＲＳＶ、ＢＶＤＶ１およびＩＢＲの一価ワクチンを作製し、１５℃または２５℃でインキュベートした。先の結果によりこのウイルスはＢＲＳＶと同様に振る舞うことが指し示されたため、ＰＩ３は省略した。この予備実験により、驚くべきことに、ソルビトールおよびアルギニンの組み合わせを用いて、改良されたレベルの成功を、同様により単純化された安定剤が試験されたウイルスの範囲にわたってより良好に機能する傾向を得ることができることが示された。

次に、上で詳述された添加剤スクリーニングの観点で多数の製剤を比較するため、加速された（２５℃）および実時間の（４℃）安定性調査を設定した（表１を参照されたい）。安定化製剤を調製し、次いでアルゴンガスを用いて注入し、０．２ｕｍ ＰＥＳボトルトップフィルターを用いてフィルター滅菌し、保存前にアルゴンガス重層をアプライした。充填の日、ウイルスを加えて混合し、次いでワクチン１ｍＬを２．２ｍＬガラスアンプル内に分注し、アルゴンガスで埋め戻し、炎で封入してインキュベートした。組み合わせ試料約１０ｍＬもまたガラスおよびプラスチックのワクチンバイアル内に充填し、アルゴンガスを重層し、栓をして圧着封入した。

全部で１１の異なる製剤が多価ウシワクチンの液体安定性製剤の潜在的候補であることが判明した（表１）。例として４℃における実時間調査を、ＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２、ＩＢＲ、ＰＩ３およびＢＲＳＶを含む多価ワクチン製剤、ならびにＢＲＣＶの一価ワクチン製剤に対して行った。これらの調査結果を下の表２Ａおよび２Ｂ中に与える。

安定性試験は３ヶ月間隔で終了した。９ヶ月目で、調査を狭めるために製剤に対する評価を行った。安定化させるのが最も難しいワクチン抗原はＢＶＤＶ１およびＩＢＲであるように思われた。所与の製剤についての調査の中止は、少なくとも部分的に以下に基づくものであった：９ヶ月目で５のワクチン抗原のいずれかについて力価が対数で１より多く失われた；別の製剤と同等の結果であり、同じ成分を有するが、濃度がより高い；および／または同じ製剤を有するが、何らかの作用を持つように見えない付加的な成分を有する。１の時点で力価が急激に低下した全ての製剤は、それが実際の不安定性であるのか、またはアッセイにおけるばらつきであるのかを決定するため、（上の除外基準のうちのいずれかに該当しないかぎり）追加の時点について続行した。

本発明は、本明細書中に記載されている特定の実施形態により範囲が限定されるものではない。実際に、本明細書中に記載されているものに加えて、本発明の様々な改変が前述の記載から当業者に明らかになるものである。かかる改変は添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。

Claims (50)

1. 生きた弱毒化ウシウイルス、５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコール、ならびにアルギニン、グルタミン酸、グリシンおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される０．１５から０．７５Ｍのアミノ酸を含み；ｐＨが６．０から８．０である、液体安定性ワクチン。
2. 糖アルコールがソルビトールである、請求項１に記載の液体安定性ワクチン。
3. アミノ酸がアルギニンである、請求項２に記載の液体安定性ワクチン。
4. 生きた弱毒化ウシウイルスがウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ感染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、パラインフルエンザ３型ウイルス（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、ウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項３に記載の液体安定性ワクチン。
5. 非アルコール性糖である糖添加物をさらに含み、液体安定性ワクチン中の糖アルコールおよび非アルコール性糖の総量が１０〜４０％（ｗ／ｖ）である、請求項１に記載の液体安定性ワクチン。
6. 非アルコール性糖がショ糖およびトレハロースよりなる群から選択される、請求項１に記載の液体安定性ワクチン。
7. 抗酸化剤、界面活性剤およびキレート剤よりなる群から選択される構成成分をさらに含む、請求項１に記載の液体安定性ワクチン。
8. バッファーをさらに含む、請求項１に記載の液体安定性ワクチン。
9. バッファーが２．５から５０ｍＭのリン酸カリウムを含む、請求項８に記載の液体安定性ワクチン。
10. アミノ酸がアルギニンである、請求項１に記載の液体安定性ワクチン。
11. 生きた弱毒化ウイルスがＢＶＤＶである、請求項４に記載の液体安定性ワクチン。
12. ＢＶＤＶがＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２ならびにＢＶＤＶ１およびＢＶＤＶ２よりなる群から選択される、請求項１１に記載の液体安定性ワクチン。
13. 生きた弱毒化ＩＢＲをさらに含む、請求項１２に記載の液体安定性ワクチン。
14. 生きた弱毒化ＰＩ３をさらに含む、請求項１３に記載の液体安定性ワクチン。
15. 生きた弱毒化ＢＲＳＶをさらに含む、請求項１４に記載の液体安定性ワクチン。
16. 生きた弱毒化ＢＲＣＶをさらに含む、請求項１５に記載の液体安定性ワクチン。
17. 死滅ウシウイルスをさらに含む、請求項４に記載の液体安定性ワクチン。
18. 細菌をさらに含む、請求項４に記載の液体安定性ワクチン。
19. 細菌が生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ（Ｍａｎｎｈｅｉｍｉａ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃａ）、生きた弱毒化ヒストフィルス・ソムニ（Ｈｉｓｔｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｍｎｉ）、生きた弱毒化マイコプラズマ・ボビス（ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｂｏｖｉｓ）およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項１８に記載の液体安定性ワクチン。
20. 細菌が死滅パスツレラ・ムルトシダ、死滅マンヘミア・ヘモリチカ、死滅ヒストフィルス・ソムニ、死滅マイコプラズマ・ボビスおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項１８に記載の液体安定性ワクチン。
21. 請求項１６に記載の液体安定性ワクチンをウシに投与することを含む、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３型（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）およびウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）に対するワクチンをウシに接種する方法。
22. 前記投与が皮下注射により行われる、請求項２１に記載の方法。
23. 請求項１に記載の液体安定性ワクチンをウシに投与することを含む、ウシウイルスに対するワクチンをウシに接種する方法。
24. 前記投与が皮下注射により行われる、請求項２３に記載の方法。
25. 治療的有効量の生きた弱毒化ウシウイルスを５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールおよび０．１５から０．７５Ｍのアルギニンと組み合わせることを含む、液体安定性ワクチンを作製する方法であって；
    液体安定性ワクチンのｐＨが６．０から８．０である、方法。
26. アミノ酸がアルギニンである、請求項１または２に記載の液体安定性ワクチン。
27. 生きた弱毒化ウシウイルスがウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ感染性鼻気管炎ウイルス（ＩＢＲ）、パラインフルエンザ３型ウイルス（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、ウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項１、２または２６に記載の液体安定性ワクチン。
28. 非アルコール性糖である糖添加物をさらに含み、
    液体安定性ワクチン中の糖アルコールおよび非アルコール性糖の総量が１０〜４０％（ｗ／ｖ）である、請求項１、２、２６または２７に記載の液体安定性ワクチン。
29. 非アルコール性糖がショ糖およびトレハロースよりなる群から選択される、請求項１、２、２６、２７または２８に記載の液体安定性ワクチン。
30. 抗酸化剤、界面活性剤およびキレート剤よりなる群から選択される構成成分をさらに含む、請求項１、２、２６〜２８または２９に記載の液体安定性ワクチン。
31. バッファーをさらに含む、請求項１、２、２６〜２９または３０に記載の液体安定性ワクチン。
32. バッファーが２．５から５０ｍＭのリン酸カリウムを含む、請求項３１に記載の液体安定性ワクチン。
33. アミノ酸がアルギニンである、請求項１、２、２６〜３１または３２に記載の液体安定性ワクチン。
34. 生きた弱毒化ウイルスがＢＶＤＶである、請求項１、２、２６〜３２または３３に記載の液体安定性ワクチン。
35. ＢＶＤＶがＢＶＤＶ１、ＢＶＤＶ２ならびにＢＶＤＶ１およびＢＶＤＶ２よりなる群から選択される、請求項３４に記載の液体安定性ワクチン。
36. 生きた弱毒化ＩＢＲをさらに含む、請求項１、２、２６〜３４または３５に記載の液体安定性ワクチン。
37. 生きた弱毒化ＰＩ３をさらに含む、請求項１、２、２６〜３５または３６に記載の液体安定性ワクチン。
38. 生きた弱毒化ＢＲＳＶをさらに含む、請求項１、２、２６〜３６または３７に記載の液体安定性ワクチン。
39. 生きた弱毒化ＢＲＣＶをさらに含む、請求項１、２、２６〜３７または３８に記載の液体安定性ワクチン。
40. 死滅ウシウイルスをさらに含む、請求項１、２、２６〜３８または３９に記載の液体安定性ワクチン。
41. 細菌をさらに含む、請求項１、２、２６〜３９または４０に記載の液体安定性ワクチン。
42. 細菌が生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ、生きた弱毒化ヒストフィルス・ソムニ、生きた弱毒化マイコプラズマ・ボビスおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項４１に記載の液体安定性ワクチン。
43. 細菌が死滅パスツレラ・ムルトシダ、死滅マンヘミア・ヘモリチカ、死滅ヒストフィルス・ソムニ、死滅マイコプラズマ・ボビスおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項４１に記載の液体安定性ワクチン。
44. 請求項１〜２０、２６〜４２または４３に記載の液体安定性ワクチンをウシに投与することを含む、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３型（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、ウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択されるウイルスに対するワクチンをウシに接種する方法。
45. 前記投与が皮下注射により行われる、請求項４４に記載の方法。
46. 前記投与が経口的にまたは鼻腔内に行われる、請求項４４に記載の方法。
47. 治療的有効量の生きた弱毒化ウシウイルスおよび任意選択で細菌を、５〜４０％（ｗ／ｖ）の糖アルコールおよび０．１５から０．７５Ｍのアルギニンと組み合わせることを含む、請求項１〜２０、２６〜４２または４３に記載の液体安定性ワクチンを作製する方法であって；液体安定性ワクチンのｐＨが６．０から８．０である、前記方法。
48. ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、ウシ感染性鼻気管炎（ＩＢＲ）ウイルス、パラインフルエンザ３型（ＰＩ３）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（ＢＲＳＶ）、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、ウシ呼吸器コロナウイルス（ＢＲＣＶ）およびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択されるウイルスに対する、ならびにパスツレラ・ムルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ、ヒストフィルス・ソムニ、マイコプラズマ・ボビスおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される細菌に対するワクチンをウシに接種する方法であって：
    ａ．請求項１〜２０、２６〜４０または４１に記載の液体安定性ワクチンを、パスツレラ・ムルトシダ、マンヘミア・ヘモリチカ、ヒストフィルス・ソムニ、マイコプラズマ・ボビスおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される細菌を含む細菌製剤と組み合わせることで、組み合わせワクチンを形成させること；ならびに
    ｂ．組み合わせワクチンをウシに投与すること
    を含む、前記方法。
49. 細菌が生きた弱毒化パスツレラ・ムルトシダ、生きた弱毒化マンヘミア・ヘモリチカ、生きた弱毒化ヒストフィルス・ソムニ、生きた弱毒化マイコプラズマ・ボビスおよびそれらの任意の組み合わせよりなる群から選択される、請求項４８に記載のワクチン接種方法。
50. 細菌製剤が凍結乾燥物（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓａｔｅ）として保存される、請求項４８または４９に記載のワクチン接種方法。