MX2015002316A - Vacunas de virus liquidas estables. - Google Patents

Vacunas de virus liquidas estables.

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Abstract

La presente invención describe vacunas líquidas estables que comprenden un virus vivo atenuado, 10-30 % de un aditivo de azúcar, y un aminoácido; la presente invención también describe la fabricación de estas vacunas y métodos de protección de un animal mediante la administración de estas vacunas.

Description

VACUNAS DE VIRUS LÍQUIDAS ESTABLES REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama la prioridad de conformidad con 35 U.S.C. § 119(e) de las solicitudes provisionales de EE. UU. Nos. de serie 61/691,507, presentada el 21 de agosto de 2012; y 61/777,164, presentada el 12 de marzo de 2013, el contenido de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
CAMPO DELAINVENCIÓN La presente invención se refiere a vacunas líquidas estables que comprenden un virus vivo atenuado. La invención también se refiere a la fabricación de tales vacunas, y a métodos para vacunar sujetos animales.
ANTECEDENTESDELAINVENCIÓN Existe un número significativo de virus que pueden infectar a perros y/o gatos. Aunque los síntomas debidos a las infecciones virales correspondientes pueden Incluir, por ejemplo, síntomas leves de tipo resfriado, otros pueden ser rápidamente fatales, como en el caso de las infecciones del virus del moquillo canino (CDV) [véase, por ejemplo, US2010/0196420], En realidad, el CDV desencadena una infección multisistémica que puede implicar el sistema ocular, respiratorio, Integumentario y nervioso. La tasa de mortalidad del parvovirus canino (CPV) también es relativamente alta (véase, por ejemplo, US2009/0010955]. El CPV es principalmente un patógeno entérico que infecta a los perros, especialmente los perros jóvenes, y se caracteriza por diarrea aguda, fiebre y leucopenia en perros y cachorros de más de 4 a 5 semanas de edad. Cachorros incluso más jóvenes pueden sufrir enfermedad miocárdica. El virus del moquillo canino y el parvovirus canino son los dos virus caninos más importantes contra los que se debe proteger a los cachorros/perros.
Virus caninos adicionales incluyen: virus de la parainfluenza canina (CPI), que es un virus muy contagioso que causa enfermedad respiratoria que contribuye a la contracción de enfermedades respiratorias superiores y traqueobronquitis infecciosa; el adenovirus canino de tipo 1 (CAVI) que produce hepatitis infecciosa; y el virus de la influenza canina (CIV) que es muy contagioso y puede causar un tipo severo de enfermedad respiratoria. Se ha reportado que el CIV es capaz de causar 100% de infección, con 80% de morbilidad y hasta 5-8% de mortalidad en infecciones severas [Crawford et al., Science 310(5747): 482-485 (2005); U.S. 7,959,929 B2]. Similarmente, existen varios virus fenilos que afectan a ios gatos, que incluyen el calicivirus felino (FCV), virus de la leucemia felina (FeLV), virus de la panleucopenia felina (FPLV), coronavirus felino (FCoV), y virus de rinotraqueitis felina (FVR).
Ahora se acepta ampliamente que la mejor forma de prevenir la enfermedad debida a infecciones virales caninas o felinas es vacunarlos contra estos virus. En realidad, las vacunas del virus de moquillo canino ha reducido significativamente el predominio de la enfermedad correspondiente. Similarmente, la hepatitis canina infecciosa ha sido sumamente limitada por las vacunas de adenovirus canino 2 (CAV2). El uso de CAV2 vivo atenuado en las vacunas en lugar de CAVI, estrechamente relacionado, elimina los problemas con respecto a la nefritis intersticial y opacidad corneal observadas en los perros en los que se ha inoculado el CAVI vivo atenuado paguchi etai, Can VetJ. 52(9): 983-986 (2011)].
Además, las vacunas multivalentes de virus vivo atenuado pueden ser administradas con seguridad que limitan el número de inyecciones de vacuna requeridas. Por consiguiente, existen varias vacunas multivalentes de virus vivos atenuados disponibles comercialmente que protegen contra el moquillo canino, hepatitis infecciosa canina, parvovirus canino y virus de parainfluenza canina. Además, también las vacunas multivalentes más nuevas protegen también contra el virus de la influenza canina.
Hasta ahora, los virus caninos y felinos atenuados han sido inestables cuando se almacenan en soluciones líquidas. Por lo tanto, la mayoría de las vacunas de virus canino o felino vivo atenuado son liofilizadas, es decir, criodesecadas, antes de su almacenamiento a largo plazo. El virus canino o felino vivo atenuado se mezcla comúnmente como una suspensión en agua con un agente protector, se congela y después se deshidrata por sublimación y secado secundario durante el proceso de liofilización. Las bajas temperaturas de la congelación y secado por sublimación, junto con las relaciones bajas de superficie a volumen, pueden requerir periodos de secado largos y con ello aumentan significativamente el tiempo y costo de fabricación.
Además, existen inconsistencias inherentes en los procesos de secado comerciales grandes, debido a: la incapacidad para ajustar la temperatura del estante en toda la carga de producto, velocidades de congelación variables en el secador, efectos de borde y efectos de energía radiante. Frecuentemente, el aumento de la temperatura de secado para reducir los tiempos de secado no es una opción, puesto que la temperatura de secado tiene que permanecer significativamente por abajo de la temperatura de transición de vidrio de la matriz de proteína protectora. Además, frecuentemente los tiempos de secado inconsistentemente largos y/o temperaturas de secado altas producen daño estructural de los virus vivos atenuados, junto con una pérdida significativa de su actividad biológica.
Consecuentemente, para contrarrestar la pérdida inherente de eficacia, las vacunas caninas y/o felinas liofilizadas que comprenden virus vivos atenuados se almacenan con títulos aumentados. Sin embargo, estos títulos aumentados pueden producir eventos adversos significativos si el proceso de liofilización produce en realidad menos pérdida de actividad que la prevista. Por lo tanto, se requiere tener mucho cuidado para formular una vacuna que contenga un título de virus que no sólo esté con seguridad por abajo de la cantidad que produce eventos adversos, sino que también mantenga suficiente eficacia en vista de la pérdida del título del virus debido a la liofilización y almacenamiento subsiguiente. Por lo tanto, existe la necesidad de nuevas vacunas de virus vivos atenuados caninos y/o felinos que puedan retener confiablemente sus títulos de virus en un nivel seguro y eficaz.
La cita de cualquier referencia en la presente no se debe considerar como una admisión de que tal referencia esté disponible como "téenica anterior" a la presente solicitud.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Para superar las deficiencias de las vacunas actuales, la presente invención provee vacunas líquidas estables de virus vivo atenuado novedosas, así como también sus composiciones ¡nmunogénicas correspondientes. En algunas modalidades, el virus vivo atenuado es un virus canino vivo atenuado. En otras modalidades, el virus vivo atenuado es un virus felino vivo atenuado. La presente invención también provee métodos de administración de estas vacunas a un animal. La presente invención provee, además, métodos de prevención de una enfermedad en un animal mediante la administración de una vacuna de la presente invención. En modalidades particulares, el animal es un can. En otras modalidades, el animal es un animal felino.
Por consiguiente, la presente invención provee vacunas líquidas estables que comprenden un virus vivo atenuado. En algunas modalidades, el virus vivo atenuado es un virus recombinante. En modalidades particulares de este tipo, el virus recombinante se utiliza como un vector recombinante que codifica una proteína heterogénea. En modalidades más particulares de este tipo, la proteína heterogénea es un antígeno de virus o bacteriano.
En modalidades particulares, la vacuna comprende un aditivo de azúcar y un aminoácido. En ciertas modalidades de este tipo, la vacuna comprende de 10% a 30% de aditivo de azúcar. En modalidades particulares, la vacuna comprende de 12% a 27% de aditivo de azúcar. En ciertas modalidades, la vacuna comprende de 15% a 25% de aditivo de azúcar. En modalidades relacionadas, la vacuna comprende de 15% a 20% de aditivo de azúcar. En otras modalidades, la vacuna comprende de 20% a 25% de aditivo de azúcar. En modalidades más particulares, la vacuna comprende de 16% a 18% de aditivo de azúcar. En modalidades aún más particulares, la vacuna comprende 17% de aditivo de azúcar.
En modalidades particulares de las vacunas de virus líquidas estables de la presente invención, el aditivo de azúcar es la sacarosa. En otras modalidades, el aditivo de azúcar es el sorbitol. En otras modalidades más, el aditivo de azúcar es el manitol. En otras modalidades más, el aditivo de azúcar es la trehalosa. En otras modalidades más, el aditivo de azúcar es la dextrosa. En modalidades particulares, el aditivo de azúcar en realidad es una combinación de dos o más aditivos de azúcar. En una modalidad particular de este tipo, el aditivo de azúcar es una combinación de sacarosa y sorbitol. En una modalidad más particular de este tipo, el aditivo de azúcar es una combinación de 15% de sacarosa y 10% de sorbitol.
El pH de las vacunas líquidas estables de la presente invención puede variar de 6.0 a 8.0. En ciertas modalidades, la escala de pH es de 6.5 a 7.8. En modalidades particulares, la escala de pH es de 6.8 a 7.5. En modalidades más particulares, la escala de pH es de 7.0 a 7.4. En una modalidad aún más particular, el pH es de 7.2.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender un amortiguador. En una modalidad particular de este tipo, el amortiguador comprende Tris de 2.5 mM a 50 mM. En una modalidad relacionada, el amortiguador comprende Tris de 5 mM a 25 mM. En modalidades particulares, el amortiguador comprende Tris de 10 mM a 20 mM. En otras modalidades, el amortiguador puede comprender histidina de 2.5 mM a 50 mM. En modalidades particulares, el amortiguador comprende Tris de 2.5 mM a 50 mM, e histidina de 2.5 mM a 50 mM. En modalidades más particulares, el amortiguador comprende Tris de 5 mM a 25 mM, e histidina de 5 mM a 25 mM. En modalidades aún más particulares, el amortiguador comprende Tris de 10 mM a 20 mM, e histidina de 10 mM a 20 mM. En otras modalidades, el amortiguador comprende fosfato de 2.5 mM a 50 mM. En una modalidad relacionada, el amortiguador comprende fosfato de 5 mM a 25 mM. En modalidades particulares, el amortiguador comprende fosfato de 10 mM a 20 mM.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención comprenden un aminoácido. En ciertas modalidades el aminoácido es la arginina. En ciertas modalidades el aminoácido es la metlonina. En otras modalidades el aminoácido es la glicina. En otras modalidades más, el aminoácido es el ácido glutámlco. En modalidades relacionadas, las vacunas líquidas estables comprenden tanto arginina como metionina. En otras modalidades, las vacunas líquidas estables comprenden tanto arginina como glicina. En otras modalidades más, las vacunas líquidas estables comprenden tanto glicina como metionina. En modalidades relacionadas, las vacunas líquidas estables comprenden tanto ácido glutámico como metionina. En otras modalidades, las vacunas líquidas estables comprenden tanto ácido glutámico como glicina. En otras modalidades más, las vacunas líquidas estables comprenden tanto ácido glutámico como arginina. En modalidades relacionadas, las vacunas líquidas estables comprenden arginina, ácido glutámico y metionina. En otras modalidades, las vacunas líquidas estables comprenden arginina, ácido glutámico y glicina. En otras modalidades más, las vacunas líquidas estables comprenden arginina, ácido glutámico y metionina. En otras modalidades más, las vacunas líquidas estables comprenden arginina, glicina y metionina. En otras modalidades más, las vacunas líquidas estables comprenden arginina, glicina y metionina. En modalidades particulares, las vacunas líquidas estables comprenden arginina, glicina, metionina y ácido glutámico.
En modalidades particulares, la concentración final de arginina, ácido glutámico o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.15 M a 0.6 M. En modalidades relacionadas, la concentración final de arginina, ácido glutámico o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.2 M a 0.5 M. En modalidades más particulares, la concentración final de arginina, ácido glutámico o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.25 M a 0.35 M. En modalidades aún más particulares, la concentración final de arginina, ácido glutámico o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.3 M.
En modalidades particulares, la concentración combinada final de arginina y/o ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.15 M a 0.6 M. En modalidades relacionadas, la concentración combinada final de arginina y/o ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.2 M a 0.5 M. En modalidades más particulares, la concentración combinada final de arginina y/o ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.25 M a 0.35 M. En modalidades aún más particulares, la concentración combinada final de arginina y/o ácido glutámico y/o glicina en la vacuna líquida estable es de 0.3 M.
En modalidades particulares, la concentración final de metionina en la vacuna líquida estable es de 0.025 M a 0.3 M. En modalidades relacionadas, la concentración final de metionina en la vacuna líquida estable es de 0.04 M a 0.15 . En modalidades más particulares, la concentración final de metionina en la vacuna líquida estable es de 0.06 M a 0.09 M. En modalidades aún más particulares, la concentración final de metionina en la vacuna líquida estable es de 0.07 M.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención también pueden comprender una proteína estabillzadora. La proteína estabillzadora puede ser una proteína intacta y/o un hidrolizado de proteína. En modalidades particulares, la proteína estabillzadora es la gelatina. En modalidades más particulares, la proteína estabillzadora contenida por la vacuna líquida estable de la presente invención es gelatina de 0.4% a 1.6%. En modalidades alternativas, la proteína estabillzadora es un hidrolizado de caseína entera. En modalidades particulares de este tipo, la proteína estabilizadora contenida por la vacuna líquida estable de la presente invención es un hidrolizado de caseína entera a 0.5-2.0 %. En ciertas modalidades, el hidrolizado de caseína entera es un hidrolizado proteolítico de caseína entera.
Además, las vacunas líquidas estables de la presente invención también pueden comprender un alcohol. En modalidades particulares de este tipo, el alcohol es el etanol. En modalidades más particulares, la vacuna líquida estable comprende de 0.25% a 1.0% de etanol. En modalidades relacionadas, las vacunas líquidas estables de la presente invención también pueden comprender sulfato de dextrano. En modalidades particulares, la vacuna líquida estable comprende sulfato de dextrano de 1 mM a 20 mM. En modalidades más particulares, la vacuna líquida estable comprende sulfato de dextrano de 2.5 mM a 10 mM. En modalidades aún más particulares, la vacuna líquida estable comprende sulfato de dextrano a 5 mM.
Además, las vacunas líquidas estables de la presente invención también pueden comprender un agente quelante. Estos agentes quelantes pueden incluir, sin limitación: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,2-b¡s(o-aminofenoxi)etano-N,N(N',N'-tetraacét¡co (BAPTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), ácido dietilentriamino pentaacético (DTPA), y ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico (DMPS). La concentración de estos agentes quelantes en las vacunas líquidas de la presente invención puede variar aproximadamente de 50 mM a 10 mM.
En ciertas modalidades, el agente quelante es el EDTA. En modalidades particulares, la vacuna líquida estable comprende EDTA de 50 mM a 10 mM. En ciertas modalidades de este tipo, la vacuna líquida estable comprende EDTA de 50 pM a 200 pM. En otras modalidades, la vacuna líquida estable comprende EDTA de 250 pM a 7.5 mM. En otras modalidades más, la vacuna líquida estable comprende EDTA de 0.5 mM a 5.0 mM. En otras modalidades más, la vacuna líquida estable comprende EDTA de 1.0 mM a 3.0 mM. En modalidades más particulares, la vacuna líquida estable comprende EDTA a aproximadamente 2 mM.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención también pueden comprender un adyuvante. En modalidades particulares de este tipo, el adyuvante es el fosfato de aluminio En otras de estas modalidades, el adyuvante es el hidróxido de aluminio. En otras modalidades más, el adyuvante es un adyuvante de copolímero de bajo peso molecular que puede formar entrelazamiento en solución, para convertirse en un gel de alto peso molecular. En otras modalidades más, el adyuvante está formado de partículas de gel de acrilato de sodio en agua. En otras modalidades más, el adyuvante es una combinación de dos o más de estos adyuvantes.
En ciertas modalidades, las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender también un barredor de radicales libres y/o un antioxidante. En modalidades relacionadas, las vacunas líquidas estables de la presente invención se mantienen en recipientes sellados que tienen un gas inerte, tal como argón, nitrógeno o helio, arriba del líquido (por ejemplo, han sido rellenados con el gas inerte).
Las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender un virus canino vivo atenuado. En ciertas modalidades, el virus canino vivo atenuado es el virus del moquillo canino. En otras modalidades, el virus canino vivo atenuado es el adenovirus canino de tipo 2. En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el parvovirus canino (CPV), En una modalidad particular de este tipo, el parvovirus canino es un parvovirus canino 2 (CPV-2). En otra modalidad particular de este tipo, el parvovirus canino es un parvovirus canino 2a (CPV2a). En otra modalidad particular de este tipo, el parvovirus canino es un parvovirus canino 2b (CPV2b). En otra modalidad particular de este tipo, el parvovirus canino es un parvovirus canino 2c (CPV2c). En una modalidad específica de este tipo, el CPV2c es del registro ATCC No. PTA13492. En otra modalidad más, el parvovirus canino es un parvovirus canino recombinante que ha sido construido para comprender un genoma de CPV-2c/CPV-2 heterogéneo, es decir, la región que codifica las proteínas de la cápslde es de un aislado de CPV-2c, y la región que codifica las proteínas no estructurales es de un aislado de CPV-2.
En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el virus de la parainfluenza canina.
En modalidades particulares, el virus de la parainfluenza canina es un vector recombinante. En modalidades más particulares, el virus recombinante de la parainfluenza canina codifica y expresa una proteína heterogénea. En ciertas modalidades de este tipo, la proteína heterogénea es un antígeno no canino. En modalidades más particulares, el antígeno es un antígeno viral o bacteriano de aves. En ciertas modalidades, el virus recombinante de la parainfluenza canina es un vims 5 de parainfluenza recombinante.
En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el coronavirus canino. En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el pneumovirus canino. En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el virus de la hepatitis infecciosa canina. En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el herpesvirus canino. En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el virus de la rabia. En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el virus diminuto canino. En otras modalidades más, el virus canino vivo atenuado es el virus de la influenza canina. En modalidades alternativas, el virus vivo atenuado es un virus de pseudorrabia.
Las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender un virus felino vivo atenuado. En ciertas modalidades, el virus felino vivo atenuado es el herpesvirus felino (FHV). En otras modalidades, el virus felino vivo atenuado es el calicivirus felino (FCV). En otras modalidades, el virus felino vivo atenuado es el pneumovirus felino (FPN). En otras modalidades más, el virus felino vivo atenuado es el parvovirus felino (FPV). En otras modalidades más, el virus felino vivo atenuado es el virus de la leucemia felina (FeLV). En otras modalidades más, el virus felino vivo atenuado es el virus de la peritonitis infecciosa felina (FIPV). En otras modalidades, el virus felino vivo atenuado es el virus de inmunodeficiencia felina (FIV). En otras modalidades más, el virus felino vivo atenuado es el virus de la enfermedad de Boma (BDV). En otras modalidades más, el virus felino vivo atenuado es el virus de la influenza felina. En otras modalidades más, el virus felino vivo atenuado es el virus de la panleucopenia felina (FPLV). En otras modalidades, el virus felino vivo atenuado es el coronavirus felino (FCoV). En otras modalidades más, el virus felino vivo atenuado es el virus de la rinotraqueitis felina (FVR).
Además, la presente invención provee vacunas líquidas estables que son vacunas multivalentes. En modalidades particulares, las vacunas multivalentes de la presente invención comprenden solo vacunas de virus vivos atenuados. Estas vacunas multivalentes pueden contener cualquier combinación de virus vivos atenuados. En modalidades particulares de este tipo, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado y un parvovirus canino vivo atenuado. En modalidades relacionadas, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado y un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado. En otras modalidades, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado y un virus de la parainfluenza canina vivo atenuado. En otras modalidades más, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, y un virus de la paralnfluenza canina vivo atenuado. En otras modalidades más, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, y un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado.
En otras modalidades más, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, y un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado. En otras modalidades más, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, y un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado. En modalidades particulares, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, y un coronavirus canino vivo atenuado. En modalidades relacionadas, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, y un coronavirus felino vivo atenuado. En modalidades particulares de este tipo, la vacuna multivalente comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, y un virus de influenza canina vivo atenuado.
En otras modalidades, la presente invención provee vacunas líquidas estables que son vacunas multivalentes que comprenden un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado y un virus de parainfluenza canina vivo atenuado. En otras modalidades más, la vacuna multivalente comprende un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado y un parvovirus canino vivo atenuado. En otras modalidades más, la vacuna multivalente comprende un parvovirus canino vivo atenuado y un virus de la parainfluenza canina vivo atenuado. En otras modalidades más, la vacuna multivalente comprende un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, y un virus de la parainfluenza canina vivo atenuado. En modalidades particulares de este tipo, la vacuna multivalente comprende un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, y un virus de influenza canina vivo atenuado.
Alternativamente, las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender también un virus muerto y/o una bacteria muerta (por ejemplo, una bacterina) y/o una subfracción de una bacterina. Por consiguiente, cualquiera de las vacunas líquidas estables de la presente Invención que comprenden una o más vacunas de virus vivos atenuados, también pueden comprender un virus muerto y/o bacteria muerta, y/o una subfracción de una bacterina. En modalidades particulares, el virus muerto es un virus de la influenza canina. En otras modalidades, el virus muerto es un pneumovirus canino. En otras modalidades más, el virus muerto es un coronavirus canino. En otras modalidades más, una vacuna líquida estable de la presente invención puede comprender dos o más de estos virus muertos.
En ciertas modalidades, la bacteria muerta es una Bordetella bronchiseptíca. En otras modalidades más, la bacteria muerta es una especie de Mycoplasma. En otras modalidades más, la bacteria muerta es una Ehriichia canis. En otras modalidades más, la bacteria muerta es una especie de Anaplasma. En otras modalidades, más la bacteria muerta es una Leptospira . En una de estas modalidades, la Leptospira es Leptospira carneóla. En otra modalidad, la Leptospira es Leptospira grippotyphosa. En otra modalidad, la Leptospira es Leptospira hardjo. En otra modalidad más, la Leptospira es Leptospira icterohaemorrhagiae. En otra modalidad más, la Leptospira es Leptospira Pomona. En otra modalidad más, la Leptospira es Leptospira interrogaos. En otra modalidad más, la Leptospira es Leptospira autmnaiis. En otra modalidad más, la Leptospira es Leptospira Bratisiava. En otras modalidades más, una vacuna líquida estable de la presente Invención puede comprender dos o más de estas bacterias muertas. En una modalidad particular, la vacuna líquida estable comprende Leptospira canicoia, Leptospira grippotyphosa, Leptospira Pomona, y Leptospira icterohaemorrhagia.
La presente invención también provee métodos para ayudar a la protección de un animal felino o canino contra una enfermedad clínica que se origina por una infección de virus canino o felino, que comprenden administrar una vacuna de la presente invención al animal. En ciertas modalidades, la administración se realiza por vía mucosal. En otras modalidades, la administración se realiza por vía parenteral. En otras modalidades más, la administración se realiza por vía intradérmica. En otras modalidades más, la administración se realiza por vía transdérmica. En modalidades más específicas, una vacuna de la presente invención se le administra al animal por vía subcutánea. En otras modalidades específicas, una vacuna de la presente Invención se le administra al animal por vía intramuscular. La presente invención también incluye el uso de vacunas primarias y/o de refuerzo.
En modalidades particulares, el sujeto animal es un can y el método comprende administrarle al can una vacuna líquida estable de la presente invención que comprende un virus vivo atenuado. En modalidades específicas, la vacuna líquida estable comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, y un virus de parainfluenza canina vivo atenuado. En ciertas modalidades de este tipo, la vacuna líquida estable comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, y un virus de influenza canina vivo atenuado. En otras modalidades de este tipo, la vacuna líquida estable comprende un virus del moquillo canino vivo atenuado, un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, un virus de parainfluenza canina vivo atenuado, y un virus de influenza canina muerto atenuado.
También se proveen métodos de preparación de todas y cada una de las vacunas líquidas estables de la presente invención. En algunas modalidades, el método comprende combinar una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus vivo atenuado con un aditivo de azúcar a 10-30 %, un aminoácido, y una solución amortiguadora de pH 6.0 a pH 8.0, para formar una vacuna líquida estable. El aminoácido puede ser arginina, glicina, ácido glutámico, metionina, o combinaciones de arginina, glicina, ácido glutámico y/o metionina. En modalidades particulares, la arginina y/o glicina y/o ácido glutámico tiene una concentración final de 0.15 M a 0.6 M en la vacuna líquida estable. En ciertas modalidades, la metionina tiene una concentración final de 0.025 M a 0.3 M en la vacuna líquida estable. En modalidades particulares, la cantidad terapéuticamente eficaz del virus vivo atenuado es una cantidad terapéuticamente eficaz de un virus canino vivo atenuado. En modalidades específicas de este tipo, la cantidad terapéuticamente eficaz del virus canino vivo atenuado incluye cantidades terapéuticamente eficaces de un virus de moquillo canino vivo atenuado, un adenovirus canino de tipo 2 vivo atenuado, un parvovirus canino vivo atenuado, y un virus de parainfluenza canina vivo atenuado.
Estos y otros aspectos de la presente invención se apreciarán mejor haciendo referencia a la siguiente descripción detallada.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A diferencia de las vacunas de virus muertos, las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención están atenuadas. Hasta ahora, se requería tener particular cuidado al formular tales vacunas de virus vivo atenuado para mantener el título de los virus atenuados a un nivel que sea con seguridad menor del que puede producir un evento adverso significativo. En realidad, la mayoría de las vacunas de virus vivos atenuados caninos o felinos son liofilizadas, y la liofilización puede producir disminución sustancial de la eficacia de las vacunas de virus vivo atenuado, debido tanto al proceso mismo de la liofilización, como también por el tiempo durante su almacenamiento a largo plazo.
La presente invención ha superado este problema suministrado vacunas líquidas estables que permanecen eficaces, incluso durante almacenamiento, sin la necesidad de aumentar el título inicial del antígeno viral vivo atenuado por arriba de un nivel confiablemente seguro. Como un beneficio adicional, la presente invención provee un medio para reducir el costo de fabricación de las vacunas, provisto mediante la reducción significativa en la cantidad de virus vivos atenuados necesarios para hacer esta vacuna segura y eficaz. Además, las vacunas de virus vivos atenuados de la presente invención son más convenientes de usar que sus contrapartes liofilizadas. Por consiguiente, la presente invención provee vacunas de virus vivos atenuados, seguras y eficaces, que se pueden almacenar como líquidos a temperaturas de refrigeración y permanecer todavía estables durante 12 a 18 meses, o incluso más tiempo.
Además, sorprendentemente, las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención pueden incluir virus caninos y/o felinos de cualquier tipo. De esta manera, las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención pueden incluir virus tanto envueltos como no envueltos. Además, las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención pueden incluir virus vivos atenuados que tienen genomas de ARN de una sola cadena, genomas de ADN de una sola cadena, o genomas de ADN de doble cadena.
Además, las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención también pueden comprender vectores caninos o felinos recombinantes que están solos, y/o con otros de estos vectores recombinantes, y/o con virus caninos o felinos vivos atenuados, y/o en combinación con bacterias muertas y/o virus caninos o felinos muertos. Estos vectores caninos o felinos recombinantes pueden codificar adicionalmente uno o más antígenos heterólogos virales o bacterianos. Un ejemplo particular de tal vector recombinante es un virus 5 de parainfluenza canina recombinante, que recientemente ha sido descrito por Li et al. [7. of Virology 87(10) 5985-5993 (2013); que se incorpora aquí como referencia en su totalidad].
Los vectores recombinantes de las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención, tal como un virus de parainfluenza 5 recombinante, pueden codificar un antígeno heterólogo de un virus canino, y/o un virus felino, y/o un virus humano, y/o un virus de simio, y/o un virus bovino, y/o un virus ovino, y/o un virus porcino, y/o un virus aviar (por ejemplo, un virus de pollo). En modalidades particulares, las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención comprenden un virus de parainfluenza 5 recombinante que codifica uno o más antígenos de uno o más virus de pollo.
Sorprendentemente, en presencia de un agente quelante (por ejemplo, EDTA a 2 mM) y/o un adyuvante (por ejemplo, fosfato de aluminio), las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención retienen su estabilidad incluso cuando se incluyen en la formulación bacterias muertas (véase más abajo el ejemplo 2). Por consiguiente, las vacunas líquidas estables de virus vivos de la presente invención pueden comprender adicionalmente uno o más virus y/o bacterias caninas o felinas muertas (por ejemplo, bacterinas), y/o subfracciones de una bacterina.
El uso de los términos singulares por conveniencia en la descripción, de ninguna manera se considera limitativo. De esta manera, por ejemplo, la referencia a "un aditivo de azúcar" incluye la referencia a uno o más de estos aditivos de azúcar, a menos que se especifique de otra manera. El uso de los términos plurales tampoco se considera limitativo a menos que se especifique de otra manera. Similarmente, un compuesto químico que puede ser referido como un ácido o su base correspondiente, a menos que se especifique de otra manera, cuando se denota aquí como cualquiera de ellos, significa cualquier forma del compuesto. De esta manera, el uso del término ácido glutámico incluye glutamato y viceversa.
Como se usa en la presente, una "vacuna" es una composición que es adecuada para su aplicación a un animal (que incluye humanos en algunas modalidades), que después de la administración al animal induce una respuesta inmune suficientemente fuerte para ayudar mínimamente en la protección contra una enfermedad clínica que se origina por una infección con un microorganismo de tipo silvestre, esto es, suficientemente fuerte para ayudar a la prevención de la enfermedad clínica, y/o para prevenir, mejorar o curar la enfermedad clínica. A menos que se indique expresamente de otra manera, el uso del término vacuna incluye vacunas multivalentes.
Como se usa en la presente, una "vacuna multivalente" es una vacuna que comprende dos o más antígenos diferentes. En una modalidad particular de este tipo, la vacuna multivalente estimula al sistema inmune del receptor contra dos o más patógenos diferentes.
Como se usa en la presente, una vacuna "líquida estable" es una vacuna mantenida como un líquido (que incluye una vacuna multivalente líquida) que permanece eficaz durante por lo menos un año cuando se almacena a 7°C o menos (por ejemplo, en un refrigerador estándar, y/o a 0°C - 7°C). En modalidades particulares, una vacuna líquida estable permanece eficaz cuando se almacena a 7°C o menos durante por lo menos 1.5 años. En modalidades más particulares, una vacuna líquida estable permanece eficaz cuando se almacena a 7°C o menos durante por lo menos 2 años. En modalidades más particulares, una vacuna líquida estable permanece eficaz cuando se almacena a 7°C o menos durante por lo menos 2.5 a 3 años.
Como se usan en la presente, los términos "proteger", "que protege", "proveer protección", "que provee protección", y "ayuda en la protección" no requieren protección completa de cualquier indicación de infección. Por ejemplo, "ayuda en la protección" puede significar que la protección es suficiente para que, después de la provocación, los síntomas de la Infección subyacente por lo menos se reduzcan, y/o se reduzcan y/o eliminen una o más de las causas o mecanismos celulares, fisiológicos o bioquímicos subyacentes que causan los síntomas. Se entiende que "reducir", como se usa en este contexto, significa con respecto al estado de la infección, que incluye el estado molecular de la Infección, no sólo el estado fisiológico de la infección.
Como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de un antígeno dado, por ejemplo, virus vivo atenuado, que es suficiente para proveer protección y/o ayudar en la protección del patógeno contra el que se administra el antígeno para proteger, cuando se provee en una sola administración, y/o cuando se desea, provista como una administración inicial con una o más administraciones de refuerzo subsiguientes.
Como se usa en la presente, una vacuna "eficaz" comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un antígeno dado.
Como se usa en la presente, el término "farmacéuticamente aceptable" se usa adjetivamente para indicar que el nombre modificado es apropiado para usarse en un producto farmacéutico. Cuando se usa, por ejemplo para describir un excipiente en una vacuna farmacéutica, caracteriza al excipiente como compatible con los otros ingredientes de la composición y no inconvenientemente nocivo para el receptor deseado.
El término "vehículo" se refiere a un dlluente, adyuvante, o excipiente con el cual se administra el compuesto. Los vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, tales como agua y/o aceites, que incluyen los de origen de petróleo, animal, vegetal o sintético, tales como aceite de cacahuate, aceite de soya, aceite mineral, aceite de ajonjolí y similares. El agua o soluciones acuosas salinas y soluciones acuosas de dextrosa y glicerol se pueden utilizar como vehículos, particularmente para soluciones inyectables.
Como se usa en la presente, un "adyuvante" es una sustancia que es capaz de favorecer o amplificar la cascada de eventos inmunológicos, llevando finalmente a una mejor respuesta inmunológica, es decir, la respuesta a un antígeno integrada corporalmente. En general, para que ocurra la respuesta inmunológica no es necesario un adyuvante, pero éste favorece o amplifica esta respuesta.
Como se usa en la presente, "administración sistémica", es la administración en el sistema circulatorio del cuerpo (que comprende el sistema cardiovascular y linfático), afectando así al cuerpo en su conjunto más que un lugar específico tal como el tracto gastrointestinal (por ejemplo, por medio de administración oral o rectal) y el sistema respiratorio (por ejemplo, por medio de administración intranasal). La administración sistémica se puede realizar, por ejemplo, administrando en el tejido muscular (intramuscular), en la dermis (intradérmica, transdérmica o supradérmica), debajo de la piel (subcutánea), debajo de la mucosa (submucosal), en las venas (intravenosa), etc.
La "administración parenteral" incluye inyecciones subcutáneas, inyecciones submucosales, inyecciones intravenosas, inyecciones intramusculares, inyecciones intradérmicas e infusión.
Como se usa en la presente, el término "can" incluye todos los perros domésticos, Canis lupus famUiaris o Canis familiaris, a menos que se indique de otra manera.
El parvovirus canino "CPV" se aisló por primera vez en 1978 y se le nombró CPV-2 para distinguirlo del virus diminuto del parvovirus canino (CMV o CPV-1). Aproximadamente un año después del aislamiento inicial de CPV-2, se identificó una variante genética, CPV-2a. A mediados de los años 1980 se identificó una segunda variante genética, CPV-2b. Pronto el CPV-2a y CPV-2b desplazaron totalmente a CPV2. En la actualidad, el CPV-2a ya no se detecta en los Estados Unidos [Parrish y Kawaoka, Annu Rev. Microbio!., 59:553-586 (2005)]. Una cuarta variante de CPV de esta familia, CPV-2c, se describió por primera vez en 2000 [ véase, U.S. 8,227,593; U.S. 8,258,274; Hong et ai., 1 Vet Diagn. Invest. (5):535-9 (2007)]. La solicitud provisional de EE. UU. 61/739,067, presentada el 19 de diciembre de 2013, cuyo contenido se incorpora en la presente como referencia en su totalidad, describe un aislado atenuado específico de CPV-2c (registro ATCC No. PTA-13492) que fue depositado subsiguientemente el 24 de enero de 2013 en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Va. 20110-2209, EE. UU., bajo las condiciones que satisfacen los requerimientos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Fines de Procedimientos de Patente. Además, se construyó un parvovirus canino recombinante que comprende un genoma de CPV-2c/CPV-2 heterogéneo, esto es, la región que codifica las proteínas de la cápside es de un aislado de CPV-2c, y la región que codifica las proteínas no estructurales es de un aislado de CPV-2 [W02011107534 (Al); US 20120328652; W02012007589 (Al), los contenidos de las cuales se incorporan en la presente por referencia en su totalidad]. Como se usa en la presente, una vacuna de la presente invención que comprende "parvovirus canino" puede comprender uno o más de estos tipos/variantes/aislados de CPV, que incluyen el parvovirus canino recombinante recientemente construido que comprende el genoma de CPV-2c/CPV-2 heterogéneo.
Como se usa en la presente, el término "felino" se refiere a cualquier miembro de la familia Fe/idae. Los miembros de esta familia incluyen miembros silvestres, de zoológico y domésticos, tales como cualquier miembro de las subfamilias Felinae, por ejemplo, gatos, leones, tigres, pumas, jaguares, leopardos, leopardos de las nieves, panteras, leones de montaña norteamericanos, chitas, linces, gatos monteses, linces africanos, o cualquier cruza de los mismos. Los gatos también incluyen gatos domésticos, gatos de compañía de raza pura y/o mestizos, gatos de exhibición, gatos de laboratorio, gatos clonados y gatos silvestres o salvajes.
Como se usa en la presente, un "aditivo de azúcar" es un azúcar de 5 a 12 carbonos (por ejemplo, sacarosa, maltosa, trehalosa, dextrosa, lactosa, glucosa, fructosa, galactosa), o alcohol de azúcar/poliol (por ejemplo, sorbitol, manltol, arabitol, inositol, maltitol). A menos que se indique específicamente de otra manera, el porcentaje (%) del aditivo de azúcar se provee como el peso (p) del aditivo de azúcar al volumen (v) de la vacuna, (p/v) de la vacuna.
Como se usa en la presente, a menos que se indique específicamente lo contrario, el porcentaje (%) de un aditivo sólido, por ejemplo, aditivo de azúcar o gelatina, en una vacuna, se basa en una solución al 1%, que es 1 g de sólido /100 mi de volumen de vacuna (p/v).
Como se usa en la presente, a menos que se indique específicamente lo contrario, el porcentaje (%) de un aditivo líquido, por ejemplo, etanol, en una vacuna, se basa en una solución al 1%, que es 1 mi de aditivo líquido /100 mi de volumen de vacuna (v/v).
Como se usa en la presente, a menos que se indique específicamente lo contrario, el valor de pH provisto es el valor de pH determinado/medido a 25°C.
Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" se usa intercambiablemente con el término "cerca de" y significa que un valor está dentro del veinticinco por ciento del valor indicado, es decir, una concentración de "cerca de" 2 mM de EDTA puede ser 1.5 mM a 2.5 mM de EDTA.
El hidrolizado de caseína entera que se puede usar en las vacunas líquidas estables de la presente invención se puede obtener por medio de varios procedimientos que incluyen, por ejemplo, como un hidrolizado ácido o un hidrolizado enzimático. Estos hidrolizados contienen, en forma de aminoácidos y péptidos mezclados, todos los aminoácidos presentes originalmente en la caseína. Un hidrolizado pancreático de caseína entera que se puede usar en las vacunas líquidas estables de la presente invención es comercializado como CASEIN HYDROLYSATE ENZYMATIC® por MP Biomedicals. Productos comparables son comercializados bajo los nombres NZ-AMINE®, NZ-AMINE® A, NZ-AMINE® AS y NZ-AMINE® B, y Tryptone, por Sigma-Aldrich.
Como idealmente el pH de las vacunas líquidas estables de la presente invención varía de 6.0 a 8.0, las vacunas líquidas estables de la presente invención pueden comprender un amortiguador. Los amortiguadores para usarse en las vacunas líquidas estables de la presente invención incluyen, sin limitación: Tris, Tris-Histidina, BIS-Tris, BIS-Tris-Propano, fosfato de potasio y/o sodio, pirofosfato de sodio o potasio, imidazol, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, tricina, glicilglicina y HEPES. Los amortiguadores se pueden llevar al pH adecuado usando cualquier contraión adecuado.
Las vacunas de la presente invención pueden contener un adyuvante, o alternativamente pueden no contener adyuvante, dependiendo a menudo del antígeno que contiene la vacuna. Los ejemplos de adyuvantes para usarse en las vacunas de la presente invención incluyen fosfato de aluminio, por ejemplo, REHYDROPHOS® (General Chemical, Parsippany, Nueva Jerscy) y/o hidróxido de aluminio, por ejemplo, REHYDROGEL®, REHYDROGEL® HPA, o REHYDROGEL® LV (General Chemical, Parsippany, Nueva Jersey), y/o un adyuvante de copolímero de bajo peso molecular que puede formar entrelazamiento en solución para convertirse en un gel de alto peso molecular, por ejemplo, POLYGEN™ (MVP Laboratories, Omaha), y/o un adyuvante formado de partículas de gel de acrilato de sodio en agua, por ejemplo, MONTANIDE™ PET GEL A™ (Seppic, París Francia).
Cuando se añade, la cantidad del adyuvante en la vacuna usualmente es de aproximadamente entre 1% y 20% (v/v), En modalidades particulares, la cantidad dei adyuvante es de aproximadamente entre 2% y 10% (v/v). En el ejemplo 2 que se da más abajo, el adyuvante está aproximadamente a 5% (v/v).
Las vacunas de la presente invención también pueden contener un agente quelante. Los ejemplos de agentes quelantes adecuados incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido 1,2-bis(o-aminofenoxi)etano-N,N,N',N'-tetraacét¡co (BAPTA), ácido etilenglicol tetraacético (EGTA), ácido dimercaptosuccínico (DMSA), y ácido dietilentriamino pentaacético (DTPA), ácido 2,3-dimercapto-1-propanosulfónico (DMPS).
Vacunas multivalentes: La presente invención provee vacunas multivalentes líquidas estables. Una vacuna multivalente canina líquida estable de la presente invención puede incluir, por ejemplo, dos o más de los siguientes: virus del moquillo canino, adenovirus canino de tipo 2, parvovirus canino, virus de la parainfluenza canina, virus de la influenza canina, pneumovirus canino, coronavirus canino, herpesvirus canino, virus de la hepatitis infecciosa canina, virus diminuto canino, virus de la rabia y virus de pseudorrabia. Estas vacunas líquidas estables también se pueden combinar con uno o más antígenos atenuados o muertos, tales como virus de la influenza canina, coronavirus canino, Bordetella bronchiseptica, especies de Mycopiasma, EhrHchia canis, especies de Anaplasma, Leptospira canicola, Leptospira gríppotyphosa, Leptospira hardjo, Leptospira icterohaemorrhagiae, Leptospira pomona, Leptospira interrogans, Leptospira autmnaiis, y Leptospira Bratisiava, y almacenarse, o alternativamente antes de la administración.
Además, una vacuna multivalente felina líquida estable de la presente invención puede comprender uno o más de los siguientes patógenos felinos: herpesvirus felino, calicivirus felino, pneumovirus felino, parvovirus felino, virus de la leucemia felina, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de inmunodeficiencia felina, virus de la enfermedad de Boma, virus de la influenza felina e influenza aviar. Estas vacunas líquidas estables se pueden combinar subsiguientemente con Chlamydophlla fe/is y/o Bartonella spp. atenuadas o muertas (por ejemplo, B. hense/ae) y almacenarse, o alternativamente antes de la administración.
Las vacunas de la presente invención también pueden contener un antibacteriano tal como un antibiótico. Los ejemplos de estos antibióticos pueden incluir: gentamicina a 10-100 pg/mL, anfotericina B a 0.5-5.0 mg/mL, tetracielina a 10-100 pg/mL, nistatina a 10-100 unidades/mL (Micostatin), penicilina a 10-100 unidades/mL, 10-100 mg de estreptomicina, 10-100 pg de polimixina B, y 10-100 pg de neomicina.
Administración de la vacuna: Las vacunas de virus líquidas estables de la presente invención se pueden administrar mediante cualquier medio convencional, por ejemplo por administración sistémica, que incluye administración parenteral, tal como por ejemplo, sin limitación, administración subcutánea o intramuscular. Las vacunas de virus líquidas estables de la presente invención también se pueden administrar por administración mucosal, tal como por ejemplo por administración intranasal, oral, intratraqueal, rectal, y/o ocular. Alternativamente, las vacunas se pueden administrar por medio de un parche dérmico, escarificación, o administración tópica. Se contempla que una vacuna de virus líquida estable de la presente invención también se puede administrar por medio del agua potable y/o alimento de los sujetos animales receptores. Además, se contempla que estas vacunas se pueden administrar en forma de un premio o juguete.
Las vacunas de la presente invención (que incluyen vacunas multivalentes) también se pueden administrar como parte de una terapia de combinación, es decir, una terapia que incluye, además de la vacuna misma, la administración de uno o más agentes activos adicionales, terapias adicionales, etc. En ese caso, se debe reconocer que la cantidad de vacuna que constituye una cantidad "terapéuticamente eficaz" puede ser mayor o menor que la cantidad de vacuna que constituiría una cantidad "terapéuticamente eficaz" si la vacuna se administrara sola. Otras terapias pueden incluir las que son conocidas en la téenica, tales como por ejemplo analgésicos, medicamentos para reducir la fiebre, expectorantes, medicamentos antiinflamatorios, antihistamínicos, y/o la administración de fluidos.
El grado de inmunogenicidad se puede determinar experimentalmente por medio de técnicas de estudio de provocación y titulación de la dosis generalmente conocidas. Típicamente, estas técnicas incluyen vacunar a varios sujetos animales con la vacuna a diferentes dosis, y luego provocar a los sujetos animales con el virus virulento para determinar la dosis protectora mínima.
Los factores que afectan el régimen de dosificación preferido pueden incluir, por ejemplo, la especie o raza (por ejemplo, de un animal canino o felino), la edad, peso, sexo, dieta, actividad, tamaño del pulmón y afección del sujeto; la vía de administración; los perfiles de eficacia, seguridad y duración de la inmunidad de la vacuna particular usada; y si la vacuna se administra como parte de una combinación de fármacos y/o vacunas. De esta manera, las dosis realmente usadas pueden variar para animales específicos y por lo tanto se pueden desviar de las dosis típicas indicadas más arriba. La determinación de estos ajustes de dosis generalmente es del dominio de los expertos en el desarrollo de vacunas, usando los medios convencionales.
De manera similar, el volumen en el que se puede administrar tal dosis es típicamente de entre 0.1 mL (típica para aplicación intradérmica o transdérmica) y 5.0 mL. Una escala típica para el volumen de administración es de entre 0.2 mL y 2.0 mL, y aproximadamente de 1.0 mL a 2.0 mL para administración intramuscular o subcutánea.
Se contempla que la vacuna se puede administrar al receptor de la vacuna una sola vez o, alternativamente, dos o más veces durante días, semanas, meses o años. En algunas modalidades, la vacuna se administra por lo menos dos veces. En algunas de estas modalidades, por ejemplo, la vacuna se administra dos veces, siendo administrada la segunda dosis (por ejemplo, un refuerzo) por lo menos 2 semanas después de la primera dosis. En modalidades particulares, la vacuna se administra dos veces, siendo administrada la segunda dosis no más de 8 semanas después de la primera dosis. En otras modalidades, la segunda dosis se administra de 1 semana a 2 años después de la primera dosis, de 1.5 semanas a 8 semanas después de la primera dosis, o de 2 a 4 semanas después de la primera dosis. En otras modalidades, la segunda dosis se administra cerca de 3 semanas después de la primera dosis.
En las modalidades anteriores, la primera dosis y las dosis subsiguientes pueden variar, por ejemplo en cantidad y/o forma. Sin embargo, a menudo las dosis son de la misma cantidad y forma. Cuando solo se administra una dosis única, la cantidad de vacuna en esa dosis sola generalmente comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de la vacuna. Sin embargo, cuando se administra más de una dosis, las cantidades de vacuna en esas dosis juntas pueden constituir una cantidad terapéuticamente eficaz. Además, una vacuna puede administrarse inicialmente y después se puede administrar un refuerzo, por ejemplo, de 2 a 12 semanas después. Sin embargo, las administraciones subsiguientes de la vacuna pueden ser sobre una base anual (1 año) o bianual (2 años), independientemente de si se administra o no un refuerzo.
La presente invención se puede entender mejor haciendo referencia a los siguientes ejemplos no limitativos que son provistos como ejemplares de la invención. Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar más cabalmente las modalidades de la invención. Sin embargo, no se deben considerar limitativos en modo alguno del amplio alcance de la invención.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Estabilidad de las vacunas de virus canino líquidas Materiales y metodos Materiales: Se adquirió sacarosa y sorbitol grado cultivo celular de Fisher Scientific. Se adquirió clorhidrato de L-arginina, L-metionina, L-histidina y cloruro de sodio grado molecular, con una pureza mayor de 98%, de Sigma. Se adquirió sulfato de dextrano con un peso molecular promedio de 10,000, a una pureza >95%, de Sigma. Se adquirió etanol grado biología molecular (>99%), TWEEN 80, TWEEN 20, y soluciones de Tris 1.0M (pH 8.0) y EDTA (pH 8.0) de Sigma. Se preparó solución de gelatina Bloom 250 a 20% y solución de NZ Amine AS al 7.61% a partir de los mejores reactivos disponibles comercialmente.
Preparación del antígeno a granel: Se prepararon las siguientes soluciones y se esterilizaron por filtración a 0.2 pm: sacarosa al 80%, sorbitol al 70%, L-arginina 1.0M (pH 7.2), L-metionina al 5%, sulfato de dextrano 5 mM. Los antígenos a granel CDV, CAV2, CPV y CPI que tenían títulos entre 6.5 y 9.5, se congelaron a -80 °C para ser descongelados inmediatamente antes de mezclarse.
Mezcla y llenado de la vacuna líquida: El procedimiento para hacer una mezcla de vacuna líquida de CDV, CAV2, CPV y CPI (1.0 mL por dosis) es el siguiente: una cantidad de dosis de antígenos se mezcla en diferentes formulaciones como se muestra más abajo en el cuadro 1, con títulos objetivo de 5.0 a 7.5 (logi0 TCIDS0) para los antígenos virales. Preparar y etiquetar un recipiente esterilizado de 200 mL, y después añadir cada componente estabilizador y excipiente al recipiente, siguiendo la cantidad calculada basada en la concentración final de cada componente como se muestra abajo en el cuadro 1. Ajustar al volumen objetivo con agua bidestilada (ddH20) para los estabilizadores y excipientes. Mezclar sobre una placa agitadora durante por lo menos 10 min hasta que todos los componentes se hayan disuelto. Enfriar la solución estabillzadora a 4°C y mantenerla así hasta que estén listos los antígenos.
Descongelar el antígeno congelado en un baño de agua a 37°C con agitación ocasional, hasta que casi todo el hielo se haya derretido. Algunos de los antígenos tienen desechos celulares visibles en la solución; por lo tanto mezclar los antígenos muy bien antes de pipetear. El antígeno descongelado se debe mantener a 2-8 °C no más de 8 horas antes de usarse. Agregar la cantidad apropiada de CDV, CAV2, CPV, y CPI al recipiente etiquetado con las soluciones estabilizadoras. Mezclar sobre la placa agitadora hasta que los antígenos y estabilizadores se hayan mezclado homogéneamente. Tratar de evitar la generación de burbujas y espuma durante este paso de mezclado, Medir el pH a 25°C y, si el pH no está dentro de 7.2±0.1, ajustar el pH con HCI 1M o NaOH 1M al pH objetivo. Mantener la mezcla de vacuna a 2-8 °C hasta su dispensación el mismo día, o dividir en alícuotas de volumen pequeño y congelar a <-70 °C para uso futuro. Dispensar la mezcla de vacuna en frascos ámpula de vidrio de 2 mL, a 1 mL por frasco. Agregar gas argón a los frascos ámpula después de llenarlos para ayudar a impedir la oxidación durante el almacenamiento, y después sellar en caliente el frasco ámpula. Etiquetar el frasco ámpula con el nombre de la muestra, número de lote, temperatura de almacenamiento y fecha, y después transferirlo a cajas y guardar éstas a diferentes temperaturas designadas.
Pruebas de estabilidad a temperatura acelerada y tiempo real: Las muestras líquidas se almacenaron a 25°C±1°C y 4°C±1°C, respectivamente, en las incubadoras correspondientes. Para análisis de estabilidad acelerada se usó 25°C para fines de selección, mientras que las muestras almacenadas a 4°C fueron las muestras de estabilidad en tiempo real. En el punto de tiempo designado, se recuperaron 3 frascos de cada formulación y se midió el título de cada antígeno por medio de un ensayo de titulación basado en cultivo celular, y se reportó como la dosis infecciosa media de cultivo de tejido (TCID50) y/o como la dosis 50% infecciosa de anticuerpo fluorescente (FAID50).
Métodos analíticos Potencia de CPI: Diluciones de muestras de virus se inoculan en células de riñón de perro (DK). Después de 4-6 días se fijan monocapas y se tiñen con antisuero CPI conjugado con fluoresceína, y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman-Karber [Cunningham, C.H. A Laboratory Guide in Viroiogy, 7a edición, Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN. (1973); Kaplan, M.M. y Koprowski, H., Laboratory Techn/ques in Rabies, Organización Mundial de ia Salud, Suiza (1973)] Potencia de CDV: Diluciones de muestras de virus se inocularon en células Vero. Después de 5-7 días se observan las monocapas para determinar el efecto citopático, y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman-Karber, como se cita arriba.
Potencia de CAV2: Diluciones de muestras de virus se inocularon en células DK. Después de 7 días se observan las monocapas para determinar el efecto citopático, y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman-Karber, como se cita arriba.
Potencia de CPV: Diluciones de muestras de virus se inocularon en células DK. Después de 3 días, las monocapas se tiñen con antisuero CPV conjugado con fluoresceína y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman-Karber, como se cita arriba.
Resultados Análisis de estabilidad acelerada a 25°C: Se efectuaron dos estudios para selección de formulación líquida. El primer estudio incluye las formulaciones L-001 a L-008, y el segundo estudio incluye las formulaciones L-009 a L-026. (Véase el cuadro 1 para los detalles de las formulaciones). Las muestras líquidas almacenadas en frascos ámpula de vidrio sellados, con 1 mL por frasco por dosis, se prueban en diferentes puntos de tiempo después de su almacenamiento a 25°C o 4°C. En el cuadro 2 se muestran los datos de estabilidad para CDV, CAV2 y CPI en almacenamiento a 25°C. El CPV no fue probado en almacenamiento a 25°C puesto que el CPV líquido se considera como la fracción más estable de los cuatro virus. Para el estudio 1, las muestras que se incubaron a 25°C (L-001 a L-008), los datos del día 0, semana 6 y semana 8 se usaron para comparar las diferentes formulaciones. Para el estudio 2, las muestras que se incubaron a 25°C (L-009 a L-026), los datos del día 0, semana 6 y semana 12 se usaron para seleccionar las formulaciones. Se hicieron pruebas en puntos de tiempo intermedios adicionales y la tendencia fue similar. Basándose en la tendencia de degradación, la estabilidad relativa de cada formulación se clasificó manualmente como se muestra en el cuadro 2; la formulación siendo clasificada más estable con cinco "+" y menos estable con una "+". Cada fracción de virus se clasificó individualmente y después la clasificación general acomoda los 3 virus. Basándose en la clasificación y comparación, se observaron varias tendencias. Por consiguiente, de los tres sacáridos probados (sacarosa, sorbitol y glicerol), la contribución estabilizante de la sacarosa y el sorbitol fue significativamente más alta que el glicerol. También hay una fuerte preferencia por la concentración más alta de azúcar; la azúcar combinada a 17%-25% funciona mejor que las formulaciones con menos de 10%. Entre los estabilizadores de proteínas o aminoácidos, la L-arginina 0.3M tuvo la contribución más alta a la estabilidad, seguida por metionina al 1%, gelatina al 0.8% y NZ Amine al 1%. Entre los otros estabilizadores, parece que el sulfato de dextrano y los barredores de radicales libres (FRS) contribuyen a la estabilidad de las formulaciones líquidas de CPV, CDV, CAV y CPI, y aunque su presencia no cambia significativamente el perfil de estabilidad, tampoco tuvieron efectos negativos sobre la estabilidad. Por lo tanto, en algunos casos sería preferible incluir el sulfato de dextrano y/o el FRS en la formulación final para la estabilidad en almacenamiento a largo plazo de una vacuna líquida de virus felino o canino vivo a 25°C. Por otra parte, se encontró que el TWEEN 80 y TWEEN 20 son nocivos para la estabilidad de las formulaciones de virus.
Análisis de estabilidad en tiempo real a 4°C: La estabilidad en almacenamiento a largo plazo de las vacunas líquidas de CPV, CDV, CAV2 y CPI vivos a 4°C también se monitoreó, y los datos se presentan en el cuadro 3. El título viral proyectado a 24 meses a 4°C se extrapola de los puntos datos el mes 12 y mes 18 para L-001 a L-008, y los meses 6 y 12 para L-009 a L-026 (véase más abajo el cuadro 3). El requisito de título de dosis mínima para cada virus en el punto de caducidad se indica en el fondo el cuadro 3 que se da más abajo, y se usa para determinar qué formulación puede proveer un producto estable a 4°C. Hay diez formulaciones (L-009, L-011, L-012, L-014, L-15, L-016, L-018, L-019, L-025 y L-026) con alta probabilidad de producir un producto estable, mientras que las formulaciones L-003 y L-007 tuvieron un gran potencial de producir un producto estable con una vida útil de 2 años a 4°C. De los cuatro virus examinados, el CDV parece ser el más lábil. Las diez formulaciones parecen capaces de proveer más de 3 años de estabilidad a 0-8 °C para CAV2, CPV y CPI, y por lo menos 2 años de estabilidad a 0-8 °C para CVD.
CUADRO 1 Formulaciones líquidas de vacuna de virus canino vivo La unidad de concentración es: Sacarosa (p/v), Sorbitol (p/v), Glicerol (v/v). Gelatina (p/v), NZ Amine (p/v), L-Arginina (M), Metionina (p/v), TWEEN (v/v), sulfato de dextrano (uM), etanol (v/v), EDTA (mM), histidina (mM), Tris (mM), NaCI (M).
CUADRO 2 Pruebas de estabilidad acelerada de las formulaciones líquidas de vacuna de virus canino 1) Estudio 1: Formulaciones L001-L008; Estudio 2: Formulaciones L-009 a L-026. Estos estudios se hicieron a diferentes puntos de tiempo. 2) El CPV no se incluyó en las pruebas de estabilidad acelerada a 25°C porque se observó que es relativamente estable. 3) La clasificación se basa en la curva de degradación relativa extrapolada desde estos tres puntos, siendo cinco "+" la mejor, y una "+" la peor.
La clasificación general toma en cuenta la clasificación para el virus individual y es determinada por la fracción menos estable.
CUADRO 3 Estabilidad en tiempo real de las formulaciones líquidas de vacuna de virus canino a 4°C 1) n/d, no determinado; 2) El título mínimo de caducidad es la especificación de producto del producto de vacuna al final de 2 años de almacenamiento a 4°C. 3) Denotado más arriba como 24*, el título por 24 meses a 4eC es extrapolado de los tres puntos de tiempo previos, es decir, el título de virus proyectado a 24 meses a 4°C se extrapola de los puntos datos de tiempo "0", el mes 12 y el mes 18 para L-001 a L-008, y tiempo "0", mes 6 mes 12 para L-009 a L-026. 4) El título de tiempo "0" es el de la mezcla inmediatamente después del mezclado y preparación de la mezcla de vacuna. .
EJEMPLO 2 Estabilidad de las vacunas líquidas de virus caninos vivos con bacterias muertas Materiales v metodos Materiales: Se adquirió sacarosa y sorbitol grado cultivo celular de Fisher. Se adquirió clorhidrato de L-arginina, L-metionina, L-histidina, y cloruro de sodio grado molecular, con una pureza mayor de 98%, de Sigma. Se adquirió sulfato de dextrano con un peso molecular promedio de 10,000, a una pureza >95%, de Sigma. Se adquirió etanol grado biología molecular (>99%), Tween 80, Tween 20, y soluciones de Tris 1.0M (pH 8.0), EDTA (pH 8.0), gentamicina (50 mg/mL) y anfotericina (25 mg/mL), de Sigma. Se preparó internamente solución de gelatina Bloom 250 a 20% y solución de NZ Amine AS al 7.61%.
Preparación del antígeno a granel: Se prepararon las siguientes soluciones y se esterilizaron por filtración a 0.2 pm: sacarosa al 80%, sorbitol al 70%, arginina 1.0M (pH 7.2), L-metionina al 5%, sulfato de dextrano 5 mM.
Los antígenos de DA2PPv CDV, CAV2, CPV y CPI a granel se obtuvieron con títulos a 6.7, 7.8, 8.0 y 9.2, respectivamente. Los antígenos a granel se congelan a -80 °C y se descongelan inmediatamente antes de mezclar.
Los antígenos de Leptospira a granel se obtienen con una concentración de alrededor de 2 x 1010 bacterias por mililitro. Los antígenos de Leptospira a granel se almacenan a 4°C.
Mezcla y llenado de la vacuna líquida: El procedimiento para hacer la mezcla de vacuna DA2PPv líquida (1.0 mL por dosis) es el siguiente: Una cantidad de dosis de antígenos se mezclará en diferentes formulaciones como se muestra en el cuadro 4, con un título objetivo de 5.5, 6.1, 6.0 y 7.9, para los virus CDV, CAV2, CPV y CPI, respectivamente, siguiendo los procedimientos estándares para un producto multivalente de CDV, CAV2, CPI y CPV (DA2PPv). Para las formulaciones con los cuatro antígenos de leptospira, la concentración objetivo de cada fracción de leptospira es de alrededor de 1 x 109 células por mililitro. Se prepara y etiqueta un recipiente esterilizado de 200 mL, y después se añade cada componente estabilizador y excipiente al recipiente, siguiendo la cantidad calculada basada en la concentración final de cada componente como se muestra abajo en el cuadro 4.
Ajustar al volumen objetivo con H20 bidestilada (dd) para los estabilizadores y excipientes. Mezclar sobre una placa agitadora durante por lo menos 10 min hasta que todos los componentes se hayan disuelto. Enfriar la solución estabilizadora a 4°C y mantenerla así hasta que estén listos los antígenos.
Descongelar el antígeno DA2PFV congelado en un baño de agua a 37°C con agitación ocasional, hasta que casi todo el hielo se haya derretido. Algunos de los antígenos tendrán desechos celulares visibles en la solución; por lo tanto mezclar los antígenos muy bien antes de pipetear. El antígeno descongelado se debe mantener a 2-8 °C no más de 8 horas antes de usarse. Agregar la cantidad apropiada de CDV, CAV2, CPV, y CPI al recipiente etiquetado con las soluciones estabilizadoras. Dosificar la cantidad apropiada de los 4 antígenos de Leptospira (Lepto) a granel en la mezcla de vacuna. Mezclar sobre la placa agitadora hasta que los antígenos y estabilizadores se hayan mezclado homogéneamente. Tratar de evitar la generación de burbujas y espuma durante este paso de mezclado. Medir el pH a 25°C y, si el pH no está dentro de 7.2±0.1, ajustar el pH con HCI 1M o NaOH 1M al pH objetivo. Mantener la mezcla de vacuna a 2-8 °C hasta su dispensación el mismo día, o dividir en alícuotas de volumen pequeño y congelar a <-70 °C para uso futuro. Dispensar la mezcla de vacuna en frascos ámpula de vidrio de 2 mL, a l mL por frasco. Llenar los frascos ámpula con gas argón después de llenarlos para ayudar a impedir la oxidación durante el almacenamiento, y después sellar en caliente el frasco ámpula. Etiquetar el frasco ámpula con el nombre de la muestra, número de lote, temperatura de almacenamiento y fecha, y después transferirlo a cajas y guardar éstas a diferentes temperaturas designadas.
Pruebas de estabilidad a temperatura acelerada y tiempo real: Las 4 muestras líquidas de DA2PFV o DA2PPv-Lepto se guardan en la incubadora a 25±1°C. Los 25°C se usaron en las pruebas de estabilidad acelerada para fines de selección. En un punto de tiempo designado se toman 3 frascos de cada formulación y se mide el título de cada antígeno por medio de TCID50 basada en cultivo celular o FAID50.
Métodos analíticos: Potencia de CPI: Se determina el título del virus CPI en la vacuna DA2PPv. Brevemente, diluciones del virus se inoculan en células de riñón de perro (células DK). Después de 4-6 días se fijan monocapas y se tiñen con antisuero CPI conjugado con fluoresceína, y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman-Karber [véase el ejemplo 1 anterior).
Potencia de CDV: Se determina el título del virus CDV en la vacuna DA2PPv. Brevemente, diluciones del virus se inoculan en células Vero. Después de 5-7 días se observan las monocapas para determinar el efecto citopático, y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman- Karber.
Potencia de CAV-2: Se determina el título del virus CAV-2 en la vacuna DA2PPv. Brevemente, diluciones del virus se inoculan en células DK. Después de 7 días se observan las monocapas para determinar el efecto citopático, y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman-Karber.
Potencia de CPV: Se determina el título del virus CPV en la vacuna DA2PPv. Brevemente, diluciones del virus se inoculan en células DK. Después de 3 días, las monocapas se tiñen con antisuero CPV conjugado con fluoresceína, y el título del virus se calcula por medio del método de Spearman-Karber.
Resultados v conclusiones Análisis de estabilidad acelerada a 25°C: Las vacunas indicadas en la formulación del cuadro 4 se mezclaron como se describe en los métodos anteriores. La formulación L-037 es la misma formulación previamente identificada como L-015 (véase el cuadro 1), excepto que contiene gentamicina y anfotericina B. Las formulaciones L-040, L-043 y L-045 contienen las cuatro fracciones de virus canino vivo, es decir, DA2PPv, y los cuatro antígenos de Leptospira muertos {Canteóla, Grippo, Pomona, e Mero). Las muestras de vacuna líquidas se almacenaron en frascos ámpula de vidrio sellados, con 1 mL por frasco por dosis. Se probaron en diferentes puntos de tiempo después de almacenamiento a 25°C. En el cuadro 5 se muestran los datos de estabilidad para CDV, CAV2 y CPI. El CPV no fue probado en almacenamiento a 25°C puesto que se considera que el CPV líquido es la fracción más estable de los cuatro virus. Basándose en los datos de estabilidad mostrados en el cuadro 5, se observa lo siguiente: 1) Los antibióticos como conservadores no afectan negativamente la estabilidad viral de DA2PPv en la formulación L-015. 2) La presencia de los cuatro antígenos de Leptospira muertos disminuye la estabilidad de CDV y CPI vivos atenuados en la formulación líquida. 3) Un suplemento de EDTA 2 mM en la formulación L-040 produce una formulación estable de DA2PPv, incluso en presencia de los cuatro antígenos de Leptospira muertos. 4) Esta formulación líquida estable también se puede usar para una DA2PPv combo con los cuatro antígenos de Leptospira muertos en presencia de adyuvantes REHYDROPHOS.
CUADRO 4 Tabla de formulación de la vacuna líquida estable combinada de PA2PPv v Lepto 4 Nota: • El volumen final es de 1 mL por dosis para cada formulación.
• La concentración de sacarosa y sorbitol es en peso a volumen (p/v). La concentración de arginina (L-Arg) es una concentración molar. La concentración de EDTA es milimolar.
• Todas las mezclas contienen: histidina lOmM y Tris lOmM como amortiguador. El pH final de la mezcla se ajustó a un pH objetivo de 7.2.
• Todas las formulaciones contienen: Los antibióticos gentamicina a 24pg/mL y anfotericina B a 0.4 mg/mL como conservadores.
• Todas las formulaciones contienen: Los antígenos virales de DA2PFV incluyen los virus CDV, CAV2, CPV-2c y CPI.
• Lepto 4 contiene cuatro cepas de Leptospira ( Cantóla ; Grippo, Pomona e Mero) con 10 millones de bacterias muertas de cada cepa en una dosis.
Para L-045, primero el Lepto 4 se mezcló con el adyuvante REHYDROPHOS, se incubó >20 min a temperatura ambiente, y luego se mezcló con otras fracciones virales.
CUADRO 5 Estabilidad de la vacuna DAPPv a 25°C en formulaciones líquidas Nota: • La entrada de antígeno de las 4 formulaciones es la misma. El título al tiempo 0 debe ser el mismo teóricamente. La variación del título del virus al tiempo 0 podría ser resultado de la variación de la prueba, combinada con la diferencia de formulación.
El título de CPV no se muestra puesto que se ha observado que el CPV es relativamente estable en la mayoría de estas formulaciones. Durante este estudio de estabilidad acelerada a 25 °C solo se midió el título de CDV, CAV2 y CPI.

Claims (28)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES
1. Una vacuna líquida estable que comprende un virus canino o felino vivo atenuado, 10-30 % (p/v) de aditivo de azúcar, y un aminoácido; en donde la vacuna líquida estable tiene un pH de 6.0 a 8.0; y en donde el aminoácido se selecciona dei grupo que consiste en arginina y metionina; y cuando el aminoácido es arginina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.15 M a 0.6 M; y cuando el aminoácido es metionina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.025 M a 0.3 M.
2. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque el virus canino vivo atenuado se selecciona del grupo que consiste en virus del moquillo canino, adenovirus canino de tipo 2, parvovirus canino, virus de la parainfluenza canina, o cualquier combinación de los mismos.
3. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque el virus de la parainfluenza canina (CPV) se selecciona del grupo que consiste en CPV-2, CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c, y un CPV recombinante que comprende un genoma de CPV2c/CPV-2 heterogéneo.
4. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el CPV-2c tiene el registro ATCC No. PTA13492.
5. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 2, 3, o 4, caracterizada además porque el virus de parainfluenza canina es un vector recombinante que codifica y expresa un antígeno heterogéneo.
6. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, o 5, caracterizada además porque comprende adicionalmente un componente seleccionado del grupo que consiste en 0.4 a 1.6% (p/v) gelatina, 0.5-2.0% (p/v) de un hidrolisado proteolítico de caseína entera, 0.25 a 1.0% (v/v) etanol, un agente quelante, un regulador de pH, un antibiótico, un adyuvante, y cualquier combinación de los mismos.
7. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 5 o 6, caracterizada además porque el regulador de pH se selecciona del grupo que consiste en Tris de 2.5 a 50 mM y Tris de 2.5 a 50 mM con histidina de 2.5 a 50 mM.
8. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, o 7, caracterizada además porque el aditivo de azúcar se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, y una combinación de azúcar y sorbitol.
9. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8, caracterizada además porque la vacuna comprende adicionalmente un antígeno seleccionado del grupo que consiste en un virus muerto, una bacteria muerta, y un virus muerto con una bacteria muerta.
10. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el virus muerto se selecciona del grupo que consiste en virus de la influenza canina, pneumovirus canino, coronavirus canino, o cualquier combinación de los mismos.
11. La vacuna líquida estable de conformidad con la reivindicación 9 o 10, caracterizada además porque la bacteria muerta se selecciona del grupo que consiste en Bordetella bronchiseptica, especies de Mycoplasma, Ehriichiacanis, especies de Anaplasma, Leptospiracanicola, Leptospiragríppotyphosa, Leptospirahardjo, Leptospiraicterohaemorrhagiae, Leptospirapomona, Leptospirainterrogans, Leptospiraautmnalis, Leptospira Bratislava, o cualquier combinación de las mismas.
12. El uso de un virus canino o felino vivo atenuado, 10-30 % (p/v) de aditivo de azúcar, y un aminoácido, para la elaboración de una vacuna líquida estable para vacunar a un can en contra de un virus canino, en donde la vacuna líquida estable tiene un pH de 6.0 a 8.0; y en donde el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en arginina y metionina; y cuando el aminoácido es arginina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.15 M a 0.6 M; y cuando el aminoácido es metionina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.025 M a 0.3 M.
13. El uso de un virus canino o felino vivo atenuado, 10-30 % (p/v) de aditivo de azúcar, y un aminoácido, para la elaboración de una vacuna líquida estable para vacunar a un can en contra de un virus del moquillo canino, adenovirus canino de tipo 2, parvovirus canino y virus de la parainfluenza canina, en donde la vacuna líquida estable tiene un pH de 6.0 a 8.0; y en donde el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en arginina y metionina; y cuando el aminoácido es arginina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.15 M a 0.6 M; y cuando el aminoácido es metionina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.025 M a 0.3 M.
14. El uso como el que se reclama en la reivindicación 12 o 13, en donde el virus canino vivo atenuado se selecciona del grupo que consiste en virus del moquillo canino, adenovirus canino de tipo 2, parvovirus canino, virus de la parainfluenza canina, o cualquier combinación de los mismos.
15. El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde el virus de la parainfluenza canina (CPV) se selecciona del grupo que consiste en CPV-2, CPV-2a, CPV-2b, CPV-2c, y un CPV recombinante que comprende un genoma de CPV2c/CPV-2 heterogéneo.
16. El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde el CPV-2c tiene el registro ATCC No. PTA13492.
17. El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, 15, o 16, en donde el virus de parainfluenza canina es un vector recombinante que codifica y expresa un antígeno heterogéneo.
18. El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, 13, 14, 15, 16, o 17, en donde la vacuna líquida estable comprende adiclonalmente un componente seleccionado del grupo que consiste en 0.4 a 1.6% (p/v) gelatina, 0.5-2.0% (p/v) de un hidrolisado proteoiítico de caseína entera, 0.25 a 1.0% (v/v) etanol, un agente quelante, un regulador de pH, un antibiótico, un adyuvante, y cualquier combinación de los mismos.
19. El uso como el que se reclama en la reivindicación 17 o 18, en donde el regulador de pH se selecciona del grupo que consiste en Tris de 2.5 a 50 mM y Tris de 2.5 a 50 mM con histidina de 2.5 a 50 mM.
20. El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, o 19, en donde el aditivo de azúcar se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, sorbitol, y una combinación de azúcar y sorbitol.
21. El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20, en donde la vacuna comprende adiclonalmente un antígeno seleccionado del grupo que consiste en un virus muerto, una bacteria muerta, y un virus muerto con una bacteria muerta.
22. El uso como el que se reclama en la reivindicación 21, en donde el virus muerto se selecciona del grupo que consiste en virus de la Influenza canina, pneumovirus canino, coronavirus canino, o cualquier combinación de los mismos.
23. El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 o 22, en donde la bacteria muerta se selecciona del grupo que consiste en Bordetella bronchiseptica, especies de Mycoplasma, Ehrtichiacanis, especies de Anaplasma, Leptosplracanicola, Leptospiragrippotyphosa, Leptospirahardjo, Leptospiraícterohaemorrhagiae, Leptospirapomona, Leptospirainterrogans, LeptospiraautmnaHs, Leptospira Bratíslava, o cualquier combinación de las mismas.
24. El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 12 a 23, en donde la vacunación se realiza por inyección subcutánea.
25. Una vacuna líquida estable de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, u 11, para usarse en la vacunación de un can contra un virus canino.
26. Una vacuna líquida estable de la reivindicación 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, u 11, para usarse en la vacunación de un can contra un virus del moquillo canino, adenovirus canino de tipo 2, parvovirus canino y virus de la parainfluenza canina.
27. La vacuna líquida estable para usarse de la reivindicación 25 o 26, en donde la vacunación se realiza por inyección subcutánea.
28. Un método para hacer la vacuna líquida estable de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, u 11, que comprende combinar una cantidad terapéuticamente efectiva de un virus canino o felino vivo atenuado con 10-30 % (p/v) de aditivo de azúcar, un aminoácido y una solución regulada de fosfato con pH de 6.0 a 8.0 para formar una vacuna líquida estable; en donde el aminoácido se selecciona del grupo que consiste en arginina y metionina; en donde cuando el aminoácido es arginina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.15 M a 0.6 M; y en donde cuando el aminoácido es metionina, su concentración final en la vacuna líquida estable es de 0.025 M a 0.3 M.
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