CN101450208B - 喷鼻免疫流感多价疫苗的制备及其方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种喷鼻免疫流感多价疫苗及其制备方法，本发明使用流感四价(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或多价减毒活疫苗经鼻腔喷鼻进行免疫接种，可安全、有效地预防人普通流感和高致病性人禽流感病毒的感染。

Description

喷鼻免疫流感多价疫苗的制备及其方法

技术领域

本发明涉及一种疫苗，特别涉及一种喷鼻免疫的流感多价疫苗。

背景技术

流感是一种由流感病毒引起的急性发热性呼吸道传染病，可引起严重的并发症。流感病毒的抗原不断发生变化，具有较强的传染性，经常造成大范围流行。在正常的流行季节，全球约10％的人口即5亿多人患流感，目前还未找到十分理想的防治药物，接种流感疫苗仍是当今预防流感的有效手段。给健康人群接种流感疫苗，70-90％的人会起到预防发病的效果(当传播的病毒毒株与疫苗采用毒株相同时)，更重要的是，给高危人群接种疫苗可以明显降低流感的发生，减少住院率及死亡率。当前，高致病性禽流感H5N1在全球迅速蔓延，而最近对1918年爆发流行的流感病毒基因组研究结果表明，那次大流行的病原就是禽流感，而且与现代流行的禽流感病毒H5N1有惊人的相似性。自1997年H5和2003年H7亚型禽流感病毒首次突破种属屏障，直接感染人，给人类的健康带来极大的威胁，特别是自2003年底以来，在泰国、越南以及柬埔寨造成138人感染，其中76人死亡(截至到2008年6月19日)。但是到目前为止，人们还不知道禽流感病毒直接感染人的机制以及确切的感染途径，在临床上是否存在隐性感染者或亚临床感染者也不确定。目前科技界普遍认为现在的H5N1毒株，不需要与人流感病毒多价，就有可能进行变异，越过种属屏障，引起人类的流感大流行，有可能造成500万-2亿人的死亡。WHO已为各国提供了制备灭活疫苗的病毒株，但国内外广泛使用的还是上世纪70年代基于鸡胚生产的流感灭活疫苗，已有的灭活全病毒疫苗不能用于12岁以下儿童的接种、裂解疫苗抗原性弱、组分疫苗效果差，均不适用于流感突发性流感大流行和生物恐怖/生物战剂造成的短期内流感大流行的预防。因此喷鼻免疫的流感四价(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)减毒活疫苗的制备及其方法的研究迫切又极为重要。

自从1940年流感病毒灭活全病毒疫苗、裂解疫苗问世以来，老年人群的病死率及感染的发生率都明显下降了。目前，已获准上市的流感病毒灭活疫苗主要包括流感三价灭活全病毒疫苗、三价灭活裂解疫苗和亚单位疫苗，这些疫苗主要经注射途径免疫，诱导血清中的抗HA/IgG抗体的产生，而不能诱导黏膜免疫sIgA抗体的产生，然而对异型流感病毒的交叉保护性反应，主要决定于自然感染过程中诱导的IgA抗体交叉反应性。因此，随着现代免疫学技术和方法的迅速发展，一种针对刺激机体产生更强的黏膜IgA免疫应答的流感新型疫苗应运而生。

近些年，一系列经鼻免疫的流感病毒疫苗得到研制和发展，例如：灭活病毒疫苗的免疫，含有羧基乙烯聚合物的灭活疫苗，带有百日咳毒素B寡聚物的灭活疫苗，含有霍乱弧菌肠毒素、大肠杆菌热稳定性外毒素及脂质体等佐剂的流感病毒裂解疫苗，这些疫苗不仅诱导机体产生血清HA/IgG抗体，同时也能诱导黏膜分泌性IgA抗体的产生。然而，经鼻免疫的灭活疫苗必须以高浓度剂量免疫，才能激发机体产生高浓度的抗体。经鼻免疫灭活流感病毒疫苗，目前还缺少合适的人用喷鼻疫苗佐剂，不能产生理想的免疫应答反应。此外，现有的免疫程序对老年人和儿童存在有效性和安全性问题亟待解决。而喷鼻流感减毒活疫苗具有类似自然感染的优越性，可以诱导包括体液免疫、细胞免疫和黏膜免疫在内的更全面免疫应答，使机体获得较广泛的免疫保护，可以在机体内长时间起作用而诱导较强的交叉免疫反应，同时可以人为任意地对其基因组进行操作。因此，国外一直致力于喷鼻流感减毒活疫苗的研究，并取得了阶段性的成果。2003年6月，通过反向遗传技术产生的冷适应喷鼻流感三价减毒活疫苗FluMist^TM在美国被批准和投入使用，采用了冷适应流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/Ann Arbor/1/66的内部基因骨架，是一种降低了毒力并能在最佳适应温度下生长的减毒人流感病毒株。临床实验证明：该疫苗在成年人和儿童中都有良好的安全性和有效性，可以有效预防流感。俄罗斯利用传统方法筛选获得的冷适应流感减毒活疫苗株，由于制备周期长，筛选过程烦琐，费时费力，且不能人为任意操作其基因组，使得其发展和应用大大受限。目前，反向遗传技术的迅速发展，为喷鼻流感减毒活疫苗的研发提供了前所未有的机遇，美国的MedImmune，Inc.公司走在最前沿，该公司作为该项新技术的主要倡导者，50多年来投入了大量的人力物力进行开发研究，并对季节性流感疫苗和大流行流感疫苗进行大规模研究和生产，尤其对喷鼻流感三价减毒活疫苗的研究已经取得了可喜的成果。基于RG技术的喷鼻流感三价减毒活疫苗通过冷适应病毒株获得的流感病毒骨架保证了疫苗的安全性，从当年流行株获得的主要保护性抗原保证了疫苗的有效性，通过鼻腔免疫获得较全面的局部免疫和系统免疫保证了可靠的保护效果、交叉保护和接种简便。MedImmune，Inc.于2006年7月宣布，美国FDA已经正式批准该公司利用反向遗传技术来生产冷适应喷鼻季节性流感疫苗。该疫苗通过鼻腔接种，使用方法简便，应用范围广泛，为喷鼻流感多价减毒活疫苗的研究提供了理论基础和技术保证。

鼻腔富有淋巴样组织，是疫苗接种的重要靶部位，即鼻相关淋巴样组织(NALT)，它主要位于喉部的淋巴样组织环，称为Waldeyer氏环。研究表明，鼻腔黏膜面积约150cm²，上皮细胞间隙较大并与毛细血管紧密相连，血管和淋巴结丰富，鼻黏膜的单位血流量约40ml/min，比肌肉、脑、肝脏的都大，实际上鼻咽部是良好的免疫器官，有丰富的抗原提呈细胞，能对抗原有效的提呈、加工，产生黏膜免疫和系统免疫应答，并且局部的黏膜免疫，还能引起呼吸道、消化道、泌尿生殖道等部位黏膜免疫应答的相通性，但以呼吸道最强。

已有的研究证实，90％以上的病原体感染是通过黏膜途径感染而致病，特别是通过呼吸道感染致病，给其有效免疫预防提出了新课题。早就知道，鼻腔接种疫苗，富含有淋巴样组织，是鼻腔接种疫苗的靶部位，富含有敏感的抗原提呈细胞，即鼻相关淋巴组织的淋巴样组织环为黏膜局部免疫接种提供了良好的微环境，并且蛋白疫苗不被酸碱破坏。就其流感疫苗至今是通过注射免疫接种，所引起的免疫应答和免疫保护没有局部的黏膜免疫效果，即不能使流感病毒入侵时获得有效的抗体中和及细胞免疫的效果。

鼻腔给药是目前研究活跃、应用最多的黏膜给药途径，国外已有加压素的一种类似物和降钙素鼻腔给药制品等上市。近年来许多制药企业开发鼻腔接种疫苗，特别是预防呼吸道感染的疫苗，如近年应用于临床的冷适应流感减毒活疫苗，通过喷鼻途径接种，不仅可以产生局部黏膜免疫，还可以产生系统免疫，并且产生具有交叉免疫保护，具有良好的免疫原性和免疫保护效果。因此，开发鼻腔接种的流感多价减毒活疫苗替代注射具有很大的应用前景，这是由于鼻腔免疫具有简单、有效、非常适于广大人群的自我使用，同时使得机体能够抵抗流感病毒感染，并且对流感疫苗免疫应答类型可以转变，由此达到更加安全的目的，为流感的免疫预防提供了保证。

鼻腔给药是相对较新的给药方式，它有可能在镇痛、勃起障碍和疫苗方面提供许多的商业机会。致力于开发新型鼻腔制剂的科学家认为，鼻腔有良好的血液供应，丰富的粘膜面积，避免了药物进入内脏的通道等。鼻腔给药至少有起效速度快，比注射更容易被患者接受的优点。目前在美国市场上只有27个鼻腔给药产品。根据Nastech的统计，这27个产品所具有的市值，超过15亿美元，其中2/3(17个)的产品是局部作用产品，1/3(10个)的产品是全身作用产品，全身作用产品都是类固醇药物制剂。IMS的统计结果显示，仅鼻腔给药类固醇产品在美国市场的价值就达到9亿美元。

2000年3月底在伦敦召开的“鼻腔释药系统”会议上，美国专门从事鼻腔给药研究的Nastech公司的R&D执行副总裁Charan Behl博士介绍了鼻腔给药的研究情况，认为在过去的几年里，鼻腔给药的研究进展很快，有很好的市场前景和相对较低的风险；鼻腔给药的市场主要集中在疼痛，偏头疼，勃起障碍和疫苗方面。

发明内容

本发明目的在于提供喷鼻免疫流感多价疫苗及其制备方法。

本发明喷鼻免疫流感疫苗包含稳定剂、抗生素和流感多价疫苗抗原。

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗中，稳定剂含0.01-0.20％w/v的谷氨酸盐，1.0-4.0％w/v的明胶，1-4％w/v的精氨酸，5-10％w/v的蔗糖，0.8-3.0％w/v的磷酸盐；优选0.07％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3％w/v的精氨酸，7％w/v的蔗糖，2.0％w/v的磷酸盐；0.05％w/v的谷氨酸盐，1.5％w/v的明胶，2％w/v的精氨酸，9％w/v的蔗糖，0.9％w/v的磷酸盐；0.09％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3.8％w/v的精氨酸，6％w/v的蔗糖2.5％w/v的磷酸盐；抗生素含量＜0.015mcg/mL；多价流感抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份，多价流感抗原包括四价或多价A型流感抗原和四价或多价B型流感抗原。

本发明流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；也可以是包含了H1-H16亚型，N1-N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原；本发明包含的流感四价及多价疫苗抗原为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原，具体地讲，A型多价病毒抗原以冷适应减毒的A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒抗原以B/AnnArbor/1/66为病毒骨架。本发明喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

本发明所提供的通过鸡胚生产喷鼻流感四价(H1N1、H3N2、H5N1和B型)减毒活疫苗的方法，主要包括以下步骤：

1)利用现有反向遗传学方法，分别将H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如COS1、COS7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生4种多价疫苗抗原；

2)鸡胚大量培养病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌；

3)浓缩纯化后的多种流感病毒抗原等量混合，同时加入稳定剂如蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液、抗生素如硫酸庆大霉素制备成喷鼻疫苗。

本发明所提供的通过哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产喷鼻流感四价减毒活疫苗的方法，主要包括以下步骤：

1)利用现有反向遗传学方法，分别将H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如COS1、COS7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生4种多价疫苗抗原；

2)使用无血清培养基培养哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)大量培养病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化疫苗抗原，透析及过滤除菌。

3)浓缩纯化后的多种流感病毒抗原等量混合，同时加入稳定剂如蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液、抗生素如硫酸庆大霉素制备成喷鼻疫苗。

本发明所提供的通过鸡胚生产任意组合的喷鼻流感多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)减毒活疫苗的方法，包括以下步骤：

1)利用现有反向遗传学方法，分别将各型流感病毒的基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如COS1、COS7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生多种多价疫苗抗原；

2)鸡胚大量培养病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌；

3)浓缩纯化后的多种流感病毒抗原等量混合，同时加入稳定剂如蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液、抗生素如硫酸庆大霉素制备成喷鼻疫苗。

本发明所提供的通过哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产任意组合的喷鼻流感多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)减毒活疫苗的方法，包括以下步骤：

1)利用现有反向遗传学方法，分别将各型流感病毒的基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如COS1、COS7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生多种多价疫苗抗原。

2)使用无血清培养基培养哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)大量培养病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化疫苗抗原，透析及过滤除菌。

3)浓缩纯化后的多种流感病毒抗原等量混合，同时加入稳定剂如蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液、抗生素如硫酸庆大霉素制备成喷鼻疫苗。

根据本发明阐述，经鼻免疫属于黏膜免疫途径，本发明疫苗可以是经鼻腔途径的液体、喷雾式的气溶胶形式、粉末状、乳脂状及乳化的病毒颗粒等。

本发明中涉及流感多价疫苗抗原包括：流感四价(H1、H3、H5、B)，流感五价(H1、H3、H5、H7、B)也可是(H1、H3、H5、H9、B)也可是(H1、H3、H5、H7、H9)等等量组合；流感六价(H1、H3、H5、H7、H9、B)也可是(H1、H2、H3、H5、H7、H9)也可是(H1、H2、H3、H4、H5、H6)等等量组合；流感八价(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9)也可是(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、B)也可是(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H9、B)等等量组合；流感十价(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H9、H10、B)也可以是(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10)等等量组合；流感十二价(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12)也可是(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、B)等等量组合；流感十四价(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14)也可是(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、B)等等量组合；流感十六价(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、H16)也可以是(H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15、B)等等量组合，也可以是包含了H1-H16亚型，N1-N9型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原。本发明流感多价疫苗抗原均采用CN20061007909.5专利申请的方法制备。

经鼻腔接种不仅可以产生系统免疫，还可以产生局部黏膜免疫。鼻腔喷雾免疫接种还具有一下特点：(1)使用简便，适宜人人可以自己喷鼻接种，适合于流感大流行或家庭化；(2)抗原用量小，免疫原性与肌肉注射相当，避免了注射的疼痛和交叉感染；(3)一苗多效，既可预防普通流感，又可预防高致病性人禽流感；(4)双重的效果，既可产生系统免疫，又可产生黏膜免疫；(5)副反应低，既可用于成年，又可适用儿童与老年；(6)制备简单、成本低廉，工艺流程简单，成本可降低10倍以上。因此，开发鼻腔接种流感疫苗代替传统的注射接种具有很大的应用前景，因为鼻腔喷雾接种流感疫苗具有简单、有效、安全，非常适于所有人群的自我使用。

本发明使用流感四价(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或多价减毒活疫苗经鼻腔喷鼻进行免疫接种，可安全、有效地预防人普通流感和高致病性人禽流感病毒的感染。本发明的优点在于，经鼻途径免疫的流感四价(H1N1、H3N2、H5N1、B型)或多价减毒活疫苗，在哺乳动物中可同时诱导有效的黏膜免疫和系统免疫，并使机体产生高效价sIgA和IgG、IgA，其效果较目前所应用的疫苗组分——无论是单纯的灭活病毒颗粒、加佐剂的灭活病毒及活病毒都理想。

本发明使用无血清培养基培养哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)制备抗原的优势是，可以避免鸡胚特异性蛋白所引起的过敏反应。因此本疫苗尤其适用于如患有哮喘、过敏、免疫缺陷及老年人等高危人群，可有效地预防流感病毒感染。本发明的流感四价或多价减毒活疫苗经不同实验动物(小鼠、雪貂和人体)滴鼻途径免疫，结果证明，按第0、28天两次滴鼻免疫程序，可产生高效价的IgA和IgG抗体，即可同时诱导黏膜免疫和系统免疫。可以很好的保护小鼠免受流感病毒的攻击，且产生了一定的交叉保护性。流感四价减毒活疫苗的小鼠实验结果显示：有AL(OH)₃佐剂的情况下，喷鼻流感四价灭活疫苗不能激发机体较高水平的IgA和IgG免疫应答，相反，喷鼻流感四价减毒活疫苗在无佐剂情况下，则可激发机体产生更高效价的IgA、IgG、和HAI。流感四价减毒活疫苗的雪貂实验结果显示：无论是鸡胚培养得到的，还是Vero细胞培养得到的病毒抗原，经喷鼻途径免疫雪貂后，较流感灭活疫苗加AL(OH)₃佐剂组可产生较高的HI效价。说明流感多价减毒活疫苗喷鼻免疫途径为可供选择的理想途径之一。流感四价减毒活疫苗的人体实验结果显示：在健康人群志愿者中，一剂量接种28天后，喷鼻免疫流感多价减毒活疫苗和灭活疫苗产生相似的血清阳性，血清转化率和血清保护率。但是喷鼻免疫流感多价减毒活疫苗比灭活疫苗产生更高水平的IgA抗体。

具体实施方式

实施例1：流感四价(H1N1、H3N2、H5N1和B型)减毒活疫苗株的制备

A型流感病毒株H1、H3、H5和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。采用传统的鸡胚尿囊腔培养流感病毒方法或微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。

①利用现有反向遗传学方法，A型多价病毒以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为拯救病毒骨架，分别整合当年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即将H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如COS1、COS7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生4种多价病毒。

②鸡胚大量培养4种多价病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、12-60％蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌。

③由哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产4种多价病毒：用无血清培养基，采用的方法有：微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌。

④浓缩纯化后的4种流感病毒抗原等量混合，病毒抗原用稳定液稀释，最终使得每一剂0.2ml，包含0.188mg谷氨酸一钠(monosodiumglutamate)，2.00mg水解猪明胶(hydrolyzed porcine gelatin)，2.42mg精氨酸(arginine)，13.68mg蔗糖(sucrose)，2.26mg磷酸氢二钾(dibasicpotassium phosphate)，0.96mg磷酸二氢钠(monosodium phosphate)，以及抗生素如硫酸庆大霉素含量要求＜0.015mcg/mL。从而制备流感四价疫苗用于喷鼻免疫，该疫苗在2-8℃下是稳定的，便于运输和长期保存。

实施例2：流感多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2亚型)减毒活疫苗抗原的制备

A型流感病毒株H1N1、H3N2、H5N1、H7N7、H9N2亚型和B型流感病毒株由中国CDC和华兰生物技术股份有限公司提供。采用传统的鸡胚尿囊腔培养流感病毒方法或微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)培养流感病毒。

①利用现有反向遗传学方法，A型多价疫苗抗原以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，B型多价疫苗抗原以B/Ann Arbor/1/66为拯救病毒骨架，分别整合当年流行A、B型流感病毒株的HA、NA表面抗原基因，即将任意组合的各型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞(如COS1、COS7、Vero、MDCK、293T等细胞或COS/MDCK、293T/MDCK等共培养细胞)产生多种多价疫苗抗原。

②鸡胚大量培养多种多价病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、12-60％蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化疫苗抗原，透析及过滤除菌。

③由哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)生产多种多价病毒：用无血清培养基，采用的方法有：微载体悬浮培养和驯服哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等等)培养流感病毒。收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化疫苗抗原，透析及过滤除菌。

④浓缩纯化后的多种流感疫苗抗原等量混合，疫苗抗原用稳定液稀释，最终使得每一剂0.2ml，包含0.188mg谷氨酸一钠(monosodiumglutamate)，2.00mg水解猪明胶(hydrolyzed porcine gelatin)，2.42mg精氨酸(arginine)，13.68mg蔗糖(sucrose)，2.26mg磷酸氢二钾(dibasicpotassium phosphate)，0.96mg磷酸二氢钠(monosodium phosphate)，以及抗生素如硫酸庆大霉素含量要求＜0.015mcg/mL。从而制备流感多价疫苗用于喷鼻免疫，该疫苗在2-8℃下是稳定的，便于运输和长期保存。

实施例3：流感四价减毒活疫苗的小鼠体内效果观察

1、免疫策略，使用不同剂型的流感病毒疫苗免疫小鼠

①按照例1所制备流感四价(H1N1、H3N2、H5N1和B型)减毒活病毒株的方法，同时将抗原用稳定剂稀释到减毒活疫苗的量≥5×10⁶EID₅₀，其中以喷鼻灭活流感疫苗+AL(OH)₃佐剂组为对照(Tab1)。

②6组Balb/c小鼠分别接受不同剂型的疫苗经鼻免疫，每只小鼠20μl的抗原溶液，其中灭活流感疫苗含有AL(OH)₃佐剂。分别于第0、28天进行免疫，并于第42天测定血清，鼻冲洗液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效价。

表1疫苗喷鼻免疫Balb/c小鼠组别设计

2、血清，鼻冲洗液及肺灌洗液中的IgG、IgA及HAI效价的测定

①免疫后42天，取动物的鼻冲洗液、肺脏及血清标本，测定每份标本的抗体效价

②分离小鼠的NALT，用0.5mlPBS冲洗，收集鼻冲洗液测定其IgA含量

③肺组织裂解标本的制备：处死小鼠，打开喉部，取出肺脏并用PBS清洗，研磨肺组织并离心匀浆去处细胞组织，收集上清液并储存于-20℃，用于IgA效价测定。

④IgG和IgA效价测定使用商品化甲型或乙型流感病毒ELISA检测试剂盒(Genzyme Virotech)。37℃孵育2h后加入羊抗鼠IgG或IgA抗体(Pharmigen)及底物液和显色液检测特异性IgG和IgA抗体效价。

⑤HAI效价测定：取小鼠血液，按照Palmer et al指定方法测定甲型和乙型流感病毒HAI效价。

⑥数据显示在有AL(OH)₃佐剂的情况下，喷鼻流感四价灭活疫苗不能激发机体较高水平的IgA和IgG免疫应答，相反，喷鼻流感四价减毒活疫苗在无佐剂情况下，则可激发机体产生更高效价的IgA、IgG、和HAI(Tab2)。表2不同种类流感疫苗株喷鼻免疫小鼠后鼻冲洗液、肺灌洗液中IgA效价以及血清IgG和HAI效价的测定结果

NC表示：New Caledonia/20/99，WS表示：Wisconsin/67/2005，XJ表示XiJiang/424/2004，ML表示Malaysia/2506/2004，

PL表示肺灌洗液，n.d表示没有测定

实施例4：流感四价减毒活疫苗的雪貂体内效果观察

1、免疫策略，使用不同剂型的流感病毒疫苗免疫雪貂

①按照例1所制备流感四价(H1N1、H3N2、H5N1和B型)减毒活疫苗的方法，制备适用于雪貂喷鼻免疫的剂型。

②9-10周龄的雄性雪貂，选取体重为1-2kg的用于本实验，所有这些动物在实验之前均为血清阴性。免疫之前，雪貂用0.5ml体积比为9∶3∶1的氯胺酮/甲苯噻嗪/阿托品混合物麻醉，通过颈静脉取血测定HI效价。

③6组雪貂，分别接受不同剂型的流感四价减毒活疫苗喷鼻免疫，每只0.2ml抗原溶液，每只鼻孔100μl，按照表3的组别分别进行免疫，并于第28天测定HI效价。

④血清HI效价测定：雪貂颈静脉取血，按照OIE标准指定的方法进行HI测定。

⑤实验结果显示，流感四价减毒活疫苗，无论是鸡胚培养得到的，还是Vero细胞培养得到的病毒抗原，经喷鼻途径免疫雪貂后，较流感灭活疫苗加AL(OH)₃佐剂组可产生较高的HI效价。说明流感多价减毒活疫苗喷鼻免疫途径为可供选择的理想途径之一(表3)。

表3实验一疫苗免疫雪貂后HI效价测定结果

c：Geometri mean titer几何平均效价

2、流感四价减毒活疫苗在雪貂上的复制情况

流感四价减毒活疫苗的减毒表型通过免疫雪貂得以验证，选取9-10周龄的雄性雪貂，评价多价疫苗株在动物呼吸道的复制情况。每只动物鼻腔接种8.5log₁₀pfu的流感多价疫苗抗原，感染后3天，雪貂用氯胺酮-HCL溶液作为镇静剂，收获肺和鼻甲，肺组织匀浆通过系列稀释接种10日龄鸡胚，利用Karber方法测定病毒滴度log₁₀EID50。空斑测定NT中病毒的复制情况，用log₁₀pfu/g表示，实验结果见表4。

表4：实验二流感多价疫苗在雪貂上的复制情况

实施例5：流感四价减毒活疫苗的人体体内效果观察

1、在健康人群志愿者中，评价并比较滴鼻给药加AL(OH)₃佐剂的流感灭活疫苗和流感四价减毒活疫苗和的免疫效果。

2、开放的、受控制的，随机的来评价了疫苗在男性和女性受试者的局部黏膜和系统免疫反应。

3、所有受试者执行下述检测：

0天，28天：ELISA检测黏膜IgA(局部免疫反应)，分别检测疫苗中每一流感代表株。

0天，28天：检测血清HA-HI抗体滴度，分别检测每一流感代表株。

4、数据来源下述项目：

(1)所有时间点血清HI抗体的几何平均数GMTs(95％有效值)。

(2)对HI：28天时血清转化率。

(3)对HI：28天时转化系数。

(4)对HI：28天时的保护率。

(5)仅对IgA：从0-28天受试者IgA抗体滴度增加2-4倍的百分率。

5、经过对局部和全身症状的8天随访期，两种疫苗对安全性和反应性均耐受。关于接种无严重有害作用显示。

6、疫苗免疫原性的检测通过血凝抑制滴度来决定血清转化率(疫苗的百分率是根据28天HI滴度是0天至少增加4倍而限定的，每一疫苗株)，转化系数(是根据28天比0天HI几何平均滴度(GMTs)的倍增值而限定的，每一疫苗株)，血清保护率(接种后公认显示保护HI滴度≥40而限定的，每一疫苗株)，另外黏膜IgA抗体反应用ELISA来检测。

7、接种一剂量喷鼻流感灭活疫苗或四价减毒活疫苗28天后HI血清阳性，血清转化率和血清保护率见表5。

血清阳性(n，％)：编号和受试者的滴度≥10

血清保护率(n，％)：编号和受试者的滴度≥40

血清转化率(n，％)：编号和受试者从0天到28天的滴度至少是4倍的增殖

8、所有实验中，血清转化系数(接种后血清HI GMTs增加)要高于2.5，这一水平是所有成功流感疫苗必须的。

9、在0天，28天中(一剂量)，亚型/总IgA抗体比率增加2倍或4倍的受试者百分率见下表6。

10、结果表明：一剂量接种28天后，喷鼻免疫流感多价减毒活疫苗和灭活疫苗产生相似的血清阳性，血清转化率和血清保护率。但是喷鼻免疫流感多价减毒活疫苗比灭活疫苗产生更高水平的IgA抗体。

实施例6：喷鼻免疫流感疫苗

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗，0.07％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3％w/v的精氨酸，7％w/v的蔗糖，2.0％w/v的磷酸盐；流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；流感四价及多价疫苗病毒为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原。具体地讲，A型多价病毒以冷适应减毒的A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

实施例7：

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗，0.05％w/v的谷氨酸盐，1.5％w/v的明胶，2％w/v的精氨酸，9％w/v的蔗糖，0.9％w/v的磷酸盐；

流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；流感四价及多价疫苗病毒为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原。具体地讲，A型多价病毒以冷适应减毒的A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

实施例8：

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗，0.09％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3.8％w/v的精氨酸，6％w/v的蔗糖2.5％w/v的磷酸盐。抗生素如硫酸庆大霉素含量＜0.015mcg/mL。

流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；流感四价及多价疫苗病毒为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原。具体地讲，A型多价病毒以冷适应减毒的A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

实施例9：

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗，0.05％w/v的谷氨酸盐，1.5％w/v的明胶，2％w/v的精氨酸，9％w/v的蔗糖，0.9％w/v的磷酸盐；抗生素如硫酸庆大霉素含量＜0.015mcg/mL。

流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；流感四价及多价疫苗病毒为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原。具体地讲，A型多价病毒以冷适应减毒的A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

实施例10：

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗，0.09％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3.8％w/v的精氨酸，6％w/v的蔗糖2.5％w/v的磷酸盐。抗生素如硫酸庆大霉素含量＜0.015mcg/mL。流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；流感四价及多价疫苗病毒为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原。具体地讲，A型多价病毒以冷适应减毒的A/AnnArbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

实施例11：

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗，0.05％w/v的谷氨酸盐，1.5％w/v的明胶，2％w/v的精氨酸，9％w/v的蔗糖，0.9％w/v的磷酸盐；

流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；流感四价及多价疫苗病毒为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原。具体地讲，A型多价病毒以冷适应减毒的A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

实施例12：

每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗，0.09％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3.8％w/v的精氨酸，6％w/v的蔗糖2.5％w/v的磷酸盐。抗生素如硫酸庆大霉素含量＜0.015mcg/mL。流感多价疫苗抗原包含了流感四价(H1N1、H3N2、B、H5N1)或在此基础上任意组合的多价(H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2等亚型)疫苗抗原；流感四价及多价疫苗病毒为通过反向遗传学方法制备的多价流感减毒活疫苗抗原。具体地讲，A型多价病毒以冷适应减毒的A/AnnArbor/6/60为病毒骨架，而B型多价病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。喷鼻流感疫苗成品中含有A型流感(H1N1、H3N2、H5N1、H7N7和H9N2等亚型)和B型病毒制备的流感四价或多价减毒活疫苗抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份。

流感多价减毒活疫苗抗原的制备：通过现有反向遗传学方法，A、B型多价病毒分别以冷适应减毒流感病毒株A/Ann Arbor/6/60和B/AnnArbor/1/66为拯救病毒骨架，整合当年流行病毒株的表面抗原基因，利用现有流感病毒质粒拯救系统制备的多价疫苗抗原，通过感染鸡胚或哺乳动物细胞(如Vero细胞、MDCK细胞、2BS细胞等)进行培养，然后除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化、透析及过滤除菌，浓缩纯化后得流感减毒活疫苗抗原。

Claims (8)

1.一种喷鼻免疫流感多价疫苗，其特征在于该喷鼻免疫流感疫苗包含稳定剂、抗生素和流感多价疫苗抗原；每0.2ml喷鼻免疫流感疫苗中，稳定剂含0.01-0.20％w/v的谷氨酸盐，1.0-4.0％w/v的明胶，1-4％w/v的精氨酸，5-10％w/v的蔗糖，0.8-3.0％w/v的磷酸盐；抗生素含量＜0.015μg/mL；多价流感抗原的用量为1×10⁶EID₅₀-15×10⁶EID₅₀/0.2ml/人份或0.1×10^6.5-7.5TCID₅₀-10×10^6.5-7.5TCID₅₀/0.2ml/人份，多价流感抗原包括A、B型重组流感病毒组合形成的四价或多价病毒抗原；流感多价疫苗抗原包含了由H1N1、H3N2、B、H5N1组成的流感四价疫苗抗原，由H1N1、H3N2、B、H5N1、H7N7、H9N2组合的六价疫苗抗原或在此基础上包含H1-H16亚型，N1-N9亚型的所有组合得到的流感多价疫苗抗原。

2.如权利要求1所述的喷鼻免疫流感疫苗，其特征在于所述稳定剂为0.07％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3％w/v的精氨酸，7％w/v的蔗糖，2.0％w/v的磷酸盐。

3.如权利要求1所述的喷鼻免疫流感疫苗，其特征在于所述稳定剂为0.05％w/v的谷氨酸盐，1.5％w/v的明胶，2％w/v的精氨酸，9％w/v的蔗糖，0.9％w/v的磷酸盐。

4.如权利要求1所述的喷鼻免疫流感疫苗，其特征在于所述稳定剂为0.09％w/v的谷氨酸盐，3.0％w/v的明胶，3.8％w/v的精氨酸，6％w/v的蔗糖，2.5％w/v的磷酸盐。

5.如权利要求1-4任一所述的喷鼻免疫流感疫苗，其特征在于所述流感四价及多价疫苗抗原为通过反向遗传学技术制备的重组流感减毒活疫苗，A型重组病毒以冷适应、减毒的A/Ann Arbor/6/60为病毒骨架，而B型重组病毒以B/Ann Arbor/1/66为病毒骨架。

6.如权利要求1-4任一所述的喷鼻免疫流感疫苗，其特征在于所述疫苗是经鼻腔途径的液体、喷雾式的气溶胶形式、粉末状、乳脂状及乳化的病毒颗粒。

7.如权利要求1-4任一所述的喷鼻免疫流感疫苗的制备方法，其特征在于该方法为包括以下步骤：

1)利用现有反向遗传学方法，分别将H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞产生4种多价疫苗抗原；

2)鸡胚大量培养病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化，透析及过滤除菌；

3)浓缩纯化后的多种流感病毒抗原等量混合，同时加入稳定剂如蔗糖磷酸谷氨酸盐缓冲液、抗生素如硫酸庆大霉素制备成喷鼻疫苗。

8.如权利要求1-4任一所述的喷鼻免疫流感疫苗的制备方法，其特征在于该方法为包括以下步骤：

1)利用现有反向遗传学方法，分别将H1N1、H3N2、H5N1和B型流感病毒基因片段构建的8、3或4个重组质粒共转染哺乳动物细胞产生4种多价疫苗抗原；

2)使用无血清培养基培养哺乳动物细胞大量培养病毒，收集病毒通过除菌、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心或柱层析分离纯化疫苗抗原，透析及过滤除菌；

3)浓缩纯化后的多种流感病毒抗原等量混合，同时加入稳定剂、抗生素制备喷鼻疫苗。