CN111511396B

CN111511396B - 活包膜病毒的液体疫苗

Info

Publication number: CN111511396B
Application number: CN201880082809.XA
Authority: CN
Inventors: P·维尔梅吉; E·凯特斯; C·德克斯; M·皮埃斯特
Original assignee: Intervet International BV
Current assignee: Intervet International BV
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2018-12-21
Publication date: 2024-02-02
Anticipated expiration: 2038-12-21
Also published as: CA3084450A1; AR113996A1; US20200368346A1; AU2018386618A1; CL2020001688A1; RU2020123713A3; BR112020012632A2; US11344617B2; JP7184900B2; AU2018386618B2; CN111511396A; JP2021508680A; EP3727440A1; WO2019122329A1; MX2020006514A; ZA202003155B; CA3084450C; RU2020123713A

Abstract

本发明描述了一种活包膜病毒和药学上可接受的载体的液体疫苗组合物，其中所述载体是天然低共熔溶剂(NADES)，和所述疫苗的水活度小于约0.8。NADES在长时间和环境温度下稳定敏感病毒。在通常情况下，根据本发明的液体疫苗组合物在各种包膜病毒的不同组合物中显示出显著的稳定能力。这克服了对冻干的需求，具有巨大的经济利益。疫苗的液体性质也便于向人或动物目标施用。

Description

活包膜病毒的液体疫苗

技术领域

本发明涉及疫苗学领域。特别地，本发明涉及活包膜病毒的液体疫苗组合物。此外，本发明涉及制备这样组合物的方法及其医药用途，涉及试剂盒以及NADES的用途。

背景技术

低共熔溶剂(DES)是众所周知的组合物，具有很多卓越的性质。在通常情况下，这些是在环境温度下为液体，但水含量较低的化合物的混合物。而且，存在的少量水紧密结合，限制了其在化学或生物过程中的可用性。这由非常低的水活度值表示。例如，Abbott等，2003，Chem.Commun.，vol.1，p.70-71和在WO 2009/120839中描述了DES。

DES也称为“质子离子液体”。其前身是仅由一种熔融盐组成的“离子液体”，其长期以来已在各种工业应用中使用，例如作为金属的溶剂，或用于提取纤维素或生物燃料。

DES具有高离子性，但同时水活度非常低，因此作为极性疏水性化合物的溶剂非常有效。实例的范围从气体、矿物质或工业批量产品的提取到药物增溶。还将DES用于提取和稳定诸如酶和RNA的生物分子，分别参见US 8,247，198和WO 2011/155829。

从2011年左右开始，人们就开始考虑使用由天然物质组成的特殊形式的DES。将这些称为“天然DES”或NADES，如在Choi等，2011，Plant Physiol.，vol.156，p.1701-1705；和Dai等，2013，Anal.Chim.Acta，vol.766，p.61-68中所描述的。目前，NADES作为可用于提取天然产物的“绿色”溶剂，以及用作天然杀虫剂的溶剂备受关注。

病毒是人和动物的重要病原体。因为对于大多数病毒来说，要么没有抗病毒药物，要么使用这样的药物是不可行的，因此，针对病毒感染和病毒性疾病最常用的防御措施是接种疫苗。病毒疫苗可以存在灭活(杀死)的病毒，通常需要免疫佐剂来促进充分的免疫应答。当使用包含“活”(即，复制性)病毒的疫苗时，通常不需要佐剂，因为该病毒能够在接种宿主中复制，从而引起免疫应答。通常，活病毒疫苗包含弱毒力病毒，以免由接种本身引起(严重)疾病。

疫苗工业中的重要问题是如何在此类减毒活病毒的生产、收集、制剂过程中以及最终产品的保质期内保持其活力。如果没有某种形式的稳定作用，几乎任何病毒都无法在这种处理和储存条件下存活长达2年。一些病毒甚至需要在液氮中储存和销售，这当然是非常昂贵且费力的。但是，最常用的方法是通过在适当的稳定剂中冻干减毒活病毒来从样品中除去大部分水，以形成由冷冻干燥体(例如，以饼或冻干球形式)组成的疫苗。冷冻干燥疫苗可以在保护性氛围中长时间保存，通常在-20℃或在4℃下。接种时，通常将冻干体溶于适当稀释剂中，并且可以将重构病毒向需要此类接种的目标施用。

然而，冷冻干燥过程费力、昂贵且非常耗时；例如，在正常情况下，生产需要长达4天或者甚至更多天时间，因此需要在冷冻干燥设备上进行大量资本投资。因此，已经研究了用于提供液体形式的活病毒疫苗的选择，参见例如WO 2014/029702、WO 2014/140239和WO2015/121463。这些公开文件描述了含有高达40％w/v的糖类添加剂以及诸如缓冲剂和氨基酸的其他组分的水性液体。然而，即使这些组合物也不能总是为活病毒产品(特别是敏感病毒)，或在无法获得冷藏或冷藏不可靠的情况下提供所需的寿命。

因此，在这一领域中需要稳定的活病毒疫苗，其不需要通过冷冻干燥生产，但是在液体形式下对敏感病毒具有足够的稳定性，且在长期保存后仍具有足够的稳定性。

病毒稳定性取决于几个因素，主要是：物理、化学和生物因素。物理因素主要是温度和时间；化学因素来自包含病毒的组合物，包括pH、渗透压和水含量。生物因素涉及水活度和病毒本身的特征。通常，最稳定的病毒很小，具有DNA基因组并且最相关的是没有病毒包膜。

在通常情况下，包膜病毒是最不稳定的病毒，尤其是当其很大和/或包含RNA基因组时。有几个对稳定性敏感的包膜病毒科，在这些科中，有很多与人类医学或兽医相关的病毒种。在诸如Fields Virology(第4版，2001，Lippincott Williams&Wilkins,ISBN-10:0781718325)的手册中对这些进行了描述。仅举一些实例是副粘病毒、疱疹病毒和冠状病毒。

在现有技术中，WO 2014/029702、WO 2014/140239和WO 2015/121463描述了活病毒的液体疫苗组合物，其中组合物不包含DES，且液体至少包含60％w/v的水。在这些水性组合物中，水活度(a_w)大于0.85。

WO 2011/155829描述了使用NADES提取生物材料。列出的选择之一是提取蛋白性材料，如疫苗。

类似地，WO 2014/131906特别地描述了一种用于血液或组织中病毒的固定剂，特别着重用于病毒RNA的提取和稳定，以用于临床诊断。固定剂是DES，且WO 2014/131906列出了大量可能的DES组合物，但实际仅使用了含有尿素或三氟乙酰胺作为质子受体，以及胆碱或甜菜碱作为质子供体的组合物。在WO 2014/131906中，最优选的DES由胆碱氯化物和三氟乙酰胺组成，因此其不是NADES，并且三氟乙酰胺不是药学上可接受的赋形剂。

Byrne等(2012,Phys.Chem.Chem.Phys.,vol.14,p.10119-10121)描述了在质子离子液体中植物病毒烟草花叶病毒(TMV)的稳定作用。尽管其具有RNA基因组，但作为植物病毒，TMV是没有包膜的。此外，该论文没有公开疫苗，也没有提供有关病毒感染性长期稳定性的定量数据。而且，Byrne等使用的质子离子液体是基于甲磺酸盐(甲烷磺酸盐)和乙胺的，因此其不是NADES。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，并通过提供一种不需要通过冷冻干燥生产，但是即使针对敏感病毒也足够稳定的活病毒疫苗来适应本领域的需求。

令人吃惊地发现，通过提供能够稳定敏感病毒(如包膜病毒)的液体疫苗组合物，能够实现这一目的，并因此可以克服现有技术中的一个或多个缺陷。这是通过使用水活度低于0.8的NADES作为疫苗载体来实现的。

这一发现开启了很多非常有利的应用领域：现在甚至可以针对敏感病毒制备稳定的疫苗，而无需冷冻干燥，这可以极大地节约时间成本、人工和资本投资。此外，在环境温度下呈液体形式能够容易地向目标人或动物施用。而且，可以将天然化合物用作药物赋形剂。

出乎意料的是，DES能够稳定包膜病毒：因为作为强大的溶剂，预期DES会溶解脆弱的病毒包膜并提取病毒蛋白和核酸。但是，相反的是，已经发现NADES制剂能够稳定病毒包膜。这种稳定作用比使用水性液体组合物所观察到的稳定作用更好。例如，在使用活的犬副流感病毒(CPiV)进行的稳定性研究中，在基于具有非常低的水活度的NADES的液体疫苗组合物中，在25℃下，显著的病毒滴度能够维持长达8周，而在两周内几乎检测不到储存在完全培养基中的病毒。

还令人吃惊的发现，包含NADES的根据本发明的液体疫苗组合物在直接注射进入目标动物后具有良好的耐受性，并且可用于鼻内施用。

尚不确切知晓，NADES如何或为何能够有效地稳定包膜活病毒。尽管发明人不想受到任何可能解释这些发现的理论或模型的束缚，但是其推测DES中极低的水活度负责维持病毒的稳定性，并且天然来源的NADES成分对敏感病毒的攻击性不及DES的常见成分。

因此，在一个方面中，本发明涉及一种包含活包膜病毒和药学上可接受的载体的液体疫苗组合物，其特征在于，所述载体是天然低共熔溶剂(NADES)，和所述疫苗的水活度小于约0.8。

具体实施方式

术语“液体”以其通常含义使用，是指可以在一定温度和一定时间段内能够流动的组分。确定液体性质的一种方法是倾斜试验，其中在某一温度下将含有某一组分的容器倾斜，并且当在一定量的时间之后检测到组分形式的任何变化时，将该组分归类为液体。

众所周知，“疫苗”是具有医学作用的组合物。疫苗包含免疫活性组分和药学上可接受的载体。在当前情况下，“免疫活性组分”包含活病毒。疫苗被目标人或动物的免疫系统所识别，从而诱导保护性免疫应答。应答可以来源于目标的先天性和/或获得性免疫系统，并且可以是细胞型和/或体液型的。

疫苗通常可以有效降低感染的严重程度，例如通过减少病原体的数量，或缩短病原体在宿主动物中复制的持续时间。

而且，或者可能是其结果，疫苗通常可以有效减轻或改善可能是由此类感染或复制引起的，或由目标对这种感染或复制的应答引起的疾病的(临床)症状。

如本文中所使用的术语“包含/包括/含有/具有(comprises/comprise/comprising/comprised)”，旨在指本发明所涵盖的所有要素，并且以本发明可以想到的任何可能的组合表示，其包含在使用该术语的文本部分、段落、权利要求等中，即使未明确叙述此类要素或组合；也不排除任何一个或多个此类要素或组合。

因此，任何此类文本部分、段落、权利要求等也可以因此涉及一个或多个实施方式，其中术语“包含(comprises)”(或其变体)被诸如“由……组成(consist of/consistingof)”或“基本上由……组成”的术语所替代。

尽管从生物学上来说，将病毒称为“活的”是不正确的，但是这是指未灭活病毒的常用方式。因此，对于本发明，术语“活”指在适当条件下(例如，在适宜宿主细胞中)能够复制的病毒。

实践中，包含在根据本发明的液体疫苗组合物中的活病毒具有减弱的致病性，也将这种病毒称为“修饰的活病毒”。

与未经修饰的、非减毒的或“野生型”形式的这样的病毒相比，对于本发明，将本发明的“减毒的”定义为引起较低水平的病变，和/或具有降低的感染率或复制率。可以以不同方式获得病毒的减弱，例如通过实验动物或细胞培养传代和选择、或经由重组DNA技术，其均为本领域所公知。

“包膜病毒”是具有磷脂外壳的公知的人或动物病毒的类型。例如，非洲猪瘟病毒(Asfar-)、杆状病毒、嗜肝病毒(Hepadna-)、疱疹病毒和痘病毒科；冠状病毒、黄病毒和披膜病毒科；沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒、正粘病毒、副粘病毒、肺炎病毒和弹状病毒科；以及呼肠病毒和逆转录病毒科病毒。

病毒包膜是来自人类或动物病毒几个科的病毒的组成部分，是病毒从其动物或人类宿主细胞中出芽时衍生的。包膜是脂质双层并且包含磷脂和蛋白。病毒包膜既对损伤非常敏感，又对包膜病毒感染新宿主细胞的能力至关重要。因此，如通过感染指数所测量的，任何损失都会显著降低病毒滴度。

因此，可以根据病毒的感染性，即感染适宜宿主细胞或适宜实验动物的能力，有效地表明活包膜病毒的稳定性。这可以在体内确定，但更方便地在体外确定，例如使用受精卵或适宜宿主细胞的细胞培养。然后，例如可以表达并比较稳定作用前后病毒的感染性，例如以其组织培养物感染剂量(TCID50)、噬斑形成单位或卵感染剂量(EID)的滴度表示。

对于本发明，“药学上可接受的载体”是高纯度液体并且优选地是无菌的。在当前情况下，载体是NADES。载体可以包含其他添加剂，如稳定剂、抗氧化剂或防腐剂。

“低共熔溶剂”(DES)是本领域公知的，是以形成共熔混合物的摩尔比包含至少两种化合物的混合物的离子液体，由此所得混合物的共熔点显著低于各个化合物的熔点。混合物熔点的降低是由于化合物之间的相互作用引起的，一个是质子供体，另一个是质子受体，其提供稳定的氢键而不会结晶，从而使在与其组分相比低得多的温度下混合物呈液态。通常“共熔”是指：易于熔化。

对于本发明，用于形成本发明的DES的单个化合物的熔点高于约80℃，且DES的熔点低于约40℃。例如，甜菜碱和蔗糖的熔点分别为310℃和186℃，而发现甜菜碱：蔗糖以2：1的摩尔比以及包含一些水形成的NADES形成了澄清液体，其即使在-20℃下仍为流体。

术语“天然”用来表示用于形成用于本发明的天然DES(NADES)的化合物是在正常条件下存在于来自生物来源(如植物或动物)的材料，且含量远高于痕量的有机化合物。通常，这样的天然化合物是或衍生自存在于植物或动物来源的特定材料中的主要代谢产物。如本领域技术人员将意识到的，术语天然仅在本文中用于表征用于本发明的NADES中化合物的初始来源，而不是表征所使用化合物的实际来源。因此，当通过(半)合成生产获得时，天然化合物也可用于本发明。

可以用于形成用于本发明的NADES的天然化合物的实例是有机酸、胺、糖、糖醇和氨基酸。

根据本发明的液体疫苗组合物的另一有利特征是疫苗中存在的水紧密结合在NADES的结构中。其结果是，可用于能够影响包膜病毒稳定性的化学或生物过程的水量是非常有限的。此特性通常以水活度的值表示，用符号a_w表示。水活度在上限1.0(纯水)和下限0之间变化。通常通过比较(在相同温度下)待测组合物的蒸气压相对于纯水以及已知水活度的很多饱和盐溶液的蒸汽压来测量水活度。在不同手册、综述和说明书中对其进行了描述，例如在FAO第149号农业服务公告水果和蔬菜的保存部分(Cánovas等，FAO,Rome,2003,ISBN92-5-104861-4)；和综述‘Fundamentals of water activity’,Decagon Devices Inc.,Washington,2015(http://pdf.directindustry.com/pdf/decagon-devices-inc/fundamentals-water-activity/64142-634433.html)中。

当水活度小于0.8时，大部分细菌停止生长；在小于0.7时，大部分酵母和霉菌停止生长，和在水活度小于0.4时，大多数酶的活性被有效地终止。

测量水活度的设备和程序是本领域公知和可以使用的，例如通过使用顶空压力分析。

对于本发明，所示的水活度指最终产品形式的根据本发明的液体疫苗组合物的水活度，例如，最终产品是由生产厂商提供的，并且可以以这种形式储存较长时间。因此，这是指在将其以任何方式稀释之前(如下文所述)，即将施用至目标之前的根据本发明的液体疫苗组合物。

对于本发明，“约”表示数字可以在其所示值附近±10％之间变化。优选地，“约”是指其值±9％附近，更优选地，“约”是指其值±8、7、6、5、4、3、2％附近，或者甚至“约”指其值±1％附近，以此优先顺序排列。

对本发明领域的技术人员显而易见的是，在本文公开的本发明的实施方式中，将存在某种类型的NADES与病毒类型的组合比其他组合更有利，例如对于病毒的稳定性而言。尽管如此，本领域技术人员将能够仅使用常规方法和材料，根据本文公开的信息，选择、优化和微调根据本发明的组合和组合物。下面将描述本发明的优选实施方式和其他方面进一步的细节。

发现可以制备具有约0.8至约0.1之间的水活度的根据本发明的有效液体疫苗组合物。

因此，在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，疫苗的水活度小于约0.7；更优选地，小于约0.6、约0.5、约0.4、约0.3或者甚至小于约0.2，以此优先顺序排列。

发现最有效和最有利的用于根据本发明的液体疫苗组合物中的NADES组合物是选自有机酸、胺和氨基酸(的盐)的天然有机化合物与多元醇(如糖和糖醇)的组合。

因此，在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，NADES包含有机盐和多元醇。

在用于本发明的NADES的该组合物中，有机盐充当作为质子供体的离子物质，而多元醇充当质子受体。

“有机盐”是任何有机酸或碱的盐，包括两性离子，其在如上文本文所述的天然化合物的定义内，并且能够形成如本文所述的本发明的低共熔溶剂。本领域技术人员优选地能够选择用于本发明的有机盐，并且将其应用于形成NADES。

此外，有机盐应该是疫苗组合物的药学上可接受的赋形剂。例如，在政府法规，如欧洲药典和美国9CFR，以及在手册中，如药物赋形剂手册(R.Rowe等，Pharmaceuticalpress 2012,ISBN0857110276)；雷明顿：药物科学与实践(2000,Lippincot,USA,ISBN:683306472)和“兽医疫苗学”(P.Pastoret等编著，1997,Elsevier,Amsterdam,ISBN0444819681)中描述了此类疫苗赋形剂。

在根据本发明的液体疫苗组合物的一个优选的实施方式中，有机盐选自甜菜碱(betaine)、脯氨酸、肉碱(carnitine)和胆碱(choline)的盐。

对于本发明，“甜菜碱”指化合物N,N,N-三甲基甘氨酸，CAS号107-43-7，还将其称为甘氨酸-甜菜碱。脯氨酸是CAS号609-36-9。肉碱是CAS号541-15-1。胆碱是CAS号62-49-7。

在一个优选的实施方式中，肉碱是L-肉碱。

在一个优选的实施方式中，胆碱是胆碱-氯化物(CAS号67-48-1)。

用于本发明的有机盐可以以不同的盐、异构体形式、水合物或无水形式等等使用。本领域技术人员优选地能够选择和检测用于本发明的有机盐的适宜形式。

用于本发明的NADES中的化合物可以容易地以不同的纯度和质量从各种商业供应商获得。优选地，所使用的化合物是药用级质量的。

类似地，可以加入用于本发明的NADSE制剂中的水优选地是高质量和高纯度的水，并且适于胃肠外注射，将其称为“注射用水”。通常，其是双蒸水、反渗透水等。水将是无菌的，并且基本上是无热原的。

对于本发明，“多元醇”是一种含有两个或更多个羟基的有机化合物。然而，在多元醇定义下的非常大的聚合物，如纤维素，不能有效地形成如本文所定义的NADES，因此将其排除在本发明之外。因此，用于本发明的多元醇的分子量小于约10.000克每摩尔。更优选地，用于本发明的多元醇的分子量小于5000，或者甚至小于1000克每摩尔，以此优先顺序排列。

用于本发明的优选的多元醇是糖或糖醇，因为已证明其是能够产生用于本发明的多种有效的NADES组合物的通用组分。

因此，在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，多元醇是糖或糖醇。

本发明的“糖”是选自分子量较低的水溶性碳水化合物的组的任何化合物，其通常具有甜味。术语“糖”包括还原糖(如果糖和麦芽糖)、非还原糖(如蔗糖和海藻糖)。术语糖涵盖单糖、二糖或多糖，直至且包括六糖。

因此，在用于根据本发明的液体疫苗组合物中的多元醇的一个实施方式中，糖选自：果糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和海藻糖。

在根据本发明的液体疫苗组合物的一个优选的实施方式中，糖是蔗糖。

用于本发明的多元醇还可以是糖醇。对于本发明，“糖醇”是氢化的糖，其包含3个或更多个碳原子，并且能够基于单糖、二糖或多糖。

在用于根据本发明的液体疫苗组合物的多元醇的一个实施方式中，糖醇选自：甘油、木糖醇、甘露醇和山梨糖醇。

甘油是CAS号56-81-5。木糖醇是CAS号87-99-0。甘露醇是CAS号69-65-8。山梨糖醇是CAS号50-70-4。

在一个更优选的实施方式中，糖醇选自下组：甘油、木糖醇和山梨糖醇。

在一个实施方式中，山梨糖醇是D-山梨糖醇。

在用于根据本发明的液体疫苗组合物的多元醇的一个甚至更优选的实施方式中，多元醇选自：蔗糖、甘油、木糖醇和山梨糖醇。

如以上针对有机盐所述，多元醇可以以不同的异构体形式、水合物或无水形式等使用。本领域技术人员优选地能够选择和检测用于本发明的多元醇的适宜形式。

在用于根据本发明的液体疫苗组合物的NADES的一个实施方式中，有机盐选自甜菜碱、脯氨酸、肉碱和胆碱的盐；和多元醇选自果糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、甘油、木糖醇、甘露醇和山梨糖醇。

在用于根据本发明的液体疫苗组合物NADES的一个优选的实施方式中，有机盐选自：甜菜碱、脯氨酸和胆碱；和多元醇选自蔗糖、甘油、木糖醇和山梨糖醇。

在用于根据本发明的液体疫苗组合物NADES的一个更优选的实施方式中，有机盐选自脯氨酸和胆碱；和多元醇选自甘油、木糖醇和山梨糖醇。

对于本发明，有机酸和多元醇可以以不同摩尔比应用，提供具有不同性质的NADES组合物。这些可以由技术人员优化以得到根据本发明的最佳稳定的液体疫苗组合物。

因此，在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，如本文所定义的，有机盐与多元醇之间的摩尔比在1:5至5:1之间。

在根据本发明的液体疫苗组合物的一个优选的实施方式中，如本文所定义的，有机盐与多元醇之间的摩尔比在1:4至4:1之间、1:3至3:1之间或者甚至1:2至2:1之间，以此优先顺序排列。

对于本发明，对范围的指示旨在包括所述的端点。

如上文所述，可以以一定的水含量制备根据本发明的液体疫苗组合物。通过改变水含量，可以例如根据液体疫苗组合物的粘度来优化疫苗的性质。水分含量高达50％w/v时，可以产生低粘度的有效NADES(Dai等，2015,vol.187,p.14-19)。大量的水可能会干扰NADES的氢键网络。

根据本发明的液体疫苗组合物中的水含量下限将由实际因素决定，如：多么少的水可用于使化合物增溶以形成NADES，以及需要多少水才能达到使NADES的粘度足够低，以使得其仍能够被处理或使用。此外，通过与NADES混合的病毒组合物将一定量的水引入混合物中，以将包膜病毒溶解到混合物中，并制备根据本发明的液体疫苗组合物。

NADES与要组合的疫苗组合物的体积比将通常高于5:1v/v，例如10:1v/v或更高。

因此，在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，在组合物中的水含量低于约50％w/v。

优选地，在根据本发明的液体疫苗组合物中的水含量低于约40％w/v、低于约30、25、20、15、10、8、7、6或者甚至低于约5％w/v，以此优先顺序排列。

更优选地，在根据本发明的液体疫苗组合物中的水含量是在50至0.5％w/v之间；在40至1％w/v之间；在30至1.5％w/v之间；在20至2％w/v之间；或者甚至在10至3％w/v之间，以此优先顺序排列。同样，范围包括其端点。

水含量表示为每体积重量“w/v”的百分比，其是根据本发明的液体疫苗组合物中每单位体积组合物的水的重量。可以使用不同程序测量水含量，例如通过本领域所熟知的Karl Fischer滴定。

与水活度一样，在此上下文中的液体疫苗组合物是最终产品形式的疫苗，在向目标进行施用之前进行任何稀释之前。

如所述的，根据本发明的液体疫苗组合物在稳定包膜病毒的活力方面非常有效。例如，这从本文所述的感染性滴定的结果中显而易见，所述结果是在长时间储存后，甚至在环境温度下针对根据本发明的液体疫苗组合物中配制的不同包膜病毒所获得的。

在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，包膜病毒选自由下述病毒科组成的组：非洲猪瘟病毒、杆状病毒、嗜肝病毒、疱疹病毒、痘病毒、冠状病毒、黄病毒、披膜病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒、正粘病毒、副粘病毒、肺炎病毒、弹状病毒、呼肠病毒和逆转录病毒。

对于本发明，所示病毒科是指具有其分类群成员的特征性特征(如形态、基因组和生化特征)以及生物学特征(如生理学、免疫学或病理学行为)的病毒。这同样适用于对病毒的属的引用以及对单个病毒种名称的引用。

如本领域所公知的，特定分类群中微生物的分类是基于这些特征的组合的。因此，本发明还包括以任何方式对其进行亚分类的来自所示科或来自所示种名称的种的病毒，例如亚种、毒株、分离株、基因型、变体、亚型或亚群等。

此外，对于本发明领域的技术人员而言显而易见的是，尽管本发明的包膜病毒的特定科、亚科、属或种目前可以被分配为该群，但是这是分类学分类，其可以随着时间而改变，因为新的观点可能导致将其重新分类为一个新的或不同的分类群。但是，由于这不会改变病毒本身，也不会改变其抗原库，仅改变其科学名称或分类，因此这种重新分类的病毒仍在本发明的范围内。

用于本发明的包膜病毒样品可以从多种来源获得，例如来自人的野毒株，或来自野生或农场动物，或来自各种实验室、(保藏)机构或(兽医)大学。

对感染性滴度损失特别敏感的是具有RNA基因组的包膜病毒。

因此，在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，包膜病毒具有RNA基因组。

用于本发明的包膜病毒的RNA基因组可以是单链的或双链的，可以是直链的或环状的，以及可以是一块或者可以被分成两块或更多块。

在根据本发明的液体疫苗组合物的一个优选的实施方式中，包膜病毒选自由具有RNA基因组的下述病毒科组成的组：冠状病毒、黄病毒、披膜病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒、正粘病毒、副粘病毒、肺炎病毒、弹状病毒、呼肠病毒和逆转录病毒。

甚至更优选的是具有RNA基因组的包膜病毒，其中病毒具有相对较大的尺寸。

因此，在根据本发明的液体疫苗组合物的一个更优选的实施方式中，具有RNA基因组的包膜病毒选自由下述病毒科组成的组：沙粒病毒、丝状病毒、正粘病毒、副粘病毒、肺炎病毒和弹状病毒。

在根据本发明的液体疫苗组合物的一个更优选的实施方式中，包膜病毒选自下述病毒科：冠状病毒、肺炎病毒和副粘病毒。

进一步优化根据本发明的液体疫苗组合物在技术人员的能力范围内。通常，这涉及对疫苗有效性的微调，以进一步改善其提供的免疫保护作用。这可以通过调整疫苗的剂量、体积或抗原含量或通过不同的途径、方法或方案进行应用来实现。所有这些均在本发明的范围内。

根据本发明的液体疫苗组合物可以另外地包含其他化合物，如另外的抗原或微生物、细胞因子或包含未甲基化的CpG的免疫刺激性核酸等。或者，可以将根据本发明的液体疫苗组合物本身添加到疫苗中。

根据本发明的液体疫苗组合物可以有利地与一种或多种其他抗原组合，例如来源于预期对人类或动物目标具有致病性的微生物的抗原。这种其他抗原本身可以是感染性微生物，或者是被灭活的，或者是亚基。其他抗原可以由生物或合成分子组成，如蛋白、碳水化合物、脂多糖、脂质或核酸分子。

根据本发明的液体疫苗组合物可以包含防腐剂，如硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)、酚类化合物和/或庆大霉素。优选地，不使用防腐剂。

在根据本发明的液体疫苗组合物的一个实施方式中，适用于选自下组的一个或多个或全部条件：

-疫苗的水活度小于约0.8，且包含NADES；

-疫苗的水活度小于约0.7；更优选地，小于约0.6、约0.5、约0.4或者甚至小于约0.3，以此优先顺序排列；

-NADES由有机盐和多元醇组成；

-在NADES中，有机盐是选自甜菜碱、脯氨酸、肉碱和胆碱的盐；

-肉碱是L-肉碱；

-胆碱是胆碱-氯化物；

-多元醇是糖或糖醇；

-糖选自：果糖、麦芽糖、蔗糖、葡萄糖和海藻糖；

-糖醇选自：甘油、木糖醇、甘露醇和山梨糖醇；更优选地，糖醇选自下组：甘油、木糖醇和山梨糖醇；

-山梨糖醇是D-山梨糖醇；

-多元醇选自：蔗糖、甘油、木糖醇和山梨糖醇；

-有机盐选自甜菜碱、脯氨酸、肉碱和胆碱的盐；和多元醇选自果糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、甘油、木糖醇、甘露醇和山梨糖醇；

-优选地，有机盐选自：甜菜碱、脯氨酸和胆碱；和多元醇选自蔗糖、甘油、木糖醇和山梨糖醇；更优选地，有机盐选自脯氨酸和胆碱；和多元醇选自甘油、木糖醇和山梨糖醇；

-在根据本发明的液体疫苗组合物中，如本文所定义的，有机盐与多元醇之间的摩尔比在1:4至4:1之间；优选地，如本文所定义的，有机盐与多元醇之间的摩尔比在1:3至3:1之间，或者甚至在1:2至2:1之间；

-在根据本发明的液体疫苗组合物中的水含量小于约40％w/v，小于约30、25、20、15、10、8、7、6或者甚至5％w/v，以此优先顺序排列；

-在疫苗中的水含量在50至0.5％w/v之间；在40至1％w/v之间；在30至1.5％w/v之间；在20至2％w/v之间；或者甚至在10至3％w/v之间，以此优先顺序排列；

-包膜病毒选自由下述病毒科组成的组：非洲猪瘟病毒、杆状病毒、嗜肝病毒、疱疹病毒、痘病毒、冠状病毒、黄病毒、披膜病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、呼肠病毒和逆转录病毒；

-包膜病毒具有RNA基因组；

-具有RNA基因组的包膜病毒选自由下述病毒科组成的组：冠状病毒、黄病毒、披膜病毒、沙粒病毒、布尼亚病毒、丝状病毒、正粘病毒、副粘病毒、肺炎病毒、弹状病毒、呼肠病毒和逆转录病毒；优选地，具有RNA基因组的包膜病毒选自由下述病毒科组成的组：沙粒病毒、丝状病毒、正粘病毒、副粘病毒、肺炎病毒和弹状病毒；更优选地，具有RNA基因组的包膜病毒选自由下述病毒科组成的组：冠状病毒、肺炎病毒和副粘病毒；和

-根据本发明的液体疫苗组合物可以包含防腐剂，如硫柳汞(thimerosal)、硫柳汞(merthiolate)、酚类化合物和/或庆大霉素。优选地，不使用防腐剂。

如上所述，可以使用常规技术和材料生产根据本发明的液体疫苗组合物。本文描述了用于制备根据本发明的液体疫苗组合物的这种方法、用途或工艺的细节和实例，并且本领域技术人员使用常规材料和方法可以容易地应用这样的程序。

例如，可以工业规模生产本发明的NADES，然后通过与体内或优选地体外生产的包膜病毒制剂混合而配制成疫苗。然后，将混合物灌装进入适宜尺寸的容器中。可以通过适当的检测监测生产工艺的各个阶段，例如通过对抗原的质量和数量进行免疫学检测；通过对无菌性，以及不存在外源性物质进行微生物检测；以及最后在动物中进行接种研究，以确证有效性和安全性。在完成质量、数量和无菌性检测之后，可以销售疫苗产品。

所有这些都是技术人员所公知的，并且例如在政府指令和法规(Pharmacopoeia，9CFR)和公知的手册(Pastoret,Lippincot，同上)中描述了根据公知的药物生产标准来制备疫苗的通用技术和注意事项。

因此，在一个进一步的方面中，本发明涉及一种用于制备根据本发明的液体疫苗组合物的方法，所述方法包括下述步骤：

a.制备NADES，和

b.将NADES与包含活包膜病毒的组合物混合。

方便地，根据本发明方法的两个步骤可以在时间上和/或在适当的位置分离地进行，中间可以进行存储、运输或者甚至进一步的步骤。这样可以灵活地计划和安排物流。

可以使用常规工具和方法制备用于根据本发明方法的NADES。一种方便的方法是将组合的化合物加热至能够使其混合和增溶，但不损害其的温度，例如高达约80℃。加热可以例如与搅拌或超声处理联合进行。

而且，最初可以将形成NADES的组分之一以或多或少的浓缩形式溶解在水中，随后可以将其与一种或多种其他组分混合以形成用于本发明的NADES，通过蒸发除去多余的水。

用于根据本发明的方法的包含活包膜病毒的组合物可以方便地以不同方式衍生，有利地来自病毒在适宜细胞系上的体外培养。病毒细胞培养物可以采用自动化控制和监测技术，以任何所需的规格或体积，在工业规模的大型发酵罐中进行多达几千升的培养。

然后，以一种取决于病毒特征的方式从培养物中收获病毒：作为上清液、细胞沉淀或作为整个培养物。可以使用进一步的处理步骤制备用于本发明的病毒组合物，如浓缩，例如使用通过超滤膜。然后，检查病毒组合物的活力和量。所有这些均是本领域技术人员熟知的。

在根据本发明的方法中NADES与病毒组合物的混合优选地使用无菌技术进行。

混合的顺序和方式并不重要，因为可以将NADES添加到病毒组合物中，也可以以其他方式添加。优选地，所使用的任何机械混合将是低速和低冲击的。而且，可以在保护性气氛下进行混合和/或灌装，以降低氧气暴露。

各种工艺设备的供应商都可以提供用于混合和灌装粘性液体的便捷设备。

本发明首次公开了如本文所述的NADES作为预期用于人或动物目标的疫苗的载体的用途。

因此，在一个进一步的方面中，本发明涉及如本发明所述的NADES作为预期用于人或动物目标的疫苗的药学上可接受的载体的用途。

优选地，根据本发明的NADES的用途是作为如本文所述的包膜病毒疫苗的载体。

因此，在根据本发明的NADES的用途的一个优选的实施方式中，疫苗是根据本发明的液体疫苗组合物。

本发明的液体疫苗组合物可以以例如由药品生产厂商提供的形式施用于人或动物。然而，取决于根据本发明的液体疫苗组合物的特定实施方式的具体组成，制备液体疫苗组合物的稀释物可能是有利的。这可以例如通过降低粘度来便于向目标的实际施用，或者可以减少目标接种后的局部反应。

用于这样的稀释的稀释剂通常是液体，并且可以与根据本发明的液体疫苗组合物分开提供。优选地，稀释剂与根据本发明的液体疫苗组合物一起提供，例如作为试剂盒。

因此，在另一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括至少两个容器：一个容器包含根据本发明的液体疫苗组合物，和一个容器包含液体稀释剂。

用于稀释根据本发明的液体疫苗组合物，例如包括在根据本发明的试剂盒中的“液体稀释剂”是适合于稀释根据本发明的液体疫苗组合物的液体。因此，液体稀释剂可以是水性的，例如水或缓冲液。然而，由于根据本发明的液体疫苗组合物的水含量低，因此稀释剂也可以是油性的，或者可以是油和水的乳液。

在一个实施方式中，液体稀释剂本身可以是液体疫苗组合物，例如重构冻干活疫苗，或乳液-佐剂的灭活疫苗。

用于稀释根据本发明的液体疫苗组合物的液体稀释剂(例如包括在根据本发明的试剂盒中的液体稀释剂)的选择，将取决于几个因素，例如：疫苗在其被稀释后的预期用途；它包含的包膜病毒；预期的用于接种的人或动物目标；等。技术人员完全有能力选择、制备和使用这样的稀释剂。

根据本发明的液体疫苗组合物可以用作预防方法或治疗方法，或两者。

根据本发明的液体疫苗组合物可以用作有效的初免疫苗接种，随后可以用相同或不同的疫苗进行加强接种并放大。

根据本发明的液体疫苗组合物包含一定量的免疫学有效的包膜活病毒。

本发明领域的技术人员将完全能够确定和优化根据本发明的液体疫苗组合物中的这样的免疫学上有效量的活包膜病毒，例如通过监测疫苗接种后或攻击感染(对于动物目标)后的免疫应答，例如通过监测目标的疾病迹象、临床评分或通过重新分离病原体，然后将这些结果与在模拟疫苗接种的动物中看到的疫苗接种挑战应答进行比较。

确定疫苗剂量中活病毒数量的方法是本领域公知的，并且通常将采用病毒滴定技术，例如噬菌斑测定，在卵或动物中或在微量滴定板中进行滴定。因此，可以例如以TCID50，EID50或噬菌斑形成单位(pfu)表达这种病毒感染性滴度。

根据本发明的液体疫苗组合物的目标是需要接种疫苗的人或动物，以针对由疫苗中包含的特定活包膜病毒的致病形式引起的感染或疾病。待接种目标的年龄、体重、性别、免疫状况和其他参数并不关键，尽管为健康、未感染的目标接种疫苗并尽早接种疫苗以预防任何现场(field)感染是有利的。

根据本发明的液体疫苗组合物，或者可以通过根据本发明的方法制备的液体疫苗组合物，或者可以例如使用根据本发明的试剂盒制备的稀释形式的液体疫苗组合物是用于向需要这样的疫苗的人或动物目标施用。疫苗接种诱导主动免疫，以减少由本发明的活包膜病毒的非减毒对应物引起的感染和/或疾病迹象。这样的感染的减少是指预防或减少包膜病毒对生产性感染的建立或扩散。例如，这可以通过降低目标中的病毒载量或缩短病毒复制的持续时间来实现。反过来，这导致目标人或动物减少病变的数量、强度或严重性，并减少由病毒感染引起的疾病的后续临床症状。这样的疫苗通称为“针对特定病毒的疫苗”或“病毒疫苗”。

因此，在另一方面，本发明涉及根据本发明的液体疫苗组合物，其用于保护人或动物目标免受由在所述疫苗中包含的活包膜病毒的致病形式引起的感染和/或疾病的用途。

在另一方面，本发明涉及免疫接种人或动物目标的方法，所述方法包括施用根据本发明的液体疫苗组合物，或通过根据本发明的方法获得的疫苗，或通过使用根据本发明的试剂盒。

根据本发明的疫苗接种方法，根据本发明的液体疫苗组合物可以用于直接施用于人或动物目标。

或者，可以将根据本发明的液体疫苗组合物以稀释形式施用给人或动物目标。由于其降低的粘度，根据本发明的疫苗接种方法的该实施方式可以促进通过注射的处理和施用。其他地或另外地，以稀释形式的施用可以减少人或动物目标中的局部反应，例如由接种部位的组织刺激引起。

可以通过肠胃外途径，即通过皮肤，例如肌肉内、腹膜内、皮内、粘膜下或皮下进行根据本发明的方法的疫苗接种。根据本发明的液体疫苗组合物的肠胃外施用的优选途径是肌内或皮下注射。

此外，根据本发明的液体疫苗可通过肠内或粘膜途径，即通过滴眼剂、滴鼻剂、口服、肠溶、滴鼻剂、喷雾剂等。

或者，可以通过大量施用的方法来施用根据本发明的液体疫苗组合物，例如通过饮用水、粗糙喷雾、雾化、饲料喂养等。

不言而喻，根据本发明的液体疫苗组合物的最佳施用途径将取决于所用疫苗的具体情况以及目标的特定特性。技术人员完全有能力选择和优化这样的施用途径和方法。

根据本发明的液体疫苗组合物可以通过肠胃外途径以目标人或动物可接受的体积施用，例如可以在约0.1ml至约10ml之间的体积。优选地，一剂量是在约0.1ml至约5ml之间的体积，更优选地一剂量是在0.2ml至3ml之间。

当通过肌内途径施用时，一剂量的体积优选在约0.5至约3ml之间，更优选在约1至约2ml之间。

当通过皮内途径施用时，一剂量的体积优选在约0.1ml至约0.5ml之间，更优选约0.2ml。

优选地，将根据本发明的液体疫苗组合物的施用方法、时间和体积整合到目标人或动物可能需要的其他疫苗的现有疫苗接种时间表中，以减少对目标的压力并减少人工成本。这些其他疫苗可以与它们的注册用途相容的方式，同时，并行或顺序施用。

现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实施例1：方法和材料

1.1 NADES制剂的制备

可以通过混合制备NADES，可以通过加热和/或添加少量水来加速制备。通过将有机盐和多元醇溶解在过量的水中，可以制备出本申请下文进一步检测和描述的一些NADES样品。接下来，通过在降低的大气压下，在70℃水浴中旋转蒸发数小时来除去过量的水。通过考虑由于蒸发引起的重量损失，可以计算出NADES中存在的水量。

在水浴中通过超声法制备其他NADES样品。将所需量的粉末加入烧瓶中。将烧瓶短暂摇动或涡旋以混合粉末。接下来，添加所需量的水。将该混合物置于设定为45℃的超声-水浴中，超声可达数小时，直至形成NADES。在超声处理期间，最高温度可以达到至多70℃。

1.2水活度的测量

样品

出于生物防护的目的，测量了NADES制剂样品的水活度，因此没有活病毒。但是，当已知将被添加到NADES中以形成根据本发明的液体疫苗组合物的水性病毒组合物的量时，可以根据Dai等(2015,Food Chem.,vol.187,p.14-19)的方法计算将NADES与病毒组合物组合所得到的水活度。

样品制备

将一定量的NADES样品转移到10ml玻璃小瓶中，以达到大约小瓶1/4的填充高度。对于每个样品，一式两份填充已编码的小瓶。使用带有PTFE塞的铝制钳口盖封闭小瓶，并将其置于室温下12小时，以达到样品与顶部空间之间的平衡。

设备

使用Lighthouse FMS-1400水分/压力分析仪确定样品顶部空间中的水蒸气压。将样品原样插入样品室。在测量样品之前，在0-0.2a_w范围内使用校准顶空压力标准品校准系统。此外，将饱和盐标准品用于校准和重新计算从0.2-1a_w的非线性范围。

校准

为了在a_w 0-1的整个范围内校准机器并创建水活度值的参考线，测量了很多标准样品：在纯水旁边，使用了5个特定的饱和盐溶液样品，对于6个标准品中的每一个取2个样品均进行3倍测量。通过将纯水的测量值设置为1.000，其他标准值的a_w为0.8511、0.7547、0.5438、0.3307和0.1131。还测量了一系列经认证的蒸汽压标准品。

a_w测量的结果包括在表1中。

1.3用于稳定性测定的病毒组合物

用于稳定性孵育的病毒为：

-犬副流感病毒(CPiV)；来自副粘病毒(Paramyxoviridae)科

-牛呼吸道合胞病毒(BRSV)；也被称为：牛正肺病毒(bovine orthopneumovirus)种；来自肺病毒(Pneumoviridae)科，正肺病毒(Orthopneumovirus)属，和

-牛副流感3病毒(PI3)；来自副粘病毒科。

所有这些病毒为包膜病毒，并且具有RNA基因组。

1.4用于稳定性测定的NADES组合物

用于稳定性测定的NADES组合物为：

-NADES 1:甜菜碱：蔗糖：水，以2:1:6,4的摩尔比

-NADES 2:肉碱：甘油：水，以2:1:4的摩尔比，和

-NADES 3：脯氨酸：山梨糖醇：水，以2:1:5,7的摩尔比

1.5混合NADES和病毒组合物

将NADES制剂在层流柜中以9:1v/v与病毒组合物混合。为防止渗透性休克，将稳定剂逐步分批添加到冷却的病毒溶液中。使用无菌磁力搅拌器将样品轻轻搅拌。注意不要将气泡夹带到混合物中。将混合物在2-8℃下储存，直至开始灌装进入适宜容器。

使用移液器在层流柜中将NADES/病毒混合物填充到3ml小瓶中，每小瓶2ml，将样品在冰上保存。针对每个稳定性时间点制备一式两份样品。还包括不含病毒的NADES样品作为阴性对照。灌装后，向小瓶上加盖铝盖。然后，将样品储存在其稳定性孵育温度下。

1.6稳定性测定

对于包含在根据本发明的疫苗组合物中的多种包膜病毒，进行了扩展稳定性测定。在下述3个温度下进行这次测定：4、15和25℃，并且孵育持续时间为1、2、4或8周。分开设置第0天的样品。

在适当时间点，取出NADES/病毒混合物并用于通过在细胞上滴定测定剩余病毒滴度。

在96孔微量滴定板上进行病毒滴定。包括适当的阳性和阴性对照。使用Spearman和的方法，通过计算机程序从至少两个样品读数计算滴度，并以Log10 TCID50/ml表示。

在含有5％FCS和抗生素的标准培养基上培养的Vero细胞上滴定CPI病毒。接种2x10^5个细胞/ml，并且在板上进行1:10稀释。

接下来，将微量滴定板在37℃和5％CO₂下孵育7天。然后，通过光学显微镜评价检查每个孔的cpe。

为了量化样品中感染性BRSV或PI3的量，在标准细胞培养基中制备10倍系列稀释的待测样品，并将其吸移到预先接种了Madin Darby牛肾(MDBK)细胞的微量滴定板中。在37℃下，在湿润5％CO₂气氛中，针对BRSV孵育5-7天，或针对PI3孵育4-6天后，检查单层是否存在病毒。固定板，并使用过氧化物酶标记的病毒特异性单克隆抗体以及酶底物进行免疫-过氧化物酶单层测定。通过肉眼观察有色沉淀物的存在情况进行检测。

稳定性测定结果如在实施例3中所述。

实施例2：用于本发明的NADES的实例

制备了用于本发明的大量NADES制剂，其具有不同化合物、不同摩尔比和不同水含量。

下表1中列出了一些最有效的NADES制剂；这些产生了澄清的液体溶液，其在室温(20-25℃)下为流体。提供了有关其组成和水含量的详细信息。对于所制备的几个样品，测定了水活度并包括其结果。未标明的情况下：水的分子量为18Da；所使用的海藻糖是二水合物。

可以得出以下结论：

-胆碱、甜菜碱和脯氨酸是用于本发明的最通用和最有效的有机酸，以及山梨糖醇、甘油和木糖醇是最有效的多元醇。

-能够容易地制备水含量至多37％w/v的NADES，从而产生低粘度液体。

-发现水活度通常非常低，通常低于0.3，甚至低于0.1a_w。

-尽管糖和胺可以通过美拉德反应发生反应，但观察到大多数制备的NADES在加热至70℃数小时后仍保持无色和目测未改变。

-几个样品在2-8℃或者甚至在-20℃的冷藏条件下也呈流体状态。

/>

实施例3：病毒稳定性测定结果

如上文所述，对于包含在根据本发明的液体疫苗组合物中的多种包膜病毒，进行了扩展稳定性测定。在下述3个温度下进行这些测定：4、14和25℃。

可以将在25℃下孵育8周作为加速稳定性测试，表明在4℃下孵育1-2年的效果。因此，这是对病毒稳定性非常严重的攻击，并非所有样品在这些条件下都能预期存活这么长时间。

表2：BRSV和PI3病毒的稳定性结果

表3：CPiV的稳定性结果

稳定性结果的一些结论

特别是CPiV病毒可以通过NADES 3(stab.3)制剂非常好的稳定；即使在25℃下8周后，大部分病毒仍具有感染性。

在25℃下长达4周，观察到在NADES 1中的BRSV和PI3具有相似结果。

在通常情况下，根据本发明的液体疫苗组合物在用于各种包膜病毒的不同组合物中显示出显著的稳定能力。

这克服了对冻干的需求，蕴藏着巨大的经济利益。疫苗的液体性质也便于向人或动物目标施用。

实施例4：长期稳定性测定结果

随着时间的推移，继续上述实施例1-3中所述的实验，并定期采集和测量样品。

BRSV：

在基于NADES 1(甜菜碱：蔗糖：注射用水，摩尔比2:1:6.4)、NADES 3(脯氨酸：山梨糖醇：WFI，2:1:5.7)或NADES 4(胆碱：木糖醇：WFI，2:1:3)的液体疫苗组合物中，使用肺炎病毒BRSV继续进行稳定性测定。

在4、14或28℃下分别连续储存30、8或8周的结果如图4中的A-C所示。这些是图1的小图A-C所示结果的扩展。

显而易见的是，基于所有所检测的NADES(1、2和4)的液体疫苗组合物，在4或14℃下储存时，均对肺炎病毒BRSC提供可靠的稳定作用，参见图4A和4B。而且，即使在25℃的非常苛刻的温度下(图4C)，NADES 4也具有显著的稳定作用，且NADES 1甚至具有更好的稳定作用。

对BRSV进一步的结果如实施例5中所示。

PI3：

对于副粘病毒PI3，所有基于NADES 1、2或3的液体疫苗组合物均提供了一定程度的稳定作用，见图2中的小图A-C，但是随着时间的推移，在NADES 1(甜菜碱：蔗糖：注射用水，摩尔比2:1:6.4)中获得了最佳稳定作用，如图5中所示：在4℃下储存大于30周的期间，这种组合物能够阻止活病毒滴度下降至略高于1Log10。而相比之下，在标准培养基中的对照样品在相同时间段显示出滴度下降了4Log10。

CPiV：

将副粘病毒CPiV与液体疫苗组合物混合，所述液体疫苗组合物包含脯氨酸：山梨糖醇：WFI NADES 3制剂的两种变体：NADES 3A和NADES 3B；详情见下表4。

在室温下(约20℃)孵育长达12周后，剩余活CpiV病毒滴度的量如图6中所示。这两个组合物均能够显著降低在该攻击温度下病毒的降低：在NADES 3A中滴度损失小于2Log10，在3B中损失为约3Log10，而在PBS中活CPiV的滴度损失大于5Log10。

实施例5：基于NADES的疫苗此前稳定性结果的变化

为了进一步扩展上述实施例1-4中的实验，检测了本发明NADES制剂的多种变化。

表4：所检测的NADES制剂的进一步变化

在此表中，“Tg”表示：玻璃化转变温度。这是使用差示扫描量热法的标准设置确定的。在这些测量结果中，对于在这些实验中检测的NADES样品，未观察到结晶相变，仅观察到非常少量的玻璃化转变。结合测得的Tg值非常低，这表明这些样品不含能够形成冰晶的可检测量的游离水。

NADES 3B制剂的水活度为0.76，这使得能够向9/10体积份(volume part)的该NADES中加入1/10体积份的病毒水溶液，以获得水活度为0.80的根据本发明的液体疫苗组合物。

在包含BRSV的根据本发明的液体疫苗组合物中检测了各种NADES制剂。将所有病毒样品与9体积份NADES组合，混合，并在28℃下孵育，以进行强制稳定性测定。结果如图7中所示。表4中列出的所有NADES制剂均能够稳定BRSV；使用脯氨酸或甜菜碱作为离子种类的NADES获得了最佳结果。

实施例6：在基于NADES的疫苗中其他副粘病毒的稳定性

犬瘟热病毒(CVD)是与PI3和CPiV类似的另一种副粘病毒。由于其具有感染多种犬科动物和猫科动物的能力，因而具有很高的兽医相关性。症状包括肠道症状、呼吸道症状和疾病的各种全身性体征。幼猫和幼犬针对CDV进行定期接种是很常见的。通常，疫苗是减毒活病毒，以冻干产品的形式生产。

将CDV加入根据本发明的液体疫苗组合物，与9体积份NADES3A(脯氨酸：山梨糖醇：WFI，摩尔比1:1:2.5)混合。通过在4℃下孵育长达16周进行稳定性检测。

结果如图8中所示。这表明，基于NADES 3A的组合物在冷藏温度下长期储存期间，基本上能够在初始滴度上有效地稳定CDV。随着时间的推移，在标准培养基中的对照样品显示出滴度持续下降。对于CDV而言，NADES与对照之间稳定作用的这种差异比在PI3中观察到更显著，见图2A。

实施例7：在基于NADES的疫苗中冠状病毒的稳定性

为了评估其他病毒科的稳定性，将冠状病毒加入根据本发明的液体疫苗制剂。冠状病毒通常在人或动物中引起(严重的)呼吸道疾病。使用的病毒是传染性支气管炎病毒(IBV)，这是一种禽类冠状病毒。

与该科的其他病毒一样，IBV是一种包膜病毒，因此其对外界影响非常敏感。此外，IBV具有正义单链RNA基因组，该基因组是RNA病毒已知的最大基因组之一。这使得IBV在储存时特别容易降解。

IBV对鸡等家禽的健康具有很大的影响，对家禽养殖业经济也具有很大的潜在负面影响。世界范围内的大多数鸡都接种了针对IBV感染和疾病的疫苗，其中这些疫苗中很多是减毒活疫苗，需要长达长时间储存和运输活IBV病毒。因此，很长时间以来，这种减毒活疫苗以冻干产品的形式生产。

为了评估IBV在基于NADES的液体疫苗制剂中的稳定性，将病毒加入称为NADES 3A的NADES 3变体，其组成为：脯氨酸：山梨糖醇：注射用水，摩尔比为1:1:2.5。表4中描述了该制剂的更多特征。

对IBV的滴定极其费力，因为这需要在禽类体内或在原代细胞上离体进行。一种常用但同样费力的替代方法是在鸡胚上滴定。出于这种原因，在使用IBV的这些实验中，仅检测了一种类型的NADES和仅检测了一个储存温度。

材料和方法：

获得IBV毒株4/91作为标准病毒产物，其是从接种鸡蛋中以尿囊液形式收获的。将病毒和NADES以1+9体积份组合，通过涡旋混合，并在4℃下孵育。为了能够在同一批鸡蛋上滴定所有样品，将各种定时样品分别新鲜制备，然后开始孵育，最长的孵育首先开始。

结果和结论：

在4℃下在NADES 3A中储存长达30周的IBV稳定性结果如图9中所示。

从图9中的数据可以明显看出，与尿囊液中IBV 4/91的对照样品相比，基于NADES3A的液体疫苗组合物的稳定作用具有很大正向差异：尽管在4℃下29周后，对照样品中的所有病毒都开始降解，但是在NADES 3A中活IBV的量仍不受影响，即使在7个月后与初始滴度也没有显著差异。

总之，包含冠状病毒IBV和NADES的根据本发明的液体疫苗组合物在长期储存过程中对活冠状病毒表现出优异的和前所未有的稳定作用。

实施例8：在基于NADES的疫苗中疱疹病毒的稳定性

与实施例7类似，该实验检测了根据本发明的液体疫苗组合物对另外其他包膜病毒科疱疹病毒的稳定作用。

检测了两个代表：猫疱疹病毒1(FHV1)和牛疱疹病毒1(BHV1)。这些病毒都是具有大双链DNA基因组的包膜病毒。结果，由于既是包膜病毒，又是大型病毒，因而大多数疱疹病毒非常脆弱，已知在标准储存条件下容易迅速降解。因此，不可避免地，活疱疹病毒疫苗通常以冻干产品形式生产。

FHV1在猫科动物中引起传染性和严重的呼吸道感染，称为猫科病毒性鼻气管炎。BHV1也称为牛传染性鼻气管炎病毒，在牛中引起类似症状。

FHV1和BHV 1的样品来自标准细胞培养物。

将FHV1样品以1+9v/v与NADES 3A制剂和与NADES 3B制剂混合。接下来，将样品管在旋转轮上混合1小时。考虑到产生了约1Log10的显著混合损失，认为这种混合方法对于这种脆弱的病毒可能过于猛烈了。

BHV1也与NADES 3A和与NADES 3B混合，此外还在NADES5(甜菜碱：山梨糖醇：WFI，摩尔比1:1:2.5)中进行了检测。表4中给出了详细情况。

结果和结论：

在不同液体疫苗组合物中FHV1和BHV1稳定性的结果分别如图10和11中所示。

从图10中的数据可以清楚地看出，在对照组合物(标准培养基)中FHV1迅速降解。在零时间点最初的滴度下降随后得到了更大的补偿，因为在NADES 3A中和在NADES 3B中，活FHV1基本上可以有效稳定在实验的初始滴度水平上，长达4周。考虑到在该实验中的检测温度为室温(约20℃)，这对于病毒稳定性而言是非常不利的条件，因此这是一个非常正面的结果。

类似地，图11表明，在4℃下，在不同NADES制剂中BHV1的稳定性结果具有非常好的可比性。所检测的全部三种NADES均提供了长达6周的良好稳定作用，而对照组合物(PBS)的滴度却显著下降。

结论：包含疱疹病毒FHV1或BHV1以及NADES的根据本发明的液体疫苗组合物在苛刻的储存温度下储存相当长的时间后显示出对活疱疹病毒具有优异的稳定作用。

实施例9：含有NADES的疫苗的施用

为评估根据本发明的液体疫苗组合物在目标动物中施用的容易性和安全性，将疫苗的实例施用给实验动物和尸体材料。

为此，制备并检测了包含脯氨酸、山梨糖醇和注射用水的NADES 3制剂的两种变体：一种具有较高粘度(NADES 3A)和一种具有较低粘度(NADES 3B)。将这些用于比较在粘度谱的两个极端情况下根据本发明的液体疫苗组合物的施用性质。在表3中描述了这两种组合物的特征。此外，使用标准条件测量了其粘度：在约20℃下，使用Brookfield^TM DV-I+粘度剂，在约80ml容量的标准量杯中，使用62号主轴(spindle type)，在60r.p.m.下旋转30秒。

处理

制剂编号为3A的高粘度NADES能够被推入尺寸为2lG或更小的皮下注射针头，即外径为0.8mm或更大的针头。

表5：通过施用检测的NADES制剂

在体内皮下施用

在一项在犬中进行的安全性研究中，对通过皮下注射的两种检测NADES制剂与安慰剂进行了比较。特别关注在稳定剂制剂局部或全身施用后可能发生的任何不良反应。

如上所述，通过在密封小瓶中加热和超声处理脯氨酸、山梨糖醇和注射用水来制备这两种制剂，得到澄清且均匀的液体。另外，将其过滤除菌，并确定生物负荷和内毒素。发现两种制剂的评分均低于1单位/ml的最低稀释标准，满足无菌制剂的一般合格标准。通过使用9体积份WFI稀释1体积份NADES 3A制备NADES 3C制剂，所得制剂脯氨酸：山梨糖醇：WFI的比率为1∶1∶5，且粘度为289mPa.s。NADES 3B的粘度为33.4mPa.s。

将6只7月龄健康比格犬分成两组，每组3只犬。每组分配给予NADES制剂，使用1ml注射器和21G 5/8针头以两周间隔通过皮下接种两剂所分配的制剂，每剂1ml。第1组的犬给予低粘度NADES3B，和第2组的犬给予高粘度NADES 3C。在研究期间，每天对所有犬进行临床监测，包括在接种部位的局部反应。

在颈背部进行接种；第一次接种在左侧进行，第二次接种在右侧颈部进行。在每次施用前将接种部位剃毛，并用记号笔圈出注射部位。在任何注射过程中均未观察到不适。在注射后4小时，触诊注射部位，在注射部位几乎没有可触及的物质，并且没有观察到肿胀或发红。

在每次接种前第-3、-2、-1天；在接种当天：接种前即刻和接种后4小时；以及接种后次日开始连续7天测量直肠温度。

在整个研究期间，在任何犬中均未观察到体温显著升高，也未观察到临床不良反应。

结论：通过皮下途径接种NADES制剂3C或3B不会引起局部或全身不良接种反应。

鼻内施用

当鼻内施用时，检测两种NADES制剂3A和3B在鼻粘膜表面上的扩散模式。两种NADES制剂均在不加水的情况下对其本身进行了检测，因此，NADES 3A的粘度为5197mPa.s和NADES 3B的粘度为33.4mPa.s。使用刮铲尖端将“专利蓝”着色剂添加到30ml每种NADES制剂中，以获得深蓝色。使用含着色剂的PBS作为对照。

小牛头来自约2-4周龄小牛的尸体。施用时将头保持在直立位置，模拟在野外i.n.接种时小牛的位置，使其鼻孔略微向上倾斜。

然后，根据用于鼻内接种的标准程序施用液体，由此将含有1.5ml液体的2.5ml无针头注射器放置在鼻孔中，然后将液体均匀地喷出。接下来，将头解剖成两半，取出鼻中隔并检查鼻腔内是否存在蓝色。

对于所有样品，均观察到蓝色液体容易地通过鼻道。低粘度的PBS样品使其易于注射，但所有液体都迅速流过。在包括气管起点在内的整个鼻腔都观察到了蓝色。

粘度极高的NADES 3A注射液只需要一点力即可从注射器中注射出来。而且，正如所预期的那样，蓝色液体在头部下方出现的时间更长。在将头部解剖后，还观察到这种粘性液体也均匀地分布在鼻内，其在鼻内似乎形成了厚厚的一层，从而在鼻道内留下更多物质。这表明，在i.n.接种期间，在活的小牛中施用时，将出现保留率提高和上呼吸道进展减少。

低粘度NADES 3B制剂的施用效果与PBS样品的效果非常相似，在PBS样品中，液体冲入鼻腔。

结论：鼻内注射到小牛头部后，可以监测具有不同粘度的有色制剂的分布。以蓝色判断的液体分布，对于两种NADES制剂和PBS而言是相当的，在施用方便性和残留物质的量上存在一些差异，因此NADES 3A制剂略微更加难以排出，但导致在鼻腔内残留物层更厚。这表明可以从这样的粘性NADES制剂中延迟释放抗原。

实施例10：对脯氨酸：山梨糖醇：WFI NADES的详细分析

对包含脯氨酸、山梨糖醇和注射用水的NADES 3型制剂进行了详细分析。制备和检测了这三种组分比率的很多变化。在图12中对其进行了描述，其代表了三种组分以重量比的组合物的三角图。三角形内的平行四边形表示能够产生NADES制剂的比率。平行四边形之外的比率导致混合物呈固体或水溶液，如在三角形中所示。用球表示已检测并发现可产生有效和稳定的NADES 3变体的各种NADES组合物。还显示了在上述实施例中更详细检测的NADES 3A和3B的具体制剂。

附图说明

图1：

在不同NADES制剂中BRSV的稳定性结果

图2：

在不同NADES制剂中牛PI3病毒的稳定性结果

图3：

在不同NADES制剂中CPiV的稳定性结果(在图例中，将NADES1-3表示为stab.1-3；x-轴：以周为单位的时间；y轴：滴度)。

图4、5和6：

在不同NADES制剂中和在不同储存温度下，BRSV、PI3和CPiV的长期稳定性结果。

图7：

在NADES制剂的变体中BRSV的稳定性结果

图8、9、10和11：

其他病毒和病毒科的稳定性结果：分别为CDV、IBV、FHV1和BHV1。

图12：

在NADES 3变体的详细分析中制备和检测的脯氨酸、山梨糖醇和WFI的重量比三角图。灰色平行四边形表示有效的NADES组成，球表示制备和检测的单个制剂。

Claims

1.包含活包膜病毒和药学上可接受的载体的液体疫苗组合物，其特征在于，所述载体是天然低共熔溶剂(NADES)，和所述疫苗组合物的水活度小于0.8，在所述组合物中的水含量小于50％w/v；

其中所述NADES包含有机盐和多元醇，其中所述有机盐为脯氨酸的盐并且所述多元醇为山梨糖醇。

2.根据权利要求1所述的液体疫苗组合物，其特征在于，所述包膜病毒具有RNA基因组。

3.根据权利要求1或2所述的液体疫苗组合物的制备方法，所述方法包括下述步骤：

a.制备NADES，和

b.将所述NADES与包含所述活包膜病毒的组合物混合。

4.如权利要求1或2所描述的NADES作为用于预期用于人或动物目标的疫苗的药学上可接受的载体的用途，其中所述疫苗是根据权利要求1或2所述的液体疫苗组合物。

5.试剂盒，其包括至少两个容器：一个容器包含根据权利要求1或2所述的液体疫苗组合物；和一个容器包含液体稀释剂。

6.根据权利要求1或2所述的液体疫苗组合物在制备用于保护人或动物目标免受由在所述疫苗组合物中包含的所述活包膜病毒的致病形式引起的感染和/或疾病的药物中的用途。

7.根据权利要求1或2所述的液体疫苗组合物，或根据权利要求3所述的方法获得的疫苗组合物，或根据权利要求5所述的试剂盒在制备用于免疫接种人或动物目标的药物中的用途。