JP7184900B2 - 生エンベロープウイルスの液体ワクチン - Google Patents

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Description

本発明は、ワクチン学の分野に関する。特に、本発明は、生エンベロープウイルス（ｌｉｖｅ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓｅｓ）の液体ワクチン組成物に関する。さらに、本発明は、このような組成物の調製方法、およびそれらの医学的使用、パーツ オブ キット（ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）、ならびにＮＡＤＥＳの使用に関する。
深共晶溶剤（ＤＥＳ）は、多くの顕著な特性を兼ね備えた周知の組成物である。一般に、これらは周囲温度で液体であるが、低い含水量を有する化合物の混合物である。また、存在する少量の水はしっかりと結合し、化学的または生物学的プロセスのためのその利用可能性を制限する。これは、非常に低い水分活性値によって表される。ＤＥＳは例えば、Ａｂｂｏｔｔら、２００３，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、ｖｏｌ．１，ｐ．７０－７１に記載され、およびＷＯ２００９／１２０８３９に記載されている。
ＤＥＳは「プロトン性イオン液体（ｐｒｏｔｉｃ ｉｏｎｉｃ ｌｉｑｕｉｄｓ）」とも呼ばれる。先行技術は単一の溶融塩のみからなる「イオン性液体」であり、これは、例えば、金属のための溶媒として、またはセルロースもしくはバイオ燃料の抽出のための、様々な工業的用途において長い間使用されている。
高イオン性であるが、同時に水分活性が非常に低いので、ＤＥＳは極性疎水性化合物の溶媒として非常に有効である。例は、ガス、ミネラル、または工業バルク製品の抽出から、医薬品の可溶化までにわたる。ＤＥＳはまた、酵素およびＲＮＡのような生体分子の抽出および安定化のために使用されている（それぞれ、ＵＳ８，２４７，１９８およびＷＯ２０１１／１５５８２９を参照のこと）。
約２０１１年以降、天然に存在する物質からなる特別な形態のＤＥＳが検討されている。これらのいわゆる「天然ＤＥＳ（ｎａｔｕｒａｌ ＤＥＳ）」またはＮＡＤＥＳは、Ｃｈｏｉら、２０１１、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｖｏｌ．１５６，ｐ．１７０１－１７０５；およびＤａｉら、２０１３、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．７６６，ｐ．６１－６８に記載されている。ＮＡＤＥＳは、現在、天然産物の抽出に使用することができる「グリーン（ｇｒｅｅｎ）」溶媒として、および天然農薬に使用するための溶媒として、多くの関心を集めている。
ウイルスはヒトや動物にとって重要な病原体である。ほとんどのウイルスでは、抗ウイルス薬がないか、そのような薬物の使用が不可能であるため、ウイルス感染および疾患に対する防御として最も使われているのはワクチン接種である。ウイルスワクチンは不活化（死滅）ウイルスが存在する可能性があり、通常、十分な免疫応答を促進するために免疫学的アジュバントを必要とする。「生（ｌｉｖｅ）」（すなわち複製）ウイルスを含むワクチンを適用する場合、通常、アジュバントの必要はない。なぜなら、ウイルスはワクチン接種された宿主内で複製することができ、これが免疫応答を引き起こすからである。典型的には、生ウイルスワクチンが弱毒化された毒性を有するウイルスを含み、ワクチン接種自体から（重篤である）疾患を誘発しないようにする。
ワクチン産業における重要な問題は、それらの製造、収穫、処方、および最終製品としての貯蔵寿命のプロセスの間に、このような弱毒化された生ウイルスの生存能力をいかにして保存するかである。ほとんどのウイルスは何らかの安定化なしに、このような処理および２年までの貯蔵を生き残ることができない。いくつかのウイルスは液体窒素中で貯蔵され、市販されることさえ必要とし、これは、もちろん、非常に高価であり、そして労力がかかる。しかしながら、最も適用される方法は生弱毒化ウイルスを適切な安定剤中で凍結乾燥させることによって試料から水の大部分を除去し、例えばケーキまたはリオスフィアの形態の凍結乾燥体からなるワクチンを形成することである。凍結乾燥ワクチンは、保護雰囲気中で、長期間、典型的には－２０または４℃で保存することができる。ワクチン接種に際して、凍結乾燥体は通常、適切な希釈剤に溶解され、再構成されたウイルスはこのようなワクチン接種を必要とする標的に投与され得る。
しかしながら、凍結乾燥のプロセスは労力がかかり、高価であり、極めて時間がかかり、例えば、最大４日またはそれ以上の生産運転が通常であり、凍結乾燥装置に膨大な資本投資を必要とする。従って、液体形態の生ウイルスワクチンを提供するための選択肢が研究されている（例えば、ＷＯ２０１４／０２９７０２、ＷＯ２０１４／１４０２３９、およびＷＯ２０１５／１２１４６３を参照のこと）。これらの刊行物は、４０％ ｗ／ｖまでの糖添加剤、並びに緩衝剤及びアミノ酸のような他の成分を含む水性液体を記載している。しかし、これらの組成物でさえも、生ウイルス産物、特に感受性ウイルス、または冷蔵が利用できないかまたは信頼できない状況において、所望の寿命を常に提供するわけではない。
その結果、凍結乾燥によって生産される必要はないが、感受性ウイルスを有する液体形態で、および長期間の貯蔵の際に十分に安定である安定化された生ウイルスワクチンが、当該分野において必要とされている。
ウイルスの安定性は、いくつかの要因、主に物理的、化学的および生物学的要因に依存する。物理的因子は主に温度および時間であり、化学的因子はウイルスが存在する組成物に由来し、ｐＨ、浸透圧、および含水量を含む。生物学的要因は、水分活性およびウイルス自体の特性に関連している。典型的には、最も安定なウイルスは小さく、ＤＮＡゲノムをもち、最も関連性があるのは：ウイルスエンベロープをもたない。
一般に、エンベロープウイルスは、特にそれらが大きく、および／またはＲＮＡゲノムを含む場合、最も不安定なウイルスである。安定性感受性エンベロープウイルスにはいくつかのファミリーがあり、これらのファミリーにはヒトの医療または獣医療に関連性のある多くのウイルス種が存在する。これらは、Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第４版２００１、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＩＳＢＮ－１０： ０７８１７１８３２５）のようなハンドブックに記載されている。パラミクソ（Ｐａｒａｍｙｘｏ－）、ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ－）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄｅａ）などの例もある。
先行技術において、ＷＯ２０１４／０２９７０２、ＷＯ２０１４／１４０２３９、およびＷＯ２０１５／１２１４６３は、生ウイルスの液体ワクチン組成物（ここで、該組成物はＤＥＳを含まず、液体は少なくとも６０％ ｗ／ｖの水を含む）を記載する。これらの水性組成物では、水分活性（ａｗ）は０．８５以上である。
ＷＯ２０１１／１５５８２９は、ＮＡＤＥＳを用いた生物学的材料の抽出を記載している。列挙された選択肢の１つは、ワクチンなどのタンパク質材料の抽出である。
同様に、ＷＯ２０１４／１３１９０６は、とりわけ、臨床診断のためのウイルスＲＮＡの抽出および安定化に特に焦点を当てた、血液または組織中のウイルスのための固定剤を記載している。固定剤はＤＥＳであり、ＷＯ２０１４／１３１９０６は多数の可能なＤＥＳ組成物を列挙しているが、実際にはプロトン受容体として尿素またはトリフルオロアセトアミド、およびプロトン供与体としてコリンまたはベタインを含む組成物のみが使用される。国際公開第２０１４／１３１９０６号では最も好ましいＤＥＳが塩化コリンおよびトリフルオロアセトアミドから構成され、したがって、これはＮＡＤＥＳではなく、トリフルオロアセトアミドは許容可能な医薬賦形剤ではない。
Ｂｙｒｎｅら（２０１２、Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，ｖｏｌ．１４，ｐ．１０１１９－１０１２１）は、プロトン性イオン液体中での植物ウイルス：タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）の安定化を記載している。ＲＮＡゲノムをもつにもかかわらず、植物ウイルスＴＭＶはエンベロープをもっていない。さらに、この論文はワクチンを開示しておらず、ウイルス感染性の長期安定性に関する定量的データを提供していない。また、Ｂｙｒｎｅらによって使用されるプロトン性イオン液体はメシレート（メタンスルホネート）およびエチルアンモニウムに基づいており、したがってＮＡＤＥＳではない。
ＷＯ２００９／１２０８３９ ＵＳ８，２４７，１９８ ＷＯ２０１１／１５５８２９ ＷＯ２０１４／０２９７０２ ＷＯ２０１４／１４０２３９ ＷＯ２０１５／１２１４６３ ＷＯ２０１４／０２９７０２ ＷＯ２０１４／１４０２３９ ＷＯ２０１５／１２１４６３ ＷＯ２０１１／１５５８２９ ＷＯ２０１４／１３１９０６
Ａｂｂｏｔｔら、２００３，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．、ｖｏｌ．１，ｐ．７０－７１ Ｃｈｏｉら、２０１１、Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ、ｖｏｌ．１５６，ｐ．１７０１－１７０５ Ｄａｉら、２０１３、Ａｎａｌ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，ｖｏｌ．７６６，ｐ．６１－６８ Ｆｉｅｌｄｓ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（第４版２００１、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ、ＩＳＢＮ－１０： ０７８１７１８３２５） Ｂｙｒｎｅら（２０１２、Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．，ｖｏｌ．１４，ｐ．１０１１９－１０１２１）
本発明の目的は従来技術の欠点を克服し、凍結乾燥によって製造する必要がなく、感受性ウイルスに対してさえ十分に安定である生ウイルスワクチンを提供することによって、当該分野における必要性に適応することである。
驚くべきことに、エンベロープウイルスなどの感受性ウイルスを安定化させることができる液体ワクチン組成物を提供することによって、この目的を満たすことができ、その結果、従来技術の１つまたは複数の欠点を克服することができることが見出された。これは、０．８未満の水分活性を有するＮＡＤＥＳをワクチン担体として使用することによって達成される。
この発見は多数の非常に好ましい適用を開く：凍結乾燥の必要なしに、安定なワクチンが感受性ウイルスについてさえも今や作製され得、これは、時間、労力、および資本投資のコストの大幅な節約である。さらに、周囲温度で液体形態であることは、標的のヒトまたは動物への容易な投与を可能にする。さらに、天然化合物は、医薬賦形剤としての使用を可能にする。
ＤＥＳがエンベロープウイルスを安定化することができることは予想外であった：強力な溶媒として、ＤＥＳは繊細なウイルスエンベロープを溶解し、ウイルスタンパク質および核酸を抽出することが予想された。しかしながら、反対に、ＮＡＤＥＳ製剤は、エンベロープウイルスを安定化させることができることが見出されている。この安定化は、水性液体組成物について観察されたよりも良好であった。例えば、生イヌパラインフルエンザウイルス（ｃａｎｉｎｅ ｐａｒａ－ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）（ＣＰｉＶ）を用いた安定性試験では、水分活性が非常に低いＮＡＤＥＳに基づく液体ワクチン組成物において、有意なウイルス力価を２５℃で８週間まで維持することができたが、完全培養培地中に保存されたウイルスは２週間以内にほとんど検出できなかった。
また、驚くべきことに、ＮＡＤＥＳを含む本発明の液体ワクチン組成物は標的動物への直接注射時に十分に耐性であり、鼻腔内投与に有用であることが見出された。
ＮＡＤＥＳがどのように又はなぜエンベロープを有する生ウイルスのためのそのような有効な安定剤であるは、正確には知られていない。本発明者らはこれらの発見を説明し得るいかなる理論またはモデルにも拘束されることを望まないが、ＤＥＳ中の非常に低い水分活性がウイルス安定性の維持に関与し、ＮＡＤＥＳの成分の天然起源がＤＥＳの一般的な成分よりも感受性ウイルスに対して攻撃性が低いと推測する。
従って、１つの態様において、本発明は生エンベロープウイルスおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む液体ワクチン組成物に関し、このキャリアは天然の深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）であり、そしてこのワクチンは、約０．８未満の水活性を有することを特徴とする。
用語「液体」は、その一般的な意味で使用され、特定の温度および特定の時間で流動することができる組成物を指す。液体特性を決定する１つの方法はある温度の組成物を有する容器を傾斜させ、ある量の時間の後に組成物の形態の変化が検出されたときに、その組成物が液体であると分類される傾斜試験である。
「ワクチン」が医学的効果を有する組成物であることは周知である。ワクチンは、免疫学的に活性な成分、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。「免疫学的に活性な成分」は、この場合：生ウイルスを含む。ワクチンは、標的となるヒトまたは動物の免疫系によって認識され、それが防御的免疫応答を誘導する。この応答は標的の先天性および／または獲得免疫系に由来し、細胞型および／または体液型のものであり得る。
ワクチンは一般に、例えば病原体の数を減少させることによって、または宿主動物における病原体の複製の期間を短縮することによって、感染の重症度を減少させるのに有効である。
また、またはその結果として、ワクチンは一般に、このような感染または複製によってまたはその感染または複製に対する標的の反応によって引き起こされ得る疾患の（臨床的）症状を減少または改善するのに効果的である。
本明細書で使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの変形）はそのような要素または組合せが明示的に列挙されていない場合であっても、この用語が使用されるテキストセクション、パラグラフ、請求項などによってカバーされ、またはそれらに含まれる、すべての要素、および本発明のために考えられる任意の可能な組合せを指すことを意図し、そのような要素または組合せのいずれも排除しない。
したがって、任意のそのようなテキストセクション、パラグラフ、請求項などは１つまたは複数の実施形態にも関係することができ、用語「含む」（またはその変形）は「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの用語によって置き換えられる。
ウイルスを「生（ｌｉｖｅ）」であると呼ぶことは生物学的に不正確であるが、これは不活性化されていないウイルスを言う一般的な方法であり、従って、本発明について、用語「生（ｌｉｖｅ）」であるは適切な条件下、例えば適切な宿主細胞において複製することができるウイルスを言う。
実際には、本発明による液体ワクチン組成物に含まれる生ウイルスが弱毒化された病原性を有し、このようなウイルスは「改変生（ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｌｉｖｅ）」とも呼ばれる。
本発明の「弱毒化された（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）」とは、そのようなウイルスの未変性、非弱毒化、または「野生型（ｗｉｌｄｔｙｐｅ）」形態と比較して、より低いレベルの病変を引き起こすこと、および／または感染もしくは複製の速度が低下していることと定義される。ウイルスの弱毒化は様々な方法で、例えば、実験動物を通した継代および選択によって、または細胞培養において、または組換えＤＮＡ技術を介して、得られ得て、これらは全て、当該分野で周知である。
「エンベロープウイルス（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｖｉｒｕｓ）」は、リン脂質被膜を有する周知の型のヒトまたは動物ウイルスである。例えば、アスファ－（Ａｓｆａｒ－）、バキュロ－（Ｂａｃｕｌｏ）、ヘパドナ－（Ｈｅｐａｄｎａ－）、ヘルペス－（Ｈｅｒｐｅｓ－）、ポックス（Ｐｏｘ）ウイルスファミリー；コロナ－（Ｃｏｒｏｎａ－）、フラビ－（Ｆｌａｖｉ－）、トガ（Ｔｏｇａ）ウイルスファミリー、アレナ－（Ａｒｅｎａ－）、ブニア－（Ｂｕｎｙａ－）、フィロ－（Ｆｉｌｏ－）、オルトミクソ－（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ－）、パラミクソ－（Ｐａｒａｍｙｘｏ－）、ニューモ－（Ｐｎｅｕｍｏ－）、ラブド（Ｒｈａｂｄｏ）ウイルスファミリー、レオ－（Ｒｅｏ－）、レトロ（Ｒｅｔｒｏ）ウイルスファミリーなどのウイルスがある。
ウイルスエンベロープはヒトまたは動物ウイルスのいくつかのファミリーに由来するウイルスの要素であり、その動物またはヒト宿主細胞からの出芽時にウイルスによって誘導される。エンベロープは脂質二重層であり、リン脂質およびタンパク質を含む。ウイルスエンベロープは損傷に対して非常に感受性が高く、エンベロープをもつウイルスが新たな宿主細胞に感染する能力にも重要である。したがって、いかなる損傷も、感染能指数によって測定されるウイルス力価を劇的に低下させる。
結果として、生エンベロープウイルスの安定性は、ウイルスの感染性、すなわち適切な宿主細胞または適切な実験動物に感染する能力に関して効果的に示され得る。これはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で決定することができるが、例えば、受精卵または適切な宿主細胞の細胞培養を用いて、より簡便にインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で決定することができる。次いで、ウイルス感染性を、例えば、安定化の前後で、例えば、その組織培養感染量（ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）、プラーク形成単位（ｐｌａｑｕｅ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔｓ）、または卵感染量（ｅｇｇ ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ ｄｏｓｅ）（ＥＩＤ）に関する力価として表現させ、比較することができる。
本発明について、「薬学的に許容される担体」は高グレードの純度の液体であり、好ましくは無菌である。この場合、担体はＮＡＤＥＳである。担体は、安定剤、抗酸化剤、または防腐剤などのさらなる添加剤を含むことができる。
「深共晶溶媒（ｄｅｅｐ－ｅｕｔｅｃｔｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ）」（ＤＥＳ）は共晶混合物を形成するモル比で少なくとも２つの化合物の混合物を含むイオン性液体として当技術分野で周知であり、それによって、得られる混合物の共晶点は、個々の化合物の融点よりも有意に低い。混合物の融点のこの低下は化合物の相互作用によって引き起こされ、一方はプロトン供与体として作用し、他方はプロトン受容体として作用し、これは結晶化せずに安定な水素結合を提供し、混合物をその構成成分と比較して、はるかに低い温度で液体形態にすることを可能にする。一般に、「共晶」は、容易な溶融を意味する。
本発明では本発明のためのＤＥＳを形成するために使用される個々の化合物が約８０℃を超える融点を有し、ＤＥＳは約４０℃未満の融点を有する。例えば、ベタインおよびスクロースの融点はそれぞれ３１０℃および１８６℃であり、一方、いくつかの水を含むベタイン：スクロースについて２：１のモル比で形成されたＮＡＤＥＳは、－２０℃でも流体のままである透明な液体を形成することが見出された。
用語「天然（ｎａｔｕｒａｌ）」は、本発明のための天然ＤＥＳ（ＮＡＤＥＳ）を形成するために使用される化合物が通常の条件下で、植物または動物などの生物学的供給源からの材料中に、微量をはるかに上回る量で存在する有機化合物であることを示すのに役立つ。典型的には、そのような天然化合物が植物または動物起源の特定の材料中に存在する一次代謝産物であるか、またはそれに由来する。当業者が理解するように、用語「天然」は、本発明のためのＮＡＤＥＳにおいて使用するための化合物の最初の起源を特徴付けるためにのみ本明細書において使用され、使用される化合物が実際に供給された方法を特徴付けるためには使用されない。したがって、天然化合物はまた、（半）合成産生を介して得られる場合、本発明に使用され得る。
本発明のＮＡＤＥＳを形成するために使用することができる天然化合物の例は、有機酸、アミン、糖、糖アルコール、およびアミノ酸である。
本発明による液体ワクチン組成物のさらなる有利な特徴は、ワクチン中に存在する水がＮＡＤＥＳの構造中に強固に結合していることである。この結果、エンベロープウイルスの安定性に影響を及ぼし得る化学的または生物学的プロセスに利用可能な水の量は、非常に限定される。この特徴は、シンボル：ａｗで示される水分活性の値で一般的に表現される。水分活性は純水の上限１．０と下限０との間で変化する。水分活性は一般に、純水の蒸気圧および既知の水分活性の多数の飽和塩溶液に対する試験組成物の蒸気圧を（同じ温度で）比較することによって測定される。これは様々なハンドブック、レビューおよびマニュアルに記載されており，例えば、ＦＡＯ農業サービス公報第１４９号（ＦＡＯ ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｓｅｒｖｉｃｅ ｂｕｌｌｅｔｉｎ ｎｏ． １４９）（Ｃａｎｏｖａｓら、ＦＡＯ，Ｒｏｍｅ，２００３，ＩＳＢＮ ９２－５－１０４８６１－４）において、果物および野菜の保存に関する記載があり、レビューは「水分活性の基本（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ｏｆ ｗａｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）」、Ｄｅｃａｇｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｉｎｃ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，２０１５（ｈｔｔｐ：／／ｐｄｆ．ｄｉｒｅｃｔｉｎｄｕｓｔｒｙ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／Ｄｅｃａｇｏｎ－ｄｅｖｉｃｅｓ－Ｉｎｃ／ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ－ｗａｔｅｒ－ａｃｔｉｖｉｔｙ／６４１４２－６３４４３３．ｈｔｍｌ））に記載されている。
水分活性が０．８未満では大部分の細菌の増殖が停止し、０．７未満では大部分の酵母およびカビの増殖が停止し、水分活性が０．４未満では大部分の酵素活性が効果的に停止する。
水分活性を測定するための装置および手順は周知であり、例えばヘッドスペース圧力分析を使用することによって利用可能である。
本発明について、示された水分活性は例えば、商業的生産者によって提供されるような、最終製品の形態の本発明による液体ワクチン組成物の水分活性を指し、その形態は、長期間保存することができる。したがって、これは、標的への投与の直前に、任意の方法で希釈される前の本発明による液体ワクチン組成物を指す（本明細書中に以下に記載されるように）。
「約（ａｂｏｕｔ）」は、その値の周りで±１０％の間で変化し得ることを示し、好ましくは「約」はその値の周りの±９％を意味し、より好ましくは「約」ははその値の周りの±８、７、６、５、４、３、２％を意味し、またはさらには「約」はその値の周りの±１％を意味し、その順序で好ましい。
本発明の分野の当業者には明らかなように、本発明について本明細書に開示される実施形態の範囲内で、例えばウイルスの安定性に関して、他の組み合わせよりも好ましい特定の種類のＮＡＤＥＳとウイルスの種類との組み合わせが存在する。それにもかかわらず、当業者は本明細書に開示される情報を用いて、日常的な方法および材料のみを使用して、本発明による組み合わせおよび組成物を選択し、最適化し、微調整することができるのであろう。本発明の好ましい実施形態およびさらなる態様のさらなる詳細を以下に記載する。
本発明による有効な液体ワクチン組成物は、約０．８～約０．１の水分活性で調製できることが見出された。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物の一実施形態では、ワクチンの水分活性が約０．７未満、より好ましくは約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、約０．３未満、さらには約０．２未満であり、この順序で好ましい。
本発明による液体ワクチン組成物における使用に最も有効かつ有利であったＮＡＤＥＳ組成物は、糖および糖アルコールなどのポリオールと組み合わせた、有機酸（の塩）、アミン、およびアミノ酸のから選択される天然有機化合物の組み合わせであることが見出された。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物の実施形態において、ＮＡＤＥＳは、有機塩およびポリオールを含む。
本発明のＮＡＤＥＳのこの組成物において、有機塩はプロトン供与体であるイオン種として作用し、ポリオールはプロトン受容体として作用する。
「有機塩」は両性イオンを含む任意の有機酸または塩基の塩であり、これは、本明細書中上記に提示されるような天然化合物である定義の範囲内であり、そして本明細書中に記載されるような本発明のための深共晶溶媒を形成し得る。当業者は本発明のための有機塩を完全に選択し、それを適用してＮＡＤＥＳを形成することができる。
さらに、有機塩は、ワクチン組成物の薬学的に許容される賦形剤であるべきである。このようなワクチン賦形剤は例えば、欧州薬局方およびＡｍｅｒｉｃａｎ ９ ＣＦＲのような政府規則、ならびに以下のハンドブックに記載される： Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（ＲＲｏｗｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｅｓｓ ２０１２，ＩＳＢＮ ０８５７１０２７６）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）、および：「Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ」（ＰＰａｓｔｏｒｅｔら編、１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ ０４４４８１９６８１）。
本発明による液体ワクチン組成物の好ましい実施形態において、有機塩は、ベタイン、プロリン、カルニチン、およびコリンの塩から選択される。
本発明の場合、「ベタイン」とは、化合物Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルグリシン、ＣＡＳ ｎｒ．１０７－４３－７をいい、これはグリシン－ベタインとしても知られている。プロリンはＣＡＳ ｎｒ．６０９－３６－９である。カルニチンはＣＡＳ ｎｒ．５４１－１５－１である。コリンはＣＡＳ ｎｒ ６２－４９－７である。
好ましい実施形態では、カルニチンはＬ－カルニチンである。
好ましい態様において、コリンは塩化コリンである（ＣＡＳ ｎｒ．６７－４８－１）。
本発明で使用する有機塩は、異なる塩、異性体、水和物または無水物等として使用することができる。当業者は本発明で使用するための有機塩の適切な形態を選択し、試験することが完全に可能である。
本発明のためのＮＡＤＥＳにおいて使用するための化合物は、様々な商業的供給者から異なる純度および品質で容易に入手可能である。好ましくは、化合物は医薬グレードの品質で使用される。
同様に、本発明のＮＡＤＥＳの調製において添加され得る水は好ましくは高品質および純度の水であり、非経口注射に適しており、「注射用水」と称される。典型的には、これは二重蒸留水、逆浸透水などである。水は無菌であり、発熱物質を本質的に含まない。
本発明において、「ポリオール」は、２個以上の水酸基を含有する有機化合物である。しかしながら、セルロースのようなポリオールの定義下にある非常に大きなポリマーは、本明細書で定義されるＮＡＤＥＳを形成するのに有効ではなく、それによって、それらは本発明での使用のために除外される。その結果、本発明で使用するためのポリオールは、１モル当たり約１０．０００グラム未満の分子量を有する。より好ましくは、本発明で使用するためのポリオールが、１モル当たり５０００グラム未満、または１０００グラム未満の分子量を有し、この順序で好ましい。
本発明において使用するための好ましいポリオールは糖または糖－アルコールであり、これらは、本発明において使用するための種々の有効なＮＡＤＥＳ組成物の生成を可能にする汎用性のある成分であることが実証されている。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物の一実施形態では、ポリオールは糖または糖－アルコールである。
本発明の「糖」は典型的に甘味を有する比較的低分子量の水溶性炭水化物の群からの任意の化合物である。「糖」という用語は、フルクトースおよびマルトースなどの還元糖、ならびにスクロースおよびトレハロースなどの非還元糖を含む。用語「糖」は、単糖、二糖、または六糖までおよび六糖を含む多糖を包含する。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物に使用するためのポリオールの実施形態において、糖は、フルクトース、マルトース、スクロース、グルコースおよびトレハロースから選択される。
本発明による液体ワクチン組成物の好ましい実施形態において、糖はスクロースである。
本発明のためのポリオールは、糖アルコールであってもよい。本発明では、「糖アルコール」は、３個以上の炭素原子を含み、単糖、二糖、または多糖に基づくことができる水素化糖である。
本発明による液体ワクチン組成物に使用するためのポリオールの実施形態において、糖－アルコールは、グリセロール、キシリトール、マンニトール、およびソルビトールから選択される。
グリセロールはＣＡＳ ｎｒ．５６－８１－５である。キシリトールはＣＡＳ ｎｒ．８７－９９－０である。マンニトールはＣＡＳ ｎｒ．６９－６５－８である。ソルビトールはＣＡＳ ｎｒ．５０－７０－４である。
より好ましい実施形態では、糖－アルコールがグリセロール、キシリトール、およびソルビトールの群から選択される。
一実施形態では、ソルビトールはＤ－ソルビトールである。
本発明による液体ワクチン組成物に使用するためのポリオールのさらにより好ましい実施形態において、ポリオールは、スクロース、グリセロール、キシリトール、およびソルビトールから選択される。
また、上記の有機塩について記載されるように、ポリオールは、異なる異性体形態、水和物形態または無水物形態などで使用され得る。当業者は本発明で使用するためのポリオールの適切な形態を選択し、試験することが完全に可能である。
本発明による液体ワクチン組成物のためのＮＡＤＥＳの実施形態において、有機塩はベタイン、プロリン、カルニチン、およびコリンの塩から選択され；ポリオールはフルクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、グリセロール、キシリトール、マンニトール、およびソルビトールから選択される。
本発明による液体ワクチン組成物のためのＮＡＤＥＳの好ましい実施形態において、有機塩はベタイン、プロリン、およびコリンから選択され；ポリオールはスクロース、グリセロール、キシリトール、およびソルビトールから選択される。
本発明による液体ワクチン組成物のためのＮＡＤＥＳのより好ましい実施形態において、有機塩は、プロリンおよびコリンから選択され；ポリオールがグリセロール、キシリトール、およびソルビトールから選択される。
本発明のために、有機酸およびポリオールを異なるモル比で適用することができ、異なる特性を有するＮＡＤＥＳ組成物を提供する。これらは、本発明による最適に安定化する液体ワクチン組成物に到達するために、当業者によって最適化され得る。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物の一実施形態では、本明細書で定義されるように、有機塩とポリオールとのモル比が１：５～５：１である。
本発明による液体ワクチン組成物の好ましい実施形態では、本明細書で定義されるように、有機塩とポリオールとの間のモル比が１：４～４：１、１：３～３：１、またはさらには１：２～２：１であり、この順序で好ましい。
本発明に関して、範囲の表示は、記載された終点を含むことを意図する。
以上のように、本発明に係る液体ワクチン組成物は、特定の含水量で調製することができる。この含水量を変化させることによって、例えば液体ワクチン組成物の粘度に関して、ワクチンの特性を最適化することができる。粘度がほとんどない有効なＮＡＤＥＳは５０％ ｗ／ｖまでの含水率で作り出すことができる（Ｄａｉら、２０１５，ｖｏｌ．１８７，ｐ．１４－１９）。より多量の水は、ＮＡＤＥＳの水素結合のネットワークを妨害し得る。
本発明による液体ワクチン組成物中の水含有量の下限は例えば、ＮＡＤＥＳを形成するための化合物の可溶化のためにどのくらい少ない水を使用することができるか、およびＮＡＤＥＳが依然として加工または使用され得るように十分に低いＮＡＤＥＳの粘度に達するためにどのくらいの水が必要とされるか、などの実用的な要因によって決定される。さらに、ＮＡＤＥＳと混合されたウイルス組成物によってある量の水が混合物に導入され、エンベロープウイルスを混合物に溶解し、本発明による液体ワクチン組成物を調製する。
組み合わされるＮＡＤＥＳおよびウイルス組成物の体積の比は、典型的には５：１ｖ／ｖより高く、例えば１０：１ｖ／ｖ以上である。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物の実施形態において、組成物中の水分量は、約５０％ ｗ／ｖ未満である。
好ましくは、本発明による液体ワクチン組成物中の水分含量が約４０％ ｗ／ｖ未満、約３０、２５、２０、１５、１０、８、７、６未満、またはさらには約５％ ｗ／ｖ未満であり、この順序で好ましい。
より好ましくは、本発明による液体ワクチン組成物中の水分含量が５０～０．５％ ｗ／ｖ；４０～１％ ｗ／ｖ；３０～１．５％ ｗ／ｖ；２０～２％ ｗ／ｖ；またはさらには１０～３％ ｗ／ｖであり、この順序で好ましい。再び、その範囲は、それらの終点を含む。
水分含量は体積当たりの重量のパーセンテージ「ｗ／ｖ」として表され、これは組成物の体積の単位当たりの本発明による液体ワクチン組成物中の水の重量である。含水量は異なる手順を用いて、例えば、当技術分野で周知のカールフィッシャー滴定によって測定することができる。
水分活性についてのように、この文脈における液体ワクチン組成物は、標的への投与の前に任意の希釈が適用される前の、最終産物の形態のワクチンである。
記載されるように、本発明による液体ワクチン組成物は、エンベロープウイルスの生存性を安定化するのに非常に有効である。これは、例えば、本発明による液体ワクチン組成物中に製剤化された異なるエンベロープウイルスについて、室温でさえ長期間保存した後に得られた、本明細書中に記載された感染性タイトレーションの結果から明らかである。
本発明による液体ワクチン組成物の実施形態において、エンベロープウイルスは、アスファ－（Ａｓｆａｒ－）、バキュロ－（Ｂａｃｕｌｏ－）、ヘパドナ－（Ｈｅｐａｄｎａ－）、ヘルペス－（Ｈｅｒｐｅｓ－）、ポックス－（Ｐｏｘ－）、コロナ－（Ｃｏｒｏｎａ－）、フラビ－（Ｆｌａｖｉ－）、トガ－（Ｔｏｇａ－）、アレナ－（Ａｒｅｎａ－）、ブニア－（Ｂｕｎｙａ－）、フィロ－（Ｆｉｌｏ－）、オルトミクソ－（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ－）、パラミクソ－（Ｐａｒａｍｙｘｏ－）、ニューモ－（Ｐｎｅｕｍｏ－）、ラブド－（Ｒｈａｂｄｏ－）、レオ－（Ｒｅｏ－）およびレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）のウイルスファミリーの群から選択される。
本発明に関して、示されたウイルスファミリーとは、形態学的、ゲノム学的、および生化学的特性のようなその分類学的グループメンバーの特徴、ならびに生理学的、免疫学的、または病理学的挙動のような生物学的特性を有するウイルスを指す。同じことが、ウイルス属への言及、ならびに個々のウイルス種の名称への言及にも当てはまる。
当該分野で知られているように、特定の分類群における微生物の分類は、そのような特徴の組み合わせに基づく。したがって、本発明はまた、示されたファミリーまたは示された種名からのウイルスの種を含み、それらは任意の方法でそれから、例えば亜種、株、単離体、遺伝子型、変異体、亜型または亜群などとして、下位分類される。
さらに、本発明のエンベロープウイルスの特定のファミリー、サブファミリー、属または種は現在、その群に割り当てられ得るが、しかし、これは新しい洞察が新しい分類群または異なる分類群への再分類を導き得るので、時間的に変化し得る分類学的分類であることが、本発明の分野の当業者に明らかである。しかし、これはウイルス自体、またはその抗原レパートリーを変化させず、科学的名称または分類のみを変化させるので、このような再分類されたウイルスは本発明の範囲内に留まる。
本発明における使用のためのエンベロープウイルスのサンプルは種々の供給源から、例えば、ヒトからの野外単離物（ｆｉｅｌｄ ｉｓｏｌａｔｅ）として、または野生もしくは農場における動物から、または種々の実験室、（保管）施設、もしくは（獣医学）大学から得ることができる。
感染価の消失に特に感受性が高いのは、ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物の一実施形態では、エンベロープウイルスはＲＮＡゲノムを有する。
本発明のエンベロープウイルスのＲＮＡゲノムは、一本鎖または二本鎖であってもよく、直鎖または環状であってもよく、１つの断片であってもよく、または２つ以上の断片にセグメント化されていてもよい。
本発明による液体ワクチン組成物の好ましい実施形態では、エンベロープウイルスがコロナ－（Ｃｏｒｏｎａ－）、フラビ－（Ｆｌａｖｉ-）、トガ－（Ｔｏｇａ－）、アリーナ－（Ａｒｅｎａ－）、ブニア－（Ｂｕｎｙａ－）、フィロ－（Ｆｉｌｏ－）、オルトミクソ－（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ-）、パラミクソ－（Ｐａｒａｍｙｘｏ－）、ニューモ－（Ｐｎｅｕｍｏ－）、ラブド－（Ｒｈａｂｄｏ－）、レオ－（Ｒｅｏ－）、およびレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ）のＲＮＡゲノムを有するウイルスファミリーの群から選択される。
さらにより好ましいのは、ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスであり、ここでウイルスは比較的大きなサイズである。
したがって、本発明による液体ワクチン組成物のより好ましい実施形態では、ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスがアリーナ－、フィロ－、オルトミクソ－、パラミクソ－、ニューモ－、およびラブドウイルスのウイルスファミリーの群から選択される。
本発明による液体ワクチン組成物のより好ましい実施形態では、エンベロープウイルスがコロナウイルス、ニューモウイルス、およびパラミクソウイルスのウイルスファミリーから選択される。
本発明による液体ワクチン組成物をさらに最適化することは、十分に当業者の手の届く範囲内である。一般に、これは、提供される免疫防御をさらに改善するために、ワクチンの有効性を微調整することを含む。これは、ワクチンの用量、体積、または抗原含量を適合させることによって、または異なる経路、方法、またはレジメンを介した適用によって行うことができる。これらの全ては、本発明の範囲内である。
本発明による液体ワクチン組成物は、追加の抗原または微生物、サイトカイン、または非メチル化ＣｐＧを含む免疫刺激性核酸などの他の化合物をさらに含んでもよい。あるいは、本発明による液体ワクチン組成物は、それ自体がワクチンに添加され得る。
本発明による液体ワクチン組成物は有利には例えば、意図されるヒトまたは動物標的に対して病原性の微生物に由来する、１つ以上のさらなる抗原と組み合わせることができる。このようなさらなる抗原は、それ自体が感染性微生物であってもよく、または不活性化されていてもよく、またはサブユニットであってもよい。さらなる抗原は生物学的分子または合成分子（例えば、タンパク質、炭水化物、リポポリサカリド、脂質、または核酸分子）からなり得る。
本発明による液体ワクチン組成物は、チメロサール、メルチオレート、フェノール化合物、および／またはゲンタマイシンなどの保存剤を含むことができる。好ましくは、保存剤は使用されない。
本発明による液体ワクチン組成物の一実施形態では、以下からなる群から選択される１つ以上、または全ての条件が適用される：
・ ワクチンは約０．８未満の水分活性を有し、ＮＡＤＥＳを含む；
・ ワクチンの水分活性は約０．７未満、より好ましくは約０．６未満、約０．５未満、約０．４未満、またはさらに約０．３未満であり、この順序で好ましい；
・ ＮＡＤＥＳは有機塩とポリオールからなる；
・ ＮＡＤＥＳにおいて、有機塩は、ベタイン、プロリン、カルニチン、およびコリンの塩から選択される；
・ カルニチンはＬ－カルニチンである；
・ コリンは塩化コリンである；
・ ポリオールは糖または糖－アルコールである；
・ 糖は、フルクトース、マルトース、スクロース、グルコースおよびトレハロースから選択される；
・ 糖－アルコールはグリセロール、キシリトール、マンニトール、およびソルビトールから選択され、より好ましくは糖アルコールがグリセロール、キシリトール、およびソルビトールの群から選択される；
・ ソルビトールはＤ－ソルビトールである；
・ ポリオールは、スクロース、グリセロール、キシリトール、およびソルビトールから選択される；
・ 有機塩はベタイン、プロリン、カルニチン、およびコリンの塩から選択され、ポリオールはフルクトース、マルトース、スクロース、トレハロース、グリセロール、キシリトール、マンニトール、およびソルビトールから選択される；
・ 好ましくは有機塩がベタイン、プロリン、およびコリンから選択され、ポリオールはスクロース、グリセロール、キシリトール、およびソルビトールから選択され、より好ましくは有機塩がプロリンおよびコリンから選択され、ポリオールはグリセロール、キシリトール、およびソルビトールから選択される；
・ 本発明による液体ワクチン組成物において、本明細書で定義される有機塩とポリオールとの間のモル比は１：４～４：１であり；好ましくは本明細書で定義される有機塩とポリオールとの間のモル比が１：３～３：１であり、または１：２～２：１でさえある；
・ 本発明による液体ワクチン組成物中の水分含量は約４０％ ｗ／ｖ未満、約３０、２５、２０、１５、１０、８、７、６、またはさらには５％ ｗ／ｖ未満であり、この順序で好ましい；
・ ワクチン中の水分含量は、５０～０．５％ ｗ／ｖ；４０～１％ ｗ／ｖ；３０～１．５％ ｗ／ｖ；２０～２％ ｗ／ｖ；またはさらには１０～３％ ｗ／ｖであり、この順序で好ましい；
・ エンベロープウイルスは、以下のウイルスファミリーのグループから選択される：アスファ－（Ａｓｆａｒ－）、バキュロ－（Ｂａｃｕｌｏ－）、ヘパドナ－（Ｈｅｐａｄｎａ－）、ヘルペス－（Ｈｅｒｐｅｓ－）、ポックス－（Ｐｏｘ－）、コロナ－（Ｃｏｒｏｎａ－）、フラビ－（Ｆｌａｖｉ－）、トガ－（Ｔｏｇａ－）、アレナ－（Ａｒｅｎａ－）、ブニア－（Ｂｕｎｙａ－）、フィロ－（Ｆｉｌｏ－）、オルトミクソ－（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏ－）、パラミクソ－（Ｐａｒａｍｙｘｏ－）、ラブド－（Ｒｈａｂｄｏ－）、レオ－（Ｒｅｏ－）およびレトロウイルス（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅ）；
・ エンベロープをもつウイルスはＲＮＡゲノムをもつ；
・ ＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスは以下のウイルスファミリーのグループから選択される：コロナ－、フラビ－、トガ－、アレナ－、ブニア－、フィロ－、オルトミクソ－、パラミクソ－、ニューモ－、レオ－およびレトロウイルス；好ましくはＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスがアレナ－、フィロ－、オルトミクソ－、パラミクソ－、ニューモ－、およびラブドウイルスのウイルスファミリーのグループから選択される；より好ましくはＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスがコロナ－、ニューモ－、およびパラミクソウイルスのウイルスファミリーから選択される；および
・ 本発明による液体ワクチン組成物はチメロサール、メルチオラート、フェノール化合物、および／またはゲンタマイシンのような保存剤を含み得る。好ましくは、保存剤は使用されない。
記載のように、本発明による液体ワクチン組成物は、一般的な技術および材料を使用して製造することができる。本発明による液体ワクチン組成物を調製するためのこのような方法、使用、またはプロセスの詳細および例は本明細書に記載され、このような手順は日常的な材料および方法を使用して当業者によって容易に適用可能である。
例えば、本発明のＮＡＤＥＳは工業規模で製造することができ、次いで、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）または好ましくはインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で製造されたエンベロープウイルスの調製物と混合することによってワクチンに製剤化される。次いで、混合物を適切なサイズの容器に充填する。製造工程の様々な段階は適切な試験によって、例えば、抗原の質及び量に関する免疫学的試験、無菌性に関する微生物学的試験及び外来性物質の不在に関する微生物学的試験、並びに有効性及び安全性を確認するための動物を用いたワクチン接種試験により、監視される。品質、量および無菌性についての試験が完了した後、ワクチン製品を販売に放出することができる。
これらの全ては当業者に周知であり、医薬品製造のための周知の標準下でワクチンの調製に適用される一般的な技術および考察は例えば、政府の指令および規則（Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ、９ＣＦＲ）および周知のハンドブック（Ｐａｓｔｏｒｅｔ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ、ｓｕｐｒａ）に記載されている。
したがって、さらなる態様において、本発明は本発明による液体ワクチン組成物の調製のための方法に関し、この方法は、以下の工程を含む：
（ａ） ＮＡＤＥＳを調製する工程、および
（ｂ） ＮＡＤＥＳと生エンベロープウイルスを含む組成物とを混合する工程。
好都合には、本発明による方法の２つの工程が貯蔵、輸送、またはさらに別の工程を介在させて、時間においておよび／または場所において分離して実施することができる。これは、運用の計画およびロジスティクスにおける柔軟性を可能にする。
本発明による方法で使用するためのＮＡＤＥＳの調製は、通常のツールおよび方法を使用して行うことができる。１つの便利な方法は混合および可溶化を可能にするが、それらを損傷しない温度（例えば、約８０℃まで）まで、組み合わせた化合物の加熱を適用することである。加熱は例えば、撹拌または音波処理と組み合わせて行うことができる。
また、ＮＡＤＥＳを形成する成分の１つは、最初に、多かれ少なかれ濃縮された形態で水に溶解することができ、その後、それを（ａ）さらなる成分と混合して、過剰の水を蒸発させることによって、本発明のためのＮＡＤＥＳを形成することができる。
本発明の方法で使用するための生エンベロープウイルスを含む組成物は、種々の方法で、有利には適切な細胞株上でのウイルスのインビトロ培養から都合よく誘導することができる。ウイルス－細胞培養物は、自動制御およびモニタリング技術を適用する大規模工業サイズ発酵槽において、数１０００リットルまでの任意の所望のサイズまたは体積で作製され得る。
次いで、ウイルスは、ウイルスの特徴：上清、細胞－ペレットとして、または培養物全体として、に依存する様式で、培養物から収穫される。本発明で使用するためのウイルス組成物は、濃縮などのさらなるプロセス工程を使用して、例えば限外濾過膜上の通過を使用して調製することができる。次いで、ウイルス組成物を、生存率および量についてチェックする。この全ては、当業者に周知である。
本発明による方法におけるＮＡＤＥＳおよびウイルス組成物の混合は、好ましくは無菌技術を使用して行われる。
ＮＡＤＥＳがウイルス組成物に添加されてもよく、または他の方法で添加されてもよいという点で、混合の順序および方法は重要ではない。好ましくは、使用される任意の機械的混合が低速および低衝撃である。さらに、混合および／または充填は、酸素暴露を低減するために保護雰囲気中で行うことができる。
粘性液体を混合し、充填するための便利な装置は、プロセス装置の様々な供給業者から入手可能である。
本発明は、ヒトまたは動物標的を目的とするワクチンのための担体として、本明細書に記載されるＮＡＤＥＳの使用を初めて開示する。
したがって、さらなる態様において、本発明は、ヒトまたは動物標的を意図するワクチンのための薬学的に許容される担体としての、本発明について記載されるＮＡＤＥＳの使用に関する。
好ましくは、本発明によるＮＡＤＥＳの使用は、本明細書中に記載されるようなエンベロープウイルスのワクチンのためのキャリアとしての使用ある。
したがって、本発明によるＮＡＤＥＳの使用の好ましい実施形態において、ワクチンは、本発明による液体ワクチン組成物である。
本発明による液体ワクチン組成物は、例えば医薬品製造業者によって供給される形態でヒトまたは動物に投与することができる。しかしながら、本発明による液体ワクチン組成物の特定の実施形態の特定の組成に応じて、液体ワクチン組成物の希釈を行うことが好ましい場合がある。これは、例えば粘度を低下させることによって標的への実際の投与を容易にすることができ、または標的のワクチン接種時の局所反応を低下させることができる。
このような希釈のための希釈剤は典型的には液体であり、本発明による液体ワクチン組成物とは別個に提供され得る。好ましくは、希釈剤が本発明による液体ワクチン組成物と一緒に、例えばキット オブ パーツ（ａ ｋｉｔ ｏｆ ｐａｒｔｓ）として提供される。
したがって、さらなる態様において、本発明は、少なくとも２つの容器：本発明による液体ワクチン組成物を含む１つの容器、および液体希釈剤を含む１つの容器を含む、キット オブ パーツに関する。
本発明による液体ワクチン組成物を希釈するための、例えば、本発明によるキット オブ パーツに含めるための「液体希釈剤」は、本発明による液体ワクチン組成物を希釈するために適した液体である。したがって、液体希釈剤は、水または緩衝液などの水性であってもよい。しかし、本発明による液体ワクチン組成物の含水量が低いため、希釈剤は油性であってもよく、または油と水のエマルジョンであってもよい。
一実施形態では、液体希釈剤自体が液体ワクチン組成物、例えば、再構成凍結乾燥生ワクチン、またはエマルジョンアジュベート不活化ワクチンであってもよい。
本発明による液体ワクチン組成物を希釈するための、例えば、本発明によるキット オブ パーツに含めるための、液体希釈剤の選択は、いくつかの要因、例えば、希釈後のワクチンの意図される使用；それが含むエンベロープウイルス；ワクチン接種のための意図されるヒトまたは動物標的；などに依存する。当業者はこのような希釈剤を選択し、調製し、適用することが完全に可能である。
本発明による液体ワクチン組成物は、予防的処置または治療的処置のいずれかとして、またはその両方として使用され得る。
本発明による液体ワクチン組成物は有効なプライミングワクチン接種として役立つことができ、これは、後に、同じまたは異なるワクチンを用いた追加免疫ワクチン接種によって追跡および増幅することができる。
本発明による液体ワクチン組成物は、免疫学的に有効な量の生エンベロープウイルスを含む。
本発明の分野の当業者は例えば、ワクチン接種後の免疫学的応答をモニターすることによって、または攻撃感染（ａ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）後の（動物標的の場合）、例えば、疾患の標的の徴候、臨床スコアをモニターすることによって、または病原体の再単離によって、これらの結果を偽ワクチン接種動物に見られるワクチン接種－攻撃応答と比較することによって、本発明による液体ワクチン組成物中の生エンベロープウイルスのこのような免疫学的に有効な量を決定および最適化する以上のことができる。
ワクチン用量中の生ウイルスの量を決定する方法は当該分野で周知であり、そして代表的には、ウイルスタイトレーションの技術（例えば、プラークアッセイ、卵もしくは動物におけるタイトレーション、またはマイクロタイトレーションプレートにおける滴定）を使用する。従って、このようなウイルス感染力価は例えば、ＴＣＩＤ５０、ＥＩＤ５０、またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）において表され得る。
本発明による液体ワクチン組成物の標的は、ワクチンに含まれる特定の生エンベロープウイルスの病原性形態によって引き起こされる感染または疾患に対するワクチン接種を必要とするヒトまたは動物である。ワクチン接種される標的の年齢、体重、性別、免疫学的状態、および他のパラメータは重要ではないが、健康で非感染の標的にワクチン接種し、いかなる野外感染も予防するために可能な限り早期にワクチン接種することが好ましい。
本発明による液体ワクチン組成物、または本発明による方法によって調製することができる液体ワクチン組成物、または例えば本発明によるキット オブ パーツを使用して調製することができるような希釈形態の液体ワクチン組成物は、このようなワクチン接種を必要とするヒトまたは動物標的への投与を意図する。ワクチン接種は、本発明の生エンベロープウイルスの非弱毒化対応物によって引き起こされる感染および／または疾患の徴候を減少させるために、能動免疫を誘導する。このような感染の減少とは、エンベロープウイルスによる増殖性感染の確立または増殖を予防または減少させることをいう。これは、例えば、標的におけるウイルス負荷を減少させるか、またはウイルス複製の持続時間を短縮することによって達成される。次に、これは、標的のヒトまたは動物において、病変の数、強度、または重症度、および結果としてのウイルス感染によって引き起こされる疾患の臨床徴候の減少を導く。このようなワクチンは、口語的に「特定のウイルスに対する」ワクチン、または「ウイルスワクチン」と呼ばれる。
したがって、さらなる態様において、本発明は、前記ワクチンに含まれる生エンベロープウイルスの病原性形態によって引き起こされる感染および／または疾患に対するヒトまたは動物標的の保護において使用するための、本発明による液体ワクチン組成物に関する。
さらなる態様において、本発明はヒトまたは動物標的のワクチン接種のための方法に関し、この方法は、本発明による液体ワクチン組成物の投与、本発明による方法によって得ることができるワクチンの投与、または本発明によるキット オブ パーツの使用によって得ることができるワクチンの投与を含む。
本発明の液体ワクチン組成物は、本発明のワクチン接種方法に従ってヒトまたは動物標的に直接投与するために使用することができる。
あるいは、本発明による液体ワクチン組成物が希釈された形態でヒトまたは動物標的に投与され得る。本発明によるワクチン接種方法のこの実施形態は、その粘度が低下しているため、注射による取り扱いおよび投与を容易にすることができる。あるいは、またはさらに、希釈形態での投与はヒトまたは動物標的における局所反応（例えば、接種部位での組織刺激から生じる）を減少させ得る。
本発明の方法によるワクチン接種は非経口経路によって、すなわち皮膚を通して、例えば、筋肉内、腹腔内、皮内、粘膜下、または皮下に行うことができる。本発明の液体ワクチン組成物の好ましい非経口投与経路は、筋肉内注射または皮下注射による。
さらに、本発明による液体ワクチンは、経腸または粘膜経路によって、すなわち点眼、点鼻、経口、腸溶、経口点鼻、噴霧などによって投与することができる。
あるいは、本発明による液体ワクチン組成物が飲料水、粗スプレー、噴霧、飼料中などを介する大量投与の方法を介して投与することができる。
本発明による液体ワクチン組成物の最適な投与経路は、使用されるワクチンの詳細、および標的の特定の特徴に依存することは言うまでもない。当業者は、このような投与経路および投与方法を選択および最適化することが完全に可能である。
本発明による液体ワクチン組成物は非経口経路によって、標的ヒトまたは動物に許容される容量で投与することができ、例えば、約０．１～約１０ｍｌの容量で投与することができる。好ましくは１回の用量が約０．１～約５ｍｌの体積であり、より好ましくは１回の用量が０．２～３ｍｌである。
筋肉内経路によって投与される場合、１用量の体積は、好ましくは約０．５～約３ｍｌ、より好ましくは約１～約２ｍｌである。
皮内経路によって投与される場合、１用量の体積は、好ましくは約０．１～約０．５ｍｌ、より好ましくは約０．２ｍｌである。
本発明による液体ワクチン組成物の投与の方法、タイミング、および体積は好ましくは標的へのストレスを低減し、労働コストを低減するために、標的ヒトまたは動物が必要とし得る他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに組み込まれる。これらの他のワクチンは、それらの登録された使用に適合する様式で、同時（simultaneous）、同時（concurrent）または連続様式で投与され得る。
次に、本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
実施例
実施例１：方法および材料
１．１ ＮＡＤＥＳ製剤の調製
ＮＡＤＥＳは、混合によって調製することができ、それは、加熱および／または少量の水の添加によって促進することができる。以下にさらに試験および記載されるＮＡＤＥＳのサンプルのいくつかは、過剰の水に有機塩およびポリオールを溶解することによって調製された。次に、減圧下、７０℃の水浴中で数時間回転蒸発させることにより、過剰の水を除去した。ＮＡＤＥＳ中に存在する水の量は、蒸発による重量損失を考慮して計算した。
ＮＡＤＥＳの他の試料は、水浴中での超音波処理法によって調製した。必要量の粉末をフラスコに加えた。フラスコを短時間振盪またはボルテックスして、粉末を混合した。次に、必要量の水を添加した。この混合物を、ＮＡＤＥＳが形成されるまで、数時間まで超音波処理しながら、４５℃に設定した超音波処理水浴に入れた。超音波処理中、７０℃までの温度に達することができた。
１．２ 水分活性の測定
サンプル
生物学的封じ込めの目的で、ＮＡＤＥＳ調製物のサンプルの水分活性を測定したが、生ウイルスはなかった。しかし、本発明による液体ワクチン組成物を形成するためにＮＡＤＥＳに添加される水性ウイルス組成物の量を知っている場合、ＮＡＤＥＳとウイルス組成物との組み合わせの得られる水分活性は、Ｄａｉら（２０１５，Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．１８７，ｐ．１４－１９）に従って計算することができる。
サンプル調製
ＮＡＤＥＳサンプルの量を１０ｍｌガラスバイアルに移し、バイアルの約１／４の充填高さに到達させた。各サンプルについて、コード化されたバイアルを二重に充填した。ＰＴＦＥ栓付きアルミニウムクリンプキャップを用いてバイアルを閉じ、室温で１２時間置いて、サンプルとヘッドスペースとの間の平衡に達した。
機器
サンプルのヘッドスペース中の水蒸気圧を、Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ ＦＭＳ－１４００ ｍｏｉｓｔｕｒｅ／ｐｒｅｓｓｕｒｅ ａｎａｌｙｓｅｒを用いて測定した。サンプルは、そのままサンプルチャンバに挿入される。サンプル計測の前に、０～０．２ａｗのキャリブレーションヘッドスペース圧標準を用いて系をキャリブレーションする。また、飽和塩標準を用いて、０．２～１ａｗの非線形領域を較正し、再計算した。
校正
ａｗ０－１からの全範囲にわたって機械を較正し、水分活性値の基準線を作成するために、いくつかの標準サンプルを測定した：純水に隣接して、特定の飽和塩溶液の５つの試料を使用し、６つの標準サンプルのそれぞれについて、２つの試料を３倍で測定した。純水の測定値を１．０００とすることにより、０．８５１１、０．７５４７、０．５４３８、０．３３０７、０．１１３１のａｗで他の標準値を求めた。また、一連の認定蒸気圧基準を測定した。
ａｗの測定結果は、表１に含まれている。
１．３ 安定性アッセイに使用されるウイルス組成物
安定性インキュベーションのために使用したウイルスは以下のものであった：
・ イヌパラインフルエンザウイルス（ＣＰｉＶ）；パラミクソウイルス科由来
・ ウシ呼吸器合包体ウイルス（ＢＲＳＶ）；種としても知られる：ウシオルトニューモウイルス；ニューモウイルス科、オルトニューモウイルス属、および
・ ウシパラインフルエンザ３ウイルス（ＰＩ３）；パラミクソウイルス科由来。
これらのウイルスはすべてエンベロープウイルスであり、ＲＮＡゲノムをもつ。
１．４ 安定性アッセイに使用されるＮＡＤＥＳ組成物
安定性アッセイに使用したＮＡＤＥＳ組成物は以下のものであった：
・ ＮＡＤＥＳ １：ベタイン：スクロース：水、モル比２：１：６，４での
・ ＮＡＤＥＳ ２：カルニチン：グリセロール：水、モル比２：１：４での、および
・ ＮＡＤＥＳ ３：プロリン：ソルビトール：水、モル比２：１：５．７での。
１．５ ＮＡＤＥＳおよびウイルス組成物の混合
ＮＡＤＥＳ調製物を、層流キャビネット中でウイルス組成物と９：１ｖ／ｖでブレンドした。浸透圧ショックを防ぐために、安定剤を徐々に、そして少しずつ、冷却したウイルス溶液に添加した。サンプルを、滅菌磁気撹拌を用いて穏やかに撹拌した。混合物中に気泡を閉じ込めないように注意した。混合物を、適切な容器への充填の開始まで２～８℃で保存した。
ＮＡＤＥＳ／ウイルス混合物を３ｍｌバイアルに充填することを、層流キャビネット中で、ピペットボーイを用いてバイアルあたり２ｍｌで行い、サンプルを氷上に保持した。各安定性時点について、２つのサンプルを調製した。また、ウイルスを含まないＮＡＤＥＳサンプルを陰性対照として含めた。充填後、バイアルをアルミニウムキャップでキャップした。次いで、サンプルを、それらの安定性－インキュベーション温度で保存した。
１．６ 安定性アッセイ
本発明による液体ワクチン組成物に含まれる多数のエンベロープウイルスについて、拡張安定性アッセイを行った。これらは、３つの温度：４、１５、および２５℃、ならびに１、２、４、または８週間のインキュベーションの間に行った。０日目のサンプルを分けた。
適切な時点で、ＮＡＤＥＳ／ウイルス混合物を採取し、細胞上でのタイトレーションによって残存ウイルス力価を決定するために使用した。
ウイルスタイトレーションは、９６ウェルマイクロタイトレーションプレート上で行った。適切な陽性および陰性対照を含めた。力価はＳｐｅａｒｍａｎおよびＫａｅｒｂｅｒの方法を用いて、コンピュータプログラムを介して、サンプルの少なくとも２つの読み取り値から計算し、Ｌｏｇ１０ ＴＣＩＤ５０／ｍｌで表した。
ＣＰＩウイルスをＶｅｒｏ細胞上でタイトレーションし、５％ ＦＣＳおよび抗生物質を含む標準培養培地中で培養した。２ｘ１０^５セル／ｍｌを播種し、プレート上で１：１０の希薄化を施した。
次に、マイクロタイタープレートを３７℃および５％ ＣＯ２で７日間インキュベートした。次いで、各ウェルを、光学顕微鏡によって評価されるように、ｃｐｅについて検査した。
サンプル中の感染性ＢＲＳＶまたはＰＩ３の量を定量するために、試験サンプルの連続１０倍希釈物を標準細胞培養培地中で作製し、マディーンダービー（Ｍａｄｉｎ Ｄａｒｂｙ）ウシ腎臓（ＭＤＢＫ）細胞を予め播種したマイクロタイトレーションプレート中にピペットで移した。加湿した５％ ＣＯ２大気中、３７℃で、ＢＲＳＶについては５～７日間、またはＰＩ３については４～６日間培養した後、単層のウイルスの有無を調べた。プレートを固定し、酵素－基質と組み合わせて、ペルオキシダーゼ標識ウイルス特異的モノクローナル抗体を使用して、免疫－ペルオキシダーゼ単層アッセイを行った。検出は、着色沈殿の存在を視覚的に記録することによって行った。
安定性アッセイの結果を実施例３に記載する。
実施例２：本発明で使用するためのＮＡＤＥＳの例
本発明での使用のために、異なる化合物を用いて、異なるモル比を有し、異なる水含量を有する、多数のＮＡＤＥＳ製剤を調製した。
以下の表１は、最も有効なＮＡＤＥＳ製剤のいくつかを列挙する；これらは室温（２０～２５℃）で流動性である透明な液体溶液を生じた。それらの組成および含水量の詳細を提供する。調製したいくつかのサンプルについて、水分活性を測定し、その結果を含めた。示されていない：水の分子量は１８Ｄａであり；トレハロースを二水和物として使用した。
多くの観察を行うことができた：
・ コリン、ベタイン、およびプロリンは本発明で使用するための最も汎用性があり、有効な有機酸であり、ソルビトール、グリセロール、およびキシリトールが最も有効なポリオールであった。
・ ３７％ ｗ／ｖまでの含水量を有するＮＡＤＥＳを容易に製造することができ、その結果、低粘度の液体となった。
・ 水分活性は、一般に非常に低く、しばしば０．３未満、さらには０．１ａｗ未満であることが見出された。
・ 糖およびアミンはメイラード反応を介して反応することができるが、調製されたＮＡＤＥＳの大部分は無色のままであり、７０℃までの数時間の加熱後に視覚的に変化しないままである。
・ いくつかの試料はまた、２～８℃の冷蔵条件または－２０℃でさえも流動性であったことが観察された。
Figure 0007184900000001
Figure 0007184900000002
実施例３：ウイルス安定性アッセイの結果
本発明による液体ワクチン組成物に含まれる多数のエンベロープウイルスについて、上記のように、拡張安定性アッセイを行った。これらは、３つの温度：４、１４、および２５℃で行った。
２５℃で８週間のインキュベーションは、４℃で１～２年間のインキュベーションの効果を示す迅速安定性試験として役立つことができる。したがって、これはウイルスの安定性に対する非常に重度の攻撃であり、これらの条件下で全ての試料がそれほど長く生き延びることが期待されたわけではなかった。
Figure 0007184900000003
Figure 0007184900000004
安定性の結果からのいくつかの結論
特に、ＣＰｉＶウイルスは、ＮＡＤＥＳ ３（安定剤３）製剤によって非常に良好に安定化させることができた；２５℃で８週間後でさえ、ウイルスの大部分は感染性のままであった。
同様の結果が、２５℃で４週間まで、ＮＡＤＥＳ １中のＢＲＳＶおよびＰＩ３について見られた。
一般に、本発明による液体ワクチン組成物は、種々のエンベロープウイルスのための異なる組成物において、安定化の顕著な能力を示す。
これは、凍結乾燥、大きな経済的利益の必要性を克服する。また、ワクチンの液体の性質は、ヒトまたは動物標的への投与を容易にする。
実施例４：長期安定性アッセイ結果
上記実施例１～３に記載した実験を経時的に継続し、規則的なサンプルを採取し、測定した。
ＢＲＳＶ：
安定性アッセイは、ＮＡＤＥＳ １（ベタイン：スクロース：注射用水（ＷＦＩ）、モル比２：１：６．４で）、ＮＡＤＥＳ ３（プロリン：ソルビトール：ＷＦＩ、２：１：５．７で）、またはＮＡＤＥＳ ４（コリン：キシリトール：ＷＦＩ、２：１：３で）に基づく液体ワクチン組成物中のニューモウイルスＢＲＳＶを用いて継続した。
結果を、４、１４、または２８℃の温度で、それぞれ３０、８、または８週間、連続貯蔵したものをそれぞれ図４のパネルＡ～Ｃに示す。これらは、図１のパネルＡ～Ｃに示されるような結果の拡張である。
試験した全てのＮＡＤＥＳ（１、２、および４）に基づく液体ワクチン組成物は４℃または１４℃での貯蔵の際に、ニューモウイルスＢＲＳＶに固体安定化効果を提供することが明らかである（図４Ａおよび４Ｂを参照のこと）。また、２５℃という非常に厳しい温度（図４Ｃ）においてさえ、ＮＡＤＥＳ ４による有意な安定化およびＮＡＤＥＳ １によるさらに良好な安定化が存在する。
ＢＲＳＶに関するさらなる結果を実施例５に示す
ＰＩ３：
パラミクソウイルスＰＩ３について、ＮＡＤＥＳ １、２、または３に基づく全ての液体ワクチン組成物はあるレベルの安定化を提供したが（図２、パネルＡ～Ｃを参照のこと）、経時的な最良の安定化は図５に示されるように、ＮＡＤＥＳ １（ベタイン：スクロース：注射のための水、２：１：６．４のモル比で）において得られた：この組成物は４℃で３０週間を超える期間にわたって、生ウイルス力価の１ Ｌｏｇ１０をわずかに超える低下を防ぐことができた。比較として、標準培養培地中の対照試料は、同じ期間にわたって４ Ｌｏｇ１０の力価の低下を示した。
ＣＰｉＶ：
パラミクソウイルスＣＰｉＶを、プロリン：ソルビトール：ＷＦＩ ＮＡＤＥＳ ３処方物の２つの改変体： ＮＡＤＥＳ ３ＡおよびＮＡＤＥＳ ３Ｂを含む液体ワクチン組成物に混合した；詳細を以下の表４に提供する。
１２週間までの室温（約２０℃）でのインキュベーション後に残存する生ＣＰｉＶウイルス力価の量を図６に示す。両方の組成物はこのチャレンジ温度でウイルス分解を有意に減少させることができた：ＮＡＤＥＳ ３Ａ力価損失は２ Ｌｏｇ１０未満であり、３Ｂでは損失は約３ Ｌｏｇ１０であり、一方、ＰＢＳでは生ＣＰｉＶ力価損失は５ Ｌｏｇ１０を超えた。
実施例５：ＮＡＤＥＳベースのワクチンにおける以前の安定性結果の変動
上記の実施例１～４の実験をさらに拡張するために、本発明のＮＡＤＥＳ製剤のいくつかのバリエーションを試験した。
Figure 0007184900000005
この表において、「Ｔｇ」は、ガラス転移温度を表す。これは示差走査熱量測定用の標準セットアップを用いて決定した。これらの測定では、これらの実験で試験したＮＡＤＥＳサンプルについて結晶相転移は観察されず、非常に小さいサイズのガラス転移のみが観察された。測定された非常に低いＴｇ値と共に、これは、これらのサンプルが氷結晶を形成し得る検出可能な量の遊離水を含まないことを示す。
ＮＡＤＥＳ ３Ｂ製剤は０．７６の水分活性を有し、これは、水中のウイルスの１／１０容量部をこのＮＡＤＥＳの９／１０容量部に添加して、０．８０の水分活性を有する本発明の液体ワクチン組成物を得ることを可能にする。
種々のＮＡＤＥＳ製剤を、ＢＲＳＶを含む、本発明による液体ワクチン組成物中で試験した。全てのウイルスサンプルを９容量部のＮＡＤＥＳと合わせ、混合し、２８℃でインキュベートして強制安定性アッセイを行った。結果を図７に示す。表４に列挙した全てのＮＡＤＥＳ製剤は、ＢＲＳＶを安定化することができた；最良の結果がイオン種としてプロリンまたはベタインを用いたＮＡＤＥＳで得られた。
実施例６：ＮＡＤＥＳベースのワクチンにおけるさらなるパラミクソウイルスの安定性
イヌジステンパーウイルス（Ｃａｎｉｎｅ ｄｉｓｔｅｍｐｅｒ ｖｉｒｕｓ）（ＣＶＤ）はＰＩ３およびＣＰｉＶと同様に、さらなるパラミクソウイルスである。イヌやネコの多くの種に感染する能力があるため、獣医学的関連性は高い。症状には、腸、呼吸器、および様々な全身性疾患の徴候がある。若年時のＣＤＶに対するネコおよびイヌの定期的なワクチン接種は一般的である。典型的には、ワクチンは凍結乾燥産物として産生される生弱毒化ウイルスである。
ＣＤＶを、９容量部のＮＡＤＥＳ ３Ａ（プロリン：ソルビトール：ＷＦＩ、１：１：２．５のモル比で）と混合した本発明の液体ワクチン組成物に取り込んだ。安定性は、４℃で１６週間までインキュベートすることによって試験した。
結果を図８に示す。これはＮＡＤＥＳ ３Ａに基づく組成物が冷蔵温度での長期貯蔵中に、本質的に出発力価でＣＤＶを有効に安定化することができたことを示す。標準培養培地中の対照サンプルは、経時的に力価の持続的な低下を示した。ＣＤＶについてのＮＡＤＥＳと対照との間の安定化効果のこの差は、ＰＩ３について観察されたものよりも顕著である（図２Ａを参照のこと）。
実施例７：ＮＡＤＥＳベースのワクチンにおけるコロナウイルスの安定性
さらなるウイルスファミリーの安定性を評価するために、コロナウイルスを本発明による液体ワクチン製剤に取り込んだ。コロナウイルスは典型的には、ヒトまたは動物に（重度の）呼吸器疾患を引き起こす。使用したウイルスは鶏コロナウイルス（ａｎ ａｖｉａｎ Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）である伝染性気管支炎ウイルス（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＩＢＶ）であった。
他のファミリーウイルスと同様に、ＩＢＶはエンベロープウイルスであり、外界の影響に非常に敏感である。さらに、ＩＢＶにはプラスセンスの一本鎖ＲＮＡゲノムがあり、このゲノムはＲＮＡウイルスで知られている最も大きなもの１つである。これにより、ＩＢＶは、貯蔵時に特に劣化しやすくなる。
ＩＢＶはニワトリなどの家禽の健康に大きな影響を及ぼし、家禽農業の経営経済に大きな負の潜在的影響を及ぼす。世界中のほとんどのニワトリはＩＢＶ感染および疾患に対するワクチン接種を受けており、それらのワクチンの多くは弱毒生ワクチンであり、長期間までの生ＩＢＶウイルスの保管および出荷が必要である。したがって、このような弱毒化生ワクチンは、長い間、凍結乾燥製品として製造されていた。
ＮＡＤＥＳに基づく液体ワクチン製剤中のＩＢＶの安定性を評価するために、ウイルスを、１：１：２．５のモル比でプロリン：ソルビトール：注射用水から構成されるＮＡＤＥＳ ３のバリアント、すなわちＮＡＤＥＳ ３Ａに取り込んだ。この配合物のさらなる特徴を表４に記載する。
ＩＢＶのタイトレーションは、鳥類においてインビボで、または初代細胞においてエクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）で行う必要があるため、極めて困難である。多く利用されているが、同じように手間のかかる選択肢は発育鶏卵のタイトレーションである。この理由のために、ＩＢＶを用いたこれらの実験では、ただ１つのタイプのＮＡＤＥＳおよびただ１つの貯蔵温度を試験した。
材料および方法：
ＩＢＶ株４／９１を、接種したニワトリ卵から尿膜液として採取した標準ウイルス産物として得た。ウイルスおよびＮＡＤＥＳを１＋９容量部合わせ、ボルテックスにより混合し、４℃でインキュベートした。卵の同じバッチ上の全てのサンプルをタイトレーションすることができるようにするために、種々の時限サンプルをそれぞれ新鮮に調製し、次いでインキュベーションを開始し、最も長いインキュベーションを最初に開始した。
結果と結論：
４℃で３０週間までのＮＡＤＥＳ ３ＡにおけるＩＢＶ安定性の結果を図９に示す。
図９のデータから、尿膜液中のＩＢＶ ４／９１の対照サンプルと比較して、ＮＡＤＥＳ ３Ａに基づく液体ワクチン組成物の安定化効果に大きな正の差があることが明らかである：全てのウイルスは４℃で２９週間後に対照サンプル中で分解されたが、ＮＡＤＥＳ ３Ａ中の生ＩＢＶの量は影響を受けず、７ヶ月後でさえ出発力価と有意に異ならなかった。
結論として、コロナウイルス、ＩＢＶ、およびＮＡＤＥＳを含む、本発明による液体ワクチン組成物は、延長された貯蔵期間にわたって、生コロナウイルスに対して優れたかつ前例のない安定化効果を示した。
実施例８：ＮＡＤＥＳベースのワクチンにおけるヘルペスウイルスの安定性
実施例７と同様に、この実験は、さらなるエンベロープウイルスファミリー：ヘルペスウイルスに対する本発明の液体ワクチン組成物の安定化効果を試験した。
ネコヘルペスウイルス１型（Ｆｅｌｉｎｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １）（ＦＨＶ１）、牛ヘルペスウイルス１型（Ｂｏｖｉｎｅ Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ １）（ＢＨＶ１）の２つの代表例を試験した。これらのウイルスは両方とも、大きな二本鎖ＤＮＡゲノムをもつエンベロープウイルスである。結果として、エンベロープウイルスであることから、ならびに大きなウイルスであることから、ほとんどのヘルペスウイルスは非常に繊細であり、そして標準的な貯蔵条件下で急速な分解の傾向があることが知られている。したがって、必然的に生ヘルペスウィルスワクチンは、乾燥感のある製品として一般的に生産される。
ＦＨＶ１は、ネコウイルス性鼻気管炎と呼ばれるネコの伝染性および重度の呼吸器感染症を引き起こす。ＢＨＶ１は伝染性牛鼻気管炎ウイルスとも呼ばれ、牛でも同様の症状を引き起こす。
標準的な細胞培養からＦＨＶ１およびＢＨＶ１のサンプルを採取した。
ＦＨＶ１サンプルを、１＋９ｖ／ｖで、ＮＡＤＥＳ ３ＡおよびＮＡＤＥＳ ３Ｂ製剤と混合した。次に、試料管を回転ホイール上で１時間混合した。約１Ｌｏｇ１０の有意な混合中損失を考慮すると、この混合方法は、おそらく、この脆弱なウイルスにとっては過度に激しかった。
ＢＨＶ１もＮＡＤＥＳ ３ＡおよびＮＡＤＥＳ ３Ｂと混合し、さらにＮＡＤＥＳ ５（ベタイン：ソルビトール：ＷＦＩ、モル比１：１：２．５で）でも試験した。詳細を表４に示す。
結果と結論：
異なる液体ワクチン組成物におけるＦＨＶ１およびＢＨＶ１安定性の結果を、それぞれ図１０および１１に示す。
図１０のデータから、ＦＨＶ１が対照組成物（標準培養培地）中で急速に分解することが明らかである。時点ゼロでの力価の最初の低下は、ＮＡＤＥＳ ３ＡおよびＮＡＤＥＳ ３Ｂの両方において、生ＦＨＶ１が４週間まで、本質的に実験の開始力価のレベルで効果的に安定化されたように、後に補われる以上であった。この実験における試験温度は室温（約２０℃）であり、これはウイルス安定性にとって全く好ましくない条件であることを考慮すると、これは著しく陽性の結果である。
同様に、図１１は、異なるＮＡＤＥＳ製剤における４℃でのＢＨＶ１の安定性の結果が非常に類似していることを示す。試験した３つのＮＡＤＥＳはすべて、６週間まで良好な安定性を示したが、対照組成物（ＰＢＳ）は力価の明らかな低下を示した。
結論として：ヘルペスウイルス、ＦＨＶ１またはＢＨＶ１、およびＮＡＤＥＳを含む、本発明による液体ワクチン組成物は、要求される貯蔵温度で、有意に長い期間にわたる貯蔵において、生ヘルペスウイルスに対して優れた安定化効果を示した。
実施例９：ＮＡＤＥＳによるワクチンの投与
投与の容易さ、および標的動物における本発明による液体ワクチン組成物の安全性を評価するために、ワクチンの例を実験動物および死後材料に投与した。
この目的のために、プロリン、ソルビトール、および注射用水を含むＮＡＤＥＳ ３製剤の２つのバリアントを作製し、試験した：１つは高い（ＮＡＤＥＳ ３Ａ）粘度を有するもの、および１つは低い（ＮＡＤＥＳ ３Ｂ）粘度を有するもの。これらは、粘度スペクトルの２つの極値における本発明による液体ワクチン組成物の投与特性を比較するのに役立った。これら２つの組成物の特性を表３に記載する。さらに、それらの粘度は、標準条件：約２０℃で、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（商標）ＤＶ－Ｉ＋粘度計を使用して、スピンドルタイプＮｏ．６２を利用して、６０ｒ．ｐ．ｍ．で３０秒間、約８０ｍｌ容量の標準測定カップ中で、を使用して測定した。
取扱い
高粘度ＮＡＤＥＳ、製剤番号３Ａは２１Ｇ以下のサイズの皮下注射針、すなわち、０．８ｍｍ以上の外径を有する針を通して押し出すことができる。
Figure 0007184900000006
皮下投与インビボ（Ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ）
試験した２種類のＮＡＤＥＳ製剤は、イヌを用いた安全性試験において、皮下注射により投与されたプラセボと比較された。安定剤製剤の局所または全身投与後に起こりうるあらゆる副作用に特に注意を払った。
両方の製剤はプロリン、ソルビトールおよび注射用水を密閉バイアル中で加熱および超音波処理することによって前述のように調製し、その結果、透明で均一な液体が得られた。さらに、それらを濾過滅菌し、バイオバーデンおよびエンドトキシンを測定した。両方の製剤は、滅菌製剤の一般的な許容基準を満たす、１単位／ｍｌの最低希釈標準未満のスコアを有することが見出された。ＮＡＤＥＳ ３Ｃ製剤は１容量部のＮＡＤＥＳ ３Ａを９容量部のＷＦＩで希釈することによって調製し、１：１：５の比のプロリン：ソルビトール：ＷＦＩ、および２８９ｍＰａ．ｓの粘度を有する製剤を得た。ＮＡＤＥＳ ３Ｂは３３．４ｍＰａ．ｓの粘度を有する。
７ヶ月齢の６匹の健康なビーグル犬を３匹の犬の２群に分けた。各群をＮＡＤＥＳ製剤に割り当て、１ｍｌシリンジおよび２１Ｇ ５／８針を用いて皮下接種により割り当てた製剤１ｍｌを２週間隔で２回投与した。グループ１のイヌには低粘度ＮＡＤＥＳ ３Ｂを与え、グループ２のイヌには高粘度ＮＡＤＥＳ ３Ｃを与えた。すべてのイヌを、接種部位での局所反応を含めて、研究全体を通して毎日臨床的にモニターした。
ワクチン接種は頸部のスクルフ（ｓｃｒｕｆｆ）で行われ、１回目のワクチン接種は左側、２回目のワクチン接種は頸部右側で行われた。各投与の前にワクチン接種部位を剃毛し、注射部位をマーカーペンで囲んだ。いずれの注射でも不快感は認められなかった。注射４時間後には注射部位を触知し、注射部位には物質がほとんどあるいは全く触知されず、腫脹や発赤は認められなかった。
接種前－３日目、－２日目、－１日目、接種当日：接種直前、接種後４時間目、次いで接種後７日間連日、直腸温を測定した。
全試験を通じて、いずれのイヌにおいても体温の有意な上昇は認められず、臨床的な有害作用も認められなかった。
結論として、皮下経路によるＮＡＤＥＳ製剤３Ｃまたは３Ｂの接種は、局所的にも全身的にも、いかなる有害な接種反応も誘発しなかった。
鼻腔内投与（Ｉｎｔｒａ－ｎａｓａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）
２つのＮＡＤＥＳ製剤： ３Ａおよび３Ｂを、鼻腔内投与した場合に、鼻の粘膜表面上でのそれらの広がりのパターンについて試験した。両方のＮＡＤＥＳ製剤を、水を添加せずにそのまま試験し、その結果、ＮＡＤＥＳ ３Ａは５１９７ｍＰａ．ｓの粘度を有し、ＮＡＤＥＳ ３Ｂは３３．４ｍＰａ．ｓの粘度を有する。ヘラ先端の「パテントブルー」着色剤を、ＮＡＤＥＳ配合物の各々３０ｍｌに添加して、濃青色を得た。対照として、着色剤を含むＰＢＳを使用した。
約２～４週齢の子牛から子牛頭を剖検した。投与は、野外でのｉ．ｎ．ワクチン接種の間のウシの位置を模倣する直立位置に頭部を保持し、鼻孔をわずかに上方に傾けて行った。
次いで、鼻腔内ワクチン接種のための標準的な手順に従って液体を投与し、これにより、１．５ｍｌの液体を含有する、針のない２．５ｍｌのシリンジを鼻孔内に配置し、次いで、液体を１つの定常流で噴出させた。次に、頭部を２つの半分に切開し、中隔を除去し、鼻腔内の青色の存在について検査した。
全てのサンプルについて、青色液体が鼻道を通って容易に移動したことが観察された。ＰＢＳサンプルの低粘度は容易な注入を可能にしたが、全ての液体は迅速に突き抜けた。青色は、気管の始まりを含む鼻腔全体を通して観察された。
非常に高い粘度を有するＮＡＤＥＳ ３Ａの注入は、シリンジからの注入に僅かな力を要した。また、予想通り、青色液体が頭部の下に出現するのに時間がかかった。頭部を切開した後、この粘稠な液体が鼻腔内に均等に広がり、鼻腔内により多くの物質を残して、厚い層を形成したように見えたことも観察された。このことは、ｉ．ｎ．ワクチン接種中に生存子牛に投与した場合、保持が改善され、上気道への進行が少なくなることを示している。
低粘度を有するＮＡＤＥＳ ３Ｂ製剤の投与の効果は、液体が鼻腔を突き抜けたＰＢＳサンプルの効果に非常に類似していた。
結論：子牛頭部への鼻腔内注射後、異なる粘度を有する着色調製物の分布をモニターすることが可能であった。青色によって判断される液体の分布は２つのＮＡＤＥＳ調製物およびＰＢＳについて同等であり、投与の容易さおよび残留物質の量に関していくらかの差異があり、それによって、ＮＡＤＥＳ ３Ａ処方物は放出するのが少し困難であったが、鼻道内の残留物のより厚い層をもたらした。これは、このような粘性ＮＡＤＥＳ製剤からの抗原の遅延放出が得られることを示唆する。
実施例１０：プロリン：ソルビトール：ＷＦＩ ＮＡＤＥＳの詳細な分析
プロリン、ソルビトール、および注射用水を含むＮＡＤＥＳ ３型製剤を詳細な分析に供した。３つの成分の比についての多くのバリエーションを作り、試験した。これは、図１２に示されており、３つの成分の重量比における組成物の三角プロットを表す。ＮＡＤＥＳ製剤を生成することができた比は、三角形の内側の平行四辺形によって示される。平行四辺形の外側の比率は三角形に示されるように、固体または水性のいずれかである混合物をもたらした。試験され、ＮＡＤＥＳ ３の有効かつ安定なバリアントを産生することが見出された種々のＮＡＤＥＳ組成物は、ボールによって示される。上記の実施例でより詳細に試験したＮＡＤＥＳ ３Ａおよび３Ｂの特定の製剤も示す。
図１は、異なるＮＡＤＥＳ製剤におけるＢＲＳＶの安定性結果を示す。 図２は、異なるＮＡＤＥＳ製剤における牛ＰＩ３ウイルスの安定性結果を示す。 図３は、異なるＮＡＤＥＳ製剤におけるＣＰｉＶの安定性の結果を示す（ＮＡＤＥＳ１～３は、凡例においてｓｔａｂ．１～３と呼ばれる；ｘ軸：週単位の時間；ｙ軸：力価）。 図４は、異なるＮＡＤＥＳ製剤中および異なる貯蔵温度でのＢＲＳＶの長期安定性結果を示す。 図５は、異なるＮＡＤＥＳ製剤中および異なる貯蔵温度でのＰＩ３の長期安定性結果を示す。 図６は、異なるＮＡＤＥＳ製剤中および異なる貯蔵温度でのＣＰｉＶの長期安定性結果を示す。 図７は、ＮＡＤＥＳ製剤のバリアントにおけるＢＲＳＶの安定性結果を示す。 図８は、さらなるウイルスおよびウイルスファミリー：ＣＤＶの安定性結果を示す。 図９は、さらなるウイルスおよびウイルスファミリー：ＩＢＶの安定性結果を示す。 図１０は、さらなるウイルスおよびウイルスファミリー：ＦＨＶ１の安定性結果を示す。 図１１は、さらなるウイルスおよびウイルスファミリー：ＢＨＶ１の安定性結果を示す。 図１２は、プロリン、ソルビトール、およびＷＦＩの重量比の三角プロットを作製し、ＮＡＤＥＳ ３のバリアントの詳細な分析において試験した。灰色の平行四辺形は有効なＮＡＤＥＳ組成物を示し、ボールは、製造され試験された個々の製剤を示す。

Claims (9)

  1. 生エンベロープウイルスおよび薬学的に許容される担体を含む液体ワクチン組成物であって、
    前記担体が天然の深共晶溶媒（ＮＡＤＥＳ）であり、
    前記ワクチンが０．８未満の水分活性を有し、
    前記組成物中の水分含量が約５０％ ｗ／ｖ未満であることを特徴とする、前記液体ワクチン組成物。
  2. 前記ＮＡＤＥＳが有機塩およびポリオールを含むことを特徴とする、請求項１に記載の液体ワクチン組成物。
  3. 前記有機塩がベタイン、プロリン、カルニチン、およびコリンの塩から選択されることを特徴とする、請求項２に記載の液体ワクチン組成物。
  4. 前記ポリオールが糖または糖アルコールであることを特徴とする、請求項２または３に記載の液体ワクチン組成物。
  5. 前記ポリオールがスクロース、グリセロール、キシリトール、およびソルビトールから選択されることを特徴とする、請求項２～４のいずれか１項に記載の液体ワクチン組成物。
  6. 前記エンベロープウイルスがＲＮＡゲノムを有することを特徴とする、請求項１～５のいずれか１項に記載の液体ワクチン組成物。
  7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の液体ワクチン組成物の調製方法であって、以下の：
    （ａ） ＮＡＤＥＳを調製する段階、および
    （ｂ） ＮＡＤＥＳと生エンベロープウイルスを含む組成物とを混合する段階
    を含む、前記方法。
  8. 少なくとも２つの容器：請求項１～６のいずれか１項に記載の液体ワクチン組成物を含む１つの容器；および液体希釈剤を含む１つの容器、を含む部品のキット。
  9. 前記ワクチンに含まれる生エンベロープウイルスの病原型によって引き起こされる感染および／または疾患に対するヒトまたは動物標的の保護に使用するための請求項１～６のいずれか１項に記載の液体ワクチン組成物。
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