CN101610787B - 在培养物中复制流感病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及选择在组织培养细胞中生长的流感病毒以制备适于组织培养的病毒分离物的方法。本发明还涉及由所述分离物制备的疫苗。

Description

在培养物中复制流感病毒的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2006年12月15日申请的美国申请60/875287和2006年12月28日申请的美国申请60/882412的优先权，二者均纳入本文作为参考。
技术背景
人们已认识流感流行和大流行达数个世纪，并且它已经导致了相当多的生命丧失。流感病毒是一种分段的含有RNA的病毒，属于正黏病毒科。流行和大流行是由具有在人群中很少有免疫性的新包膜成分的病毒引起的。这些新成分通常为人类和动物流感病毒突变和/或混合的结果。
然而，流感病毒的衣壳为略微多晶的，其外表面与所有病毒一致，由脂质包膜组成，从脂质包膜上伸出两种突出的糖蛋白棘：血细胞凝集素(HA或H)和神经氨酸酶(NA或N)。有三种类型的流感病毒：A、B和C型。仅A型流感病毒基于两种主要的表面糖蛋白HA和NA进一步分类为亚型。A型流感亚型根据病毒株进一步分类。B型流感病毒仅感染哺乳动物并在人中致病，但一般不如A型严重。C型流感病毒也仅仅感染哺乳动物，但仅在儿童引起非常轻的呼吸道疾病。它们在遗传学上和形态学上与A和B型不同。
A型流感病毒感染很多种动物，包括哺乳动物，如，人、马、狗、猪、白鼬、鸟类，如鸭、鸡和火鸡。有16种已知HA血清型和9种已知NA血清型。鸟类为特别重要的储存库，其生成遗传学上/抗原学上不同的病毒的库，所述病毒通过人和动物之间的近距离接触转移到人群中。猪可感染人类和鸟类流感株。因为这种不寻常的特征，当同一细胞感染两种类型的病毒时，猪被认为是允许鸟类和人类病毒之间基因交换的“混合容器”。
流感病毒基因组由分成8段的单链(-)有义RNA组成(C型流感为7段)。因为已经作出了大量遗传学研究(传统和分子)基因组结构是详知的。每段编码一种或两种病毒蛋白。人们相信流行和大流行是因为流感病毒HA和NA蛋白的两种不同的方式的遗传改变而引起：抗原漂移和抗原转变。抗原漂移经常发生，而抗原转变仅仅偶尔发生。A型流感病毒进行两种变化，B型流感病毒仅通过更渐进性的过程抗原漂移而变化。
抗原漂移是指通过两个基因中的点突变发生的小而渐进的变化，所述两个基因包含产生主要表面蛋白HA和NA的遗传物质。抗原转变是指在人中产生目前不在人群中流行的新的A型流感病毒亚型的突然而大的变化。抗原转变可通过动物(家禽)与人的直接传播发生，或通过A型人流感和A型动物流感病毒基因混合而通过被称为遗传重配的过程产生新的A型人流感病毒亚型。抗原转变产生新的A型人流感亚型。当两种不同的流感病毒感染相同细胞并平分或交换一个或多个RNA片段时发生遗传重配。例如，如果转移的片段是HA，则可导致新的病毒株出现，所述病毒株在抗原上为新型，并且进入人群时具有很少或没有免疫性。这个结果可导致流行和/或大流行。
流感病毒进入细胞能通过HA棘与含有N-乙酰神经氨酸(NANA＝唾液酸)端基的粘蛋白结合而变容易。结合后，颗粒通过内吞作用经包被的凹陷卷入形成内吞囊泡，最后形成核内体。这些被细胞酸化并且在约pH5.0下，HA单体在核内体中被类胰蛋白酶裂解以激活它们内化。一旦内化，则发生病毒复制并产生流感症状。
人们对最近的流感爆发相当关注。业已在狗中鉴别出因犬流感病毒(CIV)所致的一种严重呼吸道疾病。这种呼吸道疾病已被证实有高度传染性。而且，CIV可引起100％的感染率和80％的发病率，以及在严重感染中高达5-8％的死亡率。自从2004年在灵提赛犬中首次检出(Crawford等人，Science 310(5747)：482-485(2005))，CIV已经很快蔓延至全美国，其中至少25个州报道CIV爆发，并且二十七个州报道CIV血清阳性。
引起最近爆发的CIV血清型是H3N8。这种CIV血清型最初在马中发现，  认为它是越过种属障碍进入犬类。可能抗犬流感病毒有效疫苗的缺乏在这种病毒在狗中快速而广泛的传播中起重要作用。
A型流感(H5N1，禽流感)病毒也称为“H5N1病毒”，是一种A型流感病毒亚型，主要在鸟类中发生，在鸟类中有高度传染性，对鸟类可致死。H5N1病毒不经常感染人类，但这些病毒感染在人类中发生过。迄今为止，已在10个国家(主要在亚洲)报道了超过200例的人类确诊病例，这些病例导致了150余人死亡。幸运的是，这种病毒还不容易从鸟类传播至人类或在人类之间互相传播。然而，这有可能发生，导致流行或大流行。防止与流行或大流行相关的发病率和致死率的最佳策略是疫苗接种。
目前给予人类的流感疫苗在预防住院治疗和死亡方面有很高的性价比，然而，季节性疫苗的世界年产量有限，并且不能实际地覆盖全球高风险人群。现有疫苗是用自世界卫生组织(WHO)或疾病控制中心(CDC)获得的病毒在蛋中制成，WHO和CDC每年为疫苗生产提供病毒种子。流行病毒的HA变化(抗原漂移)需要在流感两次爆发期间周期性置换疫苗株。WHO发表了包括南半球和北半球所包括的半年推荐株。为允许有足够的时间生产，WHO在二月测定哪个疫苗株应包括在下个冬天的疫苗内。一般来说，成人一个剂量含有45μg HA(15μg每种，3种病毒)的等同物。这个剂量大约为从为一个感染的含胚鸡蛋的尿囊液中得到的纯化的病毒的量。如果制备1亿剂量的灭活的流感病毒疫苗，制造商必须获得1亿个含胚鸡蛋。这使得疫苗生产依赖于高质量含胚鸡蛋的时间可行性和WHO/CDC提供的种子株。大部分原型种子株甚至在含胚鸡蛋中也不容易生长至高效价。要克服这个困难问题，政府机关首先要通过与高产率的实验室株A/PR/8/34经典重配(以6∶2重配从A/PR/8/34株中得到6个片段)创造出高产率的实验室株。遗憾的是，这个方法可能很难做到，并且可能影响所得到的疫苗的抗原性。因此，需要提供生产疫苗的替代方法以预防由流感、特别是高度致病株如H5N1引起的临床疾病。还有，仍然需要提供在快得足以有效预防可能的流行和/或大流行的时间内生产大量救生流感疫苗的方法。本发明解决这些和其他需求。
本文所引用的任何参考不应被理解为允许这种参考作为本申请的“现有技术”。
发明简述
本发明涉及预防A型和B型流感感染的疫苗。相对于现有技术的疫苗和方法，本发明的疫苗和相关方法提供大量优点。例如，本发明的疫苗用组织培养细胞代替含胚鸡蛋生产。所述创造性生产方法通过省略传统疫苗生产步骤而节约了关键时间。另外，本发明的疫苗可用于那些对蛋物质过敏者。本发明还提供可在疫苗中应用的新型免疫原性组合物。这些新型免疫原性组合物可用于免疫动物，包括鸟类，以抵抗流感。在本法明的具体实施方式中，疫苗接受者为哺乳动物。在一个方面，本发明提供保护犬类抵抗犬流感病毒(CIV)所致的犬呼吸道疾病的疫苗。在另一方面，本发明提供保护人类抵抗通过遗传重配自然产生的流感病毒株的疫苗。
本发明提供流感病毒分离物，其特别适于在组织培养细胞中生长。在一个具体实施方式中，改造的流感病毒分离物根据其在所选择的组织培养细胞系中生长的能力，用有限稀释克隆(limit dilution cloning)选择。在一个具体实施方式中，通过将包含大量流感亚群的一些流感病毒通过系列稀释为大量等分试样，来选择适于在培养细胞系中生长的流感病毒亚群。然后大量等分试样与培养的细胞系接触，和/或在培养的细胞系中生长。大量流感病毒亚群中的一个流感病毒亚群经检测被鉴别为以低感染复数(MOI)在培养细胞中生长的流感病毒亚群，并被选为适于在培养细胞系中生长的流感病毒亚群。在相关实施方式中，本发明提供如下方法，其包括：使所述适于组织培养的分离物与组织培养细胞接触，使所述细胞生长一段足以产生致细胞病变效应(CPE)的时间。此方法也可包括收获流感病毒。在一些这样的实施方式中，所述有限稀释克隆方法包括系列稀释流感病毒分离物，并使每种稀释物与培养细胞接触，使所述细胞生长一段足以产生致细胞病变效应(CPE)的时间，从致CPE的最高倍稀释物中收获病毒，并用收获的病毒重复所述方法。在一些实施方式中，所述方法也包括使所述流感病毒分离物与有效量的胰蛋白酶混合，然后与所述培养细胞接触。在一些实施方式中，孵育所述混合物一段足以允许胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使细胞从基底脱离的时间。用于裂解病毒蛋白的胰蛋白酶为IX型胰蛋白酶。在某些情况下，使适于组织培养的分离物与组织培养细胞接触的步骤在感染复数(MOI)小于约0.01，包括小于约0.001和/或小于约0.0001的情况下进行。在其他情况下，所述流感病毒分离物首先在组织培养细胞中检测，以测定最适MOI。所述组织培养细胞可为哺乳动物胚胎肾细胞，如，人胚胎肾细胞。所述流感病毒可为A、B和C型流感病毒。在一个具体实施方式中，所述流感A病毒为H5N1株。所述流感病毒分离物可从任何来源得到，包括如鼻拭子、肺组织，和/或可由第三方提供，如WHO。在一些实施方式中，所述流感病毒分离物起初在含胚鸡蛋中生长，以得到大量适于组织培养的接种物。一些方法包括纯化所收获的病毒。在一个这样的方法中，所述纯化步骤用尺寸排阻层析进行。本发明的方法也可包括在纯化之前、之中或之后将流感病毒第二分离物与第一分离物混合，这种第二分离物是与第一分离物不同的株。在一些方法中，剂量效价研究在混合两种病毒分离物之前进行以测定病毒蛋白具有相等免疫原性的混合物。在一些实施方式中，流感被灭活。在这种类型的一些实施方式中，流感病毒用能有效灭活病毒的量的二乙烯亚胺(binary ethyleneimine)处理。在一些方法中，当血细胞凝集素蛋白含量最高时进行收获。
其他实施方式包括通过收获由以下方法制备的病毒分离物来制备的疫苗：选择在组织培养细胞中生长的流感病毒，其通过用有限稀释克隆滴定流感病毒分离物以便选择适应于组织培养细胞的流感病毒分离物。在一些实施方式中，所述病毒通过绒膜尿囊(也称为尿囊腔)或羊膜接种途径，由特异性无病原含胚鸡蛋接种制备，然后进行有限稀释克隆。在一个实施方式中，所述流感病毒首先通过含胚鸡蛋的羊膜接种复制以得到适于组织培养细胞的接种物。
另外，本发明提供选择在人胚胎肾细胞生长的流感病毒的方法。在一个这样的方法中，流感病毒分离物用有限稀释克隆滴定以便选择适于HEK细胞的流感病毒分离物。这种方法可包括适于HEK的分离物与HEK细胞接触，以及使所述细胞生长一段足以产生致细胞病变效应(CPE)的时间。在这种类型的具体实施方式中，收获所得到的流感病毒。本发明也提供疫苗，所述疫苗包括通过这些方法得到的流感病毒分离物。所述方法也包括使所述流感病毒分离物与有效量的IX型胰蛋白酶混合，然后与所述培养细胞接触一段足以使胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使细胞脱离基底的时间。在一个实施方式中，使适于HEK的分离物与HEK细胞接触的步骤在MOI小于约0.001的条件下进行。
在一些实施方式中，本发明进一步提供疫苗，所述疫苗包括以每剂量小于4μg人流感HA配制的人流感病毒。在一个相关的实施方式中，本发明提供疫苗，所述疫苗包括以每剂量小于3μg人流感HA配制的人流感病毒。在另一个实施方式中，本发明提供疫苗，所述疫苗包括以每剂量小于2μg人流感HA配制的人流感病毒。在又一个实施方式中，本发明提供疫苗，所述疫苗包括以每剂量1.5-3.5μg人流感HA配制的人流感病毒。在具体的疫苗实施方式中，佐剂为ISCOM。在其他疫苗实施方式中，至少70％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的实施方式中，至少80％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的实施方式中，至少90％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。在另外的实施方式中，多于95％的病毒包括具有相同氨基酸序列的HA。
本发明还提供组合疫苗，以产生保护性免疫来抵抗流感病毒，如犬流感病毒(CIV)和其他疾病，如其他犬类传染病。本发明还提供免疫哺乳动物例如，狗、猫或马抵抗流感的方法。也提供制备和使用传染病(如犬类传染病)的疫苗的方法。
在一个具体实施方式中，本发明的免疫原性组合物包括含有灭活CIVH3N8和佐剂的免疫原性组合物。所述佐剂通常包含水包油乳液。在一个这样的实施方式中，所述佐剂还包含氢氧化铝。在这种类型的一个具体实施方式中，所述佐剂是
Figure G2007800513763D00061
在另一个实施方式中，所述免疫原性组合物是疫苗。
疫苗组合物可包括每剂量约100血细胞凝集单位(HAU)至1500HAU。这可根据接受治疗的个体大小和其他健康因素而变化。所述组合物通常在每剂量250和750HAU之间。在一个实施方式中，所述疫苗组合物包括每剂量约500HAU。
本发明的疫苗可任选包括药学上可接受的免疫刺激剂，如细胞因子；生长因子；趋化因子；来自淋巴细胞、单核细胞或来自淋巴器官的细胞的细胞培养物的上清液；植物、细菌或寄生虫的细胞制剂和/或提取液；或促细胞分裂剂。
本发明的疫苗可通过如下途径给药：胃肠外给药、肌肉注射、皮下注射、腹膜注射、皮内注射、口服、鼻内给药、划痕及上述的组合。在本发明的优选实施方式中，疫苗通过肌肉注射给药。
本发明还提供含有与CIV H3N8结合的抗体的来自接种动物的血清，以及纯化抗体本身。在本发明的一个具体实施方式中，与CIV H3N8结合的纯化抗体是嵌合抗体。
本发明还提供组合疫苗，所述组合疫苗包括一种或多种灭活CIV株(如CIV H3N8)与一种或多种包括下列的其他犬病原体和/或免疫原相组合，如对以下产生免疫的免疫原：犬瘟病毒；犬腺病毒；犬腺病毒2型；犬细小病毒；犬副流感病毒；犬冠状病毒；犬流感病毒；和/或钩端螺旋体(Leptospira)血清型，如感冒伤寒型kirschneri血清型钩端螺旋体(Leptospira kirschneriserovar grippotyphosa)、犬型问号血清型钩端螺旋体(Leptospira interrogansserovar canicola)、出血性黄疸问号钩端螺旋体(Leptospira interrogansicterohaemorrhagiae)和/或波蒙纳问号血清型钩端螺旋体(Leptospirainterrogans serovar pomona)。可加入本发明的联合疫苗的其他犬病原体包括支气管博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)；利什曼(Leishmania)生物，如成人利什曼虫(Leishmania major)和婴儿利什曼虫(Leishmaniainfantum)；包柔氏螺旋体(Borrelia)属螺旋体，包括狭义上的(ss)博氏疏螺旋体(B.burgdorferi)、博氏疏螺旋体ss、博氏疏螺旋体加利尼(B.garinii)和博氏疏螺旋体阿滋利(B.afzelii)；支原体属(如犬支原体)；狂犬病病毒和犬艾希体(Ehrlichia canis)。
本发明提供在培养细胞中生长CIV H3N8的方法。在一些实施方式中，所述培养细胞是非犬的哺乳动物肾细胞。在一个实施方式中，所述细胞为马-达氏(Madin-Darby)牛肾(MDBK)细胞。在另一个实施方式中，所述细胞为Vero细胞。
在一些实施方式中，本发明还提供包含以小于每剂量500HAU配制的CIV H3N8的疫苗。在这些实施方式中，佐剂通常为氢氧化铝，并且至少70％，通常至少90％的HA具有相同氨基酸序列。在其他疫苗实施方式中，至少80％的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。在另外的疫苗实施方式中，多于95％的病毒包含具有相同氨基酸序列的HA。
本发明的这些和其他方面将通过参考以下附图和实施方式得到更好的理解。
附图说明
图1显示CIV感染狗之后的平均临床评分。用CIV感染非接种对照和接种的狗，并从感染后-2天至10天每日监测临床征象，如眼和鼻排出物、喷嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困难。所述临床征象根据实施例1所述的指南评分，并将每个处理组的临床评分对天数作图。
图2证明感染后狗的鼻CIV释出。用CIV感染非接种对照和接种狗。在感染前一天(-1天)收集鼻拭子以证实狗没有感染CIV。通过每天收集鼻拭子10天(感染后1天至10天)在感染狗中监测鼻病毒释出，并在单层MDCK上进行滴定。每个处理组的平均病毒效价以Log10 TCID50/mL表示，计算并对感染后天数作图。
发明详述
生产流感疫苗的传统方法包括在含胚母鸡蛋中分离株的生长，这至少部分是因为鸡蛋廉价且有效，并且因为没有大量生长流感的明显替代选择。在人流感的情况下这尤其确切，因为很多可用于繁殖流感病毒的细胞系还没有经FDA认证用于人类疫苗生产，并且在组织培养中仅得到了很低的效价。
当疫苗在鸡蛋中生产时，一般如下制备。最初，从咽拭子或相似的来源回收病毒，在鸡蛋中分离。最初在鸡蛋中的分离很困难，但病毒适应鸡蛋宿主并且其后在鸡蛋中的繁殖相对较容易。在鸡蛋中生长后，纯化病毒，并用福尔马林或β-丙内酯灭活。生长迹象表明鸡蛋不是最适于病毒繁殖的。例如，用于基于鸡蛋的生产的常规产蛋鸡群具有使病毒制剂受到在这些装置中常见的内生病毒污染的较高风险。而且，成千上万的鸡蛋的分离接种和收集以及复杂的下游加工步骤导致大量时机能将环境污染物引入病毒制剂，这很有可能是2004年某次疫苗召回的原因。如前所述，很难完全移除鸡蛋物质，而这可能导致对疫苗的敏感性。此外，所述加工完全缺乏在需要突然增加时的灵活性，这是因为没有大量适合的鸡蛋可用而造成的物流问题。也有证据表明在鸡蛋中生长可降低病毒的抗原性。一致的，在鸡蛋中生长A或B型流感病毒会生成具有HA突变谱的异源病毒产物。相反，在哺乳动物宿主细胞中相应生长的病毒则生成结构与最初分离的那些相同的流感病毒(Rocha，等人，J.Gen.Virol 1993；74：2513-2518)。而且，在哺乳动物细胞中生长的流感病毒更容易得到在人血清中中和并且HA抑制的抗体，且抗体效价高于鸡蛋中生长的对照(Oxford，等人，Bull WHO 1987；65：181-187)。
遗憾的是，所有流感病毒株看来均在鸡蛋中生长，而迄今很多流感病毒株在组织培养细胞中生长不佳，且其中在组织培养细胞中生长的那些经常不能以产生有效疫苗所需的量生长。本发明人现在公开了当用有限稀释克隆(limiting dilution cloning)使病毒在组织培养细胞中生长时，可产生适于组织培养的分离物。令人惊奇的是，本发明人发现在组织培养细胞(如，Vero细胞)中繁殖时，由通过含胚鸡蛋的羊膜接种得到的病毒的复制能产生可以复制并产生高水平HA的病毒群。所得到的病毒分离物产生的HA效价几乎与用含胚鸡蛋得到的效价相等，而HA效价为疫苗效力的一个重要量度。因此，本发明的一个重要方面涉及生产适于组织培养和适用于流感疫苗(尤其是哺乳动物疫苗)生产的流感病毒分离物的方法。所述方法涉及使用有限稀释克隆来分离和鉴定适于组织培养的病毒。所得到的分离物可经处理以生产疫苗。因此，本发明也涉及生产改进的流感病毒疫苗的方法。
为此，本发明提供选择适于组织培养的流感病毒的方法，该方法通过用有限稀释克隆滴定病毒并重复该过程2次或更多次来达成。在一些方法中，所用组织培养细胞是HEK细胞。可用胰蛋白酶或等同蛋白酶增加病毒进入细胞的效率。其他方法包括滴定胰蛋白酶以确定所使用的胰蛋白酶批次和所用细胞的最佳浓度。对所用的每一种流感病毒以及对具体细胞最佳感染复数(MOI)的测定也有助于组织培养繁殖成功。分离的适于组织培养的病毒可用来根据标准方法生产疫苗。在一些实施方式中，所述疫苗包括佐剂ISCOM的使用。在一些实施方式中，所述疫苗包括佐剂氢氧化铝的使用。当疫苗中包括超过一种的病毒株或分离物时，所述方法可包括以免疫学等量混合两种物质。本发明提供适于组织培养的病毒分离物和由此制成的疫苗的方法和组合物。
I.选择适于组织培养的病毒的方法
用于本发明方法的病毒来源对本发明不重要。例如，病毒可从感染的动物或患者分离得到；作为WHO的种子病毒原液，可从适当的组织(如，ATCC)购买得到；或从科研实验室得到。具体来说，已知CIV引起包括肺炎的严重呼吸道疾病。因此，显示这些症状的狗是可用的来源。分离病毒的适合标本包括：鼻洗涤物/抽出物、鼻咽拭子、咽喉拭子、支气管肺清洗物、气管抽出物、胸膜穿刺液、唾液、泄殖腔涂片和尸体解剖标本。来自活体动物的标本优选早期收集，且在某些情况下，在发病后4天内收集。标本可用适合的运输介质收集，并贮存在该介质中直至使用，或者立即使用。如果贮存，则病毒可在较低温下保存，如在4℃下，以保证其存活力。要从标本中分离流感病毒，可以移除大量污染物(如，通过离心)并将上清液接种到各种稀释倍数的各种细胞。或者，来自动物的病毒最初可在母鸡鸡蛋中生长。可用方法证实在过程中的任何时间点的病毒分离物确实是流感。
可用各种筛选方法证实所需流感病毒存在于制备适于组织培养的分离物的过程中的任何时间。可通过使用任何已知和/或适合的测定流感病毒的测定来筛选病毒。这种测定包括(单独或组合)用如逆遗传学、重配、互补和/或感染的方法进行的病毒复制、定量和/或定性灭活测量(如，通过抗血清)、转录、复制、翻译、病毒体合并、病毒力、HA或NA活性、病毒产率和/或形态发生。
A.组织培养细胞
允许流感病毒生长的任何哺乳动物宿主细胞可用于本发明的方法。通常，所述宿主细胞适合排除外源因子，具有可根据WHO对疫苗生产的要求确认的传代数。很多细胞系可用于分离和繁殖流感病毒。已使用的一些细胞系包括：Vero细胞(猴肾细胞)、MDCK细胞(马-达氏犬肾细胞))、BHK-21细胞(幼仓鼠肾)和BSC(猴肾细胞)和HEK细胞(人胚胎肾细胞)。因此，可用允许流感病毒生长的任何组织培养细胞。适合的细胞包括但不限于：Vero、MDBK、BK21、CV-1和任何哺乳动物胚胎肾细胞(如，HEK)。在一些实施方式中，使用Vero细胞或哺乳动物胚胎肾细胞。在一些实施方式中，使用人胚胎肾细胞(HEK细胞)。
本领域的技术人员熟知用于上述细胞系繁殖的适合组织培养基。这些培养基可含有浓度高达20％v/v的适合血清(如，胎牛血清)。本领域的技术人员应理解，可以使用含有少于20％v/v血清(2-5％v/v)的培养基来繁殖上述细胞系。
B.优化用于细胞的胰蛋白酶
为了在细胞培养物中生长出高效价的病毒原液，可用适量的蛋白酶活化血细胞凝集素，使之内化至细胞内。含有蛋白酶的溶液可直接加入到分离物中，或分离物可稀释至用于疫苗生产的分离物生长的蛋白酶中。所述蛋白酶可用来将病毒稀释至适合生长的MOI。
蛋白酶可为能激活HA内化而不破坏病毒蛋白使其不能生长和/或感染细胞的任何蛋白酶。这些蛋白酶包括但不限于原核生物蛋白酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶和枯草菌蛋白酶(A)，例如，IX型胰蛋白酶。
所用的蛋白酶的量应足以激活病毒，并且对细胞的毒效非常小。毒效可通过鉴定对细胞的损伤特征来分析，如脱离平板或基底、存在细胞碎片、出现死细胞和缺乏活力的细胞。因此，“有效量的胰蛋白酶”是指，当其使用足够时间时，允许胰蛋白酶裂解病毒蛋白，而不使细胞从基底分离或引起其他毒效者。也可使用蛋白酶滴定来增加组织培养中活性病毒的产量。滴定包括确定引起细胞最小损伤程度的胰蛋白酶的最大量。这个量可随所用的组织培养细胞以及蛋白酶批次而变化。因此，可在使用之前滴定新的蛋白酶批次以建立最适水平，且每个蛋白酶可对每种组织培养细胞滴定。滴定涉及用所述蛋白酶分步稀释接种组织培养细胞并将其孵育一段合适的时间。例如，可用蛋白酶半步稀释(10-0.5)。孵育时间随细胞系变化，但通常在约2天和7天之间。蛋白酶水平可用所用细胞的通常孵育时间测定。例如，如果4天孵育对流感病毒最好，则蛋白酶可通过在蛋白酶单独存在下孵育约4天测试。然后可用对细胞没有毒性或毒性非常低的蛋白酶最低倍稀释物。可用于哺乳动物组织培养细胞(如Vero细胞)的胰蛋白酶浓度范围为约0.5μg/mL至约10μg/mL，但更常用约2.5μg/mL培养基。
一旦蛋白酶的最适水平确定，病毒可在含有适量蛋白酶(如，胰蛋白酶)的感染培养基中稀释，以便当病毒加入到细胞培养基时达到最适水平。最适量的胰蛋白酶可用于有限稀释克隆以产生适于组织培养的分离物以及用于所述分离物的生长和收获。
C.有限稀释克隆
典型的病毒培养物是异源的。因此，例如在微滴定板的孔中的单个病毒颗粒在传染性、复制等方面可以变化。系列稀释用于选择培养中的病毒亚群，例如，最适于细胞的亚群。系列稀释涉及系列地稀释病毒培养物直至不含病毒，例如，用来测定最佳MOI。这通常涉及一系列10倍稀释，但可根据病毒效价变化。
有限稀释通常用于鉴定对细胞产生病毒效应的最高稀释倍数。所述病毒效应可为致细胞病变效应(CPE)。致细胞病变效应为流感病毒感染引起的对细胞的任何效应。这些效应包括但不限于：细胞变圆(cell rounding)、退化、脱落、凋亡、活性氧物质(ROS)诱导、细胞变成颗粒状然后成片段化，以及细胞脱离支持物(如组织培养皿)。收获最高倍稀释物的孔。然后将所收获的病毒稀释至不含病毒，并且重复该过程。系列10倍稀释液通常用适合的培养基配制(含或不含胰蛋白酶)，且将0.2mL的每种稀释液加入含有组织培养细胞的平板或微滴定板的孔中，并孵育一段足以鉴定细胞的CPE的时间。因为血清灭活胰蛋白酶，所以培养基通常不含血清。收获含有引起CPE的最高倍稀释物的孔或平板，然后稀释，并且重复该过程。该过程通常重复至少两次，但可重复多达5次。在一些情况下，该过程重复3次。
通过本发明的方法生产的病毒培养物特征在于病毒中HA蛋白序列的同质性。有很多方法可用于测量序列同质性程度。例如，对HA蛋白本身测序或通过对编码这种蛋白的RNA测序。本发明的方法生产的病毒制剂通常含有其中至少70％的HA蛋白具有相同氨基酸序列的病毒。在一些实施方式中为80％，或至少90％的HA蛋白具有相同氨基酸序列。
D.检测流感病毒的方法
可进行检测以证实在本法明方法的过程中任何时间流感病毒的活性和存在。例如，可如下鉴定血细胞凝集。如果病毒具有表面HA蛋白，其可附着在RBC上并使其凝集。如果样品中病毒浓度很高，则当样品与RBC混合时，将形成病毒和RBC晶格。这种现象称为血细胞凝集。这是一种检测使血细胞凝集的病毒(如流感病毒)的存在和效价的简单方法。如果样品中没有足够病毒使RBC血细胞凝集，则它们在孔的底部形成小球。以显示完全血细胞凝集的最高稀释倍数作为终点。病毒效价表达为HA单位(HAU)，为每毫升稀释倍数的倒数。例如，在50μL中1/32倍稀释时孔中有完全血细胞凝集，但在下一个最高稀释倍数的孔中没有，则所述病毒效价为每50μL32HAU或每mL 640HAU。
可用于鉴别和定量流感病毒的其他测定包括CPE测定(如本文所讨论)，Western印迹(Western blot)、ELISA、PCR和用对病毒某些部分(具体来说，为HA抗原)有特异性的抗体和/或探针鉴别流感病毒的其他方法。
II.生长和收获方法
在生产病毒分离物之后，收获所述分离物。可用标准方法。所收获的分离物可储存供以后使用，或可用于用标准方法生产疫苗。当产生最大量病毒时；当产生最大量血细胞凝集素时，如用HA测定方法测量；和/或当细胞裂解时，可收获病毒。
在得到适于组织培养的分离物后，所述分离物可生长并收获。生长和收获适于组织培养的病毒的方法对本发明不重要，并且可用标准方法。然而，在一些实施方式中，病毒在其最适的组织培养细胞中生长。所收获的病毒分离物可储存供以后使用，或可用于用标准方法生产疫苗。可通过在适量的蛋白酶(如胰蛋白酶)中以适合的MOI将病毒加入细胞中，使病毒在适合的组织培养细胞中生长一段足以产生高效价的病毒和/或直至细胞裂解的时间。当产生最大量病毒时；当产生最大量血细胞凝集素时；和/或当细胞裂解时，可收获病毒。本文业已发现，病毒在鸡蛋中(在尿囊腔或通过羊膜接种)的最适预生长可增强病毒在组织培养细胞中的适应性。
A.在鸡蛋中的预生长
鸡蛋培养物的传代显示能促进病毒在组织培养细胞中的适应性。因此，使病毒分离物在含胚母鸡鸡蛋中根据标准技术预生长是可取的。例如，所述病毒注射入尿囊腔或通过9-12天龄的含胚鸡蛋的羊膜，并且使其扩增约三天。然后收集尿囊液或羊膜液，收集的材料可以适合的MOI在组织培养中生长，用于疫苗生产。或者，收集的材料可直接用于有限稀释克隆。已发现，通过羊膜的鸡蛋接种能浓集可复制的病毒，并且在Vero细胞中生长时可以产生高水平的HA蛋白。
B.MOI
本文鉴定出低MOI产生较好和/或较高效价病毒分离物。不受具体理论的限制，人们相信低的MOI减少缺陷病毒颗粒的量，并且产生更有效的感染过程。在一些实施方式中，所用的MOI小于0.01(每100个细胞1个病毒)。在其他实施方式中，MOI小于0.003。在一些实施方式中，MOI小于0.001。MOI可选择在约3至4天中产生高效价病毒和/或裂解细胞的最低MOI。
III.疫苗生产
一旦从适于组织培养的病毒得到所需的分离物，则病毒可用于生产疫苗。已知很多类型的病毒疫苗，包括但不限于减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗和片段疫苗。
A.减毒病毒生产方法
减毒疫苗是已经减毒或改变而不再引起疾病的活的病毒疫苗。这些可通过多种方法生产，例如，在组织培养中生长，重复传代，并且遗传操作突变或去除涉及致病的基因。适于组织培养的分离物可用于用标准方法生产减毒病毒。例如，一个病毒基因和/或蛋白经鉴定涉及致病或涉及疾病表现，则其可被突变或改变以便所述病毒仍能在细胞内感染和复制，但不引起疾病。一个这样的实例是诱变HA1/HA2切割位点。所述适于组织培养的病毒可用任何标准方法减毒，例如，冷适应病毒。
减毒病毒生产之后，可用标准方法制备疫苗(如，本文的方法)。可用标准方法纯化病毒，例如，用尺寸排阻层析。可用标准佐剂和疫苗制剂制备疫苗，如ISCOM、纳米珠、矿物油、植物油、氢氧化铝、皂甙、非离子去污剂、角鲨烯和嵌段共聚物，可单独使用或作为辅助剂组合使用。目前美国和欧洲市售的疫苗不含任何佐剂(活疫苗和死疫苗)，这是疫苗中需要如此高浓度的HA(每病毒株15μg的HA，三价配方含45μg的HA)的部分原因。
B.灭活、亚单位和片段病毒疫苗生产方法
一旦得到所需病毒，可将其用于生产免疫原性组合物，例如，疫苗。“死”疫苗的实例是灭活、片段和亚单位疫苗。这些可用标准方法制备以治疗流感。
例如，亚单位疫苗一般涉及仅分离激活免疫系统的病毒部分。在有流感的情况下，用纯化HA和NA制备亚单位疫苗，但病毒蛋白的任何混合物可用于生产亚单位疫苗。一般来说，病毒蛋白(如HA)从重组病毒形式中提取，并且亚单位疫苗经配制含有来自WHO推荐的病毒株的这些病毒蛋白的混合物。例如，1995-1996年的疫苗含有来自两种A株和一种B株(A/Singapore/6/86(H1N1)；A/Johannesburg/33/94(H3N2)；和B/Beijing/84/93)的HA和NA。对于H3N8 CIV来说，可用H3和/或N8抗原。
一般来说，病毒蛋白从病毒中提取，并且亚单位疫苗经配制含有这些病毒蛋白的混合物。蛋白可用标准方法从适于组织培养的分离物中分离用于亚单位疫苗。或者，蛋白可用重组技术生产。本领域已知生产具体蛋白的技术。
片段疫苗一般涉及用去污剂处理包膜病毒，以使其中的蛋白溶解。在流感病毒的情况下，HA和NA溶解。例如，可用非离子去污剂如Triton X-100生产片段疫苗。
灭活病毒疫苗通过灭活收获的病毒并用已知方法配制来制备，以用作诱发哺乳动物免疫反应的疫苗。灭活步骤、亚单位纯化和/或片段可在尺寸排阻纯化病毒之前或之后进行。例如，灭活疫苗的生产可涉及去除细胞材料、灭活病毒、纯化和溶解病毒包膜。其他实施方式可涉及病毒纯化，然后灭活，例如，用甲醛。
一旦制备，任何疫苗(如，减毒、片段或灭活)可被检测以确定所述病毒和/或疫苗保持相似的抗原性，在哺乳动物中产生血清学反应，和/或提供对抗哺乳动物疾病的保护。
C.收获病毒的进一步加工
1.收获病毒的净化
收获后和/或灭活收获的病毒后，可以通过例如，沉淀去除微载体并通过渗滤浓缩上清液去除细胞材料和其他干扰材料。在组织培养细胞中生长的流感将含有宿主细胞蛋白。可能需要上清液的一些进一步净化。细胞DNA可通过酶处理(如，Benzonase)去除。在最初去除干扰材料之后，病毒可用标准方法灭活。或者，可在通过，如尺寸排阻层析进一步纯化后进行灭活。
2.病毒灭活
流感病毒可以任何方法和用任何试剂灭活。灭活方法对本发明不重要。灭活可发生在污染或干扰材料去除之后。灭活可包括使用任何已知灭活剂。这些灭活剂包括但不限于：UV照射、甲醛、戊二醛、二乙烯亚胺(BEI)和β-丙内酯。在一些实施方式中，用BEI是因为已知其破坏病毒核酸而不破坏病毒蛋白。此外，BEI不受蛋白含量和温度的影响。灭活剂以高至足以灭活溶液中每个病毒颗粒的浓度使用。例如，BEI可以约0.5和10mM之间的终浓度使用，包括但不限于：1.5、3、4、5和6mM，并且包括约1至6和1至3mM的范围。在一实施方式中，BEI以约6mM的浓度使用。BEI通常以约1.5mM的浓度使用并且在37℃下孵育48小时。在CIV的疫苗制备中，BEI可以约0.5和10mM之间，通常为4至8mM，经常为5和7mM之间的终浓度使用。在一个实施方式中，BEI以约6mM的浓度使用。在一些实施方式中，灭活在对灭活剂适合的pH和温度下发生。可选择pH和温度以保证得到的灭活病毒仍然有免疫原性。灭活可在适当的搅拌下进行以保证所述试剂与溶液中所有的病毒颗粒相接触。
灭活后，可用以下方法去除灭活剂，该方法包括但不限于，灭活剂的灭活、灭活剂的沉淀、灭活剂的过滤，以及层析，或这些方法的混合。例如，BEI可通过加入硫代硫酸钠灭活。残留的BEI也可通过尺寸排阻方法从病毒/病毒蛋白分离。一旦确定无害(缺乏活病毒)，病毒溶液可进一步加工以生产疫苗。
3.进一步加工
可进一步加工病毒溶液，例如，以去除污染物，进一步浓缩病毒，以提供较强的免疫反应。进一步加工的一些实例包括用标准方法最初去除细胞材料、去除细胞DNA、浓缩和在佐剂中配制。在组织培养细胞中生长的流感含有宿主细胞蛋白。例如，在人胚胎肾细胞(HEK)中繁殖的流感将含有HEK蛋白，或如果在MDBK或VERO细胞中生长，则分别含有牛或猴蛋白。这些蛋白可用本领域的技术人员已知的方法检测。已知很多去除DNA的方法，包括加入各种已知降解细胞DNA的DNA酶，例如，Benzonase。可进行起始浓缩步骤以提供最适于进一步层析纯化的浓度的病毒溶液。这可用任何标准方法进行，包括但不限于用分子量截留为约100K的膜(如MWCO为100K的聚砜膜)进行超滤。病毒溶液可浓缩至约100倍，包括但不限于90倍、80倍、70倍、60倍、50倍、40倍、30倍、20倍、10倍和5倍。在一些实施方式中，病毒溶液浓缩至约50倍，但更通常包括20倍和30倍。
4.纯化
可用标准方法如密度离心纯化病毒。在一些实施方式中，病毒通过尺寸排阻凝胶层析纯化。使用尺寸排阻的一个优点是产率优于用密度离心纯化。可用得到病毒纯化的任何尺寸排阻凝胶。可用任何标准凝胶，如琼脂糖凝胶(如Sepharose CL-2B)。在一些实施方式中，柱子长度为约70至120cm以得到所需纯化，包括但不限于约80、90、100和110。在其他实施方式中，柱子长度为约80至100cm，例如柱子长度为约90cm。在一些实施方式中，用多个柱子串联可得到所述长度，如两个45cm的柱子或3个30cm的柱子(如，长度为30-32cm，直径为30cm的柱子)。浓缩的病毒可用标准方法上柱，如，所述病毒可以5-10％的柱体积(CV)，通常5-7％CV上柱。然后可以从柱子上收集病毒峰，用标准方法(例如，超滤)进一步浓缩。在一些实施方式中，用总长度为90cm的2至3个柱子串联，聚集最终峰，用超滤浓缩。
5.包膜蛋白溶解
浓缩的病毒峰材料可用标准方法溶解，如用非离子去污剂。可以进行溶解以制备ISCOM配方的材料(见下文)。非离子去污剂的实例包括但不限于壬酰-N-甲基葡萄糖酰胺(Nonanoyl-N-Methylfucamide)(Mega 9)、TritonX-100、辛基葡萄糖苷、毛地黄皂苷、C12E8、Lubrol、Nonidet P-40和Tween(如Tween 20、80或120)。溶解后，病毒可用于生产疫苗，和/或可加入佐剂。例如，对于ISCOM佐剂生产，可加入脂质混合物，以有助于ISCOM形成。所述脂质混合物可包括磷脂酰胆碱和合成胆固醇。在一些实施方式中，所述病毒在室温下边搅拌边用Mega 9破坏，然后可加入脂质混合物(磷脂酰胆碱和胆固醇)，并继续搅拌。
6.佐剂形成
疫苗和/或药物组合物中可加入适合的佐剂。佐剂的实例包括含有油和水的乳液的那些，以及还包含氢氧化铝的那些。在后一种情况下，可使用市售的氢氧化铝，例如，Alhydrogel，(Superfos Biosector，Frederikssund，Denmark)和Rehydrogel(Reheis Inc.)。油和水的乳液通常包含矿物油或可代谢的油(如，植物油、鱼油)。非离子去污剂或表面活性剂可用作乳化剂。乳化剂的实例包括Tween 80/Span 80、Arlecel 80/Tween 80和Montanides(Seppic，Paris，France)。在佐剂乳液的情况下，一般5-25％的体积是油，75-95％的体积是水。在一些实施方式中，佐剂乳液为20％体积的油和80％体积的水。氢氧化铝的量一般为水相的约5％和15％之间。在一些实施方式中，
Figure G2007800513763D00181
是佐剂。
对于一些实施方式，ISCOM用作辅助剂。ISCOM是免疫刺激复合物的首字母缩合词，Morein等人(Nature 308：457-460(1984))描述了该技术。ISCOM是新型疫苗递送系统并且与传统佐剂技术不同。ISCOM可方便地以两种方式中的一种形成。在一些实施方式中，抗原在其配制期间物理上并入结构中。在其他实施方式中，ISCOM-基质(例如，通过Isconova提供)不含抗原，但通过终端使用者在免疫之前与选择的抗原混合。在混合后，抗原在溶液中与ISCOM-基质一起存在，但在物理上不并入结构中。
一般来说，在ISCOM中，纯化抗原基于在关键浓度下Quil A自发形成胶束，并通过疏水/亲水键捕获纯化的免疫原的能力以多聚体形式存在。这些胶束结构大小为35nm并很容易被免疫系统识别。与传统的储存辅助剂不同，ISCOM很快从注射部位清除和引出局部、体液和细胞介导的免疫反应。在具体的实施方式中，ISCOM如下形成。所述病毒用标准方法溶解，如用非离子去污剂(如Mega-9、Triton X-100、辛基葡萄糖苷、毛地黄皂苷、Nonidet P-40、C12E8、Lubrol、Tween-80)。加入脂质混合物以有助于ISCOM形成。所述脂质混合物可包括磷脂酰胆碱和合成胆固醇。在一些实施方式中，所述混合物首先在室温下边搅拌边用非离子去污剂处理，然后可加入脂质混合物(例如，等份数的磷脂酰胆碱和胆固醇)，并继续搅拌。将Quil A(皂苷的纯化糖苷)加至病毒脂质混合物中并继续搅拌。可加入所述Quil A得到最终浓度为约0.01至0.1％的Quil A，包括但不限于0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08和0.09的Quil A。在一些实施方式中，所述最终浓度为约0.05％。去除所述非离子去污剂(例如，通过与醋酸铵渗滤)。ISCOM的基质通过Quil A形成。通过电子显微镜观察，ISCOM粒子的形态学显示典型的笼状结构，大小为约35nm。ISCOM形成时期可用切向流渗滤精简。ISCOM显示了基于Quil A在关键浓度下自发形成胶束和通过捕获纯化抗原的疏水/亲水键的能力呈多聚体形式的纯化抗原。ISCOM的形成可通过电子显微镜证实其已形成的典型笼状结构而证实。ISCOM呈递的免疫反应显示至少比作为凝集膜蛋白胶束单独呈递的相似抗原负荷量的免疫反应好十倍。还发现ISCOM能诱发细胞介导的反应，这在用传统的整个病毒疫苗时未发现。在一些实施方式中，最终浓度为约0.05％。
也可在疫苗和/或药物组合物中加入免疫刺激剂。免疫刺激剂包括：单独使用或组合使用的细胞因子；生长因子；趋化因子；来自淋巴细胞、单核细胞或来自淋巴器官的细胞的细胞培养上清液；植物的细胞制剂和/或提取物；细菌、寄生虫的细胞制剂和/或提取物；或促细胞分裂剂，以及从其他病毒和/或其他来源(如双链RNA、CpG)得到的新型核酸；嵌段共聚物；纳米珠或本领域已知的其他化合物。
佐剂和其他免疫刺激剂的具体实例包括但不限于：溶血卵磷脂；葡萄糖苷(如皂苷和皂苷衍生物，如Quil A或GPI-0100)；阳离子表面活性剂(如DDA)；季铵烃基卤化物(quaternary hydr℃arbon ammonium halogenides)；复合多元醇；聚阴离子和多原子离子；聚丙烯酸，非离子嵌段聚合物(如Pluronic F-127)；和MDP(如，N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-降-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺、N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰基-sn-丙三基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺)。
D.疫苗效力
本领域熟知测定亚单位、减毒、片段和/或灭活病毒疫苗是否与临床分离物或从其中得到的适于组织培养的分离物的病毒维持相似抗原性的方法。这些已知方法包括抗血清或抗体、HA和NA活性和抑制以及DNA筛选(如探针杂交或PCR)的应用，以证实编码抗原决定簇的供者基因在灭活病毒中存在。本领域也熟知鉴别疫苗是否诱导血清学反应的方法，其包括用疫苗免疫待测动物，然后接种致病病毒，并鉴别疾病症状存在还是不存在。因此，流感疫苗效力可在动物中检测，通常用白鼬、小鼠和豚鼠。可用血细胞凝集抑制(HI)或神经氨酸酶抑制(NI)方法检测抗体效价，或检测组织培养物中的病毒中和抗体(微中和检测)，这些方法一般均已知。挑战性研究可提供评估疫苗的重要信息。
适合治疗的药物组合物和/或疫苗包括病毒或病毒亚单位与无菌水性或非水性溶液混合物。生产药物组合物和/或疫苗的方法可包括分离适于组织培养的分离物，生长和纯化病毒分离物，灭活和/或减毒病毒并以适合的效价与生理上可接受的稀释剂和免疫刺激剂混合。或者，病毒蛋白可经纯化以用于亚单位疫苗，并以适量与生理上可接受的稀释剂和免疫刺激剂混合。可纯化足够的病毒，以使得没有可干扰灭活步骤和/或病毒的免疫原性的污染材料或物质。
适合效价的病毒或适合浓度的病毒蛋白可与稀释剂和免疫刺激剂混合。TCID50测量是一种测量病毒效价的方法(感染50％组织培养物剂量)。例如，可用约105至1012的TCID50(基于预灭活效价)的效价，包括但不限于106、107、108、109、1010和1011。任选所述效价可用HA效价分析，并在疫苗中每个病毒可包含约1至30μg的HA，包括但不限于用于佐剂制剂的1至10μg和用于非佐剂疫苗的1至30μg。在一些实施方式中，效价为约15μg。因此，例如，当未加佐剂疫苗中包括3种病毒时，1个成人剂量含有45μgHA(3种病毒株，每一种15μg)的等同物。在其他实施方式中，每株的量可不同(例如，取决于抗原性)，但最终浓度为约1至约60μg HA，包括2、3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50和55μg。在另一个实施方式中，预期佐剂疫苗含有的HA量为约1至30μg，包括2、5、10和20μg。疫苗的体积通常为约50μl和5000μl之间，包括100、500、1000、2000和5000μl。
可用生理上可接受的标准稀释剂，例如，EMEM、Hanks平衡盐溶液和磷酸盐缓冲液(PBS)和生理盐水。
疫苗和/或药物组合物中可加入适合的免疫刺激佐剂。免疫刺激佐剂的实例包括但不限于：单独使用或组合使用的矿物油、植物油、氢氧化铝、皂苷、非离子去污剂、角鲨烯、嵌段共聚物、纳米珠、ISCOM、ISCOM基质或本领域已知的其他化合物。
除了佐剂外，药物组合物中也可包括可用于抗流感的任何适合的抗病毒剂。这些抗病毒剂包括：例如，金刚乙胺(rimantadine)、金刚烷胺(amantadine)、神经氨酸酶抑制剂(如zanamivir和oseltamivir)、γ干扰素、胍、羟基苯并咪唑、干扰素α、干扰素β、缩氨基硫脲(thiosemicarbarzones)、美替沙腙(methisazone)、利福平(rifampin)、利巴韦林(ribavirin)、嘧啶或嘌呤类似物和磷甲酸钠(foscarnet)。
含有多于一种病毒或病毒蛋白株的疫苗可用本发明的方法生产。混合物可免疫原性滴定以提供适当的等同免疫性。免疫原性滴定意指生产的最终产物平分免疫性的不同。例如，如果制备A株和B株混合物，且A株有5倍的免疫原性，则混合株的比例为A株∶B株为1∶5。
IV.疫苗给药
疫苗组合物和/或药物组合物的给药可用于预防性目的。当预防性提供时，组合物在任何流感病毒感染症状明显出现之前提供。组合物的预防性给药用于预防或减弱任何后续感染。药物组合物和/或疫苗可以本领域已知的任何方式给药，包括通过吸入、鼻内(例如用减毒疫苗)、口服或胃肠外给药。胃肠外途径给药的实例包括皮内、肌肉内、静脉内、腹膜内和皮下。在一些实施方式中，疫苗经上臂肌肉内或深层皮下注射给药。对于之前没有接种或没有接触流感(未致敏)的一些儿童来说，第二剂量可间隔2至4周给药。一或多个加强剂疫苗可在最初免疫之后的适合的时间给药。
给药有效量的疫苗和/或药物组合物。有效量是足以取得诸如诱导足够体液或细胞免疫等所需生物学效应的量。这可能取决于疫苗类型、接受者的年龄、性别、健康状况和体重。所需生物效应的实例包括但不限于无症状产生、症状减轻、组织或鼻内分泌物的病毒效价减少、完全防止流感病毒感染和部分防止流感病毒感染。
在一些实施方式中，免疫学上有效量的CIV疫苗为每剂量约100HAU至约1500HAU。组合物通常为每剂量250至750HAU之间。在一个实施方式中，疫苗组合物包括每剂量约500HAU。
当以溶液给药时，所述疫苗可以水溶液、糖浆、酏剂或酊剂的形式制备。这些制剂在本领域已知，并且通过将抗原和其他适合的添加剂溶于适合的溶剂系统中来制备。这些溶剂包括：例如，水、盐水、乙醇、乙二醇、甘油和A1液。适合的添加剂包括经鉴定的染料、香料、甜味剂和抗微生物的防腐剂，如硫汞撒(thimerosal)(乙基汞硫代水杨酸纳)。这些溶液可用标准方法稳定，例如，通过加入部分水解的明胶、山梨醇或细胞培养基，并可用标准方法缓冲，用诸如磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾的试剂。液体制剂也可包括悬浮液和乳液。悬浮液的制备(例如)用胶体磨，乳液的制备(例如)用匀浆器。
V.病毒株和WHO
为了有时间生产足够疫苗原液，必须在流感季节来临之前决定好对于今年的疫苗(冬季用)来说用流感A株和B株的哪一种。有一个世界性的精巧而复杂的流行病学监控系统来帮助这些决定。此外，WHO通常制备用于生产疫苗的种子病毒。
有16种已知HA亚型和9种已知NA亚型。HA和NA蛋白的多种不同组合是可能的。目前仅有一些流感A亚型(即H1N1、H1N2和H3N2)在人群中普遍流行。其他亚型在其他动物种中最常见。例如，在马中致病的H7N7和H3N8病毒，最近显示H3N8也在狗中致病。
已知感染鸟类和人类的禽流感A病毒三种显著亚型为流感A H5-H5感染，如，HPAI H5N1病毒、流感A H7和流感A H9。然而，感染人类并引起流行或大流行的下一批病毒株可来自任何亚型。
可用标准方法得到病毒，例如，从患者样本、美国菌种保藏中心(theAmerican Type Culture Collection)(或其他保藏中心)，或从研究病毒的其他特定实验室得到。在一些实施方式中，病毒从WHO或CDC得到，包括季节性病毒和可能的大流行株。
VI.血清学反应的检测
本领域也熟知鉴别疫苗是否诱导血清学反应的方法。例如，可将免疫原性化合物/疫苗注射入测试动物，并在血清中鉴定抗病毒抗体。本领域熟知鉴别疫苗是否有保护性的方法，该方法包括用疫苗免疫测试动物，然后用致病病毒接种，并鉴别疾病症状存在还是不存在。
可进行血细胞凝集抑制试验以鉴别对血细胞凝集素的血清学反应的存在。可在所有测试血清样品上用火鸡红细胞(RBC)进行血细胞凝集抑制(HAI)测定，例如，通过用已知流感亚型如CIV(H3N8)。简言之，在V形底的96孔微滴定板中的PBS中进行测试血清的两倍系列稀释。将含有4-8HAU/50μl CIV的等体积病毒悬浮液加入到含有测试血清的各孔中，并该板在室温下孵育30分钟。然后加入等体积的0.5％的火鸡RBC悬浮液。然后将该板在室温下孵育30分钟并读取HAI结果。显示HA抑制的血清最高稀释倍数的倒数被认为是测试样品的HAI效价。
测定抗流感病毒抗体存在的其他方法包括神经氨酸酶抑制测试、Western印迹、ELISA、PCR和鉴别流感病毒抗体的其他方法。这些测定是本领域已知的。
VII.实施例
如下实施例提供制备用于生产主要种子的均匀病毒群的流感病毒分离、适应和纯化步骤。这些实施例使用Vero细胞(美国菌种保藏中心，CCL81)，但可用流感病毒适用的任何细胞类型。
实施例1：化学试剂和生物试剂
所用感染培养基含有1L DMEM(Cambrex，目录号04-096)或等同物，贮存在2-7℃；20mL L-谷氨酰胺(Cellgro，目录号25-005-CV)或等同物，贮存在-10℃或更低温度，一旦融解，其可贮存在2-7℃多达4周；以及IX型胰蛋白酶(Sigma产品号T0303，CAS No.9002-07-7)或等同物，分装并冷冻贮存在-5至-30℃。在感染细胞之前新配制感染培养基。
细胞培养基制备如下：1L DMEM、20mL L-谷氨酰胺、50mL胎牛血清(Gibco目录号04-4000DK)或等同物(注意：来自无BSE的国家)。完全培养基制备后在2-7℃下贮存不多于30天。
用于传代细胞的EDTA-胰蛋白酶(Cellgro目录号98-102-CV或等同物)  贮存在-5至-30℃，由制造商指示有效日期。
实施例2：细胞培养物制备
因为用于病毒感染步骤的蛋白酶稀释可根据批次变化，在使用之前滴定新的胰蛋白酶批次以建立最适水平。滴定的实施例是在含有L-谷氨酰胺的DMEM中系列稀释IX型胰蛋白酶，用半对数稀释(10-1、10-1.5、10-2、10-2.5等)。用含有新鲜汇合单层Vero细胞的96孔板，用280μL的PBS将板的每个孔洗涤2次。洗涤后立即按行加入200μL每个稀释倍数的IX型胰蛋白酶至板中。然后将所述板在37℃加或减2℃下在5％CO2中孵育，并在4天后观察细胞。选择那些显示对细胞健康状况没有或很少影响的胰蛋白酶的最低稀释倍数作为胰蛋白酶的适合浓度，以用于流感感染的分离和优化。令人满意和常见的是每个浓度内接种的孔之间很少或没有变化。
对于在Vero细胞中的病毒有限稀释克隆来说，用单层细胞汇合，通常为3-4天龄的细胞；在96孔Falcon微测定板中生长。所述细胞源自ATCCCCL 81并用第132和156代之间的细胞。
Vero细胞从液氮(LN2)中如下制备：从LN2中取出1安瓿Vero细胞并在36℃加或减2℃下水浴融解。将小瓶中的全部内容移至25cm2含有补充10％胎牛血清的10mL细胞培养基的组织培养瓶中。该瓶在36℃加或减2℃下，在4-6％CO2中孵育。1小时后轻轻取出上清液和未附着的细胞，并加入10mL新鲜组织培养基。细胞在36℃加或减2℃下，在4-6％CO2中孵育直至达到90-100％的汇合。
Vero细胞传代如下：用10-20mL PBS将单层细胞洗涤约3分钟。轻轻倒出PBS并换成3mL EDTA-胰蛋白酶(Cellgro，目录号98-102-CV)，将单层细胞孵育约3分钟或直至细胞从瓶中脱离。加入17mL制备的生长培养基(含有FBS)稀释悬浮液，以稀释并中和胰蛋白酶。然后用血细胞计数器进行细胞计数，测定每mL悬浮液中的细胞数。瓶的数量可通过如下计算的悬浮液准备：每mL细胞数(悬浮液)×所需悬浮液的mL数＝每个容器的板的mL数。每mL细胞数(所需)计算悬浮液mL数的总和，悬浮液总mL数必须少于可用的体积。如果不是如此，则铺板细胞密度调节至适应这个情况，然而，应当注意，铺板时细胞密度较低时细胞汇合的时间长度将比较长。容器通常以细胞密度为每mL 1×104至1×105个细胞的细胞悬浮液铺板。细胞孵育3-4天或直至汇合。
这些维持和繁殖Vero细胞的技术可相似地应用于所用的其他细胞系，如马-达氏犬肾(MDCK)和HEK 293。
克隆尤其适于繁殖病毒分离物的HEK 293细胞。这种HEK 293亚克隆称为GT-D22(或D22)，从最初的HEK 293细胞(ATCC号CRL-1573；ATCC批号F-11285，第33代)制剂中分离。亚克隆HEK 293细胞，并根据携带有表达p53基因的5型重组腺病毒的改进产率选择。对有正常形态和足够的生长率的克隆进行胰蛋白酶消化，并以每孔1-2×106个细胞接种以用于进一步分析。最能产生克隆的克隆经受进一步亚克隆和选择。最后选择D22亚克隆。D22亚克隆繁殖流感的能力已用猪流感病毒(SIV)证实。
当研究活的流感病毒时，采取生物安全预防措施。流感是2级病原微生物，并应该遵守CDC-NIH，HS出版号(CDC)88-8395(Biosafety inMicrobiological and Biomedical Laboratories)中对在实验室中操作病毒的建议。
实施例3：有限稀释克隆
有限稀释克隆的稀释管准备和样品稀释如下。在试管架上设置测试管(12×75mm)并贴上标签。每板检测一个样品，每个样品的稀释系列为10-1至10-10。稀释培养基用血清移液器以1.8mL的量分装至每个测试管。第一个试管标为病毒鉴别。其他几个试管准备用作稀释对照，并在稀释期间有误差发生的情况下替换。将样品震荡混合约5秒，然后将200μL样品移至10-1稀释管制备起始稀释物。继续系列稀释至10-10。对于每个稀释，样品震荡混合并在稀释物之间更换移液器吸头。
稀释物如下转入细胞平板中。在使用之前即时从细胞平板中按无菌操作倒出培养基。用12道移液器用280μL无菌PBS将每个孔清洗2-3次。将平板无菌倒空，但不能干涸。将平板标上病毒鉴别、日期和稀释方案。每个稀释物在加至平板之前都短暂震荡。用监控的Finnpipette或其它合适的移液器和1000μL吸头，将每孔200μL样品接种至平板的一行。根据病毒浓度加样。首先，将2行稀释对照加入平板，然后是最高稀释的病毒(10-10)，接着是余下的样品。从10-10至10-1连续加样。
实施例4：病毒制剂
收获病毒并如下评估CPE。孵育4天后，用显微镜检查读取致细胞病变效应(CPE)。用细胞碎片的存在、死细胞和缺乏活性的细胞的出现来鉴定CPE，因为它们是流感病毒的典型现象。偶尔会在起始病毒稀释物中观察到非特异性干扰，因此检查数个稀释物的CPE很重要。当评估CPE时，检查显示CPE的最高倍稀释物的孔中CPE程度很重要。通过选择呈现CPE的最高倍样品稀释物的孔来达成取得最高水平的成功，但在这些孔中，优选呈现最小程度的CPE的那些孔。一旦被选择，通过用单道1000μL移液器吸出液体来收集所述孔中的内容物。通常重复吸出液体，以去除在孔底松散附着的细胞，并帮助打散悬浮液中的细胞或病毒块。然后用收集的液体进行下一轮或几轮的有限稀释克隆，或有时用于接种新鲜单层细胞以生产克隆后种子。一般来说立即连续地进行2至3轮有限稀释克隆以产生均一的病毒群。过程中每一步都分析HA效价，结果显示在表1中。A/Indonesia/05/2005(INDOH5N1)、A/Vietnam/1203/04(VNH5N1)、A/NewCaledonia/20/99(A/NC/20/99(R))和A/Wisconsin/67/05(A/Wis/67/05R)是由CDC提供的重配流感病毒。对于重配病毒，编码表面糖蛋白HA和NA的基因来自流感株(INDOH5N1、VNH5N1、A/New Caledonia/20/99和A/Wis/67/05)，而其余的内部基因来自A/PR/8/34。有限稀释克隆也适用于野生型(未进行PR8重配)流感株A/New Caledonia/20/99(A/NC/20/99)、A/Wisconsin/67/05(A/Wis/67/05)和B/Malaysis/2506/04。病毒通过反向遗传技术产生并在含鸡胚的鸡蛋中传代。鸡蛋材料直接用于在Vero细胞中的有限稀释克隆(用于HA效价的步骤显示在实施例5中)。
表1
＊HA效价表示为单位/mL。＊＊CDC提供的卵胚材料的HA效价。＊＊＊CDC提供的用卵胚材料直接感染的Vero细胞的HA效价。
如上表1所示，细胞培养系统能产生与蛋中产生的病毒效价同样高的病毒效价。另外，最初在Vero细胞上显示不可检测的生长的病毒株VNH5N1和B/Malaysia/2506/04可通过有限稀释克隆而适于Vero细胞上生长。有限稀释克隆之前VNH5N1和B/Malaysia/2506/04在鸡蛋羊膜上的繁殖增强了这些病毒在Vero细胞上生长的适应性。
用SRID(单向辐射免疫扩散)定量血细胞凝集素，在浓缩的Vero细胞培养基中的B/Malaysia/2506/04得到多达132μg/mL的血细胞凝集素蛋白。产率(每mL培养物的HAμg数)较公布的用Vero细胞的已知方法高10倍。目前，一个人疫苗的剂量相当于约15μg/病毒株。因此，可从1mL浓缩的Vero细胞培养基中得到约8-9个剂量。
实施例5：流感通过羊膜传代增强病毒在组织培养细胞上生长的能力
从CDC收到流感病毒VNH5N1-PR8/CDC-RG。这是一种重配病毒，由在PR8病毒骨架上的禽H5N1流感病毒越南株H5和N1基因组成。这种病毒在通过尿囊腔接种的11天龄含胚鸡蛋中扩增。接种后2-3天收集尿囊液，病毒产率为2560血细胞凝集素单位(HAU)/ml。
在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀释尿囊液(～200μl)，并使得汇合单层Vero细胞(ATCC CCL号81，第147代)在36±2℃下吸收60分钟。将含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的25mL DMEM加入培养物中，孵育3天，收集培养上清液。在收集的液体中没有可检测的血细胞凝集素活性。
将含病毒的尿囊液以1∶10,000稀释，将100μl接种至11天龄的含胚鸡蛋的尿囊腔和羊膜上。将鸡蛋在约39℃下孵育三天，分别收集尿囊和羊膜液。
Vero细胞(第132至152代)在含5％胎牛血清的DMEM中以1×104至1×105个细胞/ml、200μl/孔接种至96孔板，并在36±2℃、3-5％CO2下孵育3-4天(直至汇合)。在尿囊液或羊膜液中的VNH5N1病毒在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的DMEM中以10-1至10-10系列稀释。从Vero细胞去除培养基，用280μl的磷酸盐缓冲液清洗每个孔，然后将200μl的每种病毒稀释物接种至8个重复的孔中。平板在36±2℃，3-5％CO2下孵育4天。与尿囊来源病毒的10-7稀释相比，羊膜来源的病毒的致细胞病变效应高达10-9稀释，其可证实羊膜液导致在Vero细胞上生长的病毒效价更高(见表2)。收获来自显示致细胞病变相应的最高稀释倍数的孔的病毒，通过第二次有限稀释进行克隆。再一次，与尿囊来源病毒所见相比，羊膜液来源的病毒显示了在较高稀释倍数下的致细胞病变效应(病毒约多10倍)。
表2
有限稀释传代1
尿囊液病毒
↓稀释致细胞病变效应(+出现)
10-10 - - - - - - - -
10-9 - - - - - - - -
10-8 - - - - - - - -
10-7 + + - + - - + +
10-6 + + + + + + + +
10-5 + + + + + + + +
10-4 + + + + + + + +
10-3 + + + + + + + +
10-2 + + + + + + + +
10-1 + + + + + + + +
A B C D E F G H
收获H7孔中的病毒
羊膜液病毒
↓稀释致细胞病变效应(+出现)
10-10 - - - - - - - -
10-9 - - - - - - + -
10-8 - - - - - - + +
10-7 + + - + + + + +
10-6 + + + + + + + +
10-5 + + + + + + + +
10-4 + + + + + + + +
10-3 + + + + + + + +
10-2 + + + + + + + +
10-1 + + + + + + + +
A B C D E F G H
收获G9孔中的病毒
有限稀释传代2
尿囊液H7克隆
↓稀释致细胞病变效应(+出现)
  10-10   -   -   -  -   -   -   -   -
  10-9   -   -   -  -   -   -   -   -
  10-8   -   -   -  -   -   -   -   -
  10-7   -   -   -  -   -   -   -   -
  10-6   -   -   -  -   -   -   -   -
  10-5   -   -   -  -   -   -   -   -
  10-4   -   -   -  -   -   +   -   -
  10-3   +   +   +  +   +   +   +   +
  10-2   +   +   +  +   +   +   +   +
  10-1   +   +   +  +   +   +   +   +
  A   B   C  D   E   F   G   H
收获H3孔中的病毒
羊膜G9克隆
↓稀释致细胞病变效应(+出现)
  10-10  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-9  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-8  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-7  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-6  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-5  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-4  +   +   +   +   +   +   +   +
  10-3  +   +   +   +   +   +   +   +
  10-2  +   +   +   +   +   +   +   +
  10-1  +   +   +   +   +   +   +   +
 A   B   C   D   E   F   G   H
收获G4孔中的病毒
有限稀释传代3
尿囊H7H3克隆
↓稀释致细胞病变效应(+出现)
  10-10  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-9  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-8  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-7  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-6  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-5  -   -   -   -   -   -   -   -
  10-4  -   +   +   -   +   +   +   +
  10-3  +   +   +   +   +   +   +   +
  10-2  +   +   +   +   +   +   +   +
  10-1  +   +   +   +   +   +   +   +
 A   B   C   D   E   F   G   H
收获B4和F4孔中的病毒
羊膜G9G4克隆
↓稀释致细胞病变效应(+出现)
  10-10  -  -  -  -  -  -  -  -
  10-9  -  -  -  -  -  -  -  -
  10-8  -  -  -  -  -  -  -  -
  10-7  -  -  -  -  -  -  -  -
  10-6  -  -  -  -  -  -  -  -
  10-5  -  -  -  -  -  -  -  -
  10-4  +  +  +  +  +  +  +  +
  10-3  +  +  +  +  +  +  +  +
  10-2  +  +  +  +  +  +  +  +
  10-1  +  +  +  +  +  +  +  +
收获C5和G5孔中的病毒
表2中的流感克隆在列名为A-H和行1-10(稀释系列分别为10-1至10-10)结合的基础上鉴定。例如，克隆名为B4代表从第B列和第4行发现的孔中收获的病毒(10-4稀释)。
从第三次有限稀释收获的病毒(～100μl)在含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的5mL DMEM中稀释并接种在汇合的Vero细胞上(第132-152代)，并在36±2℃下孵育60分钟。吸收后加入含有1.25μg/ml IX型胰蛋白酶的45mL DMEM，在36±2℃下孵育培养物四天。检测收获的培养物上清液的血细胞凝集素，从羊膜扩增的病毒得来的两种克隆得到四至八倍高的HA产率(见表3)。
表3
病毒来源 克隆名称 产率(HAU/ml)
尿囊液 H7H3F4 320
H7H3B4 160
羊膜液 G9G4C5 1280
G9G4G5 1280
G9G4C5病毒随后通过在滚动瓶中(得到5120HAU/ml)和在5L生物反应器中(得到7680HAU/ml)的Vero细胞中生长来扩增。
用B型流感病毒B/Malaysia/2506/04可得到相似结果。当得自尿囊液的病毒在Vero细胞中繁殖时，这种病毒也不能产生任何可测的血细胞凝集素。然而，来源于羊膜的病毒扩增在两次有限稀释克隆后得到640HAU/ml，并在5升生物反应器中扩增后得到5120HAU/ml。
实施例6：血细胞凝集素定量
本步骤的目的是在终产物中的病毒液中定量流感病毒血细胞凝集素活性。
所用的材料包括：PBS、Cambrex、517-16Q或等同物；Alsevers溶液、E8085或等同物；在Alsevers溶液中的新鲜公鸡红细胞(1∶1比例)。使其在Alsevers中过夜以稳定受体。洗涤2次并以在PBS中的10％悬浮液贮存，或以在Alsevers中的50％悬浮液贮存。用4天之内的采集样品；微滴定板，Falcon U-底平板，目录号3911或等同物；8道微量移液器5-50μL或等同物；离心机Beckman TJ-6或等同物；20-200μL微量移液器或等同物；一次性200μL移液器吸头；已知效价的阳性对照病毒；灭活抗原。贮存在2-7℃并在测试当天使用。
A.制备标准化的在PBS中的0.5％的公鸡红细胞(rRBC)悬浮液，这通过首先使得rRBC溶液与室温平衡(15-30℃)达成。从采集日起公鸡RBC在Alseveres中有效期为4天。将在Alsevers中的足够体积的rRBC转移到50mL锥形离心管中。用PBS或Alsevers注入离心管至45mL刻度处并且通过翻转离心管数次来混合，然后在4℃下以400×g离心10分钟，以此洗涤rRBC。用移液器移除上清液。如果上清液中有任何溶血现象，则重复该洗涤步骤多达三次。最后的洗涤之后，将0.25mL聚集的公鸡RBC加入49.75mL PBS中并翻转混合。将细胞悬浮液标上制备日期、所用PBS批号和在PBS中的0.5％公鸡红细胞，并贮存在2-7℃(最长贮存时间为4天)。
B.确定测试样品材料所需的微滴定板数量。用两行分别为1∶2和1∶3的稀释方案测试所有测试样品。也用以1∶2稀释方案的两行阳性对照病毒和两行PBS对照。其他样品根据需要测试。用永久黑色记号笔标记微滴定板上的行名。下表2所示为一个实例。
表2：微滴定板
Figure G2007800513763D00341
在微滴定板的每个孔中加入50μL的PBS。另外在用1∶3稀释方案的那些行和PBS对照行的第一个孔中再加入50μL的PBS。每个微滴定板完成从加样点直至加入RBC完成，然之后再继续进行下一个微滴定板。将50μL样品和阳性对照病毒加入到所称的指定行的第一个孔中加入50μL样品和阳性对照病毒。样品系列两倍稀释用多道移液器制备，转移50μL等分样品。将适合的吸头无菌地安装至多道移液器，以确保将移液量设定为50μL。通过抽吸和排出材料至少七次来混合一列的孔的内容物。丢弃用于混合的吸头。安装更多吸头，将每孔中50μL材料转移至下一列的孔中。重复这些步骤直至所有行按顺序稀释。确保从微滴定板的第十二行移除50μL。用多道移液器将50μl的0.5％rRBC悬浮液移送至每个孔中。rRBC悬浮液从最高稀释的孔至最低稀释的孔中加入。轻轻摇动每个板以混合其中的内容物。在微滴定板顶端放上盖子，并将板堆起来，在室温下(大约20-25℃)孵育45-60分钟。
孵育阶段之后，将平板放置在酶标仪上读取并测定PBS对照孔是否满足要求(PBS孔不应显示任何血细胞凝集现象)。也进行定性测定。rRBC必须设定为没有任何防护的完全按钮(complete button)。防护反应分散rRBC。如果PBS对照孔满足要求，则其他孔根据血细胞凝集评分。如果PBS对照孔不满足要求，则测试无效，重复测试。将血细胞凝集结果记录为阳性(+)(有血细胞凝集)、部分(+/-)和阴性(0)。阳性反应表明rRBC完全防护或细胞全部分散。阴性反应表明显示“+/-”的rRBC孔形成的完全按钮(total button)，为了端点计算的目的认为其是阴性。对每个稀释(即1∶2和1∶3)的每个重复鉴定凝集发生(没有按钮(no button))的最高稀释倍数，并且其效价计算为显示完全凝集的最后稀释倍数的倒数。鉴定测定的样品和阳性对照病毒的效价水平。测定每组重复稀释倍数的端点效价的数学平均值。也测定每0.5mL(50μL)样品、PBS和阳性对照病毒的HA单位。将0.05mL数值乘以20计算得到每1mL的HA单位。
按如下计算：对每一个1∶2和1∶3的测试样品稀释，记录重复样品的数学平均值。记录最高效价。进行HA/0.05mL×20＝HA/1mL相乘。记录测试停止日期和每1mL(病毒液)的HA单位的结果或每剂量(终产物)的HA单位结果。母液或终产物的有效测试含有在最低稀释倍数下的完全凝集(没有按钮(no button))和最高稀释倍数下的不凝集(按钮(button))。阳性对照组应在所建立的范围内。所列参数之外的效价范围组成“未测试”或无效测试，应在无偏差条件下重复实验。
实施例7：疫苗生产
病毒株是WHO、CDC或其他政府组织命名的大流行株或季节性株。为了验证人疫苗生产过程，使用CDC提供的流感病毒重配VNH5N1-PR8/CDC-RG参考株。用磷酸盐缓冲液作为疫苗制备的稀释剂，ISCOM作为佐剂。用等份数的胆固醇和磷脂酰胆碱的脂质混合物来促进ISCOM形成中的亲水/疏水混合过程。通过渗滤去除用于破坏病毒的非离子去污剂。ISCOM的形成经电子显微镜证实。使用二乙烯亚胺(BEI)来灭活病毒，然后用硫代硫酸钠中和BEI。下面的步骤1-19更详细地说明所述过程。
在Vero(非洲绿猴肾)中细胞生产流感株，用氮丙啶化合物二乙烯亚胺(BEI)灭活，浓缩，纯化，并用过滤和凝胶层析纯化。用含有Quil A的佐剂和脂质混合物配制病毒以制备药物产品。
步骤1A-Vero细胞从工作细胞库(WCB)复苏Vero细胞。传代数限制在主细胞库(MCB)的20代，从主细胞库(MCB)开始。融解1安瓿来自液氮中的WCB，以4-5×104个细胞/cm2在25cm2 Nunc瓶中在含有20％v/v经照射的来源于新西兰或澳大利亚的胎牛血清、4mM L-谷氨酰胺(一般地)的Dulbecco的改良极限必需培养基(Modified Minimum Essentialmedium，DMEM)中接种。在36℃加或减2℃下孵育所述瓶，约1小时后去除上清液和未附着的细胞，用新鲜培养基重新加入瓶中并如前孵育。
步骤2A-用胰蛋白酶/EDTA溶液收获汇合单层细胞，然后将细胞重新接种到更多的静止瓶或滚动瓶中继续细胞扩增。可用微载体以20-30g/L在生物反应器中进行进一步扩增。
步骤3A-当在生物反应器或滚动瓶中得到培养底物的所需产物体积时，用Dulbecco的改良极限必需培养基(DMEM)洗涤细胞两次以去除灭活感染培养基中的胰蛋白酶的残留血清。
步骤1B-独立制备工作病毒种(WVS)，并在大量生产之前冷冻。融解并在含有IX型猪胰蛋白酶的病毒感染培养基中稀释贮存在-70℃的主要种子病毒或工作种子病毒(MSV+1)，以得到所需MOI。将预定体积接种到滚动瓶中或生物反应器中的汇合Vero细胞单层，并在36℃加或减2℃下孵育，一般孵育40-72小时，直至鉴定高达100％致细胞病变效应(CPE)。收获病毒并在-50℃或更低温下贮存。
步骤4-融解工作种子病毒(不高于MSV+2代)并在含有0.5-5.0μg/mL的IX型猪胰蛋白酶的病毒感染培养基中稀释，以得到所需感染复数。在培养基中用胰蛋白酶有助于贴壁和病毒对细胞的穿透。
步骤4A-用生物反应器生产流感病毒。用SoloHill Plastic Plus微载体以30g/L的密度制备5升生物反应器。在加入含5％v/v经照射的来源于新西兰或澳大利亚的胎牛血清和4mM L-谷氨酰胺的Dulbecco’s改良极限必需培养基(DMEM)中以2×105个Vero细胞/mL接种生物反应器，并在36℃加或减2℃下孵育。细胞汇合达到80-100％后，静置含Vero细胞的微载体并洗涤两次，每次洗涤用2升不含血清的DMEM。将含有2.5μg/mL IX型胰蛋白酶的感染培养基加入到生物反应器中。病毒种子(例如VNH5N1)也以0.0001-0.0003MOI加入到生物反应器中。病毒制备进行5天。每天对生物反应器取样，用于CPE观察和HA滴定。CPE达到80-100％后收获病毒。
步骤5-在收获的病毒中加入二乙烯亚胺(BEI)，得到1.5mM的终浓度，在36℃加或减2℃和pH7.3加或减0.3下维持1小时(边搅拌)。
步骤6-完成步骤5后，将收获物转移到第二个瓶中，并在36℃±2℃下进行灭活步骤，持续48小时(边搅拌)。这段时间后加入硫代硫酸钠至终浓度为3mM，以中和任何残留BEI。
步骤7-将培养物通过7μ和1μ过滤器净化并贮存在2℃-8℃待测安全清除率。安全测试需10天进行。
步骤8-用分子量截留(MWCO)为100K的聚砜膜，用切向流超滤系统浓缩抗原。得到高达约50倍浓缩物。
步骤9-将所得到的浓缩培养液在适合的缓冲液中平衡，用DNA酶(Benzonase)处理以降解细胞DNA。
步骤10-用尺寸排阻凝胶层析纯化浓缩物。目前使用的凝胶是交联琼脂糖(CL-2B，Pharmacia)。柱子长度为90cm以得到所需分离。CL-2B是一种“软”胶，其依靠柱壁的支持。一般90cm长度可用2×45cm或3×30cm(如，高30-32cm，直径30cm)柱串联达到。浓缩病毒以柱体积的约5-7％上柱。
步骤11-用100K MWCO聚砜膜进行实验室小型切向流超滤来重新浓缩病毒峰材料。
步骤12-通过加入5ml 10％(w/v)的去污剂(壬酰-N-甲基葡萄糖酰胺(Nonanoyl-N-Methylglucamide))Mega 9溶液至200ml抗原溶液中来溶解重新浓缩的病毒峰材料。将溶液在20-25℃下，在玻璃容器中边进行磁力搅拌边缓慢混合1小时。
步骤13-以每20mL重新浓缩的病毒峰加入50μl脂质混合物。所述脂质混合物含有10mg/mL鸡蛋源的磷脂酰胆碱和胆固醇。在20-25℃下继续搅拌，确保脂质在重新浓缩的病毒中平均分布。加入Quil A(从10％w/v的贮存溶液中得到)使得终浓度为0.05％。将溶液在20-25℃下搅拌约30分钟。
步骤14-用50mM醋酸铵通过渗滤从混合物中去除Mega 9去污剂。这使用有100K MWCO聚砜膜的实验室小型切向流超滤系统来进行。所用醋酸铵的体积最少约为10倍重新浓缩的病毒峰混合物的体积。通过平衡加入和渗透流动以维持全程定容来达到渗滤。去污剂干扰ISCOM形成。电子显微镜证实典型笼状结构形成。
步骤15-重新浓缩ISCOM作为渗滤的最后一步。
步骤16-满意的QC释放后，配制数批ISCOM以制备每1mL剂量含1至20μg人流感HA的疫苗。用磷酸盐缓冲液(PBS)作为稀释剂。
步骤17-在A级条件下将共混的疫苗装入单剂量的最终容器中。取样检测无菌性、实验室动物中的安全、可提取体积和视觉外观。给疫苗贴上标签并堆放，在2℃至7℃下隔离放置。
步骤18-最后QA完成后，将产品释放进行成品冷藏(2℃至7℃)待派送。
实施例8：源自Vero细胞的疫苗在白鼬中效力
评估源自Vero得到的流感疫苗对血清转变白鼬的能力。基于2006-2007季节性流感株(A/NC/20/99、A/Wis/67/05的两个PR8重配株和B/Malaysia，都得自CDC)的三价人流感疫苗在有限稀释克隆后在Vero细胞中生产。将所得到的疫苗，“SPflu0607”(含或不含ISCOM佐剂)，注射入4-6月龄雌性白鼬的左后腿。市售的人流感疫苗
Figure G2007800513763D00391
(Sanofi-Pasteur生产)和
Figure G2007800513763D00392
(Chiron生产)作为对照比较与SPflu0607一起检测。用单辐射免疫扩散(SRID)测量疫苗中的血细胞凝集素(HA)蛋白的量。通过血细胞凝集素抑制(HI)测量白鼬的血清转变的白鼬的血细胞凝集抑制(HI)。认为大于或等于1∶40的HI效价是阳性的。参见表3。
表3
GMT＝几何平均抗体效价
％阳性＝HI抗体水平≥1∶40的动物百分比
以上结果表明Vero细胞源的疫苗与市售鸡蛋源的疫苗相当。
实施例9：制备CIV疫苗的犬流感病毒繁殖方法
从病犬的鼻分泌物中分离犬流感。取鼻拭子并放置在含庆大霉素和两性霉素的2mL组织培养基中。将0.8mL所得拭子材料接种到在含有1.3μg/mL IX型胰蛋白酶的10mL DMEM组织培养基中的汇合马-达氏犬肾(MDCK)细胞中，并在36±2℃下孵育2天。通过倒出培养基，收获培养瓶，用标准抗血清通过美国兽医服务实验室(National Veterinary Serviceslaboratory)用标准抗血清鉴定病毒为H3N8。MDCK传代病毒含每ml 160血细胞凝集素单位。通过在96孔板中的汇合MDCK细胞上接种10倍系列稀释，并收获显示致细胞病变效应的最高稀释倍数的单个孔(组织培养基是含1.3μg/mL IX型胰蛋白酶的DMEM)，以克隆病毒。重复此过程两次。然后将所述克隆在75cm2瓶中的MDCK细胞上扩增。生成的病毒(第4代)产率为每ml 640血细胞凝集素单位。然后通过所述病毒用300mL含0.8μg/mL IX型胰蛋白酶的DMEM，通过将0.23MOI接种至1050cm2滚动瓶中的汇合单层细胞上，在马-达氏牛肾细胞上传代。所述将滚动瓶在36±2℃下孵育3天。收获的病毒产率为2560HAU/ml。因为在MDBK上的HA产率增加，这种细胞系被选为按比例增加扩增用于疫苗制备的病毒。所述病毒在生物反应器中繁殖。以3.0×105个细胞/mL在5L生物反应器中接种以5g/L附着Cytodex III微载体的MDBK细胞，所述细胞以5g/L附着Cytodex III微载体。细胞在36±2℃下在含5％胎牛血清且没有抗体的DMEM中生长4天。安置静置微载体后，去除90％的培养基，以用不含血清的DMEM替换。加入IX型胰蛋白酶至最后的5,000mL中的浓度为10μg/mL。所述细胞用0.01MOI的病毒感染。将病毒与微载体上的MDBK细胞一起在36±2℃下孵育2天，然后收获上清液。得到的病毒产率为10,240HAU/ml。
实施例10：在鸡蛋中未传代的临床分离物的有限稀释克隆产生均一群 和改进的TCID50/mL和HA效价
犬流感病毒H3N8(野生型)从诊断实验室得到并从鼻拭子分离。在收到之后处理鼻拭子，并将其用于接种含有汇合单层MDCK细胞的25cm2培养瓶。感染培养基由以下成分组成：DMEM、4mM L-谷氨酰胺/ml、1.3μg/mlIX型和庆大霉素。将培养瓶在36±2℃和3-5％CO2下孵育，并在CPE开始时收获。在收获液中进行HA测定，其结果是160HAU/ml和TCID50/ml效价为7.94。
MDCK细胞在含5％胎牛血清的DMEM中以1×104至1×105个细胞/ml，200μl/孔种在96孔板中，并在36±2℃，3-5％CO2下孵育3-4天(直至汇合)。在这部分按指定稀释CIV H3N8病毒：有限稀释第1轮。在含有1.3μg/mL IX型胰蛋白酶、4mM L-谷氨酰胺和庆大霉素的DMEM中进行稀释。从MDCK细胞中去除培养基，用280μl磷酸盐缓冲液清洗孔，然后将200μl的每种病毒稀释接种至8个重复孔中。平板在36±2℃，3-5％CO2下孵育4天。进行两轮有限稀释克隆，有限稀释第2轮紧接着有限稀释第1轮。所述过程产生的病毒分离物能产生较高TCID50/ml和血细胞凝集效价。收获显示最低程度致细胞病变效应的较高稀释倍数的孔，第二次用有限稀释克隆。
有限稀释第1轮
将第1代材料滴定得到7.5 TCID50/ml的结果。用这个值稀释病毒产生5个样品。
A.10-4
B.10-5
C10病毒颗粒/孔(10-6.5)
D.3病毒颗粒/孔(10-7.02)
E.1病毒颗粒/孔(10-7.5)
Figure G2007800513763D00431
收获孔A11以准备有限稀释克隆第2轮。
有限稀释第2轮
Figure G2007800513763D00432
收获孔A5的病毒
使用从有限稀释克隆(～200μl)第二轮中收获的病毒接种含汇合单层MDCK细胞和补充1.3μg/mL IX型胰蛋白酶、4mM L-谷氨酰胺/ml和25μg/ml庆大霉素的DMEM的75cm2瓶中。滴定收获的培养上清液以测定TCID50/ml和血细胞凝集效价(见表4)。
表4
病毒传代 TCID50/ml HAU/ml
现场分离物的第1代 7.94 160HAU/ml
第4代，主要种子之前 7.69 640HAU/ml
在实验室实验中进行免疫原性试验，病毒在5L生物反应器中在MDBK细胞上生长，得到的血细胞凝集效价为10,240HAU/ml。
实施例11：灭活犬流感疫苗对狗的效力
犬流感病毒(CIV)血清型H3N8在狗中引起严重的呼吸道疾病。然而，目前没有抗CIV的有效疫苗可用。本研究的目的是评估通过有限稀释和CIV在组织培养细胞中繁殖制备的灭活CIV疫苗在预防由有毒CIV感染诱导的临床疾病和肺损伤中的效力。所述疫苗由二乙烯亚胺(BEI)灭活的CIV抗原辅以
Figure G2007800513763D00441
佐剂构成，抗原输入水平为每剂量500血细胞凝集单位(HAU)。肌肉注射此疫苗接种一组8只7周龄CIV血清阴性狗，并在初次接种后21天给予加强剂。加强接种后两周，与未接种的对照相比，接种狗显示显著较高水平的HA抑制抗体效价，未接种的对照狗显示有疫苗的免疫反应刺激。未接种的对照和接种狗在加强接种后16天均用异种有毒CIV分离物感染，并在感染后10天内每天监测临床征象、直肠温度和鼻CIV释出。所有对照狗(100％)发展的临床征象包括表明感染病毒毒性的眼和鼻排出物、喷嚏和咳嗽。与对照组(中值评分＝6.8，p＝0.0051)相比，接种组显示明显较低的临床征象(中值评分＝4.3)。在接种组中仅有一只狗(12.5％)显示鼻CIV释出，且其仅存在一天，然而，与接种组相比，对照组的所有狗(100％)有显著较高的病毒释出(p＝0.0003)。在对照组中，感染后病毒释出持续7天。感染后10天所有狗施以无痛致死，进行尸体剖检评估肺损伤。对照组中所有狗(100％)显示不同程度的肺实变，然而，接种组仅有一只(12.5％)显示轻度肺实变。当与接种狗(中值评分＝0，p＝0.0005)对比时，对照狗肺评分明显较高(中值评分＝4.9)。这些结果明确证明在此研究中的所测疫苗制剂通过明显减少临床征象，降低病毒释出和预防CIV诱导的肺实变而保护狗抗CIV感染。
研究综述
本研究的目的是测试-辅助的CIV疫苗制剂在狗中预防CIV感染的效力。
起初使狗适应环境8天。对于测试组，第一次接种在第0天进行，加强剂在第21天进行。对照组不接种。在第37天两组狗均用CIV感染。在研究全程按如下所述监测和观察狗。狗在感染后10天施以无痛致死，进行尸体剖检。
测试动物
测试动物在第0天平均约48.25天龄。对照组有8只狗，测试组有8只狗。平均重量为1.8kg。研究中所用的狗没有呼吸道感染病史或CIV接种史。为了证实狗为CIV抗体阴性(HA效价＜10)，在第-1天取血样，通过血细胞凝集抑制测定检测。在第-1天也取鼻拭子以确保狗在接种时没有CIV感染。
预接种监测
为了证实狗为CIV抗体阴性，在给药第一次疫苗前一天取所有狗的血样，并收集到抽空的血清分离管中。在同一天取鼻拭子以证实狗没有CIV感染。
第一次接种之前两天给狗体检，评估狗的大致健康状况。从最初接种和加强接种前两天至接种日进行临床评估和直肠温度检测。
接种
在此研究中用犬流感病毒疫苗CIV H3N8-
Figure G2007800513763D00452
犬流感病毒(H3N8)从有严重呼吸道疾病的狗中分离。用MCS+19代水平(即主细胞库中第19代以后)的马-达氏牛肾(MDBK)-KC细胞，繁殖CIV H3N8。然后在36℃下用6mM BEI灭活病毒60小时。用60mM硫代硫酸钠中和BEI。
用于本研究的疫苗以用于等分成800个1mL剂量的800mL原液制备。800mL溶液如表5中制备。
表5
Figure G2007800513763D00461
灭活的CIV H3N8病毒在生理盐水中稀释，然后辅以氢氧化铝。水相中的残留成分加入辅助的抗原中。分别制备油相，然后在10分钟内加至水相中，并持续混合1小时。用Silverson匀化器匀化系列稀释30分钟。
在室温下平衡贮存在2-7℃的CIV疫苗小瓶至少30分钟。将疫苗装入3mL注射器(每个注射器1mL)，用于免疫。在第0天将疫苗的第一剂肌肉内注射至右后腿，在第21天将第二剂肌肉内给药至左后腿。
接种后步骤
在每次接种后3-6小时内对所有的狗进行完全临床评估以测量任何直接反应，完全临床评估包括直肠温度和注射部位观察。在每次接种后持续7天，每天进行临床评估，并根据以下临床评估指南评分。在第20天和36天取血样，并用所述血清样品通过血细胞凝集抑制测量CIV抗体。
预感染步骤
在感染之前2天(第35和36天)和感染当天(第37天)给予感染之前对所有的狗进行临床评估并记录直肠温度。根据临床评估指南给临床征象评分。
感染
感染材料：从MDCK细胞分离CIV14-06A病毒，并用其感染接种的狗，这种病毒最初是从经受犬呼吸道疾病的狗中现场收集的样品中分离。感染病毒的平均效价是7.7 Log10TCID50/mL。在感染当天，感染材料以1∶4在无菌、冷的Dulbecco极限必需培养基(DMEM)中稀释至每只狗7.4Log10TCID50的目标感染剂量。
给予感染：在第37天给予所有的狗感染。四只狗放在Plexiglas小间，并且大约20分钟内用8mL感染病毒(2mL/狗)在生成喷雾剂。将狗暴露在喷雾剂中共40分钟。
感染后监测
感染后每天对每只狗记录直肠温度和进行临床评估，持续10天。感染后每天对每只狗收集鼻拭子，持续10天。每次收集后，鼻拭子按如下所述进行处理和滴定。在感染后第10天将血样收集在排空的血清分离管中，紧接着进行无痛致死。
尸体剖检
所有感染狗在感染后第10天(第47天)用AVMA认证的方法(氯胺酮鸡尾酒和Beuthanasia-D)无痛处死，进行尸体剖检。无痛处死后立即进行肺的评估。评估可见的实变区，并按每个肺叶的实变百分比评分。百分比转变为称重评分，计算每只狗的总评分。在尸体剖检中，收集肺组织，用于病毒分离和滴定，以及组织病理学用途。
病毒滴定
进行病毒效价的血细胞凝集(HA)测定。将病毒在V底微滴定板中系列两倍稀释，并将等体积0.5％的火鸡红细胞(RBC)悬浮液加至病毒悬浮液中。将板放置在室温下孵育30分钟，读取HA结果。显示HA活性的病毒最高稀释倍数称为1HA单位。所有测定重复进行两次，并测量HA效价端点。
通过在MDCK细胞中滴定测定感染材料、鼻拭子和肺组织中的病毒效价，以证实在给予感染的狗中感染材料的效力并测量病毒释出。MDCK细胞接种在96孔组织培养板中2天，然后用10倍系列稀释病毒悬浮液或从肺组织和鼻拭子制备的样品接种。将板在36±2℃的温度和5％CO2下孵育。感染七天后，观察板的致细胞病变效应(CPE)，用Spearman-Karber方法计算50％感染率端点。病毒效价以Log10TCID50/mL表示。
血清学反应检测
通过血细胞凝集抑制(HAI)测定来测量狗血清样品中的抗CIV抗体。简言之，在V底96孔微滴定板中用PBS进行测试血清的系列两倍稀释。在含测试血清的每个孔中加入含4-8HAU的CIV25-06B的等体积病毒悬浮液，将板在室温下孵育30分钟，使抗原抗体发生反应。然后，加入等体积的0.5％火鸡RBC悬浮液。将板在室温下孵育30分钟，读取HAI结果。显示HA抑制的血清最高稀释倍数的倒数被认为是测试样品的HAI效价。所有测试重复进行两次，并测定端点HAI效价。
结果：临床评分
从感染前两天至感染后10天，每天监测所有狗的临床征象，包括眼排出物、鼻排出物、喷嚏、咳嗽、呼吸困难和抑郁。对感染后10天的眼排出物、鼻排出物、喷嚏、咳嗽、抑郁和呼吸困难的每天临床评分求和，得到每只狗的临床评分总数。用Wilcoxon Exact秩和检验(Wilcoxon Exact RankSum Test)对比接种组和对照组的临床评分总数，并计算双侧P值。
对照组和接种组的狗从感染后2天起均显示一定范围的临床征象(图1)。对照组的所有8只狗(100％)显示不同程度的咳嗽，在10天的感染后观察期内持续多达5天。另一方面，接种组仅有2只狗(25％)在整个10天的感染后观察期内显示轻微咳嗽，并仅观察到1天。咳嗽是对照组的狗显示的主要征象。相反，接种组的狗显示的主要临床征象仅仅是轻微的眼排出物。与接种狗(中值评分＝4.3)相比对照组的临床评分(中值评分＝6.8)明显较高(p＝0.0051)。这些数据表明CIV疫苗保护狗预防CIV诱导的临床征象。
结果：鼻病毒释出
通过在感染前一天(第-1天)，然后从感染后第1天至第10天收集和处理鼻拭子，以监测所有狗的鼻病毒脱落。测定鼻拭子的病毒效价(Log10TCID50/mL)并对时间作图。用Wilcoxon Exact秩和检验比较对照组和接种组曲线下的面积。将每组的平均病毒效价(表示为Log10 TCID50/mL)对感染后天数作图(图2)。
从感染后第1天的鼻分泌物中，对照组开始释出病毒。所述病毒释出在感染后第5天达到高峰(1.25 Log10 TCID50/mL)，然后在第7天急骤下降(图2)。在10天的感染后观察期内，对照组中所有的狗(100％)在一或多个时间点为病毒释出阳性。另一方面，接种组仅有一只狗(ID号CXTAMM)(12.5％)在鼻分泌物中有病毒释出，并仅持续一天(第3天)。与接种狗相比，未接种的对照狗显示明显较高的鼻病毒释出(p＝0.0003)。这些结果清楚表明所述CIV疫苗通过接种狗显著抑制鼻病毒释出。
结果：血清学反应
在初次接种和加强接种后计算从HAI测定所得的计算几何平均抗体效价(GMT)。记录免疫之间的效价增加倍数。用Wilcoxon Exact秩和检验比较对照组和接种组之间的抗体效价。在研究中登记的所有16只狗在初次接种时均为健康且血清阴性(即，CIV抗体阴性)(HAI效价＜10)。在接种前一天(第-1天)收集的鼻拭子证实所有的狗均没有鼻CIV释出。对照狗在感染时保持血清阴性。
将HAI抗体效价制成表格，并比较对照组和接种组。在初次接种后所有接种狗产生可测水平的抗体效价。HAI抗体效价范围为10和40之间，且GMT为22，当与对照狗相比时，这些效价是显著的(p＝0.0070)。第二次接种加强了抗体效价六倍(GMT＝135)，这明显高于对照组(p＝0.0002)。大部分显示HAI效价为160(75％)的狗的抗体效价范围为80和160之间。所有对照狗保持无CIV抗体直至感染时(HAI效价＜10)。感染后，接种狗的抗体效价达到非常高的水平(GMT＝546)，证明了疫苗提供在诱导免疫系统抗有毒CIV的效力。这些狗中的HAI效价范围为120和1920之间。未接种的对照狗也随着CIV感染而生成GMT为149的抗体。
结果：肺实变、病毒分离和组织病理学
在所有流感感染中，肺实变/肺炎是主要的病理性损伤。在发展感染模型的先前研究中，我们在感染后第6天和14天在狗中观察到了严重肺实变。因此，为了评估CIV是否预防CIV诱导的肺实变，将对照组和接种组的所有狗在感染后第10天无痛处死，进行尸体剖检。评估肺损伤并按每个肺叶的实变百分比评分。在尸体剖检期间，根据狗的肺评分系统(与Diseases of the Swine(1999)第8版，第61章，第913-940页中的猪流感病毒肺评分系统相似)将每个肺叶的肺实变百分比评分转变为称重评分。用WilcoxonExact Rank秩和检验比较接种组和对照组的中值肺评分，并计算双侧P值。也记录疫苗效率相对于对照的缓和分数评估(Mitigated fraction estimate)以及评估的95％置信区间。
对照组中所有的狗(100％)显示不同程度的肺实变，而接种组仅有一只狗显示轻微肺实变(12.5)。未接种的对照狗的肺损伤特征为出血和微红色实变和肝样变。对照组肺评分范围为0.10和14.70之间，其中中值肺评分为4.9。对照组的肺评分明显高于接种组(p＝0.0005；缓和分数评估为93.5％)。肺评分清楚证明用于本研究中的CIV疫苗制剂保护狗预防CIV诱导的肺实变。
除了在尸体剖检中评分损伤之外，也可无菌收集肺组织进行病毒分离和在福尔马林进行组织病理学检测。从接种和对照狗的肺组织样品中均未发现可检测的CIV，这与无鼻病毒释出相关联。因为流感病毒引起急性感染在前七天内出现峰病毒脱落和临床征象，这个现象是预期的。到感染后10天，病毒从肺组织完全清除。这些结果与之前的研究结果一致。组织病理学检查显示对照和接种狗有不同程度的表示肺组织炎症的组织病理学变化。这个发现并不意外，因为甚至在病原特异性免疫的存在下，对任何病原的免疫反应也可能导致一定程度的炎症反应。此外，对照和接种狗的组织病理学的肺损伤严重性不能进行比较，因为所述组织不是从肺损伤区域选择性收集的。因此，组织病理学不能用作评估本研究中的疫苗的效力的标准。
结论
疫苗接种在显示疫苗引起的免疫反应刺激的初次接种(GMT＝22)和第二次接种(GMT＝135)后诱导显著较高的抗体反应，如通过HAI方法测定。
疫苗显著减轻CIV诱导的临床征象，特别是咳嗽，每只狗的剂量为500HAU，这证实了所述疫苗控制CIV诱导的临床疾病的效率。
疫苗在接种狗中显著减少鼻病毒释出，这证实了所述疫苗减少感染的效力。
疫苗成功地保护狗预防CIV诱导的肺实变，证实了所述疫苗抗最严重临床后果-肺炎的效力。
疫苗对狗不引起主要副作用，证明了所述疫苗的安全性。
临床评估指南
鼻排出物
0＝来出现
0.5＝浆液排出物：从鼻孔流下水性液滴。这里记录从鼻中流出的液体。
1＝粘液脓性排出物，轻度至中度：从鼻至口至少不完全流下混合有粘液的混浊液体。
2＝粘液性脓性排出物，重度：粘液流过口。
眼排出物
0＝未出现：在眼角有少量干的结痂物，不认为是眼排出物。
0.5＝浆液排出物：从眼睛流出清亮液体排出物。
1＝粘液脓性排出物，轻度至中度：从眼睛至口至少不完全流下混合有粘液的混浊液体。
2＝粘液性脓性排出物，重度：液体或粘液流下鼻部或在眼睛边缘滚动并且在眼内角或外角渗入头发。
咳嗽
0＝未出现
0.5＝轻微：仅观察到短暂咳嗽。
1.0＝中度：顽固性咳嗽，在观察期重复出现。
2.0＝重度：咳嗽伴随呼吸困难或干呕声。
喷嚏
0＝未出现
2＝出现
呼吸困难
0＝未出现(正常呼吸)
2＝出现(喘息)
抑郁
0＝未出现(正常活性)
2＝出现：与正常相比，狗的活动或嬉戏较少。当观察时如果出现昏睡或躺下和站立勉强，则记录。
尽管为了清楚理解而详细描述了前述发明，很明显可在所附权利要求的范围内进行某些改动。对所有目的，本文所引用的所有公开物和专利文件都以全文纳入作为参考，纳入程度如同其中每一个都单独表示一样。
从上文显而易见的是本发明提供一些应用。例如，本发明提供任何新鉴别的致病流感病毒株以及已知致病株用于制备适于细胞培养的分离物和/或疫苗的应用。本发明提供为或能制成允许流感生长的任何新鉴别的细胞培养细胞的应用。本发明提供适于组织培养的株制备成疫苗的方法，所述疫苗具有至少减毒、亚单位、片段或死病毒；并且还有佐剂、载体、赋形剂、抗流感药剂和增强对病毒的免疫反应的其它试剂。所述疫苗可在与流感接触之前或接触之后应用。

Claims (12)

1.通过有限稀释克隆选择在组织培养细胞中生长的犬流感病毒的方法，所述方法包括：
a.将一定量的犬流感病毒系列稀释，以获得一系列犬流感病毒浓度递减的稀释物，
b.使每一份系列稀释的犬流感病毒与组织培养细胞接触；
c.使在步骤b中进行了接触的所述犬流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间；
d.从接触了来自引起CPE的、系列稀释物中的最高倍稀释物的犬流感病毒的组织培养细胞中收获步骤c中生长的犬流感病毒；以及
e.用在步骤d中收获的一定量的犬流感病毒重复所述a到d的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，还包括在步骤b的接触之前将所述一定量的犬流感病毒与有效量的胰蛋白酶混合。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述胰蛋白酶为IX型胰蛋白酶。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述步骤b的接触是在少于0.01的MOI下进行的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织培养细胞为哺乳动物胚胎肾细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述哺乳动物胚胎肾细胞为马-达氏牛肾(MDBK)细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述的犬流感病毒是H3N8株。
8.生产犬流感病毒疫苗的方法，包括纯化由权利要求1收获的病毒。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述纯化步骤用尺寸排阻层析进行。
10.权利要求8所述的方法，还包括用有效灭活病毒的量的二乙烯亚胺(BEI)处理所述病毒。
11.通过有限稀释克隆选择在组织培养细胞中生长的犬流感病毒的方法，所述方法包括：
a.将一定量的犬流感病毒系列稀释获得一系列犬流感病毒浓度递减的稀释物；
b.将所述量的犬流感病毒与有效量的IX型胰蛋白酶混合；
c.使每一份系列稀释的犬流感病毒与哺乳动物胚胎肾细胞接触；
d.使在步骤c中进行了接触的所述犬流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间；
e.从哺乳动物胚胎肾细胞收获在步骤d中生长的犬流感病毒，所述的哺乳动物胚胎肾细胞接触了来自引起CPE的、系列稀释物中的最高倍稀释物的犬流感病毒；
f.将在步骤e中收获的一定量的犬流感病毒系列稀释获得一系列犬流感病毒浓度递减的稀释物；
g.将步骤e中收获的所述量的犬流感病毒与有效量的IX型胰蛋白酶混合；
h.使每一份系列稀释的犬流感病毒与哺乳动物胚胎肾细胞接触；
i.使在步骤h中进行了接触的所述犬流感病毒生长足以产生致细胞病变效应(CPE)的一段时间；和
j.从哺乳动物胚胎肾细胞收获在步骤i中生长的犬流感病毒，所述的哺乳动物胚胎肾细胞接触了来自引起CPE的、步骤f的系列稀释物中的最高倍稀释物的犬流感病毒。
12.权利要求11的方法，其中所述的哺乳动物胚胎肾细胞为马-达氏牛肾(MDBK)细胞。
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