BRPI0720304A2 - Método para replicar vírus influenza em cultura - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA REPLICAR VÍRUS INFLUENZA EM CULTURA".

REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido reivindica prioridade ao Pedido US ns 60/875287, depositado em 5 de dezembro de 2006 e Pedido US n- 60/882412, depositado em 28 de dezembro de 2006, ambos dos quais estão aqui incorporados por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Epidemias e pandemias de influenza foram reconhecidas duran- te vários séculos e resultaram em perda considerável de vida. Vírus da influ- enza é um vírus contendo RNA segmentado que pertence a família de Or- thomyxoviridae. As epidemias e pandemias são causadas pelo aparecimento de vírus com novos componentes envelope para que haja pouca imunidade na população. Estes novos componentes são frequentemente o resultado de mutação e/ou mistura de vírus da influenza humano e de animais.

Considerando que o capsídeo do vírus da influenza é um pouco pleomórfico, a superfície externa é de acordo com todos os vírus e consiste em um envelope de lipídeo do qual se projeta os picos de glicoproteína pro- eminentes de dois tipos: hemaglutinina (HA ou H) e neuraminidase (NA ou N). Há três tipos de vírus da influenza: A, B, e C. Somente os vírus da influenza A são também classificados através de subtipos com base em duas glicoproteí- nas de superfície principal HA e NA. Os subtipos de influenza A são também classificados através de cepas. O vírus da influenza B infecta mamíferos somente e causa doença em humanos, porém geralmente não tão severa quanto o tipo A. O vírus de influenza C também infecta somente mamíferos, porém causa somente um distúrbio respiratório muito moderado em crian- ças. Eles são geneticamente e morfologicamente distintos dos tipos AeB.

O vírus da influenza A infecta uma ampla variedade de animais, incluindo mamíferos, por exemplo, humanos, cavalos, cachorros, suínos, furões e aves, por exemplo, patos, galinhas e perus. Há 16 sorotipos de HA conhecidos e 9 sorotipos de NA conhecidos. Os pássaros são reservatórios particularmente importantes, geradores de grupos de vírus geneticamente/ antigenicamente diversos que são transferidos de volta para a população humana por contato próximo entre os humanos e animais. Os porcos são permissivos para ambas as cepas de influenza de humano e pássaro. Por causa desta característica incomum, os porcos são considerados como "Re- cipientes de Mistura" que permitem troca genética entre vírus de ave e hu- mano quando a mesma célula é infectada com ambos os tipos de vírus.

O genoma do vírus da influenza consiste em RNA de senso(-) de filamento único em 8 segmentos (7 em Influenza C). A estrutura do genoma é conhecida em grande detalhe por causa da tremenda quantidade de inves- tigação genética (convencional e molecular) que foi feita. Cada segmento codifica uma ou duas proteínas virais. Acredita-se que as epidemias e pan- demias sejam devido à mudança genética nas proteínas de HA e NA do ví- rus da influenza de dois modos diferentes: desvio antigênico e mudança an- tigênica. O desvio antigênico acontece constantemente, considerando que a mudança antigênica acontece somente ocasionalmente. O vírus da influenza tipo A sofrem ambos os tipos de mudanças; vírus da influenza tipo B mudam somente pelo processo mais gradual de desvio antigênico.

O desvio antigênico se refere a mudanças pequenas, graduais que ocorrem por mutações de ponto nos dois genes que contêm o material genético para produzir as proteínas de superfície principais, HA e NA. A mu- dança antigênica se refere a uma mudança abrupta, principal para produzir um novo subtipo de vírus da influenza A em humanos que não estavam cir- culando atualmente entre pessoas. A mudança antigênica ocorre ou por transmissão direta de animal (aves domésticas) para humano ou por mistura de genes de vírus da influenza A humano e influenza A animal para criar um novo vírus de subtipo de influenza A humana por um processo chamado de reclassificação genética. A mudança antigênica resulta em um novo subtipo de influenza A humana. A reclassificação genética ocorre quando dois vírus da influenza diferentes infectam a mesma célula e compartilham ou permu- tam um ou mais segmentos de RNA. Se o segmento que é transferido for o HA, por exemplo, isto pode resultar no aparecimento de uma nova cepa viral que é antigenicamente nova entrando em uma população com pouca ou ne- nhuma imunidade. O resultado pode levar a uma epidemia e/ou uma pan- demia.

A entrada de vírus da influenza em células é facilitada ligando-se as pontas de HA às mucoproteínas que contêm grupos de ácido neuramíni- co de terminal de N-acetila (NANA = ácido siálico). Após a ligação, a partícu- la é engolida através de endocitose por buracos revestidos em vesículas endocitóticas e finalmente endossomas. Estes são acidificados pela célula e em cerca de pH 5,0, os monômeros de HA são clivados por enzimas do tipo de tripsina no endossoma para ativá-las quanto à internalização. Uma vez interiorizada a replicação viral ocorre e resulta nos sintomas de influenza.

Há preocupação considerável sobre recentes ataques de influ- enza. Um tipo severo de doença das vias respiratórias foi identificado em cachorros que é devido ao Vírus da influenza Canino (CIV). Esta doença das vias respiratórias provou ser altamente contagiosa. Além disso, CIV pode causar 100% da infecção com 80% de morbidez, e até 5-8% de mortalidade em infecções severas. Desde sua primeira descoberta em 2004 em cachor- ros de corrida galgo inglês (Crawford e outros, Science 310(5747):482-485 (2005)) CIV se propagou rapidamente pelos Estados Unidos com pelo me- nos 25 estados que informam ataque de CIV, e vinte e sete estados que in- formam soroprevalência de CIV.

O sorotipo do CIV que causa o ataque recente é H3N8. Este so- rotipo de CIV foi originalmente descoberto em cavalos, e acredita-se ter cru- zado a barreira de espécies em caninos. É provável que a ausência de uma vacina eficaz contra vírus da influenza canino tenha um papel principal na disseminação rápida e difundida em cachorros deste vírus.

O vírus da influenza A (H5N1, influenza aviária) - também cha- mado "vírus H5N1" - é um subtipo de vírus da influenza A que ocorre princi- palmente em pássaros, é altamente contagioso entre pássaros, e pode ser mortal a eles. Os vírus H5N1 normalmente não infectam as pessoas, porém as infecções com estes vírus ocorreram em humanos. Até hoje, mais de 200 casos humanos confirmados que resultaram em mais de 150 mortes foram informados em 10 países, principalmente na Ásia. Felizmente, até o momen- to, o vírus não se propagou facilmente de pássaros para humanos ou de um humano para outro. Porém, isto poderia acontecer com o resultado que uma epidemia ou pandemia poderia ocorrer. A melhor estratégia para prevenção de morbidez e mortalidade associada com uma epidemia ou pandemia é a vacinação.

As vacinas de influenza agora administradas a humanos têm uma relação de benefício para custo alto em termos de prevenir hospitaliza- ções e mortes, porém, a capacidade de produção anual do mundo para va- cina sazonal é limitada e realisticamente não cobre a população de alto risco global. As vacinas presentes são feitas em ovos que usam vírus obtidos da Organização de Saúde Mundial (WHO) ou os Centros para Controle de Do- ença (CDC), que fornecem as sementes de vírus para fabricação de vacina todos os anos. As mudanças no HA de vírus circulantes (desvio antigênico) requerem substituição periódica das cepas da vacina durante períodos inter- pandêmicos. O WHO publica recomendações semianuais para as cepas a serem incluídas para os Hemisférios do Norte e Sul. Para permitir tempo su- ficiente para fabricar, o WHO determinou em fevereiro que as cepas de vaci- na deveriam ser incluídas na vacina do inverno seguinte. Em geral, 1 dose para adultos contém o equivalente de 45pg de HA (15pg cada para 3 vírus). Esta dose é aproximadamente a quantidade de vírus purificado obtido do fluido alantoico de um ovo embrionado infectado. Se 100 milhões de doses de vacina de vírus da influenza morta forem preparados, o fabricante tem que obter 100 milhões de ovos embrionados. Isto torna a produção de vaci- na dependente da disponibilidade oportuna de ovos embrionados de boa qualidade e as cepas de semente fornecidas pelo WHO/CDC. A maioria das cepas de semente de protótipo não é facilmente desenvolvida para alta titu- lação mesmo em ovos embrionados. Para superar este problema, agências do governo primeiro criam cepas de laboratório de produção elevada para reclassificação clássica com cepa de laboratório de produção elevada A/PR/8/34 (em uma reclassificação de 6:2 obtendo 6 segmentos da cepa A/PR/8/34). Infelizmente, este processo pode ser difícil de se fazer e pode causar a antigenicidade da vacina resultante. Então, há uma necessidade de fornecer métodos alternativos de fabricação de vacinas que protegem contra doenças clínicas causadas por influenza, particularmente cepas altamente patogênicas tal como H5N1. Além disso, nesse aspecto permanece uma necessidade de fornecer métodos de fabricação de grandes quantidades de vacinas da influenza de proteção de vida em um período de tempo rápido o bastante para eficazmente prevenir possíveis epidemias e/ou pandemias. A presente invenção trata destas e outras necessidades.

A citação de qualquer referência aqui não deveria ser interpreta- da como uma admissão que tal referência está disponível como "técnica an- terior" para o presente pedido.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se às vacinas para a prevenção de infecções de influenza A e B. As vacinas e os métodos relacionados da in- venção fornecem várias vantagens sobre as vacinas e métodos da técnica anterior. Por exemplo, as vacinas da invenção são produzidas usando célu- las de cultura de tecido em vez de ovos embrionados. Os métodos de pro- dução inventivos ganham tempo crítico evitando-se o procedimento de fabri- cação de vacina clássica. Além disso, as vacinas da invenção são úteis para aqueles que são alérgicos ao material de ovo. A presente invenção também fornece novas composições imunogênicas que podem ser usadas nas vaci- nas. Estas novas composições imunogênicas podem ser usadas para imuni- zar animais, incluindo aves, contra o vírus da influenza. Em modalidades particulares da invenção, o recipiente da vacina é um mamífero. Em um as- pecto, a presente invenção fornece uma vacina que protege caninos contra a doença das vias respiratórias canina devido ao Vírus da Influenza Canino (CIV). Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma vacina que pro- tege os humanos contra cepas do vírus da influenza naturalmente produzi- das por reclassificação genética.

A invenção fornece isolados do vírus da influenza que foram es- pecificamente adaptados para crescer em células de cultura de tecido. Em uma modalidade particular, os isolados do vírus da influenza adaptados são selecionados quanto à sua capacidade de crescer em uma linhagem de cé- lula de cultura de tecido escolhida usando clonagem por diluição limitada. Em uma modalidade particular, uma subpopulação de vírus da influenza a- daptado para desenvolvimento em uma linhagem de célula cultivada é sele- cionada serialmente diluindo-se em uma multiplicidade de alíquotas, uma quantidade de vírus da influenza que compreende uma multiplicidade de subpopulações de influenza. A multiplicidade de alíquotas é então contatada com e/ou crescida na linhagem de célula cultivada. Uma subpopulação de vírus da influenza na multiplicidade de subpopulações de influenza é identifi- cada como uma que cresce nas células cultivadas em uma baixa multiplici- dade de infecção (MOI) e selecionada como a subpopulação de vírus da in- fluenza que é adaptado para desenvolvimento na linhagem de célula cultiva- da. Em modalidades relacionadas, a presente invenção fornece métodos que incluem contatar o isolado adaptado de cultura de tecido com células de cultura de tecido, crescer durante um tempo suficiente para produzir efeitos citopáticos (CPE). Este método pode incluir também a coleta do vírus da in- fluenza. Em algumas tais modalidades, o processo de clonagem por diluição limitada envolve serialmente diluir um isolado do vírus da influenza e conta- tar cada diluição com células cultivadas, o desenvolvimento das células du- rante um tempo suficiente para produzir efeitos citopáticos (CPE), coletando vírus da maior diluição que causa CPE, e repetindo o processo com o vírus coletado. Em algumas modalidades, o método também inclui misturar o iso- lado de vírus da influenza com uma quantidade eficaz de tripsina antes de contatar as células cultivadas. Em algumas modalidades, a mistura é incu- bada durante um tempo suficiente para permitir que a tripsina clivar as prote- ínas virais, sem separar as células do substrato. A tripsina usada para clivar as proteínas virais pode ser tripsina tipo IX. Em alguns casos, a etapa de contatar o isolado adaptado de cultura de tecido com as células de cultura de tecido é realizada em uma multiplicidade de infecção (MOI) de menos do que cerca de 0,01, incluindo menos do que cerca de 0,001 e/ou menos do que cerca de 0,0001. Em outros casos, o isolado do vírus da influenza é pri- meiro testado nas células de cultura de tecido para determinar o MOI ideal. As células de cultura de tecido podem ser células de rim embriônicas de mamífero tal como células de rim embriônicas humanas. O vírus da influenza pode ser um vírus da influenza A, B, ou C. Em uma modalidade particular, o vírus da influenza A é uma cepa de H5N1. O isolado de vírus da influenza pode ser obtido de qualquer número de fontes incluindo de um cotonete na- sal, um tecido pulmonar, e/ou pode ser fornecido por um terceiro grupo, por exemplo, o WHO. Em algumas modalidades, o isolado de vírus da influenza é inicialmente desenvolvido em ovos embrionados para obter um grande inóculo para adaptação a cultura de tecido. Alguns métodos incluem purificar o vírus coletado. Em um tal método, a etapa de purificar é realizada usando cromatografia de exclusão por tamanho. Os métodos da invenção também podem envolver misturar um segundo isolado de vírus da influenza com o primeiro isolado antes, durante ou subsequente a purificação, tal que o se- gundo isolado seja uma cepa diferente do primeiro isolado. Em alguns méto- dos, os estudos de titulação de dose são realizados antes de misturar os dois isolados virais para determinar uma mistura que permita imunogenici- dade igual das proteínas virais. Em alguns métodos a influenza é inativada. Em algumas modalidades deste tipo, o vírus da influenza é tratado com uma quantidade de etilenoimina binário eficaz para inativá-lo. Em alguns méto- dos, a coleta é realizada quando o conteúdo de proteína de hemaglutinina for máximo.

Outras modalidades incluem uma vacina preparada coletando-se o isolado viral preparado pelo método de selecionar um vírus da influenza para desenvolvimento em células de cultura de tecido por titulação de um isolado de vírus da influenza usando clonagem por diluição limitada tal que 25 um isolado do vírus da influenza que é adaptado às células de cultura de tecido seja selecionado. Em algumas modalidades, o vírus é preparado por inoculação de ovos de galinha livres de patógeno específico embrionado através de rotinas de inoculação de membrana amniótica ou corioalantoico (também chamada cavidade alantóica) antes da clonagem por diluição Iimi- 30 tada. Em uma modalidade o vírus da influenza é replicado primeiro através de inoculação pela membrana amniótica de ovos embrionados para obter um inóculo para adaptação às células de cultura de tecido. Além disso, a invenção fornece métodos para selecionar um vírus da influenza para desenvolvimento em células de rim embriônicas humanas. Em um tal método um isolado de vírus da influenza é titulado usando clonagem por diluição limitada tal que um isolado de vírus da influenza que é adaptado às célu- Ias HEK seja selecionado. Este método pode incluir contatar o isolado adapta- do a HEK com células HEK e desenvolver as células durante um tempo sufi- ciente para produzir efeitos citopáticos (CPE). Em uma modalidade particular deste tipo, o vírus da influenza resultante é coletado. A invenção também fornece uma vacina que inclui o isolado de vírus da influenza obtido por es- tes métodos. O método também pode incluir misturar o isolado de vírus da influenza com uma quantidade eficaz de tripsina tipo IX antes de contatar as células cultivadas durante um tempo suficiente para permitir a tripsina clivar as proteínas virais, sem separar as células do substrato. Em uma modalida- de, a etapa de contatar o isolado adaptado por HEK com as células HEK é realizada em um MOI de menos do que cerca de 0,001.

Em algumas modalidades, a invenção também fornece vacinas que compreendem vírus da influenza humano formulados em menos do que

4 pg de HA de influenza humana por dose. Em uma modalidade relacionada a invenção fornece vacinas que compreendem vírus da influenza humano formulado em menos que 3 pg de HA de influenza humana por dose. Em outra modalidade a invenção fornece vacinas que compreendem vírus da influenza humano formulado em menos do que 2 pg de HA de influenza hu- mana por dose. Em ainda outra modalidade, a invenção fornece vacinas que compreendem vírus da influenza humano formulado em 1,5 - 3,5 pg de HA de influenza humana por dose. Em modalidades de vacina particulares o adjuvante é um ISCOM. Em outras modalidades de vacina pelo menos 70% dos vírus compreendem HA que tem a mesma seqüência de aminoácido. Em ainda outras modalidades de vacina pelo menos 80% dos vírus compre- endem HA que tem a mesma seqüência de aminoácido. Em ainda outras modalidades de vacina pelo menos 90% dos vírus compreendem HA que tem a mesma seqüência de aminoácido. Em ainda outras modalidades de vacina mais do que 95% dos vírus compreendem HA que tem a mesma se- quência de aminoácido. A presente invenção também fornece vacinas de combinação para obter imunidade protetora contra vírus da influenza, por exemplo, vírus da influenza canino (CIV) e outras doenças, por exemplo, outras doenças infeccio- sas caninas. A presente invenção também fornece um método de imunizar um mamífero, por exemplo, um cachorro, gato, ou cavalo contra influenza. Os métodos de fabricação e o uso das vacinas para as doenças infecciosas, por exemplo, doenças infecciosas caninas também são fornecidos.

Em uma modalidade particular uma composição imunogênica da presente invenção compreende uma composição imunogênica que compre- ende um H3N8 de CIV inativado e um adjuvante. Tipicamente, o adjuvante compreende uma emulsão de óleo em água. Em tal modalidade, o adjuvante também compreende hidróxido de alumínio. Em uma modalidade particular deste tipo, o adjuvante é Emunade®. Em outra modalidade a composição imunogênica é uma vacina.

A composição de vacina pode incluir de cerca de 100 unidades de hemaglutinationa (HAU) a cerca de 1500 HAU por dose. Isto pode variar amplamente dependendo do tamanho e outras considerações de saúde do paciente que recebe o tratamento. A composição é tipicamente entre 250 e 750 HAU por dose. Em uma modalidade, a composição de vacina inclui cer- ca de 500 HAU por dose.

Opcionalmente, as vacinas da presente invenção também po- dem incluir um estimulante imune farmaceuticamente aceitável, por exemplo, citocinas, fator de desenvolvimento, quimiocinas, sobrenadantes de culturas de célula de linfócitos, monócitos, ou células de órgãos linfoide, preparações de célula e/ou extratos de plantas, bactérias ou parasitas, ou mitógenos.

As vacinas da presente invenção podem ser administradas por uma rotina tal como: administração parenteral, injeção intramuscular, injeção subcutânea, injeção peritoneal, injeção intradérmica, administração oral, administração intranasal, escarificação e combinações destes. Em uma mo- dalidade preferida da invenção, a vacina é administrada através de injeção intramuscular. A invenção também fornece soro obtido de um animal vacinado que contém anticorpos que se ligam a H3N8 de CIV e os anticorpos purifica- dos deles. Em uma modalidade particular da invenção, o anticorpo purificado que se liga a H3N8 de CIV é um anticorpo quimérico.

A presente invenção também fornece vacinas de combinação que incluem uma ou mais cepas de CIV inativado, por exemplo, CIV H3N8, em combinação com um ou mais outros imunógenos e/ou de patógenos ca- ninos, incluindo, por exemplo, imunógenos por obter imunidade a vírus de sinomose canina; adenovírus canino; adenovírus canino tipo 2; parvovírus canino; vírus de parainfluenza canina; coronavírus canino; vírus da influenza canina; e/ou Leptospira serovars, por exemplo, Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa, Leptospira interrogans serovar canicola, Leptospira interro- gans icterohaemorrhagiae, e/ou Leptospira interrogans serovar pomona. Os patógenos caninos adicionais que podem ser adicionados a uma vacina de combinação da presente invenção incluem Bordetella bronchiseptica; orga- nismos de Leishmania tal como Leishmania principal e Leishmania infantum\ espécies de Borrelia (spp.) spirochetes, incluindo B. burgdorferi sensu stricto (ss), B. burgdorferi ss, B. garinii, e B. afzelii; uma espécie de Mycoplasma (por exemplo, Mycopiasma Cynos); vírus da raiva; e Ehrlichia canis.

A presente invenção fornece métodos de desenvolver CIV H3N8 em células cultivadas. Em algumas modalidades, as células cultivadas são células de rim de mamífero não canino. Em uma modalidade, as células são células de rim bovino de Madin-Darby (MDBK). Em outra modalidade, as células são células Vero.

Em algumas modalidades, a invenção também fornece vacinas que compreendem CIV H3N8 formulados em menos do que 500 HAU por dose. Nestas modalidades, o adjuvante é normalmente hidróxido de alumí- nio, e pelo menos 70%, tipicamente pelo menos 90%, do HA tem a mesma seqüência de aminoácido. Em outras modalidades de vacina pelo menos 80% dos vírus compreendem HA que tem a mesma seqüência de aminoáci- do. Em ainda outras modalidades de vacina mais do que 95% dos vírus compreendem HA que têm a mesma seqüência de aminoácido. Estes e outros aspectos da presente invenção serão apreciados melhor através de referência às seguintes Figuras e Descrição Detalhada. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1 mostra a média de escores clínicos, seguinte o desafio de CIV em cachorros. Os cachorros vacinados ou controle não vacinado fo- ram desafiados com CIV e monitorados diariamente do dia -2 por 10 dias após desafio quanto aos sinais clínicos, tais como descarga ocular e nasal, espirro, tosse, depressão e dispnéia. Os sinais clínicos foram marcados co- mo pelas normas descritas no Exemplo 1 e escores clínicos médios para cada grupo de tratamento foram plotados contra dias.

Figura 2 demonstra eliminações de CIV nasal após desafio em cachorros. Os cachorros vacinados e controle não vacinado foram desafia- dos com CIV. Os cotonetes nasais foram coletados no dia antes do desafio (dia -1) para confirmar que os cachorros ficaram livres de CIV. A eliminação de vírus nasal foi monitorada em cachorros desafiados coletando-se os co- tonetes nasais diariamente durante 10 dias (dia 1 até 10 após desafio) e rea- lizando-se a titulação em monocamadas de MDCK. Os títulos de vírus mé- dios para cada grupo de tratamento, expressos como Logi0 TCID5o/mL, fo- ram calculados e plotados contra dias após desafio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os métodos tradicionais de produção de vacinas de influenza envolvem o desenvolvimento de uma cepa isolada nos ovos de galinhas embrionados pelo menos em parte porque o uso de ovos é barato e eficiente e porque não há nenhuma escolha alternativa facilmente aparente para o desenvolvimento de influenza em quantidades grandes. No caso de influen- za humana isto é particularmente verdade porque muitas linhagens celulares que podem ser usadas para propagar vírus da influenza não foram aprova- das pelo FDA para fabricação de vacina humana e foram obtidos somente títulos muito baixos em cultura de tecido.

Quando a vacina é feita em ovos, geralmente é feita como se- gue. Inicialmente, o vírus é recuperado de um cotonete de garganta ou fonte semelhante e isolado em ovos. O isolamento inicial em ovo é difícil, porém o vírus se adapta ao seu hospedeiro de ovo e a propagação subsequente em ovos ocorre relativamente facilmente. Após o desenvolvimento no ovo, o ví- rus é purificado e formalina ou beta-propiolactona inativados. A evidência crescente sugere que o ovo não seja ideal para propagação de vírus. Por exemplo, os flocos em camadas convencionais usados em fabricação com base em ovo são de alto risco para contaminar a preparação de vírus com vírus endógenos habitualmente encontrados nestas aplicações. Além disso, a inoculação separada e coleta de milhões de ovos como também o proces- samento a jusante complicado resulta em oportunidades vastas para conta- minantes ambientais serem introduzidos na preparação de vírus e é a prová- vel razão de haver um novo chamamento de vacina em 2004. Como previa- mente mencionado, é difícil de remover o material de ovo completamente e isto pode resultar em sensibilidade à vacina. Além disso, o processo comple- tamente necessita de flexibilidade se a demanda subitamente aumentar por causa dos problemas logísticos devido à não disponibilidade de quantidades grandes de ovos adequados. Também há evidência que o desenvolvimento em ovos pode reduzir a antigenicidade do vírus. Constantemente, o desen- volvimento dos vírus A ou B da influenza em ovos resulta em um produto viral heterogêneo que tem um espectro de mutações de HA. Em contraste direto, o desenvolvimento correspondente em células hospedeiras de mamí- fero resulta em vírus da influenza que são estruturalmente idênticos àqueles originalmente isolados (Rocha, e outros J. Gen. Virol 1993;74:2513-2518). Além disso, o desenvolvimento de vírus da influenza em células de mamífero elicia anticorpos de inibição de HA e neutralização em soros humanos mais facilmente e com um título mais alto que suas contrapartes desenvolvidas em ovo (Oxford, e outros, Bull WHO 1987;65:181-187).

Infelizmente, considerando que todas as cepas virais de influen- za parecem se desenvolver em ovos, até agora, muitas não se desenvolvem bem em células de cultura de tecido, e dessas que crescem em células de cultura de tecido frequentemente não crescem nas quantidades necessárias para produzir uma vacina eficaz. Os presentes inventores agora descrevem que quando o vírus da influenza é desenvolvido em cultura de tecido usando clonagem por diluição limitada, os isolados podem ser produzidos, os quais são adaptados a cultura de tecido. Surpreendentemente, os inventores des- cobriram que a replicação de um vírus que é o resultado de inoculação pela membrana amniótica de ovos embrionado resultou em uma população de 5 vírus que poderia replicar e poderia produzir níveis altos de HA quando pro- pagados em células de cultura de tecido (por exemplo - Células Vero). O isolado viral resultante produz um título de HA que é quase igual àquele ob- tido usando ovos embrionados e título de HA é uma medida importante de potencial de vacina. Então, um aspecto importante da presente invenção 10 está voltado aos métodos de produzir isolados virais de vírus da influenza que são adaptados a cultura de tecido e adequados para uso na produção de vacinas de influenza, particularmente vacinas de mamífero. Os métodos envolvem o uso de clonagem por diluição limitada para isolar e identificar os vírus adaptados à cultura de tecido. O isolado resultante pode ser tratado 15 para produzir uma vacina. Desse modo, a presente invenção também está voltada aos métodos de produzir vacinas melhoradas de vírus da influenza.

Para este fim, métodos são fornecidos para selecionar vírus da influenza adaptados a cultura de tecido através de titulação do vírus usando clonagem por diluição limitada e repetindo o processo 2 ou mais vezes. Em 20 alguns métodos, a célula de cultura de tecido usada é uma célula HEK. A tripsina ou uma protease equivalente pode ser usada para aumentar a efici- ência de entrada viral nas células. Outros métodos envolvem a titulação da tripsina para identificar a melhor concentração para o lote de tripsina usado e para as células usadas. A identificação da melhor multiplicidade de infecção 25 (MOI) para cada vírus da influenza usado e para as células específicas tam- bém contribui com a propagação de cultura de tecido bem sucedida. O vírus adaptado a cultura de tecido isolado pode ser usado para produzir uma vaci- na de acordo com métodos padrões. Em algumas modalidades, as vacinas incluem o uso do adjuvante ISCOM. Em algumas modalidades, as vacinas 30 incluem o uso do adjuvante de hidróxido de alumínio. Quando mais de uma cepa viral ou isolados forem incluídos na vacina, os métodos podem envol- ver misturar os dois em uma quantidade imunologicamente igual. Os méto- dos e composições são fornecidos aqui para os isolados virais adaptados a

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cultura de tecido e para vacinas feitas destes.

I. Métodos para Selecionar Vírus Adaptado a Cultura de Tecido

A fonte de vírus usada nos métodos da invenção não é crucial para a invenção. Por exemplo, o vírus pode ser obtido através de isolamento de um animal ou paciente infetado, como um cepo de vírus semente de WHO1 adquirindo-se de uma agência apropriada (por exemplo, ATCC), ou de laboratórios de pesquisa. Em particular, CIV é conhecido por causar do- enças severas das vias respiratórias incluindo pneumonia. Assim, os cachor- ros que mostram estes sintomas são fontes úteis. Os espécimes apropriados para isolar vírus incluem: lavagem/aspirado nasal, cotonete nasofaríngeo, cotonete de garganta, lavagem broncoalveolar, aspirado traqueal, punção de fluido pleural, cuspe, esfregaço cloacal, e espécimes de autópsia. Os espé- cimes de animais vivos de modo mais eficiente deveriam ser coletados an- tes, e em alguns casos, em 4 dias após o início da doença. Os espécimes podem ser coletados em um meio de transporte apropriado para ser arma- zenado até o uso ou podem ser usados imediatamente. Se armazenado, o vírus pode ser mantido em uma temperatura reduzida, tal como em 4°C para garantir viabilidade. Para isolar o vírus da influenza do espécime, grandes contaminantes podem ser removidos (por exemplo, através de centrifuga- ção) e o sobrenadante inoculado sobre uma variedade de células em uma variedade de diluições. Alternativamente o vírus do animal pode inicialmente ser desenvolvido em ovos de galinha. Os métodos podem ser usados para confirmar que o isolado de vírus realmente é influenza em qualquer ponto no processo.

Para confirmar a presença do vírus da influenza desejado a qualquer hora no processo de preparação de um isolado adaptado a cultura de tecido, uma variedade de métodos de avaliação pode ser usada. O vírus pode ser avaliado por ensaio usando qualquer ensaio conhecido e/ou ade- 30 quado para vírus da influenza. Tais ensaios incluem (sozinhos ou em combi- nação), replicação viral, medição quantitativa e/ou qualitativa de inativação (por exemplo, através de antissoro), transcrição, replicação, translação, in- corporação de virion, virulência, atividade de HA ou NA, produção viral, e/ou morfogênese, usando tais métodos como genéticos reversos, reclassifica- ção, complementação, e/ou infecção.

A. Células de cultura de tecido

Qualquer célula hospedeira de mamífero que permita o desen- volvimento de vírus da influenza pode ser usada para os métodos inclusos. Tipicamente, as células hospedeiras adequadamente excluem os agentes adventícios e são de um número de passagem que pode ser certificado de acordo com a exigência de WHO para produção de vacina. Várias linhagens de célula podem ser usadas para isolar e propagar o vírus da influenza. Al- gumas linhagens de célula que foram usadas incluem: células Vero (células de rim de macaco), células de MDCK (células de rim caninas Madin-Darby), células de BHK-21 (rim de hamster bebê) e BSC (célula de rim de macaco) e células de HEK (células de rim embriônicas humanas). Desse modo, qual- quer célula de cultura de tecido que permita o desenvolvimento de vírus da influenza pode ser usada. As células adequadas incluem, porém não estão limitadas a: Vero, MDBK, BK21, CV-1, e qualquer célula de rim embriônica de mamífero (por exemplo, HEK). Em algumas modalidades, as células Vero ou células de rim embriônicas de mamífero são usadas. Em algumas moda- lidades, as células de rim embriônicas humanas (células de HEK) são usa- das.

O meio de cultura de tecido apropriado para propagação das linhagens de célula acima mencionadas é conhecido por aqueles por aque- les versado na técnica. Tal meio pode conter um soro apropriado (por exem- plo, soro bovino fetal) em uma concentração até 20% volume/volume. Será apreciado por aqueles de experiência, que um meio contendo menos do que 20% de soro em volume/volume (2-5% volume/volume) pode ser usado para propagar as linhagens de célula acima mencionadas.

B. Otimização da tripsina para as células

Para desenvolver um cepo de título elevado do vírus em cultura de célula, uma quantidade apropriada de protease pode ser usada para ati- var o hemaglutinina para internalização em células. A solução que contem protease pode ser adicionada ao isolado diretamente ou o isolado pode ser diluído na protease para desenvolvimento de um isolado para produção de uma vacina. A protease pode ser usada para diluir o vírus para MOI apropri- ado para desenvolvimento.

A protease pode ser qualquer protease que seja capaz de ativar o HA para internalização sem danificar as proteínas virais tal que elas não possam se desenvolver e/ou infectar as células. Tais proteases incluem, po- rém não estão limitadas a, protease procariótica, pronase, tripsina, e subtili- sina (A), por exemplo, Tripsina IX.

A quantidade de protease a ser usada deveria ser o bastante para ativar o vírus com muito pouco efeito tóxico para as células. O efeito tóxico pode ser analisado identificando-se as características de dano à célu- la tal como separação da placa ou substrato, presença de escombros celula- res, aparecimento de células mortas e falta de células viáveis. Desse modo, uma "quantidade eficaz de tripsina" é uma que, quando usada durante um tempo suficiente, permite a tripsina clivar proteínas virais, sem separar as células do substrato ou causar outros efeitos tóxicos. A titulação da protease também pode ser usada para aumentar a produção de vírus ativo na cultura de tecido. A titulação envolve identificar a quantidade máxima de tripsina que seja minimamente danosa às células. Esta quantidade pode variar com as células de cultura de tecido usadas e com o lote de protease. Então, novos lotes de protease podem ser titulados para estabelecer o nível ideal antes do uso e cada protease pode ser titulada para cada célula de cultura de tecido. A titulação envolve inocular as células de cultura de tecido com diluições em etapas da protease e as incubando durante um tempo apropriado. Por e- xemplo, as diluições de meia etapa (10'0,5) de protease podem ser usadas. O tempo de incubação variará com a linhagem de célula, porém, tipicamente estará entre cerca de 2 dias e 7 dias. O nível de protease pode ser determi- nado usando o tempo de incubação típico para as células que são usadas. Por exemplo, se uma incubação de 4 dias for melhor para o vírus da influen- za, a protease pode ser testada incubando-se durante cerca de 4 dias na presença de protease somente. A diluição mais baixa de protease que tem nenhuma toxicidade ou muito pouca toxicidade para as células pode ser en- tão usada. A faixa de concentrações de tripsina que pode ser usada em cé- lulas de cultura de tecido de mamífero, por exemplo, células Vero, é de cer- ca de 0,5pg/mL a cerca de 10pg/mL, porém mais geralmente cerca de

5 2,5pg/mL de meio.

Uma vez que o nível ideal de protease é identificado, o vírus po- de ser diluído no meio de infecção com uma quantidade apropriada de pro- tease, (por exemplo, tripsina) tal que o nível ideal seja alcançado quando o vírus for adicionado aos meios celulares. A quantidade ideal de tripsina pode 10 ser usada para a clonagem por diluição limitada para produzir um isolado adap- tado à cultura de tecido como também desenvolvimento e coleta do isolado.

C. Clonagem por diluição limitada

Uma cultura de vírus típica é heterogênea. Desse modo, por e- xemplo, as partículas virais individuais no poço de uma placa de microtítulo 15 pode variar com respeito à infecciosidade, replicação, e similares. A diluição em série é usada para selecionar as subpopulações de vírus em uma cultu- ra, subpopulações que são adaptadas melhor às células, por exemplo. A diluição em série envolve diluir uma cultura de vírus serialmente até extin- ção, por exemplo, para determinar o melhor MOI. Tipicamente isto envolve 20 uma série de diluições de 10 vezes, porém pode variar, dependendo do título do vírus.

Tipicamente a diluição limitada é usada para identificar a diluição mais alta que produz efeito viral na célula. O efeito viral pode ser um efeito citopático (CPE). Os efeitos citopáticos são qualquer efeito na célula causa- 25 do por infecção de vírus da influenza. Estes incluem, porém não estão limi- tados a: arredondamento de célula, degeneração, escara, apoptose, indução de espécies de oxigênio de reativo (ROS), células que ficam granular e em seguida fragmentadas, e separação de células de um suporte (tal como um prato de cultura de tecido). O poço da diluição mais elevada é coletada. Este 30 vírus coletado é então diluído para extinção e o processo é repetido. Tipica- mente, as diluições em série de 10 vezes são feitas em um meio apropriado (com ou sem tripsina), e 0,2 ml de cada diluição é adicionado a uma placa ou poços de uma placa de microtítulo contendo as células de cultura de teci- do e incubado durante um tempo suficiente para identificar CPE das células. Uma vez que o soro inativa a tripsina, o meio tipicamente não contém soro. O poço ou placa que contém a diluição mais elevada que causa CPE é cole- tada, em seguida diluída e o processo é repetido. O processo é tipicamente repetido pelo menos duas vezes, porém pode ser repetido até 5 vezes. Em alguns casos, o processo é repetido 3 vezes.

As culturas de vírus produzidas pelos métodos da invenção são caracterizadas por homogeneidade da seqüência das proteínas de HA nos vírus. Vários métodos podem ser usados para medir o grau de homogenei- dade de seqüência. Por exemplo, sequenciando-se as próprias proteínas de HA ou através de sequenciamento do RNA que codifica tais proteínas. Tipi- camente, as preparações de vírus produzidas pelos métodos da invenção conterão vírus no qual pelo menos 70% das proteínas de HA têm a mesma seqüência de aminoácido. Em algumas modalidades em 80%, ou pelo me- nos 90% das proteínas de HA têm a mesma seqüência de aminoácido.

D. Métodos para testar vírus da influenza

Os testes podem ser realizados para confirmar atividade e a presença de vírus da influenza em qualquer hora no processo para os méto- dos inclusos. Por exemplo, a hemaglutinação pode ser identificada como segue. Se o vírus tem uma proteína de HA superfície ele pode se prender a RBCs e pode os aglutinar. Se a concentração de vírus em uma amostra for elevada, quando a amostra for misturada com RBCs, uma estrutura de vírus e RBCs será formada. Este fenômeno é chamado de hemaglutinação. É um modo simples para detectar a presença e título de vírus que se hemagluti- nam tal como o vírus da influenza. Se não houver bastante vírus na amostra para hemaglutinar os RBCs, eles formam uma pelota no fundo do poço. A diluição mais elevada que mostra hemaglutinação completa é tomada como o ponto final. O título viral é expresso em unidades de HA (HAU), que são o inverso da diluição por mililitro. Por exemplo, se houver hemaglutinação completa no poço, em uma diluição de 1/32 em 50μ Ls, porém não no poço com a próxima diluição mais elevada, o título do vírus é 32 HAU por 50pLs Outros ensaios que podem ser usados para identificar e quantifi- car o vírus da influenza inclui a identificação de CPE (como descrito aqui), manchamento do Oeste, ELISA, PCR, e outros métodos para identificação de vírus da influenza usando anticorpos e/ou sondas que são específicos para alguma parte do vírus, particularmente o antígeno de HA.

II. Métodos de desenvolvimento e coleta

Após a produção de um isolado de vírus, o isolado pode ser co- letado. Métodos padrões podem ser usados. O isolado coletado pode ser armazenado para uso futuro ou usado para produzir uma vacina usando mé- todos padrões. O vírus pode ser coletado quando uma quantidade máxima de vírus for produzida; quando uma quantidade máxima de hemaglutinina for produzida, como medido por ensaio de HA; e/ou quando as células forem lisadas.

Depois de obter um isolado adaptado à cultura de tecido, o iso- lado pode ser desenvolvido e pode ser coletado. O método de desenvolvi- mento e coleta do vírus adaptado a cultura de tecido não é crítico para a in- venção e métodos padrões podem ser usados. Porém, em algumas modali- dades, o vírus é desenvolvido na célula de cultura de tecido que for adapta- da melhor a ele. O isolado viral coletado pode ser armazenado para uso fu- turo ou usado para produzir uma vacina que usa métodos padrões. O vírus pode ser desenvolvido nas células de cultura de tecido apropriadas adicio- nando-se o vírus a um MOI apropriado na quantidade apropriada de protea- se (por exemplo, tripsina) às células durante um tempo suficiente para pro- duzir um título elevado de vírus e/ou até que as células sejam lisadas. O ví- rus pode ser coletado quando uma quantidade máxima de vírus for produzi- da, quando uma quantidade máxima de hemaglutina for produzida e/ou quando as células forem lisadas. Descobriu-se, entretanto que um pré- desenvolvimento ideal do vírus em ovos (no poço alantóica ou inoculação pela membrana amniótica) pode aumentar a adaptação do vírus nas células de cultura de tecido. A. Pré-desenvolvimento em ovos

A passagem em culturas de ovo foi mostrada facilitar a adapta- ção de vírus na célula de cultura de tecido. Desse modo, pode ser desejável pré-desenvolver o isolado viral nos ovos de galinha embrionados de acordo com tecnologias padrões. Por exemplo, o vírus é injetado no poço alantóica ou pela membrana amniótica de ovos embrionados de 9-12 dias de idade e permitido multiplicar durante cerca de três dias. Então o fluido alantoico ou amniótico é coletado e o material coletado pode ser desenvolvido em cultura de tecido no MOI apropriado para uso na produção de uma vacina. Alternati- vamente, o material coletado pode ser usado diretamente na clonagem por diluição limitada. Descobriu-se que a inoculação dos ovos pela membrana amniótica enriquece para vírus que podem replicar e podem produzir níveis elevados de proteína de HA quando desenvolvidos em células Vero.

B. MOI

Foi identificado aqui que um MOI baixo resulta em um isolado viral de título melhor e/ou mais elevado. Sem limitação a uma teoria especí- fica, acredita-se que um MOI baixo reduz a quantidade de partículas de vírus defeituosas e resulta em um processo de infecção mais eficiente. Em algu- mas modalidades, o MOI usado é menos do que cerca de 0,01 (um vírus por 100 células). Em outras modalidades, o MOI é menos que cerca de 0,003. Em algumas modalidades, o MOI é menos que cerca de 0,001. O MOI pode ser escolhido como sendo o MOI mais baixo que resulta em um título eleva- do de vírus e/ou de lisa as células em cerca de 3 a 4 dias.

III. Produção de vacina

Uma vez que um isolado desejado é obtido do vírus adaptado a cultura de tecido, o vírus pode ser usado para produzir uma vacina. Muitos tipos de vacinas virais são conhecidos, incluindo, porém não-limitado a vaci- nas atenuadas, inativadas, de subunidade, e divididas.

A. Métodos para produzir vírus atenuado

As vacinas atenuadas são vacinas virais vivas que foram atenu- adas ou alteradas para não mais causar doença. Estas podem ser produzi- das de muitos modos, por exemplo, desenvolvimento em cultura de tecido para gerações repetidas e manipulação genética para mutar ou remover ge- nes envolvidos na patogenicidade. O isolado adaptado à cultura de tecido pode ser usado para produzir um vírus atenuado usando os métodos pa- drões. Por exemplo, uma vez que os genes virais e/ou proteínas são identifi- cados os quais estão envolvidos na patogenicidade ou envolvidos na mani- festação de doença, estes podem ser mutados ou mudados tal que o vírus seja ainda capaz de infectar e replicar em uma célula, porém não pode cau- sar doença. Um exemplo disto é mutagenisar o sítio de clivagem de HA1/HA2. O vírus adaptado à cultura de tecido pode ser atenuado usando qualquer método padrão, por exemplo, adaptando ao frio o vírus.

Após a produção do vírus atenuado, a vacina pode ser prepara- da usando métodos padrões (por exemplo, os métodos deste). O vírus pode ser purificado usando métodos padrões, por exemplo, usando cromatografia por exclusão de tamanho. Uma vacina pode ser então preparada usando adjuvante padrão e preparações de vacina, por exemplo, ISCOM, nano- contas, óleo mineral, óleo vegetal, hidróxido de alumínio, saponina, deter- gentes não-iônicos, esqualeno, e co-polímeros de bloco pode ser usada so- zinha ou em combinação como adjuvantes. As vacinas comerciais atuais nos Estados Unidos e Europa não contêm nenhum adjuvante (tanto vacinas vi- vas quanto mortas) e isto é em parte por que uma tal concentração elevada de HA (15pg de HA por cepa de vírus, 45pg de HA para formulação trivalen- te) é necessária na vacina.

B. Métodos de produção de vacinas de vírus inativadas, de subunidades, e divididas

Uma vez que um vírus desejado é obtido, ele pode ser usado para produzir uma composição imunogênica, por exemplo, uma vacina. Os exemplos de vacinas "mortas" são vacinas inativadas, divididas e de subuni- dade. Estes podem ser preparados para tratar influenza usando métodos padrões.

Por exemplo, as vacinas de subunidade geralmente envolvem isolar somente a parte do vírus que ativa o sistema imune. No caso de Influ- enza, as vacinas de subunidade foram preparadas usando HA e NA purifica- do, porém qualquer mistura de proteínas virais pode ser usada para produzir uma vacina de subunidade. Geralmente, a proteína viral, tal como HA é ex- traída de formas de vírus recombinante e a vacina de subunidade é formula- da para conter uma mistura destas proteínas virais de cepas recomendadas por WHO. Por exemplo, a vacina 1995-1996 conteve o HA e NA de duas cepas A e uma cepa B (A/Singapore/6/86 (H1N1); A/Johannesburg/33/94 (H3N2); e B/Beijing/84/93). Para H3N8 CIV, os antígenos H3 e/ou N8 podem ser usados.

Geralmente, a proteína(s) viral é extraída do vírus e a vacina de subunidade é formulada para conter uma mistura destas proteínas virais. As proteínas podem ser isoladas de um isolado viral adaptado a cultura de teci- do para uma vacina de subunidade usando métodos padrões. Alternativa- mente, as proteínas podem ser produzidas usando técnicas recombinantes. As técnicas para produzir uma proteína particular são conhecidas na técnica.

As vacinas divididas geralmente envolvem tratar vírus envelopa- dos com detergente para solubilizar as proteínas nestas. No caso de vírus da influenza, HA e NA se tornam solubilizados. Por exemplo, os detergentes não-iônicos tal como Triton X-100 podem ser usados para produzir vacinas divididas.

As vacinas virais inativadas são preparadas através de inativa- ção do vírus coletado e as formulando usando métodos conhecidos para uso como uma vacina para induzir uma resposta imune em um mamífero. A eta- pa de inativação, purificação de subunidades, e/ou divisão pode ser realiza- da antes ou após a purificação do vírus através de exclusão de tamanho. Por exemplo, a produção de uma vacina inativada, pode envolver remoção de material celular, inativação de vírus, purificação e solubilização do enve- lope viral. Outras modalidades podem envolver purificação de vírus e em seguida inativação, por exemplo, usando formaldeído.

Uma vez preparadas, quaisquer das vacinas (por exemplo, ate- nuada, dividida, de subunidade ou inativada) podem ser testadas para identi- ficar que o vírus e/ou vacina mantiveram antigenicidade semelhante, produ- zem uma resposta sorológica em um mamífero, e/ou fornecem proteção de doença em um mamífero. C. Processamento adicional de vírus coletado

1. Clarificacão de vírus coletado

Após coleta e/ou após inativação do vírus coletado, o material celular e outros materiais de interferência podem ser removidos, por exem- plo, através de sedimentação para remover os microveículos e concentrar o sobrenadante através de ultrafiltração. A influenza desenvolvida em células de cultura de tecido conterá as proteínas celulares hospedeiras. Alguma cla- rificação adicional do sobrenadante pode ser necessária. O DNA celular po- de ser removido através de tratamento enzimático (por exemplo, Benzona- se). Após a remoção inicial do material de interferência, o vírus pode ser ina- tivado usando os métodos padrões. Alternativamente, a inativação pode ser realizada após purificação adicional por, por exemplo, cromatografia por ex- clusão de tamanho.

2. Inativação de vírus

O vírus da influenza pode ser inativado em qualquer número de modos e por qualquer número de agentes. O método de inativação não é crítico para a invenção. A inativação pode ocorrer após o material de interfe- rência ou contaminante ser removido. A inativação pode incluir o uso de a- gentes de inativação conhecidos. Tais agentes de inativação incluem, porém não estão limitados a: irradiação de UV1 formaldeído, glutaraldeído, etilenoi- mina binária (BEI), e beta-propiolactona. Em algumas modalidades, BEI é usado porque é conhecido para destruir o ácido nucléico viral sem danificar as proteínas virais. Além disso, BEI não é afetado pela temperatura e conte- údo de proteína. Os agentes de inativação são usados em uma concentra- ção elevada o suficiente para inativar toda partícula viral na solução. Por e- xemplo, BEI pode ser usado em uma concentração final dentre cerca de 0,5 e 10mM, incluindo porém não-limitado a: 1,5, 3, 4, 5, e 6 mM e incluindo fai- xas de cerca de 1 a 6, e 1 a 3 mm. Em uma modalidade, o BEI é usado em uma concentração de cerca de 6mM. Tipicamente, o BEI é usado em uma concentração de cerca de 1,5 mM e incubado em 37°C durante 48 horas. Na preparação de vacinas para CIV, BEI pode ser usado em uma concentração final dentre cerca de 0,5 e IOmM normalmente entre 4 a 8, e frequentemente entre 5 a 7 mM. Em uma modalidade, o BEI é usado em uma concentração de cerca de 6mM. Em algumas modalidades, a inativação ocorre no pH e temperatura apropriados para o agente de inativação. O pH e a temperatura podem ser escolhidos para garantir que o vírus inativado resultante ainda seja imunogênico. A inativação pode prosseguir com uma quantidade apro- priada de agitação para garantir que o agente contate todas as partículas de vírus na solução.

Após a inativação, os agentes de inativação podem ser removi- dos usando métodos incluindo, porém não-limitados a, inativação do agente de inativação, precipitação do agente de inativação, filtração do agente de inativação, e cromatografia, ou uma mistura destes métodos. Por exemplo, BEI pode ser inativado pela adição de tiossulfato de sódio. BEI residual tam- bém pode ser separado de proteínas virais/vírus usando métodos por exclu- são de tamanho. Uma vez que a inocuidade (ausência de vírus vivo) é con- firmada, a solução viral pode ser também processada para produzir uma va- cina.

3. Processamento adicional

A solução viral pode ser também processada, por exemplo, para remover contaminantes, também concentrar o vírus e fornecer uma resposta imune mais forte. Alguns exemplos de processamento adicional incluem a remoção inicial de material celular, remoção de DNA celular, concentração, e formulação em adjuvante usando os métodos padrões. A influenza desen- volvida em células de cultura de tecido conterá as proteínas celulares hos- pedeiras. Por exemplo, a influenza propagada em células do rim embriônicas humanas (HEK) possuirão proteínas de HEK ou proteínas símias ou bovinas se desenvolvida em células de MDBK ou VERO respectivamente. Estas pro- teínas podem ser descobertas por métodos conhecidos por aqueles versado na técnica. Muitos métodos são conhecidos para remoção DNA, incluindo adição de uma variedade de enzimas de DNase conhecidas para degradar DNA celular, por exemplo, Benzonase. Uma etapa de concentração inicial pode ser realizada para fornecer a solução viral em uma concentração me- Ihor adequada para purificação adicional através de cromatografia. Isto pode ser feito usando qualquer método padrão, incluindo, porém não-limitado a ultrafiltração usando uma membrana tendo um cut off de peso molecular de cerca de 100K (por exemplo, membrana de polissulfona com um MWCO de 5 100K). A solução viral pode ser concentrada até cerca de 100 vezes, incluin- do, porém não-limitado a 90 vezes, 80 vezes, 70 vezes, 60 vezes, 50 vezes, 40 vezes, 30 vezes, 20 vezes, 10 vezes, e 5 vezes. Em algumas modalida- des, a solução viral é concentrada até cerca de 50 vezes, porém mais tipi- camente incluindo 20 vezes e 30 vezes.

4. Purificação

O vírus pode ser purificado usando métodos padrões tal como centrifugação de densidade. Em algumas modalidades, o vírus é purificado através de cromatografia de gel por exclusão de tamanho. Uma vantagem de usar exclusão de tamanho é que as produções são melhores do que ao 15 usar centrifugação de densidade. Qualquer gel de exclusão de tamanho po- de ser usado que resulte em purificação de vírus. Qualquer gel padrão pode ser usado, tal como gel de Sepharose (por exemplo, Sepharose CL-2B). Em algumas modalidades, a coluna é cerca de 70 a 120 cm em comprimento para alcançar a separação requerida, incluindo, porém não-limitado a cerca 20 de 80, 90, 100, e 110. Em outras modalidades, a coluna é de cerca de 80 a 100 cm em comprimento, por exemplo, a coluna é cerca de 90 cm em com- primento. Em algumas modalidades, o comprimento é alcançado por múlti- plas colunas em série, por exemplo, duas colunas de 45 cm ou três colunas de 30 cm (por exemplo, uma coluna de 30-32 cm em comprimento, por 30 25 cm em diâmetro). O vírus concentrado pode ser aplicado usando métodos padrões, por exemplo, o vírus é aplicado em 5-10% do volume de coluna (CV), tipicamente 5-7% de CV. O pico viral da coluna pode então ser coleta- do e também pode ser concentrado usando métodos padrões, por exemplo, ultrafiltração. Em algumas modalidades, 2 a 3 colunas em série tendo um 30 total de 90 cm em comprimento são usadas e o pico final é agrupado e con- centrado através de ultrafiltração. 5. Solubilização das proteínas envelope

O material pico de vírus de concentração pode ser solubilizado usando métodos padrões, tais como, com um detergente não-iônico. A solu- bilização pode ser realizada para preparar o material para formulação de ISCOMS (veja abaixo). Os exemplos de detergentes não-iônicos, incluem, porém não estão limitados a, Nonanoil-N-Metilfucamida (Mega 9), Triton X- 100, Octilglicosídeo, Digitonina, C12E8, Lubrol, Nonidet P-40, e Tween (por exemplo, Tween 20, 80 ou 120). Após a solubilização, o vírus pode ser usa- do para produzir uma vacina, e/ou um adjuvante pode ser adicionado. Por exemplo, para produção de um adjuvante de ISCOM, uma mistura de lipídeo pode ser adicionada para ajudar a formação de ISCOM. A mistura de lipídeo pode incluir uma fosfatidil colina e colesterol sintético. Em algumas modali- dades, o vírus é rompido com Mega 9 em temperatura ambiente com agita- ção e então a mistura de lipídeo (fosfatidil colina e colesterol) pode ser adi- cionada e a agitação continuada.

6. Formação de adjuvantes

Os adjuvantes apropriados podem ser adicionados a vacina e/ou composição farmacêutica. Os exemplos de adjuvantes incluem aqueles con- tendo uma emulsão de óleo e água, como também aqueles que também compreendem hidróxido de alumínio. No último caso, hidróxido de alumínio de uma fonte comercial pode ser usado, por exemplo, Alhydrogel, (Superfos Biosector, Frederikssund, Dinamarca) e Rehydrogel (Reheis Inc.). A emulsão de óleo e água tipicamente compreende óleo mineral ou óleos metabolizá- veis (por exemplo, óleo vegetal, óleo de peixe). Os detergentes não-iônicos ou tensoativos podem ser usados como emulsificantes. Os exemplos de emulsificantes incluem Tween 80 / Span 80, Arlecel 80/Tween 80, e Monta- nides (Seppic, Paris, França). No caso de emulsões adjuvantes, geralmente 5-25% do volume é óleo e 75-95% do volume é aquoso. Em algumas moda- lidades, a emulsão adjuvante é 20% de óleo e 80% aquosa em volume. A quantidade de hidróxido de alumínio normalmente é entre cerca de 5% e 15% da fase aquosa. Em algumas modalidades, Emunade® é o adjuvante.

Para algumas modalidades, ISCOM é usado como um adjuvan- te. ISCOM é um acrônimo para Complexo Estimulante Imune e a tecnologia foi descrita por Morein e outros (Nature 308:457-460 (1984)). ISCOM's é um novo sistema de liberação de vacina e é distinto das técnicas adjuvantes convencionais. Uma ISCOM pode ser convenientemente formado em um 5 dos dois modos. Em algumas modalidades, o antígeno está fisicamente in- corporado na estrutura durante sua formulação. Em outras modalidades, uma matriz de ISCOM (como fornecido por, por exemplo, Isconova) não con- tém antígeno, porém é misturado com o antígeno de escolha pelo usuário final antes da imunização. Após a mistura, os antígenos estão presentes na 10 solução com a matriz de ISCOM porém não são incorporados fisicamente na estrutura.

Geralmente, em um ISCOM, os antígenos purificados são apre- sentados em uma forma multimérica com base na capacidade de Quil A es- pontaneamente formar micelas em uma concentração crítica e por uma Iiga- 15 ção hidrofóbica/hidrofílica, apanhar os imunógenos purificados. Estas estru- turas micelares estão na ordem de 35 nm em tamanho e são facilmente re- conhecidas pelo sistema imune. Diferentes de adjuvantes de depósito con- vencionais, ISCOMS são rapidamente depurados do sítio de injeção e res- postas imunes locais ilícitas, humorais e mediadas por célula. Em modalida- 20 des particulares, ISCOMs são formados como segue. O vírus é solubilizado usando os métodos padrões, tal como com um detergente não-iônico (por exemplo, Mega-9, Triton X-100, Octilglicosídeo, Digitonina, Nonidet P-40, C12E8, Lubrol, Tween-80). Uma mistura de lipídeo é adicionada para ajudar na formação de ISCOM. A mistura de lipídeo pode incluir uma fosfatidilcolina 25 e um colesterol sintético. Em algumas modalidades, a mistura é tratada pri- meiro com detergente não-iônico em temperatura ambiente com agitação, em seguida a mistura de lipídeo (partes iguais de fosfatidilcolina e colesterol, por exemplo) é adicionada e a agitação é continuada. Quil A (um glicosídeo purificado de saponina) é adicionado à mistura de lipídeo de vírus e a agita- 30 ção é continuada. O Quil A pode ser adicionado para produzir uma concen- tração final de Quil A de cerca de 0,01 a 0,1%, incluindo porém não-limitado a 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, e 0,09. Em algumas modalidades, a concentração final é cerca de 0,05%. O detergente não-iônico é removido (por exemplo, por diafiltração com acetato de amônio). A matriz do ISCOM é formada por Quil A. A morfologia de uma partícula de ISCOM, como visto por microscopia eletrônica, mostra uma estrutura do tipo gaiola típica de a- proximadamente 35 nm em tamanho. O estágio de formação de ISCOM po- de ser refinado pelo uso de diafiltração de fluxo tangencial. Os ISCOMs pre- sentes purificaram os antígenos de uma forma multimérica com base na ca- pacidade de Quil A espontaneamente formar micelas em uma concentração crítica e por uma ligação hidrofóbica/hidrofílica que apanha os antígenos pu- rificados. A formação de ISCOMs pode ser verificada através de microscopia eletrônica para verificar que as estruturas típicas do tipo gaiola foram forma- das. A resposta imune de uma apresentação de ISCOM foi mostrada ser pelo menos dez vezes melhor do que de uma carga útil de antígeno seme- lhante apresentada como micelas de proteína de membrana agregada sozi- nha. Também se descobriu que os ISCOMs eliciam uma resposta mediada por célula, não vista com vacinas de vírus inteiras convencionais. Em algu- mas modalidades, a concentração final é cerca de 0,05%.

Estimulantes imunes também podem ser adicionados à vacina e/ou composição farmacêutica. Os estimulantes imunes incluem: citocinas, fatores de crescimento, quimiocinas, sobrenadantes de culturas de célula de linfócitos, monócitos, ou células de órgãos de línfoide, preparações de célula e/ou extratos de plantas, preparação de célula e/ou extratos de bactérias, parasitas, ou mitógenos, e novos ácidos nucléicos derivados de outros vírus e/ou outras fontes (por exemplo, RNA de filamento duplo, CpG), copolímero de bloco, nano-contas, ou outros compostos conhecidos na técnica, usados sozinho ou em combinação.

Os exemplos particulares de adjuvantes e outros estimulantes imunes incluem, porém não estão limitados a: lisolecitina; glicosídeos (por exemplo, saponina e derivados de saponina tal como Quil A ou GPI-0100); tensoativos catiônicos (por exemplo, DDA); halogenetos de amônio de hidro- carboneto quaternário; polióis plurônicos; poliânios e íons poliatômicos; áci- dos poliacrílicos, polímeros de bloco não-iônico (por exemplo, Pluronic F- 127); e MDP (por exemplo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr- MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina, N-acetilmuramil-L-alanil- D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)- etilamina).

D. Eficácia das vacinas

Os métodos são bem conhecidos na técnica por determinar se uma vacina vírus de subunidade, atenuada, dividida, e/ou inativada manteve antigenicidade semelhante àquela do isolado clínico ou isolado adaptado à cultura de tecido derivado dele. Tais métodos conhecidos incluem o uso de antissoro ou anticorpos, atividade e inibição de HA e NA e avaliação de DNA (tal como hibridização por sonda ou PCR) para confirmar que os genes doa- dores que codificam os determinantes antigênicos estão presentes no vírus inativado. Os métodos de identificar se a vacina induz uma resposta soroló- gica também são bem conhecidos na técnica e incluem a imunização de um animal de teste com a vacina, seguido por inoculação com um vírus causa- dor de doença e identificação da presença ou ausência de sintomas da do- ença. Desse modo, a eficácia da vacina de influenza pode ser testada em animais, normalmente furões, ratos, e cobaias são usados. O título de anti- corpo pode ser testado usando o método de inibição de Hemaglutinina (HI) ou inibição de Neuraminidase (NI), ou testando quanto aos anticorpos de neutralização de vírus (teste de micro neutralização) em tecido de cultura, e tais métodos que são geralmente conhecidos. Estudos de desafio podem fornecer informação importante para avaliar a vacina.

As composições e/ou vacinas farmacêuticas adequadas para tratamento incluem vírus ou subunidade viral em mistura com soluções a- quosas ou não-aquosas estéreis. O processo de produzir uma composição e/ou vacina farmacêutica pode envolver isolar um isolado adaptado a cultura de tecido, desenvolver e purificar o isolado viral, inativar e ou atenuar o vírus e misturar um título apropriado com um diluente fisiologicamente aceitável e um agente de estimulação imune. Alternativamente, as proteínas virais po- dem ser purificadas para uma vacina de subunidade e uma quantidade a- propriada misturada com um diluente fisiologicamente aceitável e um agente estimulante imune. O vírus pode ser purificado o bastante para que não haja

i

nenhum material ou substância contaminante que possa interferir com a eta- pa de inativação e/ou a imunogenicidade do vírus.

Um título apropriado de vírus ou concentração de proteínas vi- 5 rais pode ser misturado com o diluente e com o agente estimulante imune. A medição de TCID50 é um modo para medir o título de vírus (50% de dose infecciosa de cultura de tecido). Por exemplo, um título de cerca de 105 a

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10 TCID50 (com base nos títulos de pré-inativação) pode ser usado, inclu- indo porém não-limitado a 106, 1071 108, 109, 1010 e 1011. Opcionalmente o título pode ser analisado pelo título de HA e pode conter de cerca de 1 a 30 pg de HA por vírus incluído na vacina, incluindo, porém não-limitado a 1 a 10 pg para formulações de adjuvante e 1 a 30 pg para vacinas de não adjuvan- tes. Em algumas modalidades, o título é cerca de 15 pg. Desse modo, por exemplo, quando 3 vírus são incluídos em uma vacina de não adjuvante, 1 dose para adultos contém o equivalente a 45 pg de HA (15 pg para cada uma das 3 cepas de vírus). Em outras modalidades, a quantidade de cada cepa pode diferir (dependendo, por exemplo, da antigenicidade), porém a concentração final é de cerca de 1 a cerca de 60 pg de HA, incluindo 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 e 55 pg. Em outra modalidade, as vacinas adjuvantes são esperadas conter quantidades de HA de cerca de 1 a 30 pg, incluindo 2, 5, 10, e 20 pg. A vacina é tipicamente de um volume entre cerca de 50 μΙ e 5000 pl, incluindo 100, 500, 1000, 2000, e 5000 pl.

Os diluentes fisiologicamente aceitáveis padrões podem ser u- sados, incluindo, por exemplo, EMEM, Solução de Sal Equilibrada de Hank, e Salina Tamponada de Fosfato (PBS) e Salina Normal.

Os adjuvantes imune-estimulantes apropriados podem ser adi- cionados a composição de vacina e/ou farmacêutica. Os exemplos de adju- vantes imune-estimulantes, incluem, porém não estão limitados a: óleo mine- ral, óleo vegetal, hidróxido de alumínio, saponina, detergentes não-iônicos, 30 esqualeno, copolímero de bloco, nano-contas, ISCOM, matriz de ISCOM ou outros compostos conhecidos na técnica, usados sozinhos ou em combina- ção. Além do adjuvante, qualquer agente antiviral apropriado que seja útil contra influenza também pode ser incluído em uma composição farma- cêutica. Tais agentes antivirais incluem, por exemplo, rimantadina, amanta- dina, inibidores de neuraminidase (tal como zanamivir e oseltamivir), gama interferon, guanidina, hidroxibenzimidazol, interferon alfa, interferon beta, tiosemicarbarzonas, metisazona, rifampina, ribavirina, pirimidina ou análogos de purina, e foscarnet.

As vacinas que têm mais de um vírus ou cepa de proteínas virais podem ser produzidas usando os métodos desta. As misturas podem ser imunologicamente tituladas para fornecer imunogenicidade aproximadamen- te equivalente. Imunologicamente titulada significa que o produto final é pro- duzido para ajustar diferenças em imunogenicidade. Por exemplo, se uma mistura de cepa A e de cepa B for preparada e a cepa A for 5 vezes mais imunogênica, as cepas serão misturadas em uma relação de cepa A: cepa B de 1:5.

IV. Administração de vacina

A administração da composição de vacina e/ou da composição farmacêutica pode ser para propósitos profiláticos. Quando fornecidas profi- laticamente, as composições são fornecidas antes que qualquer sintoma de infecção viral de influenza esteja evidente. A administração profilática da composição serve para prevenir ou atenuar qualquer infecção subsequente. A composição farmacêutica e/ou de vacina pode ser administrada de qual- quer forma conhecida na técnica, incluindo por inalação, intranasalmente (por exemplo, com vacinas atenuadas), oralmente, e parenteralmente. Os exemplos de rotinas parentais de administração incluem intradérmica, intra- muscular, intravenosa, intraperitoneal e subcutânea. Em algumas modalida- des, a vacina é administrada por injeção intramuscular ou subcutânea pro- funda no braço superior. Uma segunda dose pode ser dada após um interva- lo de 2 a 4 semanas a algumas crianças as quais não foram previamente vacinadas ou expostas à influenza (não-iniciada). Uma ou mais vacinações de reforço podem ser administradas em um momento apropriado após a i- munização inicial. Uma quantidade eficaz da composição de vacina e/ou farmacêu-

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tica é administrada. Uma quantidade eficaz é uma quantidade suficiente para obter um efeito biológico desejado tal como para induzir imunidade celular ou humoral suficiente. Isto pode ser dependente do tipo de vacina, da idade, 5 sexo, saúde, e peso do recipiente. Os exemplos de efeitos biológicos dese- jados incluem, porém não estão limitados a, produção de nenhum sintoma, redução em sintomas, redução em título de vírus em tecidos ou secreções nasais, proteção completa contra infecção através de vírus da influenza, e proteção parcial contra infecção através de vírus da influenza.

Em algumas modalidades, uma quantidade imunologicamente

eficaz de uma vacina de CIV é de cerca de 100 HAU a cerca de 1500 HAU por dose. A composição está tipicamente entre 250 e 750 HAU por dose. Em uma modalidade, a composição de vacina inclui cerca de 500 HAU por dose.

Quando administrada como uma solução, a vacina pode ser 15 preparada na forma de uma solução aquosa, um xarope, um elixir, ou uma tintura. Tais formulações são conhecidas na técnica, e são preparadas para dissolução do antígeno e outros aditivos apropriados nos sistemas solventes apropriados. Tais solventes incluem água, salina, etanol, etileno glicol, glice- rol, e fluido A1, por exemplo. Os aditivos adequados incluem tinturas certifi- 20 cadas, aromatizantes, adoçantes, e preservativos antimicrobianos, tal como timerosal (etilmercuitiossalicilato de sódio). Tais soluções podem ser estabi- lizadas usando métodos padrões, por exemplo, por adição de gelatina parci- almente hidrolisada, sorbitol, ou meio de cultura de célula e podem ser tam- ponadas usando métodos padrões, usando, por exemplo, reagentes tais 25 como fosfato de hidrogênio de sódio, di-idrogênio de sódio, fosfato, fosfato de hidrogênio de potássio e/ou fosfato de diidrogênio de potássio. As formu- lações líquidas também podem incluir suspensões e emulsões. A prepara- ção de suspensões, por exemplo, usando um moinho de coloide, e emul- sões, por exemplo, usando um homogeneizador.

V. Cepas virais e WHO

A fim de estabelecer o tempo adequado de estoques de vacina a ser produzida, uma decisão deve ser tomada bem antes da estação de influ- enza, como aquelas para uso de cepas de influenza AeB para esta vacina anual (para a estação de inverno). Há um sistema de monitoramento epide- miológico elaborado e sofisticado mundial que ajuda nestas decisões. Além disso, o WHO normalmente prepara vírus semente para uso na produção de vacinas.

Há 16 subtipos de HA conhecidos e 9 subtipos de NA conheci- dos. Muitas combinações diferentes de proteínas de HA e NA são possíveis. Somente alguns subtipos de influenza A (isto é, H1N1, H1N2, e H3N2) estão atualmente em circulação geral entre as pessoas. Outros subtipos são en- contrados mais geralmente em outras espécies de animais. Por exemplo, os vírus de H7N7 e H3N8 causam doença em cavalos, e H3N8 também foi mostrado recentemente causar doença em cachorros.

Três subtipos proeminentes do vírus da influenza A aviária que são conhecidos por infectar pássaros e pessoas são infecções de H5-H5 de Influenza A, tal como vírus de H5N1 de HPAI, H7de Influenza A, e H9 de Influenza A. Porém, as próximas cepas que infectam os humanos e causam epidemias ou pandemias poderiam vir de qualquer subtipo.

Os vírus podem ser obtidos usando métodos padrões, por e- xemplo, de amostras de paciente, a Coleção de Cultura do Tipo Americano (ou outra coleção) ou de laboratórios específicos que trabalham no vírus. Em algumas modalidades, o vírus é obtido do WHO ou CDC, incluindo vírus sa- zonais e possíveis cepas de pandemia.

VI. Detecção de resposta sorolóqica

Métodos de identificar se a vacina induz uma resposta sorológi- ca também são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, alguém pode inje- tar um animal de teste com o composto / vacina imunogênica e pode identifi- car os anticorpos antivirais no soro de sangue. Os métodos de identificar se a vacina é protetora são bem conhecidos na técnica e incluem a imunização de um animal de teste com a vacina, seguido por inoculação com um vírus causador da doença e identificação da presença ou ausência de sintomas da doença.

O teste de inibição de hemaglutinação pode ser realizado para identificar a presença de uma resposta sorológica a hemaglutinina. O ensaio

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de inibição de hemaglutinação (HAI) pode ser realizado com células verme- lhas do sangue de peru (RBCs) em todas as amostras de soro do teste, por exemplo, usando um subtipo de influenza conhecido tal como CIV(H3N8).

Brevemente, uma diluição de duas vezes em série é realizada de soro de teste é realizada em PBS em placas de microtítulo de 96 poços de fundo em

V. Um volume igual de suspensão de vírus que contém 4-8 HAU/50pl de CIV é adicionado a cada cavidade que contém o soro de teste, e as placas incu- badas em temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida, um volu- 10 me igual de 0,5% de suspensão de RBC de peru foi adicionado. As placas são então incubadas em temperatura ambiente durante 30 min e os resulta- dos de HAI são lidos. A recíproca da diluição mais elevada do soro que mos- tra inibição de HA é considerada como o título de HAI da amostra de teste.

Outros métodos para determinar a presença de anticorpos para vírus da influenza incluem o teste de inibição de Neuraminidase, mancha- mento do Oeste, ELISA, PCR, e outros métodos para a identificação de anti- corpos de vírus da influenza. Estes ensaios são conhecidos na técnica.

VII. Exemplos

Os seguintes exemplos fornecem procedimentos para isolamen- 20 to, adaptação e purificação de vírus da influenza para criar uma população de vírus homóloga para a produção de uma semente mestre. Os exemplos usam células Vero (Coleção de Cultura do Tipo Americano, CCL 81), porém qualquer tipo de célula poderia ser usado que fosse permissivo para vírus da influenza.

EXEMPLO 1: Substâncias Químicas e Biológicas

O meio de infecção usado conteve 1 Litro de DMEM (Cambrex, Catálogo n° 04-096) ou equivalente; armazenado a 2-7°C, 20 mL de L- Glutamina (Cellgro, Catálogo n° 25-005-CV) ou equivalente; armazenado congelado a -10°C ou mais frio. Uma vez descongelado, foi armazenado em 30 2-7°C durante até 4 semanas, e Tripsina do Tipo IX (Produto de Sigma n° T0303, CAS n° 9002-07-7) ou equivalente; foi aliquotado e armazenado con- gelado em -5 a -30°C. O meio de infecção foi era recentemente feito antes de infectar as células.

A preparação do meio de cultura de célula foi como segue: 1 Litro de DMEM1 20 mL de L-Glutamina, 50 mL de Soro Bovino Fetal (Gibco Catálogo n° 04-4000DK) ou equivalente (Nota: Fornecido de um país sem BSE). O meio completo foi armazenado em 2-7°C durante não mais que 30 dias após a preparação.

A tripsina de EDTA (Cellgro Catálogo n° 98-102-CV ou equiva- lente) usada para passar as células foi armazenada em -5 a -30°C, a data de expiração foi designada pelo fabricante. EXEMPLO 2: Preparação de Cultura de Célula

Porque a diluição de protease a ser usada para a etapa de in- fecção de vírus pode variar por lote, novos lotes de tripsina foram titulados para estabelecer o nível ideal antes do uso. Um exemplo da titulação é para tripsina do tipo IX diluída em série em DMEM que contém L-glutamina, u- sando diluições de meio Iog (10"\ IO"1·5, 10"2, 10"2·5, etc.). Usando uma placa de 96 poços contendo uma monocamada recentemente confluente de célu- las Vero, lavar cada poço da placa 2 vezes usando 280 pL de PBS. Imedia- tamente após a lavagem, adicionar 200 pL de cada diluição de tripsina do tipo IX a uma fileira da placa. A placa é então incubado em 37°C mais ou menos 2°C com 5 % de CO2 e as células são observadas após 4 dias. A di- luição mais baixa de tripsina que mostra nenhum ou pouco efeito na saúde das células é selecionada como uma concentração apropriada de tripsina para usar para isolamento e otimização de infecção com influenza. É dese- jável e comum observar pouca ou nenhuma variação entre os poços inocu- Iados em cada concentração.

Para clonagem por diluição limitada de vírus nas células Vero, uma monocamada confluente foi usada, tipicamente 3-4 dias de idade; de- senvolvida em placas de microteste de 96 poços Falcon. As células foram derivadas de ATCC CCL 81 e usadas entre as passagens 132 e 156.

A preparação de células Vero de nitrogênio líquido (LN2) foi co- mo segue: uma ampola de células Vero foi removida de LN2 e descongelada em um banho de água de 36 0C mais ou menos 2°C. O conteúdo inteiro do frasco foi pipetado em um frasco de cultura de tecido de 25 cm2 contendo 10 mL de meio de cultura de célula que é suplementado com 10% de soro bovi- no fetal. O frasco foi incubado em 36°C mais ou menos 2°C entre 4 a 6% de CO2. Após cerca de 1 hora, o sobrenadante e as células soltas foram sua- vemente removidos e 10 mL de meio de cultura de tecido fresco adicionado. As células foram incubadas em 36°C mais ou menos 2°C entre 4 a 6% de CO2 até que 90 a 100% de confluência fosse alcançado.

A passagem das células Vero foi como segue: As monocamadas foram lavados usando 10 a 20 mL de PBS durante aproximadamente 3 mi- nutos. PBS foi decantado e substituído com 3 mL de EDTA-tripsina (Cellgro, Catálogo n° 98-102-CV), a monocamada foi incubada durante aproximada- mente 3 minutos ou até que as células fossem separadas do frasco. A sus- pensão foi diluída adicionando-se 17 mL de meio de desenvolvimento prepa- rado (contendo FBS) para diluir e neutralizar a tripsina. As células foram en- tão contadas usando um hemocitômetro para determinar a contagem de cé- lula por mL de suspensão. O número de frascos que poderiam ser prepara- dos usando esta suspensão foi calculado por: Células por mL (suspensão) X mLs de suspensão desejada = mLs de placa para cada recipiente. As célu- las por mL (desejado) totalizam os mLs de suspensão, o total de mLs de suspensão deve ser o menor volume disponível. Se não a semeadura a densidade de célula pode ser ajustada para acomodar isto, porém deveria ser notado que a duração do tempo até que as células fiquem confluentes será mais longa com uma densidade de célula mais baixa na semeadura. Os recipientes foram normalmente semeados usando suspensões de células com uma densidade de célula de 1x104 a 1x105 células por mL. As células foram incubadas durante 3 a 4 dias, ou até confluente.

Estas técnicas para manter e para propagar as células Vero fo- ram similarmente aplicadas a outras linhagens de célula usadas tal como o Rim Canino Madin Darby (MDCK) e HEK 293.

As células de HEK 293 particularmente adequadas para propa- gação de isolados virais foram clonadas. Este subclone de HEK 293, desig- nado GT-D22 (ou D22), foi isolado de uma preparação inicial de células HEK 293 (ATCC n° CRL-1573; Grupo de ATCC n° F-11285 na Passagem 33). As células HEK 293 foram subclonadas e selecionadas com base na produtivi- dade melhorada de adenovírus recombinante Tipo 5 carregando o gene para expressão de p53. Os clones que têm morfologías normais e taxas de de- senvolvimento adequadas foram tripsinízados e semeados em 1-2 χ 106 cé- lulas por poço para análise adicional. Os clones de produção Top foram submetidos à subclonagem e seleção adicional. O subclone de D22 foi fi- nalmente selecionado. A capacidade do subclone de D22 de propagar Influ- enza foi demonstrada usando Vírus da influenza Suína (SIV).

As precauções de Biosafety foram tomadas ao trabalhar com vírus da influenza vivo. A influenza é um agente etiológico de Classe 2 e re- comendações encontradas em CDC-NIH1 Publicação de HHS n° (CDC) 88- 8395 (Biosafety in Microbiological e Biomedical Laboratories) para controlar o vírus no laboratório foram seguidas. EXEMPLO 3: Clonagem por Diluição Limitada

A preparação de tubos de diluição e diluição de amostra para clonagem por diluição limitada foi como segue. Os tubos de teste (12 χ 75 mm) foram montados em prateleiras e rotulados. 1 amostra foi executada por placa e as séries de diluição para cada amostra foi 10"1 a 10~10. O meio de diluição foi dispensado em quantidades de 1,8 mL em cada tubo de teste usando uma pipeta sorológica. O primeiro tubo foi rotulado com a identifica- ção de vírus. Vários tubos adicionais foram preparados para uso como con- troles de diluente e para substituição se qualquer erro for cometido durante o desempenho da diluição. As amostras foram vortexadas durante aproxima- damente 5 segundos, em seguida a diluição inicial foi feita através de pipe- tagem de 200 pL de amostra no tubo de diluição de 10"1. As diluições em série foram continuadas para 10"10. Para cada diluição, a amostra foi vorte- xada e a ponta da pipeta foi mudado entre as diluições.

As diluições foram transferidas para placas de célula como se- gue. Imediatamente antes do uso, o meio foi assepticamente vertido das placas de célula. Cada poço foi enxaguado usando um pipetador de 12 ca- nais 2 a 3 vezes com 280 pL de PBS estéril. As placas foram assepticamen- te esvaziadas, porém elas não foram permitidas secar. As placas foram rotu- ladas com a identificação de vírus, data, e esquema de diluição. Cada dilui- ção foi vortexada brevemente antes de adição a placa. Ao usar um Finnpi- pette motorizado ou outro pipetador apropriado com pontas de 1000 pL, 200 pL por poço de amostra foram inoculados em uma única fileira da placa. As amostras foram carregadas de acordo com concentração de vírus. Primeiro, 2 fileiras de controles de diluente foram adicionadas a placa seguido pela diluição mais elevada de vírus (10"1°) e continuando com o restante das a- mostras. As amostras foram carregadas na seqüência de 10"10 até 10-1. EXEMPLO 4: Preparação de Vírus

A coleta do vírus e do CPE foi avaliada como segue. Seguindo o período de incubação de 4 dias, o efeito citopático (CPE) foi lido através de exame microscópico. A presença de detritos celular, o aparecimento de célu- las mortas e falta de células viáveis foram usados para caracterizar o CPE porque são típicos para vírus da influenza. Interferência ocasionalmente não específica foi observada nas diluições de vírus iniciais, então foi importante examinar várias diluições para CPE. Ao avaliar CPE foi importante determi- nar a ex-cepa de CPE nos poços do CPE exibindo diluição mais elevada. Os níveis mais elevados de sucesso foram alcançados selecionando-se os po- ços da diluição de amostra mais elevada do que exibiu CPE, porém desses poços, preferência foi dada o poço ou poços que mostraram a ex-cepa me- nor de CPE. Uma vez selecionados, os conteúdos do poço foram coletados usando uma pipeta de 1000 pL de canal único para aspirar os fluidos. Nor- malmente os fluidos foram repetidamente pipetados para remover as células fracamente presas do fundo do poço e ajudar a separam qualquer aglome- ração de células ou vírus na suspensão. Os fluidos coletados foram então usados para realizar um ciclo adicional, ou ciclos, de clonagem por diluição limitada ou foram algumas vezes usados para inocular uma monocamada fresca para a produção de uma semente pós-clonagem. Foi típico realizar 2 a 3 ciclos de clonagem por diluição limitada em sucessão imediata para pro- duzir uma população uniforme de vírus. O título de HA foi analisado em cada etapa no processo e os resultados são mostrados na Tabela 1. A/lndonésia/05/2005 (IND0H5N1), ΑΛ/ietnam/1203/04 (VNH5N1), A/Nova Caledônia/20/99 (A/NC/20/99(R)), e A/Wísconsin/67/05 (A/Wis/67/05R) são vírus da influenza de reclassificação fornecidos pelo CDC. Para os vírus de reclassificação os genes que codificam as glicoproteínas de superfície HA e NA são da cepa de influenza (INDOH5N1, VNH5N1, A/Nova Caledô- nia/20/99 e A/Wis/67/05) ao mesmo tempo em que os genes internos restan- tes são de A/P R/8/34. A clonagem por diluição limitada também foi aplicada a cepa de influenza do tipo selvagem (sem reclassificação de PR8) A/Nova Caledônia/20/99 (A/NC/20/99), A/Wisconsin/67/05 (A/Wis/67/05) e D B/Malaysis/2506/04. Os vírus foram gerados usando técnicas genéticas re- versas e passados em ovos embrionados. Os materiais de ovo foram dire- tamente usados para clonagem por diluição limitada em células Vero (Um procedimento para titulação de HA é mostrado no Exemplo 5). TABELA 1

Título de HA * antes e após a Clonaqem por Diluição Limitaria (I Γ)Π) Cepa de influenza Materiais Originais * * Antes de * * * LDC Após 2o LDC Após 3o LDC Garrafa rolante Biorreator lndoH5N1 20.480 160 1.280 2.560 5.120 7.680 VNH5N1 2560 <40 640 1.280 5.120 7.680 A/NC/20/99 5.600 640 1.280 A/NC/20/99 (R) 10.240 1.280 1.280 2.560 10.240 A/Wis/67/05 (H3) 2.560 640 1.280 A/Wis/67/05(H3R) 7.680 640 1.280 2.560 5.120 B/Malaysia/2506/04 2.560 <40 640 5.120

* Título de HA é expresso como Unidade/mL. * * Título de HA em material embriônico de ovo fornecido por CDC. * * * Título de HA de células Vero in- fectadas diretamente com material embriônico de ovo fornecido por CDC.

Como visto na Tabela 1 acima, um sistema de cultura de célula pode produzir um título de vírus tão alto quanto aquele de ovos. Adicional- mente, as cepas de vírus que não mostraram nenhum desenvolvimento de- tectável em células Vero no início, VNH5N1 e B / Malaysia/2506/04, podem ser adaptadas para desenvolver em células Vero limitando-se a clonagem por diluição. A propagação de VNH5N1 e B / Malaysia/2506/04 na membra- na amniótica de ovos antes da clonagem por diluição limitada aumentou a adaptação destes vírus para desenvolvimento em células Vero.

Ao usar SRID (Imunodifusão Radial Única) para quantificar he- maglutinina, até 132pg/mL de proteína de hemaglutinina foram obtidos para B/Malaysia/2506/04 no meio de cultura de célula Vero concentrado. A pro- dução em pg de HA/mL de cultura foi 10x melhor do que métodos publicados conhecidos que usam células Vero. Atualmente, uma dose de vacina huma- na é equivalente a cerca de 15 pg/cepa de vírus. Então cerca de 8-9 doses 3 podem ser obtidas de um ml. de meio de cultura de célula Vero concentrado. EXEMPLO 5: Passagem de Influenza pela Membrana Amniótica Aumenta quanto ao Vírus Capaz Crescer em Células de Cultura de Tecido

O vírus da influenza VNH5N1-PR8/CDC-RG foi recebido do CDC. Este é um vírus de reclassificação composto dos genes H5 e N1 de > uma cepa de Vietnã de vírus da influenza H5N1 aviário no esqueleto de ví- rus PR8. Este vírus foi expandido em ovos embrionados de 11 dias de idade inoculado pela cavidade alantóica. Os fluídos alantoicos foram coletados 2-3 dias após a inoculação e tiveram uma produção de vírus de 2560 unidades de hemaglutinina (HAU)/ml.

Os fluidos alantoicos (-200 μ|) foram diluídos em 5 mL de DMEM contendo 1,25 pg/ml de Tripsina do Tipo IX e permitidos absorver para uma monocamada confluente de células Vero (ATCC CCL n° 81 na passagem 147) durante 60 minutos em 36 ± 2°C. As culturas foram alimentadas com 25 mL de DMEM, contendo 1,25 pg/ml de Tripsina do Tipo IX e incubadas du- rante 3 dias e os sobrenadantes de cultura coletados. Não houve nenhuma atividade de hemaglutinina detectável nos fluidos coletados.

Os fluídos alantoicos contendo vírus foram diluídos 1:10.000 e 100μΙ inoculados no poço alantóica e sobre as membranas amniônicas de ovos embrionado de 11 dias de idade. Os ovos foram incubados em cerca de 39°C durante três dias e os fluidos alantoicos e amnióticos coletados se- paradamente.

As células Vero (passagem 132 a 152) foram semeadas em pia- cas de 96 poços em 1 χ 104a 1 χ 105 células/ml, 200 μΙ/poço em DMEM con- tendo 5% de soro bovino fetal e incubadas durante 3-4 dias (até confluente) em 36 ± 2°C, 3-5% de CO2. O vírus de VNH5N1 em fluidos alantoicos ou amniônicos foi serialmente diluído 10"1 a 10"10 em DMEM que contém 1,25 Mg/ml de tripsina do Tipo IX. O meio foi removido de células Vero, os poços enxaguados com 280 μΙ de salina tamponada de fosfato e então 200 μΙ de cada diluição de vírus foram inoculados em 8 poços replicados. As placas foram incubadas durante 4 dias em 36 ± 2°C, 3-5% de CO2. Os fluidos amni- óticos resultaram em vírus que se desenvolveu para títulos mais elevados em células Vero como comprovado pelos efeitos citopáticos até a diluição de 10"9 pelo vírus fonte de âmnio comparado com a diluição de 10"7 pelo vírus fonte alantoico (veja, Tabela 2). O vírus de uma cavidade na diluição mais elevada que mostra efeitos citopáticos foi coletado e clonado limitando-se a diluição em uma segunda vez. Novamente, o vírus de origem de fluido amni- ônico mostrou efeitos citopáticos em diluições mais elevadas do que as vis- tas para vírus fonte alantoico (aproximadamente 10 vezes mais vírus). <

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Φ ^i- GQ <Λ O Ο- Ο Ο.

W O Ό CO D

λ— > Os clones de influenza, na Tabela 2, foram identificados com base em uma combinação da designação de coluna A-H e fileira T10 (séries de diluição de 10"1 até 10"10, respectivamente). Por exemplo, o nome de clo- ne B4 representa vírus coletado do poço encontrado na coluna B e fileira 4 (diluição de 10"4).

O vírus coletado da terceira diluição limitada (-100 μΙ) foi diluído em 5 ml de DMEM que contém 1,25 pg/ml de tripsina do tipo IX e inoculado sobre células Vero confluentes (passagem 132-152) e incubado durante 60 minutos em 36 ± 2°C. Após absorção, 45 ml de DMEM que contém 1,25 pg/ml de Tripsina do Tipo IX foram adicionados e as culturas foram incuba- das durante quatro dias em 36 ± 2°C. Os sobrenadantes de cultura coleta- dos foram testados quanto à hemaglutinina e ambos os clones derivados de vírus expandido de âmnio resultaram em produções quatro a oito vezes mais elevadas de HA (veja Tabela 3). TABELA 3

Vírus fonte Designação de clone Produção (HAU/ml) Fluido Alantoico H7H3F4 320 H7H3B4 160 Fluido Amniótíco G9G4C5 1280 G9G4G5 1280

O vírus de G9G4C5 foi subseqüentemente expandido através de desenvolvimento em células Vero em garrafas rolantes (resultou em 5120 HAU/ml) e biorreatores de 5 litros (resultou em 7680 HAU/ml).

Resultados semelhantes foram obtidos com o vírus da Influenza Tipo B, B/Malaysia/2506/04. Este vírus também deixou de produzir qualquer hemaglutinina mensurável quando o vírus obtido de fluido alantoico foi pro- pagado em células Vero. Porém, o vírus derivado de expansão de âmnio resultou em 640 HAU/ml após duas clonagens por diluição limitada e 5120 HAU/ml após expansão em um biorreatorde 5 litros. EXEMPLO 6: Quantificação de hemaglutinina

O propósito deste procedimento foi quantificar a atividade de hemaglutinina de vírus da influenza em fluidos virais no produto final. Os materiais usados incluíram: PBS1 Cambrex, 517-16Q ou e- quivalente, Solução de Alsevers1 E8085 ou equivalente, eritrócitos de Galo frescos em Solução de Alsevers (relação de 1:1). Permitir sentar durante a noite em Alsevers para estabilizar os receptores. Lavar 2 vezes e armazenar como uma suspensão de 10% em PBS, ou como uma suspensão de 50% em Alsevers. Uso em 4 dias de coleta, as placas de microtítulo, placas de fundo em U Falcon, Catálogo n° 3911 ou equivalente, micropipeta de 8 ca- nais, 5 a 50 pL, ou equivalente, Centrífuga Beckman TJ-6, ou equivalente, micropipeta de 20 a 200 pL ou equivalente, pontas de pipeta de 200 μΙ_ des- cartáveis, Vírus de Controle Positivo com título conhecido, antígeno inativa- do. Armazenado em 2-7°C e usado como está no dia do teste.

A. Uma suspensão de célula vermelha do sangue de galo a 0,5% padronizada (rRBC) em PBS foi preparada primeiro permitindo a solu- ção de rRBC equilibrar em temperatura ambiente (15 a 30°C). RBC de galo em Alseveres tem um período de expiração de 4 dias a partir da data da co- leta. Um volume suficiente de rRBC em Alsevers foi transferido para um tubo centrífugo cônico de 50 mL. Os rRBC's foram lavados carregando-se o tubo para a marca de 45 mL com PBS ou Alsevers e misturados invertendo-se o tubo várias vezes, então centrifugados a 400 χ g, em 4°C durante 10 minu- tos. O sobrenadante era removido com uma pipeta. Se houver qualquer he- mólise no sobrenadante, as etapas de lavagem seriam repetidas até três vezes. Após a lavagem final, 0,25 mL de RBCs de galo embalado foi adicio- nado a 49,75 mL de PBS e invertido para misturar. A suspensão de célula foi rotulada com os dados da preparação, o número de lote de PBS usado, e 0,5% de Células Vermelhas do Sangue de Galo em PBS, armazenadas em 2 a 7°C (tempo de armazenamento máximo é 4 dias).

Β. O número de placas de microtítulo necessárias para testar o material de amostra foi determinado. Todas as amostras de teste foram tes- tadas usando duas fileiras cada de um esquema de diluição de 1:2 e 1:3. Duas fileiras do vírus de controle positivo em um esquema de diluição 1:2 e duas fileiras como um controle de PBS também foram usadas. Outras amos- tras foram testadas quando pedido. Usando um marcador permanente preto a designação da fileira na placa de microtítulo foi indicada. Um exemplo é mostrado abaixo como Tabela 2. Tabela 2: placa de microtítulo

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1? Diluição de 1:2 de A O O O O O O O O O O O O n° de Série B O O O O O O O O O O O O Diluição de 1:3 de C O O O O O O O O O O O O n° de Série. D O O O O O O O O O O O O Diluição de 1:2 de E O O O O O O O O O O O O Vírus de Controle F O O O O O O O O O O O O Positivo PBS G O O O O O O O O O O O O PBS H O O O O O O O O O I O O O

50 pL de PBS foram adicionados a cada poço da placa de micro- título. Um adicional de 50 pL de PBS foi adicionado ao poço de número um daquelas fileiras usando um esquema de diluição de 1:3 e as fileiras de con- trole de PBS. Cada placa de microtítulo do ponto de adição de amostra até a adição de rRBC foi completada antes de prosseguir para a próxima placa de microtítulo. 50 pL de amostra e vírus de controle de positivo foram adiciona- dos ao poço um das fileiras designadas. As diluições de duas vezes em sé- rie das amostras foram preparadas usando o pipetador de múltiplos canais, transferindo 50 pL de alíquotas. As pontas apropriadas foram assepticamen- te empurradas sobre o pipetador de múltiplos canais, garantindo que o pipe- tador ficasse ajustado em 50 pL. Os conteúdos do poço de uma coluna fo- ram misturados puxando e expelindo o material em um mínimo de sete ve- zes. As pontas usadas para misturar foram descartadas. Mais pontas foram empurradas e bem 50 pL de material em cada poço foram transferidos para a próxima coluna de poços. Estas etapas foram repetidas até que todas as fileiras fossem consecutivamente diluídas. A remoção de 50 pL da fileira do- ze das placas de microtítulo foi garantida. 50 pl de suspensão de rRBC a 0,5% foram liberados para cada poço usando o pipetador de múltiplos ca- nais. A suspensão de rRBC foi adicionada dos poços da diluição mais eleva- da para a diluição mais baixa. Cada placa foi suavemente agitada para mis- turar os conteúdos. Uma cobertura de tampa foi colocada em cima da placa de microtítulo de topo e as placas foram empilhadas e incubadas em tempe- ratura ambiente (aproximadamente 20 a 25 0C) durante 45 a 60 minutos.

Após o período de incubação, as placas foram ajustadas em um visualizador de placa de microtítulo para ler e determinar se os poços de controle de PBS são aceitáveis (as cavidades de PBS não devem exibir qualquer hemaglutinação). As características também foram determinadas. Os rRBC's devem ter assentado como um botão completo sem qualquer pro- teção. Uma reação de proteção é uma dispersão do rRBC. Se os poços de controle de PBS foram aceitáveis, os outros poços foram marcadas quanto à hemaglutinação. Se os poços de controle de PBS não foram aceitáveis o teste foi inválido e foi repetido. Os resultados de hemaglutinação foram re- gistrados como positivo (+) para hemaglutinação, parcial (+ / -), e negativo (0). Uma reação positiva mostrou uma proteção completa do rRBC ou dis- persão total das células. Uma reação negativa mostrou um botão total for- mado pelos poços do rRBC que exibiram um "+ / e foram consideradas serem negativas para propósitos de cálculo de finalidade. A diluição mais elevada na qual a aglutinação (nenhum botão) ocorreu foi identificada para cada das réplicas de cada diluição (isto é, o 1:2 e 1:3) e os títulos foram computados como o inverso da última diluição demonstrando aglutinação completa. O nível do título das amostras e o vírus de controle positivo testa- dos foram identificados. A média aritmética do título de finalidade de cada grupo de diluições duplicadas foi determinada. As unidades de HA por 0,5 mL (50μΙ_) da Amostra, PBS e Vírus de Controle Positivo também foram de- terminadas. As unidades de HA por 1 mL foram calculadas multiplicando-se o valor de 0,05 mL por 20.

O cálculo foi realizado como segue: Para cada uma da diluição de amostra de teste de 1:2 e 1:3, a média aritmética das duplicatas foi regis- trada. O título mais elevado foi registrado. HA/0,05mL χ 20 = HA/1 mL foi multiplicado. Os Dados do teste Off e os Resultados como unidades de HA por 1 mL (fluidos de vírus) ou unidades de HA por dose (produto final) foram registrados. Um teste válido para volumes ou produtos finais contêm agluti- nação completa (nenhum botão) na diluição mais baixa e nenhuma aglutina- ção (botão) à diluição mais elevada. O lote de Controle positivo deveria estar dentro da faixa estabelecida. Uma faixa de título fora dos parâmetros lista- dos constitui um "não teste" ou um teste inválido e deveria ser repetida dis- torção.

EXEMPLO 7: Produção de uma vacina

A cepa de vírus é uma cepa de pandemia ou cepas sazonais designadas pelo WHO1 CDC, ou outras organizações governamentais. Com a finalidade de validação do processo industrial de vacina humana, a cepa de referência de VNH5N1-PR8/CDC-RG de reclassíficação do vírus da influ- enza fornecida por CDC é usada. A salina tamponada de fosfato é usada como um diluente para a preparação de vacina e ISCOM como o adjuvante. Uma mistura de lipídeo de partes iguais de colesterol e fosfatidilcolina, é u- sada para ajudar o processo de complexo hidrofílico/hidrofóbico na formação de ISCOM. O detergente não-iônico que é usado para romper o vírus é re- movido através de diafiltração. A formação de ISCOMS é verificada através de microscopia eletrônica. Etilenimina binária (BEI) é usado para inativar o vírus e então o BEI é neutralizado com tiossulfato de sódio. O processo é apresentado em mais detalhes nas etapas 1-19 abaixo.

A cepa de influenza é produzida em células Vero (Rim de Maca- co Verde africano), inativada com o etilenoimina binário (BEI) de composto de aziridina, concentrada, purificada e purificada porfiltração e cromatografia de gel. O vírus é formulado com um adjuvante com Quil A e uma mistura de lipídeo para fazer o produto de fármaco.

Estágio IA-As células Vero são reavivadas do Banco de Célula de Trabalho (WCB). O número de passagem é limitado a 20 passagens do Banco de Célula Principal (MCB). Uma ampola é descongelada do WCB em nitrogênio líquido e semeada em 4-5 χ 104 de células/cm2 no meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 20% em v/v de soro bo- vino fetal irradiado de origem da Nova Zelândia ou australiana, 4 mM de L- glutamina em (tipicamente) um frasco de Nunc de 25 cm2. O frasco é incu- bado em 36°C mais ou menos 2°C, o sobrenadante e as células soltas são removidos após cerca de 1 hora, e o frasco é realimentado com meio fresco e incubado como antes.

Estágio 2A - A expansão de célula é continuada coletando-se as monocamadas confluentes usando uma solução de Tripsina/EDTA, e res- semeando células em frascos mais estáticos ou garrafas rolantes. Outra ex- pansão pode ser realizada em biorreatores pelo uso de microportadores em a 30 g/L.

Estágio 3A - Quando o volume de produção desejado de subs- trato de cultura é alcançado no biorreator ou em garrafas rolantes, células são lavadas duas vezes com o meio Essencial Mínimo Modificado de Dul- becco (DMEM) para remover soro residual, que vai inativar a tripsina no meio de infecção.

Estágio 1B - A Semente de Vírus de Trabalho (WVS) é separa- damente preparada e congelada com antecedência de fabricação de grande escala. O Vírus de Semente Principal ou Vírus de Semente de Trabalho (MSV+1) armazenado em -70 0C é descongelado e diluído em meio de in- fecção de vírus que contém tripsina Porcina do Tipo IX para alcançar o MOI desejado. Um volume predeterminado é inoculado sobre a monocamada de célula Vero confluente nas garrafas rolantes ou biorreatores e incubado em 36°C mais ou menos 2,00C1 tipicamente durante 40-72 horas, quando até 100% do efeito citopatético (CPE) é identificado. O vírus é coletado e conge- lado em -50°C ou mais frio.

Estágio 4-0 vírus semente de trabalho (não mais alto do que a passagem MSV+2) é descongelado e diluído em Meio de Infecção de Vírus que contém 0,5 a 5,0 pg/mL de tripsina Porcina do Tipo IX para alcançar a multiplicidade desejada de infecção. O uso de tripsina no meio ajudará a li- gação e penetração do vírus na célula.

Estágio 4A- A produção de vírus da influenza que usa um bior- reator. Um biorreator de 5 litros foi preparado com microveículos de SoIoHiII Plastic Plus em uma densidade de 30 g/L. O biorreator foi semeado em 2 χ 105 de células Vero/mL no meio Essencial Mínimo Modificado de Dulbecco com 5% em v/v de soro bovino fetal irradiado de origem da Nova Zelândia ou australiana, 4mM de L-glutamina e incubado a 36°C mais ou menos 2°C. Depois que a confluência de célula alcançou 80-100%, os microveículos contendo as células Vero foram sedimentados e lavados duas vezes com 2 litros por lavagem de DMEM sem soro. O meio de infecção que contém 2,5 pg/mL de tripsina do tipo IX foi adicionado ao biorreator. A semente de vírus, por exemplo, VNH5N1, também foi adicionada ao biorreator em um MOI de 0,0001- 0,0003. A preparação de vírus foi continuada durante 5 dias. O bior- reator foi amostrado diariamente para observação de CPE e titulação de HA. O vírus foi coletado após 80 a 100% de CPE terem sido obtidos.

Estágio 5 - Etilenoimina Binário (BEI) é adicionado ao vírus cole- tado para estabelecer uma concentração final de 1,5mM, e mantido a 36°C mais ou menos 2°C durante 1 hora (com agitação) em um pH de 7,3 mais ou menos 0,3.

Estágio 6 - Após o estágio 5 ser concluído, a coleta é transferida para um segundo recipiente e o processo de inativação continuou a 36°C ± 2°C durante 48 horas (com agitação). Após este tempo, o tiossulfato de só- dio é adicionado a uma concentração final de 3mM para neutralizar qualquer BEI residual.

Estágio 7 - A cultura é clarificada por filtros de 7 μ e 1 μ e arma- zenada em 2°C - 8 0C de liberação de inocuidade pendente. O teste de ino- cuidade leva dez dias para realizar.

Estágio 8 - Antígeno é concentrado usando um sistema de ultra- filtração de fluxo tangencial, usando uma membrana de polissulfona com uma redução de peso molecular (MWCO) de 100 K. Até que aproximada- mente um concentrado de 50 vezes seja alcançado.

Estágio 9 - Os fluidos de cultura concentrados resultantes são equilibrados em um tampão apropriado e tratados com DNase (Benzonase) para degradar o DNA celular.

Estágio 10 - O concentre é purificado usando cromatografia de gel de exclusão de tamanho. O gel atualmente usado é uma Sefarose reticu- Iada (CL-2B, Pharmacia). A coluna é 90 cm em comprimento para alcançar a separação requerida. CL-2B é um gel 'macio' que depende da parede da coluna para suporte. Tipicamente os 90 cm de comprimento são alcançados por colunas de 2 χ 45 cm ou 3 χ 30 cm (por exemplo, 30 a 32 cm em altura por 30 cm em diâmetro) em série. O vírus concentrado é aplicado em cerca de 5 a 7% do volume da coluna.

Estágio 11-0 material de pico de vírus é novamente concen- trado usando um sistema de ultrafiltração de fluxo tangencial de escala de bancada com uma membrana de polissulfona de MWCO de 100 K.

Estágio 12-0 material de pico de vírus novamente concentrado é solubilizado adicionando-se 5 ml de uma solução Mega 9 detergente a 10% (peso/volume) (NonanoiI-N-MetiIgIucamida) a 200 mis de uma solução de antígeno. A solução é lentamente misturada com uma barra de agitação magnética durante 1 hora em 20 -25°C em um recipiente de vidro.

Estágio 13 - Uma mistura de lipídeo é adicionada a 50 μΙ por 20 mLs de pico de vírus reconcentrado. A mistura de lipídeo contém 10 mg/mL cada de fosfatidilcolina derivada do ovo e colesterol. A agitação é continuada a 20 a 25°C para garantir a distribuição uniforme dos lipídeos no vírus re- concentrado. Quil A (de 10% em peso/volume de solução de matéria-prima) é adicionado para estabelecer uma concentração final de 0,05%. A solução é agitada durante aproximadamente 30 minutos em 20 a 25°C.

Estágio 14-0 detergente Mega 9 é removido desta mistura (pa- ra permitir a formação de ISCOM) para diafiltração com 50 mM de acetato de amônio. Isto é realizado usando o sistema de ultrafiltração de fluxo tan- gencial de escala de bancada com uma membrana de polissulfona de MW- CO de 100 Κ. O volume de acetato de amônio usado é um mínimo de cerca de 10X o volume de mistura pico de vírus reconcentrado. A diafiltração é efetuada mantendo-se um volume constante completamente, equilibrando- se o alimento e fluxo permeado. O detergente interfere com a formação de ISCOM. A microscopia eletrônica verifica que as estruturas típicas do tipo gaiola foram formadas.

Estágio 15 - O ISCOM é novamente concentrado como a etapa final de diafiltração.

Estágio 16 - Após liberação de QC adequada, os grupos de IS- COMs são formulados para fazer a vacina em 1 a 20pg de HA de influenza humana por 1mL de dose. A salina tamponada de fosfato (PBS) é usada como o diluente.

Estágio 17 - A vacina misturada é carregada em recipientes fi- nais de dose única sob condições de Classe A. As amostras são tomadas para esterilidade, segurança em espécies animais de laboratório, volume extraível e aparência visual. A vacina está rotulada e embalada e mantida em quarentena a 2o a 7°C.

Estágio 18 - Após a purificação de QA final, o produto é liberado para armazenamento gelado de mercadorias acabadas (2o a 7°C) até a ex- pedição.

EXEMPLO 8: Eficácia de Vacina Derivada de Célula Vero em Furões

A capacidade de vacina de influenza derivada de Vero para fu- rões soroconvertidos foi avaliada. Uma vacina de influenza humana trivalen- te com base na cepa de influenza sazonal de 2006-2007 (A/NC/20/99, A/Wis/67/05 reclassificação de PR8 e B/Malaysia, todos obtidos do CDC) foi produzida em células Vero após a clonagem por diluição limitada. A vacina de resultante, "SPflu0607", com ou sem adjuvante de ISCOM, foi injetada na perna traseira esquerda de furões fêmeas de 4-6 meses de idade. Como comparações de controle, as vacinas de influenza humanas comercialmente disponíveis Fluzone® (fabricadas por Sanofi-Pasteur) e Fluvirin® (fabricadas por Chiron) foram testadas ao longo do lado de SPflu0607. A Difusão Imune Radial Única (SRID) foi usada para medir a quantidade de proteína de He- maglutinina (HA) na vacina. A soroconversão dos furões foi medida por inibi- ção de hemaglutinina (Hl). Os títulos de Hl maiores ou iguais a 1:40 são considerados positivos. Veja Mesa 3 Os resultados acima indicam que vacina derivada de célula Vero é comparável com as vacinas derivadas de ovo comercialmente disponíveis. Exemplo 9: Método de Propagação de Vírus da influenza Canina para Pre- parar uma Vacina de CIV

A influenza canina foi isolada de secreções nasais de um ca-

chorro doente. Os cotonetes nasais foram levados e colocados em 2 ml_ de meio de cultura de tecido contendo gentamicina e anfotericina. 0,8 mL do material de cotonete resultante foi inoculado sobre células de Rim Canino Madin Darby confluentes (MDCK) em 10 mL de meio de cultura de tecido DMEM contendo 1,3 pg/mL de Tripsina do tipo IX e incubadas durante 2 dias em 36 ± 2°C. O frasco foi coletado decantando-se os meios e o vírus foi i- dentificado como H3N8 pelo laboratório de Serviços Veterinário Nacional usando antissoro padrão. O vírus passado por MDCK conteve 160 unidades de hemaglutinina por ml. O vírus foi clonado inoculando-se diluições em sé- ries de 10 vezes sobre células de MDCK confluentes em placas de 96 poços e coletando um único poço na diluição mais elevada mostrando efeitos cito- páticos (o meio de cultura de tecido foi DMEM contendo 1,3 pg/mL de tripsi- na do tipo IX). Este procedimento foi repetido uma segunda vez. O clone foi então expandido em células MDCK em um frasco de 75 cm2. O vírus resul- tante (passagem 4) produziu 640 unidades de hemaglutinina por ml. O vírus foi então passado sobre células de Rim Bovinas Madin Darby inoculando-se 0,23 MOI sobre uma monocamada confluente em uma garrafa rolante de 1050 cm2 usando 300 mL de DMEM contendo 0,8 pg/mL de tripsina do tipo IX. A garrafa rolante foi incubada durante 3 dias a 36 ± 2°C. O vírus coletado produziu 2560 HAU/ml. Devido a produção aumentada de HA em células de MDBK, esta linhagem de célula foi escolhida para graduação de vírus para preparação de vacina. O vírus foi propagado em um biorreator. Um biorrea- tor de 5L foi semeado com células de MDBK em 3,0 χ 105 de células/mL presas aos microveículos Cytodex Ill em 5 gramas por litro. As células foram desenvolvidas durante 4 dias em DMEM contendo 5% de soro bovino fetal sem antibióticos a 36 ± 2°C. Após estabelecer os microveículos 90% dos meios foram removidos e substituídos com DMEM livre de soro. A tripsina do tipo IX foi adicionada a uma concentração de 10pg/mL nos 5.000 mL finais. As células foram infetadas com vírus em um MOI de 0,01. O vírus foi incu- bado com as células MDBK em microveículos durante 2 dias a 36 ± 2°C e

então o sobrenadante foi coletado. O vírus resultante produziu 10.240 HAU/ml.

Exemplo 10: Clonagem por Diluição Limitada de Isolado Clínico Sem Passa- gem em Ovos Cria uma População Uniforme e Melhora TCID50/mL e título de HA.

O vírus da influenza canino H3N8 (tipo selvagem) foi recebido de um laboratório de diagnóstico e isolado de um cotonete nasal. Após o rece- bimento, o cotonete nasal foi processado e usado para inocular um frasco de cm2 que contém uma monocamada confluente de células MDCK. O meio de infecção foi compreendido de: DMEM, 4 mM de L-glutamina/ml, 1,3 pg/ml de Tipo IX, e gentamicina. O frasco foi incubado a 36 ± 2°C com 3 a 5% de CO2 e coletado no começo de CPE. Um ensaio de HA foi realizado nos flui- dos de coleta com um resultado de 160 HAU/ml e um título de TCID50/ ml de 7,94.

As células MDCK foram semeadas em placas de 96 poços em 1 x 104 a 1 χ 105 células/ml, 200 μΙ/poço em DMEM que contém 5% de soro bovino fetal e incubadas durante 3-4 dias (até confluente) a 36 ± 2°C, 3-5% de CO2. O vírus CIV H3N8 foi diluído como especificado na seção: Ciclo de Diluição Limitada 1. As diluições foram realizadas em DMEM contendo 1,3 pg/ml de tripsina do tipo IX, 4 mM de L-glutamina, e gentamicina. Os meios foram removidos de células MDCK, os poços enxaguados com 280 μΙ de salino tamponada de fosfato e então 200 μΙ de cada diluição de vírus foram inoculados em 8 poços replicadas. As placas foram incubadas durante 4 dias a 36 ± 2°C, 3-5% de CO2. Dois ciclos de clonagem por diluição limitada fo- ram realizados, o ciclo de diluição limitada 2 imediatamente seguinte ao ciclo de diluição limitada 1. O processo produziu um isolado de vírus que produziu TCID50/ml e títulos de hemaglutinação mais elevado. O vírus de um poço nas diluições mais elevadas demonstrando a extensão menor de efeito citopático foi coletado e clonado por diluição limitada em uma segunda vez. Ciclo de Diluição Limitada 1

O material de passagem 1 foi titulados com um resultado de 7,5 TCID50/ml. Usando este valoro vírus foi diluído para produzir 5 amostras. A. IO'4 B. 1CT5

C 10 partículas de vírus / poço (10~6,5)

D. 3 partículas de vírus / poço (10"7 02)

E. 1 partícula de vírus / poço (10~7·5)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CD C CD D Q φ TD (D -γ ò IO Ò τ— 10-6,5 1 q-7,02 1 0-7,5 O Ι- Ε O <J

O poço A11 foi coletada em preparação para o ciclo 2 de clona- gem por diluição limitada. Ciclo de Diluição Limitada 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B d) Q) C C CD D C (D Zl D Q CD ■σ ~õ o σ> Ò τ— CO (D m Ò Tj- CM ò Q CD T3 CD E Ò Ò ò O O o v— o F ■4—» C o O C G υ O O H

O vírus do poço A5 foi coletado

O virus coletado do segundo ciclo de clonagem por diluição Iimi- tada (-200 μΙ) foi usado para inocular um frasco de 75 cm2 contendo uma monocamada confluente de células MDCK e DMEM suplementado com; 1,3 Mg/ml de tripsina do tipo IX, 4 mM de L-glutamina/ml, e 25 pg/ml de gentami- cina. Os sobrenadantes de cultura coletados foram titulados para determinar o TCID50/ml e título de hemaglutinação (veja Tabela 4). TABELA 4

Passagem de vírus TCID50/ml HAU/ml Passagem 1 de isolado de campo 7,94 160 HAU/ml Passagem 4, semente Pré-mestre, 7,69 640 HAU/mL

Em experiências de laboratório realizadas para exames de imu-

nogenicidade o vírus foi desenvolvido em células MDBK em um biorreator de

5L com um título de hemaglutinação resultante de 10.240 HAU/ml.

EXEMPLO 11: Eficácia de um Vacina de Influenza Canina Inativada em Ca- chorros

O sorotipo H3N8 de vírus da influenza canino (CIV) causa doen- ça severa das vias respiratórias em cachorros. Porém, não há nenhuma va- cina eficaz contra CIV atualmente disponível. O objetivo deste estudo é ava- liar a eficácia de uma vacina de CIV inativada, preparada por diluição limita- da e propagação de CIV em células de cultura de tecido na prevenção de doença clínica e lesões pulmonares induzidas por um desafio de CIV virulen- to. A vacina consiste em antígeno de etilenoimina binário (BEI)- CIV inativa- do de adjuvante com adjuvante de Emunade® com um nível de fornecimento de antígeno de 500 unidades de hemaglutinação (HAU) por dose. Um grupo de oito cachorros soronegativos de CIV de 7 semanas de idade foi vacinado intramuscularmente com a vacina e dose de reforço foi administrada 21 dias após a vacina primária. Duas semanas seguinte a vacinação de reforço, os cachorros vacinados exibiram níveis significantemente mais elevados de títu- lo de anticorpo de inibição de HA comparado com suas contrapartes não vacinadas demonstrando estimulação de resposta imune pela vacina em cachorros. O controle não vacinado e os cachorros vacinados foram desafi- ados com um isolado de CIV virulento heterólogo 16 dias após a vacinação de reforço, e monitorados diariamente durante 10 dias após desafio quanto aos sinais clínicos, temperatura retal e vazamento de CIV nasal. Todos os cachorros de controle (100%) desenvolveram sinais clínicos incluindo vaza- mento ocular e nasal, espirro e tosse, indicando virulência de vírus de desa- fio. O grupo vacinado exibiu sinais clínicos significantemente reduzidos (es- core médio = 4,3) comparado com grupo de controle (escore médio = 6,8; ρ = 0,0051). Somente um dos cachorros no grupo vacinado (12,5%) mostrou vazamento de CIV nasal e ficou somente durante um dia, considerando que, todos os cachorros no grupo de controle (100%) tiveram vazamento de vírus significantemente mais elevado comparado com as vacinas (p= 0,0003). O vazamento de vírus durou 7 dias, seguinte o desafio no grupo de controle. Todos os cachorros foram eutanizados 10 dias após o desafio, e a necropsia foi realiza- da para avaliação de lesões pulmonares. Todos os cachorros no grupo de con- trole (100%) mostraram graus variados de consolidação pulmonar, consideran- do que, somente um no grupo vacinado (12,5%) exibiu uma consolidação pulmonar moderada. Os escores de pulmão foram significantemente mais elevados em cachorros de controle (escore médio = 4,9) quando comparado com cachorros vacinados (escore médio = 0; ρ = 0,0005). Estes resultados demonstram inequivocamente que a formulação de vacina testada neste estudo protege cachorros contra infecção de CIV significantemente diminu- indo-se os sinais clínicos, reduzindo o vazamento de vírus, e prevenindo a consolidação pulmonar induzida por CIV. Avaliação do Estudo

O objetivo do estudo foi testar a eficácia de formulação de vaci- na de CIV de adjuvante de Emunade® para proteger contra desafio de CIV em cachorros.

Os cachorros foram inicialmente aclimados durante oito dias. Para o grupo de teste, a primeira vacinação ocorreu no dia 0 e um reforço foi dado no dia 21. O grupo de controle não foi vacinado. O desafio com CIV foi apresentado a ambos os grupos no dia 37. Os cachorros foram monitorados e observados ao longo do estudo, como descrito abaixo. Os cachorros foram eutanizados 10 dias após o desafio e uma necropsia foi realizada. Animais de Teste;

Os animais de teste tinham uma média de 48,25 dias de idade no dia 0. Havia 8 cachorros no grupo de controle e 8 cachorros no grupo de teste. O peso médio era 1,8 kg. Os cachorros usados no estudo não tiveram uma história de infecção respiratória ou vacinação de CIV. Para confirmar que os cachorros eram negativos para anticorpos de CIV (título de HA < 10), as amostras de sangue foram coletadas no dia -1, e testadas por um ensaio de inibição de hemaglutinação. Os cotonetes nasais também foram tomados no dia -1 para garantir que os cachorros estavam livres de CIV na hora de vacinação.

Monitoramento da Pré-vacinação

As amostras de sangue foram coletadas de todos os cachorros em tubos de separação de soro evacuado no dia antes da administração da primeira vacina para confirmar que os cachorros eram negativos para anti- corpos de CIV. Os cotonetes nasais foram tomados no mesmo dia para con- firmar que os cachorros estavam livres de CIV.

A saúde geral dos cachorros foi avaliada por exame físico dos cachorros dois dias antes da primeira vacinação. As avaliações clínicas e temperatura retal foram realizadas de dois dias antes da vacinação inicial e vacinação de reforço até o dia de vacinação. Vacinação

A vacina de vírus da influenza canina CIV H3N8-Emunade® foi usada neste estudo. O vírus da influenza canino (H3N8) foi inicialmente iso- lado de um cachorro com doença severa das vias respiratórias. As células (MDBK)-KC de Rim Bovino Madin-Darby em nível de passagem de MCS+19, isto é, seguindo 19 passagens do Cepo de Célula Principal, foram usadas para propagar o CIV H3N8. O vírus então foi inativado com 6 mM de BEI durante 60 horas a 36° C. O BEI foi neutralizado com 60mM de tiossulfato de sódio.

A vacina para este estudo foi preparada em uma matéria-prima de 800 mL para alíquota em uma doses de 800 mL. A solução de 800 mL foi preparada como mostrado na Tabela 5. Tabela 5

Componente Volume Usado Fase aquosa: CIV Inativado 156 mL (2560 HAU/mL) Salina 342 mL Hidróxido de alumínio (2,1% de óxido de alumínio) 77 mL Álcool etílico 16 mL Glicerina 40 mL HEPES 1M 8 mL 1% de Solução de Tintura vermelha 0.8 mL Fase de Óleo: Óleo mineral 107 mL Tween 80 34,5 mL Span 80 18,4 mL Preservativo. Gentamicina 0,373 mL Volume total 800,0 mL

O vírus de CIV H3N8 inativado foi diluído em salina normal e em

seguida auxiliado com hidróxido de alumínio. Os componentes restantes fo- ram adicionados na fase aquosa ao antígeno auxiliado. A fase de óleo foi preparada separadamente e m seguida adicionada à fase aquosa durante um período de 10 minutos com agitação contínua durante uma hora. A série foi homogeneizada usando homogeneizante de Silverson durante 30 minu- tos.

Os frascos de vacina CIV foram armazenados a 2 a 7°C foram equilibrados em temperatura ambiente durante um mínimo de 30 minutos. A vacina foi carregada em seringas de 3 mL (1 mL por seringa) e usada para imunização. A primeira dose de vacina foi administrada intramuscularmente na perna traseira direita no dia 0 e a segunda dose foi administrada intra- muscularmente na perna traseira esquerda no dia 21. Procedimentos pós-vacinação

As avaliações clínicas completas que incluem temperaturas re- tais e observação do sítio de injeção foram realizadas em todos os cachorros dentro de 3-6 horas depois de cada vacinação para medir qualquer reação imediata. As avaliações clínicas foram continuadas diariamente durante os 7 dias seguintes a cada vacinação e marcadas de acordo com o Guia de Ava- liação Clínico abaixo. Os cachorros foram sangrados nos dias de estudo 20 e 36, e as amostras de soro foram usadas para medir anticorpos de CIV pa- ra inibição de hemaglutinação. Procedimentos de pré-desafio

As avaliações clínicas foram realizadas e temperaturas retais foram registradas para todos os cachorros durante dois dias antes de desa- fio (dias 35 e 36) e no dia de desafio (dia 37) antes de administração de de- safio. Os sinais clínicos foram marcados de acordo com o Guia de Avaliação Clínico. Desafio

Material de desafio: O vírus de CIV14-06A isolado de células MDCK e usado para desafiar cachorros vacinados, foi originalmente isolado de amostra de campo coletada de cachorro sofrendo de doença das vias respiratórias canina. O título médio do vírus de desafio era 7,7 Log10TCID50/mL. No dia de desafio, o material de desafio foi diluído para 1:4 no Meio Essencial Mínimo de Dulbecco estéril, frio (DMEM) para alvejar uma dose de desafio de 7,4 LogioTCID5o por cachorro.

Administração do Desafio: Todos os cachorros foram adminis- trados com desafio no dia 37. Quatro cachorros foram colocados em uma câmara Plexiglas e 8 ml_ de vírus de desafio (2 mL/cachorro) foram usados para gerar aerossol durante um período de aproximadamente 20 minutos. Os cachorros foram expostos ao aerossol durante um total de 40 minutos. Monitoramento após desafio

A temperatura retal foi registrada e avaliações clínicas foram realizadas diariamente para cada cachorro durante 10 dias após desafio. Os cotonetes nasais foram coletados diariamente de cada cachorro durante 10 dias após desafio. Os cotonetes nasais foram processados e titulados diari- amente após cada coleta como descrito aqui. As amostras de sangue foram coletadas em tubos de separação de soro evacuados no dia 10 após desafio logo antes da eutanásia. Necropsia

Todos os cachorros desafiados foram eutanizados no dia 10 a- pós desafio (Dia 47) usando um método aprovado por AVMA (coquetéis de Cetamina e Beuthanasia-D), e a necropsia foi realizada. Imediatamente se- guinte a eutanásia, os pulmões foram avaliados. As áreas de consolidação D visíveis foram avaliadas e marcadas como um percentual de consolidação de cada lóbulo pulmonar. As porcentagens foram convertidas para escores em peso, e a escore total para cada cachorro foi calculada. Durante a ne- cropsia, o tecido pulmonar foi coletado para isolamento e titulação de vírus, e para histopatologia. Titulação de vírus

O ensaio de hemaglutinação (HA) foi realizado para título de ví- rus. O vírus foi serialmente diluído duas vezes em uma paca de microtítulo de fundo em V e um volume igual de 0,5 % de suspensão de célula verme- lha do sangue de peru (RBC), foram adicionadas à suspensão de vírus. As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 30 minutos e os resultados de HA lidos. A diluição mais elevada do vírus que mostra a ativi- dade de HA foi considerada como 1 unidade de HA. Todos os ensaios foram realizados em duplicata e o título de HA final foi medido.

Para confirmar a potência do material de desafio e medir o va- zamento de vírus em cachorros administrados com desafio, o título de vírus em material de desafio, cotonete nasal e tecido pulmonar foram determina- dos por titulação em células de MDCK. As células MDCK foram semeadas em placas de cultura de tecido de 96 poços durante dois dias, e foram inocu- Iadas com suspensão de vírus diluído serialmente dez vezes ou amostras preparadas de tecido pulmonar e cotonetes nasais. As placas foram incuba- das em temperatura de 36±2°C e 5% de CO2. Sete dias pós-infecção, as placas foram observadas quanto ao efeito citopático (CPE), e a finalidade de 50% para infecciosidade foi calculada usando o método de Spearman-Karber. Os títulos de vírus foram expressos como Log10TCID50/mL. Detecção de resposta sorológina

Os anticorpos para CIV em amostras de soro de cachorro foram medidos por ensaio de inibição de hemaglutinação (HAI). Brevemente, uma diluição de duas vezes em série de soro de teste foi realizada em PBS em placas de microtítulo de 96 cavidades de fundo em forma de V. Um volume igual de suspensão de vírus que contém 4-8 HAU de CIV25-06B foi adicio- nado a cada cavidade contendo soro de teste, e as placas foram incubados 3 em temperatura ambiente durante 30 min para que a reação de antígeno- anticorpo ocorresse. Em seguida, um volume igual de 0,5% de suspensão de RBC peru foi adicionado. As placas foram incubadas em temperatura ambiente durante 30 minutos e os resultados de HAI foram lidos. O recípro- co da diluição mais elevada do soro que mostra inibição de HA foi conside- i rado como o título de HAI da amostra de teste. Todos os ensaios foram rea- lizados em duplicata e o título de HAI final foi determinado. Resultados: escores clínicos

Todos os cachorros foram monitorados diariamente, de dois dias antes do desafio até 10 dias após desafio, para sinais clínicos incluindo des- carga ocular, descarga nasal, espirro, tosse, dispnéia e depressão. Os esco- res clínicas diários para descarga ocular, descarga nasal, espirro, tosse, de- pressão e dispnéia durante 10 dias após desafio foram somados para obter um escore clínico somado para cada cachorro. Os escores clínicas somadas para grupos vacinados e de controle foram comparados usando os testes Wilcoxon Exact Rank Sum e dois p-valores laterais foram calculados.

Os cachorros em ambos os grupos de controle e vacinados exi- biram uma faixa de sinais clínicos a partir de dois dias após desafio (Figura 1). Todos os oito cachorros (100%) no grupo de controle exibiram graus va- riados de tosse que durou até cinco dias dentro do período de observação após desafio de 10 dias. Por outro lado, somente dois cachorros (25%) no grupo vacinado exibiram uma tosse moderada que foi observada somente um dia durante todo o período após desafio de 10 dias. A tosse foi o sinal predominante exibido por cachorros no grupo de controle. Pelo contrário, somente descarga ocular moderada foi o sinal clínico predominante exibido por cachorros vacinados. Os escores clínicos foram significantemente mais elevados (p=0,0051) no grupo de controle (escore médio = 6,8) comparado com cachorros vacinados (escore médio = 4,3). Estes dados sugerem que a vacina de CIV protege cachorros contra sinais clínicos induzidos por CIV. Resultados: vazamento de vírus nasal

O vazamento de vírus nasal foi monitorado em todos os cachor- ros coletando-se e processando cotonetes nasais no dia antes do desafio (dia-1), e então, diariamente a partir do dia 1 até o dia 10 após desafio. Os títulos de vírus (Log10 TCID50/mL) dos cotonetes nasais foram determinados e plotados contra tempo. A área sob a curva foi comparada entre os grupos de controle e vacinados usando testes Wilcoxon Exact Rank Sum. O título de vírus médio para cada grupo, expresso como Log10TCID50/mL, foi plotado contra dias após desafio (Figura 2).

O grupo de controle começou a vazar vírus em secreções nasais a partir do dia 1 após desafio. O vazamento de vírus alcançou seu máximo no dia 5 após desafio (1,25 Log10TCID50/mL) seguido por uma gota precipi- tada no dia 7 (Figura 2). Todos os cachorros no grupo de controle (100%) foram positivos para o vazamento de vírus em uma ou mais pontos de tempo durante a observação após desafio de 10 dias. Por outro lado, somente um cachorro (12,5%) no grupo vacinado (ID No CXTAMM) vazou vírus em se- creções nasais somente durante um dia (dia 3). Os cachorros de controle não-vacinados exibiram vazamento de vírus nasal significantemente mais elevado comparado com cachorros vacinados (p=0,0003). Estes resultados indicam claramente que a vacina de CIV inibe o vazamento de vírus nasal significantemente por cachorros vacinados. Resultados: resposta sorológica

Os títulos de anticorpo médios geométricos (GMT) de ensaios de HAI foram calculados em seguida às vacinações primárias e de reforço. O aumento de vezes em títulos entre imunizações foi reportado. Os títulos de anticorpo foram comparados entre grupos de controle e vacinados usando testes Wilcoxon Wilcoxon Exaet Rank Sum. Todos os 16 cachorros matricu- lados no estudo eram saudáveis e soronegativos (isto é, negativo para anti- corpos de CIV) (título de HAI de < 10) no momento da vacinação primária. Os cotonetes nasais coletados no dia antes da vacinação (Dia -1) confirma- ram que os cachorros estavam livres de vazamento de CIV nasal. Os ca- chorros de controle permaneceram soronegativos no momento do desafio.

Os títulos de anticorpo de HAI foram tabulados e compararam entre grupos de controle e vacinados. Todos os cachorros vacinados gera- ram níveis mensuráveis de títulos de anticorpo seguinte a primeira vacina- ção. Os títulos de anticorpo de HAI variaram entre 10 e 40 com um GMT de 22, e os títulos foram significantes quando comparados com cachorros de controle (p = 0,0070). A segunda vacinação reforçou os títulos de anticorpo em seis vezes (GMT = 135) os quais foram significantemente mais elevados do que controle (p = 0,0002). Os títulos de anticorpo variaram entre 80 e 160, com a maioria dos cachorros exibindo um título de HAI de 160 (75%). Todos os cachorros de controle permaneceram livres de anticorpos de CIV até o momento do desafio (título de HAI < 10). Seguinte o desafio, os títulos de anticorpo em cachorros vacinados alcançaram níveis muito elevados (GMT = 546) demonstrando eficácia da vacina preparando o sistema imune contra CIV virulento. Os títulos de HAI nestes cachorros variaram entre 120 e 1920. Os controles não-vacinados também construíram anticorpos em se- guida ao desafio de CIV com GMT de 149.

Resultados: Consolidação pulmonar, isolamento de vírus, e histopatologia

A consolidação/pneumonia pulmonar é a lesão patológica princi- pal em toda a infecção de influenza. No estudo anterior em desenvolvimento de modelo de desafio, foi observada consolidação pulmonar severa em ca- chorros em 6 e 14 dias após desafio. Então para avaliar se a vacina de CIV protege contra consolidação pulmonar induzida por CIV, todos os cachorros em grupos de controle e vacinado foram eutanizados no dia 10 após desafio, e a necropsia foi realizada. As lesões pulmonares foram avaliadas e marca- das como percentual de consolidação de cada lóbulo pulmonar. O percentu- al de consolidação de cada lóbulo pulmonar marcada durante a necropsia foi convertida em escores em peso com base no sistema de escore pulmonar para cachorros (semelhante ao sistema de escore pulmonar de vírus da in- fluenza Suína em Diseases of the Swinfi (1999) 8o Ed., Capítulo 61, páginas 913-940). Os escores pulmonares médios para grupos vacinados e de con- trole foram comparados usando os Testes Wilcoxon Exact Rank Sums e dois valores-p laterais foram reportados. A estimativa de fração mitigada de efici- ência de vacina relativa aos controles e o intervalo de confidência de 95% para a estimativa também foi informada.

Todos os cachorros no grupo de controle (100%) exibiram grau variado de consolidação pulmonar considerando que somente um cachorro no grupo vacinado mostrou uma consolidação pulmonar moderada (12,5%). As lesões pulmonares em cachorros de controle não-vacinados foram carac- terizadas por hemorragias e consolidação avermelhada e hepatização. Os escores pulmonares no grupo de controle variaram entre 0,10 e 14,70 com o escore pulmonar médio de 4,9. Os escores pulmonares no grupo de controle foram significantemente mais elevados do no grupo vacinado (p = 0,0005; estimativa de fração mitigada é 93,5%). Os escores pulmonares demonstram inequivocamente que a formulação de vacina CIV usada neste estudo prote- ge cachorros contra consolidação pulmonar induzida por CIV.

Além de marcar a lesão durante a necropsia, os tecidos pulmo- nares foram também coletados assepticamente para isolamento de vírus e em formalina para histopatologia. Não houve nenhum CIV detectável na a- mostra de tecido pulmonar de ambos os cachorros vacinados e de controle, que se correlacionassem com a ausência de vazamento de vírus nasal. Isto era esperado uma vez que o vírus da influenza causa infecção aguda com vazamento de vírus máximo e sinais clínicos nos primeiros sete dias. O vírus foi purificado completamente de tecido pulmonar em 10 dias após a infec- ção. Estes resultados estão de acordo com os resultados do estudo prévio. O exame histopatológico revelou graus variados de mudanças histopatológi- cas sugestivas de inflamação em tecidos pulmonares de controle como tam- bém cachorros vacinados. Esta descoberta não foi inesperada porque desde então a resposta imune a um patógeno é provável induzir certo grau de res- posta inflamatória até mesmo na presença de imunidade específica de pató- geno. Além disso, a severidade das lesões pulmonares histopatológicas, em cachorros de controle e vacinados, não pôde ser comparada uma vez que os tecidos não foram coletados seletivamente de áreas com lesões pulmonares. Então, a histopatologia não pôde ser usada como um critério para avaliar a eficácia da vacina neste estudo. Conclusões

A vacinação induziu uma resposta de anticorpo significantemen- te mais elevada, como determinado por ensaio de HAI, seguindo a primeira

(GMT=22) e segunda vacinações (GMT=135) indicando estimulação de res- posta imune pela vacina.

A vacina significantemente diminuiu os sinais clínicos induzidos por CIV, especialmente tosse, em uma dose de 500 HAU por cachorro que demonstra eficácia da vacina no controle da doença clínica induzida por CIV.

A vacina significantemente reduziu o vazamento de vírus nasal em cachorros vacinados o que demonstra a eficácia da vacina na redução da infecção.

A vacina de modo bem sucedido protegeu cachorros contra con- solidação pulmonar induzida por CIV o que prova a eficácia da vacina contra o resultado clínico mais severo, pneumonia.

A vacina não causou nenhuma reação adversa principal em ca- chorros o que demonstra a segurança da vacina. Guia de Avaliação Clínica Descarga nasal

0 = ausente

0,5 = descarga sorosa: fluidos de água gotejando da narina. Os fluidos que correm para fora do nariz são registrados aqui.

1 = descarga mucopurulenta, médio a moderado: fluido turvo misturado com mucosas correm pelo menos a meio caminho do nariz para a boca.

2 = descarga mucopurulenta, severa: Mucosa corre para além da boca. Descarga ocular

0 = ausente: quantidade pequena de material encrostado seco no canto do olho não é considerada uma descarga ocular.

0,5 = descarga sorosa: descarga de fluido claro que corre para fora do olho. 1 = descarga mucopurulenta, médio a moderado: fluido turvo misturado com mucosa que corre pelo menos a meio caminho abaixo do olho para a boca. 2 = descarga mucopurulenta, severa: Fluido ou mucosas corre a meio cami- nho abaixo do nariz ou beira do olho e encharca o pelo no canto interno ou externo do olho. Tosse 0 = ausente

3 0,5 = moderada: Somente uma tosse breve é observada.

1,0 = moderada: Tosse é persistente, ocorrendo repetidamente no período de observação.

2,0 = severa: Tosse é acompanhada de sufocação ou sons de vômito. Espirrando

> 0 = ausente

2 = presente

Dispnéia

0 = ausente (respiração Normal) 2 = presente (Arquejando) Depressão

0 = ausente (atividade Normal)

2 = presente: Cachorro é menos ativo ou brincalhão, comparado ao normal. Os cachorros são registrados se letárgicos ou em repouso e relutantes para ficar de pé enquanto a observação estava sendo conduzida.

Embora a invenção precedente tenha sido descrita em detalhes para propósitos de claridade de entendimento, será óbvio que certas modifi- cações possam ser praticadas no escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações e documentos de patente citados aqui são desse modo in- corporados por referência em sua totalidade para todos os propósitos na mesma medida como se cada fosse desse modo denotado individualmente.

Ficará evidente, a partir dos antecedentes, que a invenção for- nece vários usos. Por exemplo, a invenção fornece uso de qualquer cepa de vírus da influenza patogênico recentemente identificado para preparação de isolados adaptados a cultura de célula e/ou para vacinas como também ce- pas patogênicas conhecidas. A invenção fornece o uso de qualquer célula de cultura de célula recentemente identificada para que seja ou possa se tornar permissível ao desenvolvimento de influenza. A invenção fornece a preparação da cepa adaptada a cultura de tecido em vacinas que têm vírus pelo menos atenuado, de subunidade, dividido ou morto, porém também tendo adjuvantes, veículos, excipientes, farmacêuticos anti-influenza, e ou- tros agentes que aumentam a resposta imune ao vírus. As vacinas podem ser usadas antes do contato com influenza ou após o contato.

Claims (35)

1. Método para selecionar um vírus influenza humano para cres- cimento nas células de cultura de tecido limitando-se a clonagem por dilui- ção, o método compreendendo: serialmente diluir um isolado de vírus influenza e contatar cada diluição com células cultivadas; desenvolver as células durante um tempo suficiente para produ- zir efeitos citopáticos (CPE); colher o vírus da diluição superior que causa CPE; e repetir o processo com o vírus colhido.

2. Método, de acordo com a reivindicação, adicionalmente com- preendendo misturar o isolado de vírus de influenza com uma quantidade efetiva de tripsina antes de contatar as células cultivadas.

3. Método, de acordo com a reivindicação, em que a tripsina é tripsina do tipo IX.

4. Método, de acordo com a reivindicação, em que a etapa de contatar o isolado adaptado a cultura de tecido com as células de cultura de tecido é realizada em um MOI menor do que cerca de 0,01.

5. Método, de acordo com a reivindicação, em que as células de cultura de tecido são células de rim embriônicas de mamífero.

6. Método, de acordo com a reivindicação, em que as células de rim embriônicas de mamífero são células de rim embriônicas humanas.

7. Método, de acordo com a reivindicação, em que o vírus influ- enza é um vírus influenza A, B, ou C.

8. Método, de acordo com a reivindicação, em que o vírus de influenza A é uma cepa H5N1.

9. Método, de acordo com a reivindicação, em que o isolado de vírus influenza é inicialmente desenvolvido em ovos embrionados para obter um inóculo grande para adaptação a cultura de tecido.

10. Método, de acordo com a reivindicação, em que o isolado de vírus influenza é inicialmente desenvolvido na membrana amniótica.

11. Método para a produção de uma vacina de vírus influenza humano compreendendo purificar um vírus colhido, de acordo com a reivin- dicação 1.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, em que a etapa de purificação é realizada usando cromatografia de exclusão de tamanho.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, adicionalmente compreendendo tratar o vírus com uma quantidade de etilenoimina binário (BEI) efetiva para inativar o vírus.

14. Composição imunogênica, compreendendo um vírus influen- za humano inativado por BEI e um adjuvante.

15. Vacina, compreendendo um vírus influenza humano formu- lado em menos do que 4 de HA de influenza humano por dose onde pelo menos 70% do HÁ, tem a mesma seqüência de aminoácido.

16. Vacina, de acordo com a reivindicação 15, em que o vírus influenza humano é inativado por BEI.

17. Vacina, de acordo com a reivindicação 15, em que a vacina também compreende ISCOM.

18. Vacina, de acordo com a reivindicação 15, em que pelo me- nos 90% do HA tem a mesma sequencia de aminoácido.

19. Método para selecionar um vírus influenza canino (CIV) H3N8 para crescimento em células de cultura de tecido limitando-se a clo- nagem por diluição, o método compreendendo: Serialmente diluir um isolado de vírus de influenza e contatar cada diluição com células cultivadas; Desenvolver as células durante um tempo suficiente para produ- zir efeitos citopáticos (CPE); Colher o vírus da diluição superior que causa CPE; e Repetir o processo com o vírus colhido.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, adicionalmente compreendendo misturar o isolado de vírus de influenza com uma quantida- de efetiva de tripsina antes de contatar as células cultivadas.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que a tripsina é tripsina do tipo IX.

22. Método, de acordo com a reivindicação 19, em que as célu- las de cultura de tecido são células de rim embriônicas de mamífero.

23. Método, de acordo com a reivindicação 5, em que as células de rim embriônicas de mamífero são células de rim bovinas de Madin-Darby (MDBK).

24. Composição imunogênica, compreendendo um vírus influen- za canino inativado (CIV) H3N8 e um adjuvante.

25. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação, em que o adjuvante é uma emulsão de óleo e água.

26. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 24, em que o adjuvante é hidróxido de alumínio.

27. Composição imunogênica, de acordo com a reivindicação 24, em que o CIV H3N8 inativado é um CIV H3N8 inativado por etilenoimina binário.

28. Vacina, compreendendo a composição imunogênica, de a- cordo com a reivindicação.

29. Vacina, de acordo com a reivindicação, adicionalmente com- preendendo uma quantidade imunologicamente efetiva de um ou mais soro- tipos de CIV inativados adicionais.

30. Vacina, de acordo com a reivindicação, adicionalmente com- preendendo um patógeno adicional, em que o patógeno adicional é selecio- nado do grupo que consiste em vírus da cinomose canina, adenovírus cani- no, parvovírus canino, vírus parainfluenza canino, coronavírus canino, Lep- tospira serovars, organismos de Leishmania, espécies de Borrelia (spp.); Bordetella bronchiseptica, espécies de Mycoplasma, vírus da raiva, Ehrlichia canis, e combinações dos mesmos.

31. Vacina, de acordo com a reivindicação 28, em que o CIV H3N8 é formulado em 500 HAU/dose e onde pelo menos 70% do HA tem a mesma sequencia de aminoácido.

32. Vacina, de acordo com a reivindicação 31, em que o adju- vante é hidróxido de alumínio.

33. Vacina, de acordo com a reivindicação 34, em que pelo me- nos 90% do HA tem a mesma sequencia de aminoácido.

34. Método para imunizar um canino contra CIV1 compreenden- do injetar o canino com vacina, de acordo com a reivindicação.

35. Soro, compreendendo anticorpos que se ligam a CIV H3N8 obtido de um canino imunizado pelo método, como definido na reivindicação34.